專利名稱：：用于調(diào)節(jié)腫瘤特異性表達(dá)的組合物和方法1.引言本發(fā)明涉及控制一種腎細(xì)胞癌相關(guān)蛋白MN-CA9表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它調(diào)節(jié)元件。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及包含來(lái)自控制MN-CA9表達(dá)的5’調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸序列及其轉(zhuǎn)錄活性片段的組合物。特別提供其中MN-CA9啟動(dòng)子能夠控制一種異源基因的表達(dá)、能夠過(guò)量表達(dá)一種內(nèi)源基因或一種病理過(guò)程的抑制劑、或者能夠使一種在癌癥發(fā)生和/或發(fā)展中被認(rèn)為是重要的特定基因的表達(dá)失效的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明也涉及使用所述載體、細(xì)胞和動(dòng)物來(lái)篩選作為癌癥發(fā)生和/或發(fā)展之激動(dòng)劑和拮抗劑的候選分子的方法。本發(fā)明也涉及用于調(diào)節(jié)與癌癥發(fā)生和/或發(fā)展有關(guān)的化合物之表達(dá)的組合物和方法。另外，本發(fā)明涉及篩選在癌癥發(fā)生和/或發(fā)展期間調(diào)節(jié)表達(dá)的化合物。也提供應(yīng)用通過(guò)篩選測(cè)定而鑒定的分子與化合物進(jìn)行治療性治療的方法。本發(fā)明另外涉及包含MN-CA9啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄活性片段的組合物與方法，所述啟動(dòng)子及其活性片段能夠以組織特異性方式選擇性地啟動(dòng)異源基因的表達(dá)。更詳細(xì)地講，所述啟動(dòng)子能夠選擇性地在各種各樣的腫瘤內(nèi)增強(qiáng)異源基因的表達(dá)。因此，由于本發(fā)明啟動(dòng)子的組織特異性，故可以使治療基因的傳遞靶向癌細(xì)胞，而用不著向正常的非腫瘤細(xì)胞傳遞治療基因。此外，組織特異性表達(dá)提供附加的、便于給予治療基因的有利條件，所述給予治療基因即不僅通過(guò)直接應(yīng)用例如通過(guò)注射給予治療基因，而且通過(guò)靜脈內(nèi)給予、口服給予或諸如此類地系統(tǒng)性給予治療基因；因?yàn)榛虻谋磉_(dá)將被限制和定位于特定的細(xì)胞類型。2.發(fā)明背景2.1基因治療體細(xì)胞基因治療是一種用于治療目的的策略，在這種策略中一般以DNA形式給予核酸從而改變靶細(xì)胞的所有遺傳組成部分。雖然在實(shí)驗(yàn)性基因治療方面的研究是一個(gè)相對(duì)的年輕領(lǐng)域，但是在最近十年期間，已取得了重要的進(jìn)展(Arai，Y.等，1997，OrthopaedicResearchSociety，22-341)。體細(xì)胞基因治療治療人類疾病的潛力已激發(fā)了許多科學(xué)家的想像，主要是因?yàn)閮煞N新技術(shù)進(jìn)步。首先，有許多能在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中于體內(nèi)有效轉(zhuǎn)移及表達(dá)基因的病毒和非病毒基因治療載體。其次，加強(qiáng)對(duì)人類基因組計(jì)劃的支持，將在不久的將來(lái)，為構(gòu)成人類基因組的推算的80,000個(gè)基因的標(biāo)識(shí)與測(cè)序創(chuàng)造條件。最初設(shè)想基因治療為一種用于矯正遺傳缺陷以傳遞功能活性的治療基因到靶細(xì)胞中的特定基因替代療法。對(duì)體細(xì)胞基因治療的最初嘗試依靠將基因引入到組織中的間接手段，稱為離體基因治療；例如，從機(jī)體中取出靶細(xì)胞，用攜帶重組基因的載體轉(zhuǎn)染或感染，并重新植入到所述機(jī)體中去(“自體細(xì)胞轉(zhuǎn)移”)。各種各樣的轉(zhuǎn)染技術(shù)通常是可用的，且使用各種各樣的轉(zhuǎn)染技術(shù)在體外將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中去；所述技術(shù)包括磷酸鈣-DNA沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移或用重組病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)。已提出了將DNA轉(zhuǎn)移到各種各樣不同細(xì)胞類型中去的這樣的離體處理方案，所述各種各樣不同細(xì)胞包括上皮細(xì)胞(美國(guó)專利4,868,116；Morgan和MulliganWO87/00201；Morgan等，1987，Science2371476-1479；Morgan和Mulligan，第4,980,286號(hào)美國(guó)專利)、內(nèi)皮細(xì)胞(WO89/05345)、肝細(xì)胞(WO89/07136；Wolff等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA843344-3348；Ledley等，1987Proc.Natl.Acad.Sci.845335-5339；Wilson和Mulligan，WO89/07136；Wilson等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.878437-8441)、成纖維細(xì)胞(Palmer等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA841055-1059；Anson等，1987，Mol.Biol.Med.411-20；Rosenberg等，1988，Science2421575-1578；Naughton和Naughton，第4,963,489號(hào)美國(guó)專利)、淋巴細(xì)胞(Anderson等，第5,399,346號(hào)美國(guó)專利；Blaese，R.M.等，1995，Science270475-480)以及造血干細(xì)胞(Lim，B.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868892-8896；Anderson等，第5,399,346號(hào)美國(guó)專利)。近來(lái)，已嘗試了用包封在脂質(zhì)體中的DNA制劑(Ledley等，1987，J.Pediatrics1101)、用包封在含有病毒被膜受體蛋白中的DNA制劑(Nicolau等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A801068)和偶聯(lián)到聚賴氨酸-糖蛋白載體復(fù)合物上的DNA進(jìn)行體內(nèi)直接基因轉(zhuǎn)移。另外，已運(yùn)用了“基因槍”將基因傳遞到細(xì)胞中(第9068389號(hào)澳大利亞專利)。甚至有人推測(cè)可以裸露的DNA或與脂質(zhì)體結(jié)合的DNA配制到液體載體溶液中，供注射到胞間隙中，以轉(zhuǎn)移DNA到細(xì)胞中去(Felgner，WO90/11092)。對(duì)于像囊性纖維化和癌癥這樣的不同疾病，利用基因治療技術(shù)的許多臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。雖然可以在于臨床背景下成功應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)之前仍有許多必須越過(guò)的障礙；但是這種治療方法在顯著改善醫(yī)學(xué)實(shí)踐方面的前景得到了廣泛的支持?；蛟S，不管是離體還是體內(nèi)，與當(dāng)前設(shè)計(jì)的基因治療有關(guān)的最大的問(wèn)題之一，是不能控制靶基因的表達(dá)以及不能將靶基因的表達(dá)限制于達(dá)到有益治療效果所需的一種或多種細(xì)胞類型。已充分地認(rèn)識(shí)到傳遞有毒的治療基因到腫瘤細(xì)胞中且在腫瘤細(xì)胞中通過(guò)使用組織特異性啟動(dòng)子而表達(dá)有毒的治療基因的理念。當(dāng)載體(病毒、脂質(zhì)體等等)基因的傳遞導(dǎo)致既感染正常細(xì)胞、又感染癌細(xì)胞時(shí)，這種方法則減少治療基因?qū)︵徑＜?xì)胞的毒性作用。實(shí)例包括應(yīng)用甲胎蛋白啟動(dòng)子以靶向肝癌細(xì)胞(Koryama等，1991，CellStruct.Punct.，16503-510)、對(duì)于胃癌應(yīng)用癌胚抗原(CEA)啟動(dòng)子(Tanaka等，1996，CancerResearch，461341-1345)、應(yīng)用酪氨酸酶啟動(dòng)子殺傷黑素瘤細(xì)胞(Vile等，1994，CancerResearch，546228-6234)、對(duì)于腦應(yīng)用骨形態(tài)發(fā)生蛋白啟動(dòng)子以靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(Shimizu，K.1994，NipsonRinsbo，523053-3058)、以及應(yīng)用骨鈣蛋白啟動(dòng)子以殺傷骨癌和前列腺癌(Ko，S.等，1996，CancerResearch，564614-4619；Gardener等，1998，GeneTherapyandMolecularBiology，241-58)。現(xiàn)在越來(lái)越頻繁地使用分子治療策略，例如通過(guò)使用組織限制性啟動(dòng)子和腫瘤限制性啟動(dòng)子的基因治療?；蛑委煼椒ǖ年P(guān)鍵部分包括i)選擇合適的組織特異性啟動(dòng)子或腫瘤限制性啟動(dòng)子，在某些情況下，所述啟動(dòng)子可以可由一種激素、維生素、一種抗生素、藥物或重金屬誘導(dǎo)；ii)選擇治療(或毒性)基因；iii)合適的載體，例如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等等。靶向合適的腫瘤組織而不損害正常宿主組織的關(guān)鍵是可以僅將治療基因?qū)蚰切┦褂盟暨x啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。2.2MN-CA9蛋白的表達(dá)有人認(rèn)為稱為MN-CA9的蛋白產(chǎn)物是具有胚胎起源性質(zhì)的，且可以解釋具有這種表型表達(dá)的腫瘤的某些強(qiáng)轉(zhuǎn)移行為。實(shí)質(zhì)上，該基因產(chǎn)物的表現(xiàn)類似于胎兒癌基因，潛在地給予細(xì)胞局部發(fā)展、侵染以及轉(zhuǎn)移到周圍及遠(yuǎn)端器官的能力。免疫熒光和免疫電鏡術(shù)的研究揭示了，MN-CA9具有54kd和58kd的分子量，并且該蛋白既存在于質(zhì)膜上、又存在于細(xì)胞核中。免疫組織化學(xué)研究進(jìn)一步揭示了，例如由宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌產(chǎn)生MN-CA9蛋白。此外，在正常的宮頸組織、卵巢組織或腎組織中不表達(dá)該蛋白。僅在今年，預(yù)期在美國(guó)的腎細(xì)胞癌、胃癌和結(jié)腸癌以及宮頸癌的新病例分別大約是30,000例、21,900例、12,800例。此外，預(yù)計(jì)這些癌癥導(dǎo)致美國(guó)國(guó)內(nèi)11,900人、13,500人及4,800人死亡。這種高死亡百分率與常常伴隨這些特殊癌癥發(fā)生的轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)展有關(guān)。另外，如果考慮世界范圍的由于這些癌癥引起的死亡率，則這些數(shù)目急劇地增加。所有這些癌癥都有最終的高死亡率及顯著的發(fā)病率。例如，對(duì)于腎細(xì)胞癌，大約50％診斷有癌癥的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病且通常是不可救藥的。因此，由于當(dāng)前在治療包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌、胃癌和結(jié)腸癌的各種各樣癌癥方面的不足；因而對(duì)這些癌癥，急需新的治療方法。本發(fā)明滿足這些需要且提供一種用于調(diào)節(jié)、診斷和/或治療這樣的癌癥的有用模型。3.發(fā)明概述在這里公開的本發(fā)明提供一種用于腫瘤特異性基因轉(zhuǎn)錄的模型。本發(fā)明部分基于本文描述的一種新的MN-CA9啟動(dòng)子的功能特性描述，所述啟動(dòng)子是一種僅在各種各樣癌中發(fā)現(xiàn)有活性的啟動(dòng)子；所述的各種各樣癌包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌。本發(fā)明提供用于篩選調(diào)節(jié)癌癥發(fā)生和/或發(fā)展期間化合物表達(dá)的化合物的組合物和方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供包含控制癌相關(guān)蛋白MN-CA9表達(dá)、來(lái)自MN-CA9的5’調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸及其轉(zhuǎn)錄活性片段、以及在高度嚴(yán)格條件下和中等嚴(yán)格條件下與這樣的核苷酸雜交的核酸的組合物。特別提供包含可操作地與一個(gè)異源報(bào)道基因連接的MN-CA95’調(diào)節(jié)區(qū)及其轉(zhuǎn)錄活性片段的表達(dá)載體，以及提供含有這樣載體的宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明也提供使用這樣的載體、細(xì)胞和動(dòng)物來(lái)篩選作為各種各樣癌之激動(dòng)劑和拮抗劑的候選分子的方法。同樣，提供應(yīng)用所述篩選測(cè)定而鑒定的分子與化合物進(jìn)行治療處理的方法。例如(但不是作為限制)，將包含一個(gè)報(bào)道基因的組合物可操作地連接到本文稱為MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的一種腫瘤特異性調(diào)節(jié)序列上。該MN-CA9驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因在動(dòng)物中作為轉(zhuǎn)基因表達(dá)?？梢允褂盟鲛D(zhuǎn)基因動(dòng)物以及來(lái)源于所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)的癌細(xì)胞的細(xì)胞，來(lái)篩選作為可用于調(diào)節(jié)各種各樣癌的候選物的化合物。雖然不希望受任何特定理論所約束，但這樣的分子可能既干擾反式作用因子例如轉(zhuǎn)錄因子的功能，又干擾順式作用元件例如與各種各樣癌有關(guān)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的功能。照這樣，它們可能是用于治療這樣癌癥的強(qiáng)有力的候選物；所述癌癥包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌、胃癌和結(jié)腸癌、以及任何其它產(chǎn)生MN的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供高通量地篩選調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因特異性表達(dá)的化合物的方法。在本發(fā)明的這一方面，從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體中取出來(lái)自癌組織的細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)所述的細(xì)胞。利用報(bào)道基因的表達(dá)來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤特異性基因的活性。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)道基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，螢火蟲熒光素酶是所述的報(bào)道基因。可以進(jìn)一步測(cè)試用這種方法鑒定的化合物對(duì)正常動(dòng)物中的非癌細(xì)胞的作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行體內(nèi)篩選，以研究候選藥物對(duì)癌細(xì)胞上作用的作用機(jī)制。具體地說(shuō)，可以分析所述藥物對(duì)包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌的各種各樣癌的作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于治療癌癥發(fā)生和/或發(fā)展的基因治療方法。使用MN-CA9調(diào)節(jié)序列來(lái)驅(qū)動(dòng)藥物或毒素的腫瘤特異性表達(dá)；且將MN-CA9調(diào)節(jié)序列引入到各種各樣的癌細(xì)胞中。該方法包括將可操作地與一種藥物或毒素基因連接的MN-CA9調(diào)節(jié)序列引入到癌細(xì)胞中。本發(fā)明另外提供用于篩選調(diào)節(jié)MN-CA9調(diào)節(jié)序列的新的轉(zhuǎn)錄因子的方法?？梢园延眠@種方法鑒定的這樣的新轉(zhuǎn)錄因子用作治療各種各樣癌癥的靶。4.附圖簡(jiǎn)述圖1從1到540堿基對(duì)的MN啟動(dòng)子序列。在該圖內(nèi)也指出了所述啟動(dòng)子序列內(nèi)的限制性酶切位點(diǎn)。圖2A-2CMN-CD(圖2A)、MNSP-CD(圖2B)及MN-Ela(圖2C)重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建。已使用這些載體來(lái)構(gòu)建復(fù)制缺陷型(Ad-MN-CD和Ad-MNSP-CD)重組腺病毒載體及復(fù)制限制型(Ad-MN-Ela)重組腺病毒載體。圖3MN啟動(dòng)子構(gòu)成物在不同細(xì)胞系中的相對(duì)的熒光素酶活性。該圖表明了單獨(dú)的MN啟動(dòng)子構(gòu)成物以及和SV-40啟動(dòng)子的SV40增強(qiáng)子區(qū)聯(lián)合的MN啟動(dòng)子構(gòu)成物在以下細(xì)胞系中的相對(duì)熒光素酶活性MN表達(dá)的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系(SK-RCC31，SK-RCC-38)和MN非表達(dá)的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系(SK-RCC-29，SK-RCC-42)、MN表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞系(Hela)以及MN非表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP)。相對(duì)于具有MN啟動(dòng)子的pGL3質(zhì)粒，每種MN非表達(dá)子顯示了極小的熒光素酶活性；且將SV-40啟動(dòng)子的增強(qiáng)子區(qū)段添加到MN啟動(dòng)子上，熒光素酶活性僅有略微的增強(qiáng)。另外，MN表達(dá)細(xì)胞系在MN啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下，表達(dá)顯著的基礎(chǔ)熒光素酶活性；添加SV-40啟動(dòng)子的增強(qiáng)子區(qū)則顯著增強(qiáng)(8至12倍)所述熒光素酶活性。圖4腎細(xì)胞癌和宮頸癌細(xì)胞系中的MN啟動(dòng)子缺失分析。使用和圖3中的相同細(xì)胞系，證實(shí)了MN啟動(dòng)子區(qū)對(duì)于MN表達(dá)細(xì)胞系的特異性。任何啟動(dòng)子片段的缺失與全長(zhǎng)MN啟動(dòng)子在MN表達(dá)細(xì)胞系中所示特異性和活性的丟失有關(guān)。圖5MN-熒光素酶構(gòu)成物的示意圖。最前面的線代表MN5’序列。數(shù)字為按bp計(jì)的距MN轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離。5.發(fā)明詳述本發(fā)明提供指導(dǎo)在腫瘤內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它調(diào)節(jié)元件，所述啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它調(diào)節(jié)元件包括來(lái)自控制MN-CA9蛋白表達(dá)的5’調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸序列及其轉(zhuǎn)錄活性片段。特別提供其中MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)能夠控制異源基因的表達(dá)、能夠過(guò)量表達(dá)一種內(nèi)源腫瘤基因或一種病理過(guò)程的抑制劑、或者能夠使一種在癌癥發(fā)生和/或發(fā)展中被認(rèn)為是重要的特定基因的表達(dá)失效的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這樣的癌癥的實(shí)例包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌。本發(fā)明也提供使用所述載體、細(xì)胞和動(dòng)物來(lái)篩選作為癌癥發(fā)生和/或發(fā)展之激動(dòng)劑和拮抗劑的候選分子的方法。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)與癌癥發(fā)生和/或發(fā)展有關(guān)的化合物表達(dá)的組合物和方法，且提供篩選在癌癥發(fā)生和/或發(fā)展期間調(diào)節(jié)表達(dá)的化合物的組合物和方法。也提供應(yīng)用通過(guò)所述篩選測(cè)定而鑒定的分子與化合物進(jìn)行治療處理的方法。本發(fā)明另外提供治療和/或改善癌癥和其它疾病及紊亂的方法，所述癌癥包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌。本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)使用可以供核苷酸序列的組織特異性表達(dá)之用的啟動(dòng)子，可以以細(xì)胞和組織特異性的方式，給予包含于載體(即病毒載體)內(nèi)的編碼毒劑和/或治療劑編碼序列的核苷酸序列。此外，因?yàn)楸景l(fā)明的載體利用這些啟動(dòng)子來(lái)控制毒性和/或治療性編碼序列的表達(dá)，所以本發(fā)明的載體不僅當(dāng)通過(guò)直接應(yīng)用給予時(shí)，而且當(dāng)系統(tǒng)給予機(jī)體時(shí)，都是有效的治療劑；因?yàn)閮H僅將在被特異性靶向的細(xì)胞中即在表達(dá)MN-CA9的細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)所述毒劑和/或治療劑編碼序列。利用這種特性，來(lái)設(shè)計(jì)本發(fā)明的方法，從而有效地轉(zhuǎn)移一種或更多種編碼治療劑的DNA分子到必需治療劑的部位。所述方法涉及給予一種包含編碼翻譯產(chǎn)物(即治療蛋白)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即反義RNA或核酶)的DNA載體到哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)必需所述翻譯產(chǎn)物的部位上。只要該載體感染必需治療劑的細(xì)胞，所關(guān)注的編碼序列即表達(dá)胸苷激酶便得以表達(dá)；因此放大了毒劑和/或治療劑、蛋白或RNA的量。本發(fā)明也涉及包含載體的藥用組合物，所述載體包含供治療和/或改善癌癥和其它疾病及紊亂之用的DNA；所述癌癥包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌。本發(fā)明的組合物通常由包含載體的生物適合性材料組成，該載體包含編碼所關(guān)注治療蛋白即胸苷激酶、生長(zhǎng)因子等等的DNA。生物適合性組合物是一種當(dāng)給予哺乳動(dòng)物宿主時(shí)不引起變態(tài)反應(yīng)、有害反應(yīng)或其它不適宜反應(yīng)之形式的組合物。本發(fā)明克服了特別與當(dāng)前治療和/或癌癥和其它疾病及紊亂的重組蛋白療法有關(guān)的缺點(diǎn)，所述癌癥包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌。首先，直接基因轉(zhuǎn)移是一種有合理的策略；所述策略允許轉(zhuǎn)染細(xì)胞(a)制造生理學(xué)量的、以組織和范圍特異性方式修飾的治療蛋白，以及(b)在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中，傳遞這種蛋白到合適的細(xì)胞表面信號(hào)受體上。預(yù)期這樣分子的外源傳遞與有效給藥和傳遞難題有關(guān)。其次，當(dāng)可能時(shí)，用本發(fā)明的方法不需要反復(fù)給藥；因?yàn)榭梢杂酶鞣N各樣的啟動(dòng)子，包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，來(lái)控制所關(guān)注治療蛋白的表達(dá)水平。另外，轉(zhuǎn)染DNA的整合可涉及重組蛋白的長(zhǎng)期表達(dá)。在下面5.1和5.2節(jié)中詳細(xì)描述了所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸序列、以及其中由MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)控制異源基因的表達(dá)的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在5.3節(jié)中，描述了使用這樣的多核苷酸(即MN-CA9基因的調(diào)節(jié)區(qū))和融合蛋白產(chǎn)物篩選與MN-CA9基因之調(diào)節(jié)區(qū)相互作用的化合物的方法。這節(jié)描述篩選與所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合或調(diào)節(jié)所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)之活性的小分子、化合物、重組蛋白、肽、核酸、抗體等等的體內(nèi)和體外測(cè)定。5.4節(jié)描述了供將所鑒定的激動(dòng)劑和拮抗劑用于藥物傳遞或基因治療的方法。最后，在5.5節(jié)中，描述了運(yùn)用這樣的激動(dòng)劑和拮抗劑來(lái)調(diào)節(jié)與癌細(xì)胞相關(guān)的疾病的藥用組合物。提供用于治療各種各樣癌癥的方法和組合物，所述癌癥包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌。5.1本發(fā)明的多核苷酸和核酸本發(fā)明包括包含MN-CA9基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)及其轉(zhuǎn)錄活性片段的多核苷酸序列。尤其是，本發(fā)明涉及包含圖1所示序列的、緊接地位于MN-CA9基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之5’的多核苷酸。在不同的實(shí)施方案中，所述多核苷酸可以是5000、4000、3000、2000、1000bp的長(zhǎng)度，優(yōu)選大約500bp的長(zhǎng)度，且更優(yōu)選大約250bp的長(zhǎng)度。本發(fā)明進(jìn)一步提供MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的探針、引物和片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供由MN-CA9基因序列的至少8個(gè)核苷酸組成的純化的核酸(即一個(gè)可雜交部分)；在其它的實(shí)施方案中，所述核酸由MN-CA9序列的至少20個(gè)(鄰接的)核苷酸、25個(gè)核苷酸、50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸、500、1000、2000、3000、4000或5000個(gè)核苷酸組成?？梢杂脤?duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來(lái)構(gòu)建這些序列，它們或者呈分離的狀態(tài)，或者被包含于表達(dá)載體中。這些方法包括例如，體外DNA重組技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)遺傳重組。參見例如Sambrook等于1989年描述的技術(shù)(參見上文)、以及Ausabel等于1989年描述的技術(shù)(參見上文)，也參見在“OligonucleotideSynthesis”(《寡核苷酸合成》)(1984，GaitM.J.編輯，IRLPressOxford)中描述的技術(shù)；通過(guò)引用將其全部結(jié)合到本文中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸在長(zhǎng)度方面小于20、25、35、200或500個(gè)核苷酸。核酸可以是單鏈的或雙鏈的。本發(fā)明也包括與上述序列可雜交或互補(bǔ)的核酸。在特定的方面，提供包含與MN-CA9基因調(diào)節(jié)區(qū)的至少10、20、25、50、100、200、500個(gè)核苷酸或全部序列互補(bǔ)的序列的核酸。研究團(tuán)體可以為了各種各樣的目的使用由本發(fā)明提供的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的探針、引物及片段?？梢詫⑺鼈冇米鱀NA印跡凝膠上的分子量標(biāo)志；用作鑒定染色體或作相關(guān)基因位置之圖譜的染色體標(biāo)志或標(biāo)記(當(dāng)被標(biāo)記時(shí))；與患者體內(nèi)的內(nèi)源DNA序列比較以鑒定潛在的遺傳病；用作雜交探針且因此發(fā)現(xiàn)新的、相關(guān)的DNA序列；用作衍生出用于基因指紋分析的PCR引物的信息源；以及在發(fā)現(xiàn)其它新的多核苷酸的方法中，用作“扣除”已知序列的探針。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，進(jìn)行上面列舉的應(yīng)用的方法是眾所周知的。公開這樣的方法的參考文獻(xiàn)包括而不限制于“MolecularCloningALaboratoryManual”，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis編輯，1989；以及“MethodsinEnzymologyGuidetoMolecularCloningTechniques”，AcademicPress，Berger，S.L.和A.R.Kimmel編輯，1987。本發(fā)明的核苷酸序列也包括與圖1所示核苷酸序列及/或其轉(zhuǎn)錄活性片段有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高核苷酸序列同一性、能夠特異性地在包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌的癌內(nèi)驅(qū)動(dòng)表達(dá)的核苷酸序列。為了測(cè)定兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的同一性百分率，則為了最佳比較的目的而將所述序列進(jìn)行比對(duì)(例如，為了和第二種氨基酸序列或核酸序列進(jìn)行最佳比對(duì)，可以在第一種氨基酸序列或核酸序列中引入空位)。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。如果在第一種序列中的一個(gè)位置被第二種序列中相應(yīng)位置的、同樣的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)，那么，所述分子在該位置是相同的。在兩種序列之間的同一性百分率是由所述序列所享有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即％同一性＝相同重疊位置數(shù)/位置總數(shù)x100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩種序列有同樣的長(zhǎng)度。也可以用一種數(shù)學(xué)算法來(lái)完成兩種序列之間的同一性百分率的確定。一種優(yōu)選的、非限制的、用來(lái)比較兩種序列之?dāng)?shù)學(xué)算法的例子是Karlin和Altschul的算法((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268)；在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877中改進(jìn)了該算法。將這樣一種算法結(jié)合到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中((1990)J.Mol.Biol.215403-410)。用所述NBLAST程序、分值＝100、字長(zhǎng)＝12，可進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的一種核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肵BLAST程序、分值＝50、字長(zhǎng)＝3，進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的一種蛋白分子同源的氨基酸序列。至于為了比較目的而得到引入空位的序列比對(duì)，可以如Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.253389-3402中描述，利用GappedBLAST。另一方面，可以用PSI-Blast來(lái)進(jìn)行一種測(cè)定分子之間距離關(guān)系的迭代搜索(出處同上)。當(dāng)使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以用各自程序(例如NBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)(參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。另一種優(yōu)選的、非限制性的、用來(lái)比較序列之?dāng)?shù)學(xué)算法的例子是Myers和Miller的算法((1988)CABIOS411-17)。將這樣一種算法結(jié)合到ALIGN程序(2.0版本)中，所述ALIGN程序?yàn)镚CG序列比對(duì)軟件包的一部分。當(dāng)使用ALIGN程序來(lái)比較氨基酸序列時(shí)，可以用一張PAM120加權(quán)殘基表(PAM120weightresiduetable)、空位長(zhǎng)度罰分(gaplengthpenalty)為12以及空位罰分(gappenalty)為4。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，使用NA_MULTIPLE_ALIGNMENT1.0程序，用為5的GapWeight和為1的GapLengthWeight，可達(dá)到序列比對(duì)。使用類似于上面描述的那些技術(shù)的技術(shù)，允許或不允許有空位，可確定兩種序列之間的同一性百分率。在計(jì)算同一性百分率方面，一般僅計(jì)算準(zhǔn)確的匹配。本發(fā)明也包括(a)包含上述MN-CA9調(diào)節(jié)序列和/或其互補(bǔ)物(即反義物)中的任一種的DNA載體；(b)包含與一種異源基因例如一種報(bào)道基因可操作地連接的上述MN-CA9調(diào)節(jié)元件序列之任一種的DNA表達(dá)載體；以及(c)遺傳工程化的宿主細(xì)胞；所述細(xì)胞包含與一種異源基因可操作地連接的上述MN-CA9調(diào)節(jié)元件序列之任一種，致使所述MN-CA9調(diào)節(jié)元件指導(dǎo)該異源基因在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，同樣包括這調(diào)節(jié)區(qū)的各種各樣轉(zhuǎn)錄活性片段。按照本發(fā)明的、圖1所示序列的“轉(zhuǎn)錄活性”或“轉(zhuǎn)錄功能”片段，是指包含作為在重組宿主細(xì)胞中重組多肽或重組多核苷酸表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)有功能的所述多核苷酸片段的多核苷酸。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，如果所述的調(diào)節(jié)多核苷酸含有包含轉(zhuǎn)錄信息的核苷酸序列，且這樣的序列與編碼所需多肽或所需多核苷酸的核苷酸序列可操作地連接；則該核酸或多核苷酸作為重組多肽或重組多核苷酸表達(dá)之調(diào)節(jié)區(qū)是“轉(zhuǎn)錄活性的”。尤其是，本發(fā)明MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性片段包括那些當(dāng)可操作地連接在MN-CA9調(diào)節(jié)序列上且轉(zhuǎn)染到一種MN-CA9-表達(dá)細(xì)胞系中時(shí)具有足夠長(zhǎng)度而啟動(dòng)報(bào)道基因之轉(zhuǎn)錄的片段。一般將該調(diào)節(jié)區(qū)緊接地置于編碼序列的5’，且與該編碼序列可操作地連接。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指的是緊接報(bào)道基因的5’(上游)放置調(diào)節(jié)序列，以致轉(zhuǎn)錄起始所需反式作用因子例如轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶亞基以及輔助蛋白能夠在這個(gè)區(qū)域裝配，從而使得能夠起始該報(bào)道基因依賴于RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方案中，所選擇的多核苷酸序列可以另外包含其它的核苷酸序列；所述其它的核苷酸序列或者來(lái)自MN-CA9基因，或者來(lái)自一種異源基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將一種啟動(dòng)子或其片段的多個(gè)拷貝相互連接。例如，可以以頭-尾、頭-頭或尾-尾的取向，將啟動(dòng)子序列或其片段連接到該啟動(dòng)子的另一個(gè)拷貝上、或其另一個(gè)片段上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將腫瘤特異性增強(qiáng)子可操作地連接到MN-CA9調(diào)節(jié)序列或其片段上，并將其用來(lái)增強(qiáng)含有所述MN-CA9調(diào)節(jié)序列的構(gòu)成物的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，也包括大體上不影響核苷酸序列之轉(zhuǎn)錄活性的這種核苷酸序列的修飾。這樣的修飾包括插入、缺失和取代。另外，本發(fā)明包括在嚴(yán)格條件下與圖1所示序列之互補(bǔ)物選擇性地雜交、且能夠激活編碼序列表達(dá)的任何核苷酸序列。示范性的中等嚴(yán)格的雜交條件如下于65℃，在由6XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA以及500μg/ml變性鮭精DNA組成的緩沖液中，進(jìn)行載有DNA之濾膜的預(yù)雜交達(dá)8小時(shí)至過(guò)夜。在65℃，于含有100μg/ml變性鮭精DNA以及5-20X106cpm之32P標(biāo)記的探針的預(yù)雜交混合物中，使濾膜雜交達(dá)48小時(shí)。在37℃，于含有2XSSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll以及0.01％BSA的溶液中，進(jìn)行濾膜的洗滌達(dá)1小時(shí)。此后于50℃在0.1XSSC中洗滌達(dá)45分鐘，然后進(jìn)行放射自顯影。另一方面，示范性的高度嚴(yán)格的條件如下例如，于65℃，在0.5MNaHPO4、7％的十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mMEDTA中，與結(jié)合濾膜的DNA雜交；且在68℃用0.1xSSC/0.1％SDS洗滌(AusubelF.M.等編輯，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.I，GreenPublishingAssociates，Inc.，以及JohnWiley&sons，Inc.，NewYork，第2.10.3頁(yè))?？梢允褂玫钠渌母叨葒?yán)格條件是本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的。通常，對(duì)于長(zhǎng)度在14與70個(gè)核苷酸之間的探針，用公式Tm(℃)＝81.5+16.6(log[單價(jià)陽(yáng)離子(摩爾濃度(molar))])+0.41(％G+C)-(500/N)，來(lái)計(jì)算解鏈溫度(Tm)；在公式中，N為該探針的長(zhǎng)度。如果在含有甲酰胺的溶液中進(jìn)行雜交，則用公式Tm(℃)＝81.5+16.6(log[單價(jià)陽(yáng)離子(摩爾濃度)])+0.41(％G+C)-(0.61％甲酰胺)-(500/N)，來(lái)計(jì)算解鏈溫度(Tm)；在公式中，N為該探針的長(zhǎng)度。通常在Tm以下大約20-25℃(對(duì)于DNA-DNA雜合體)或在Tm以下大約10-15℃(對(duì)于RNA-DNA雜合體)，進(jìn)行雜交。所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)或其轉(zhuǎn)錄功能片段最好是來(lái)源于一種哺乳動(dòng)物有機(jī)體。依靠核酸雜交的篩選步驟使得從其它生物中分離任何基因序列成為可能。可以標(biāo)記本文公開的分離的多核苷酸序列或其片段，并可以將其用來(lái)篩選由得自所關(guān)注有機(jī)體的合適細(xì)胞或組織(例如癌組織)的mRNA構(gòu)建成的cDNA文庫(kù))。如果該cDNA文庫(kù)來(lái)源于一種與所述標(biāo)記序列所來(lái)源之有機(jī)體類型不同的有機(jī)體，則所用的雜交條件應(yīng)該具有較低的嚴(yán)格性。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知低嚴(yán)格條件，且低嚴(yán)格條件將根據(jù)該文庫(kù)和標(biāo)記序列所來(lái)源的特定生物而變化。至于有關(guān)這樣條件的指導(dǎo)，參見例如，Sambrook等，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborPress，N.Y.，；以及Ausabel等，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience，N.Y.，通過(guò)引用，將它們中的每一篇全部結(jié)合到本文中。另外，通過(guò)運(yùn)用兩種根據(jù)本文公開的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)核苷酸序列而設(shè)計(jì)的引物庫(kù)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增；可以從例如牛核酸或其它非人類核酸中分離出其它哺乳動(dòng)物的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的同源物。用于所述反應(yīng)的模板可以是通過(guò)mRNA反轉(zhuǎn)錄而得到的cDNA，所述mRNA即由例如?；蚱渌侨祟惖募?xì)胞系、或者已知表達(dá)MN-CA9基因的組織制備的mRNA。至于有關(guān)這樣條件的指導(dǎo)，參見例如，Innis等(編輯)，1995，PCRStrategies，AcademicPressInc.，SanDiego；以及Erlich(編輯)，1992，PCRTechnology，OxfordUniversityPress，NewYork；通過(guò)引用，將它們中的每一篇全部結(jié)合到本文中。通過(guò)使用常規(guī)技術(shù)例如外切核酸酶III消化或合適的限制性內(nèi)切酶消化，構(gòu)建5’和/或3’的嵌套缺失物；可以進(jìn)一步地確定在MN-CA9基因的5’非編碼區(qū)內(nèi)的啟動(dòng)子序列?？梢詫⑺a(chǎn)生的缺失片段插入到所述啟動(dòng)子報(bào)道基因載體中，以確定是否該缺失已降低了或消除了啟動(dòng)子的活性；例如如Coles等所述(Hum.Mol.Genet.，7791-800，1998)。這樣，可以確定啟動(dòng)子的邊界。如果希望，可以運(yùn)用定點(diǎn)誘變或接頭分區(qū)誘變來(lái)單獨(dú)或組合地消除啟動(dòng)子內(nèi)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，從而鑒定該啟動(dòng)子內(nèi)的潛在的各個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)。通過(guò)將突變體插入到啟動(dòng)子報(bào)道基因載體中的克隆位點(diǎn)上，可確定這些突變?cè)谵D(zhuǎn)錄水平上的效應(yīng)。這些測(cè)定的類型是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(WO97/17359，US5,374,544，EP582796，US5,698,389，US5,643,746，US5,502,176以及US5,266,488)。運(yùn)用本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的操作法，靠重組DNA技術(shù)，可產(chǎn)生所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)及其轉(zhuǎn)錄功能片段以及用來(lái)鑒定MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)及其片段的、本文描述的片段和探針?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，或者以分離的形式，或者以包含于表達(dá)載體中的形式，來(lái)構(gòu)建這些序列。這些方法包括例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)遺傳重組。參見例如Sambrook等于1989年描述的技術(shù)(參見上文)、以及Ausabel等于1989年描述的技術(shù)(參見上文)，也參見在“OligonucleotideSynthesis”(1984，GaitM.J.編輯，IRLPressOxford)中描述的技術(shù)；通過(guò)引用將其全部結(jié)合到本文中。用各種各樣的、本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的化學(xué)方法和酶法，可導(dǎo)致該調(diào)節(jié)序列的改變。例如，可以缺失掉由限制性位點(diǎn)定限定的序列區(qū)域?？梢杂霉押塑账嶂笇?dǎo)的誘變，以一種限定方式來(lái)改變序列，和/或在該序列內(nèi)的特定區(qū)域中引入限制性位點(diǎn)。另外，運(yùn)用DNA核酸酶例如Bal31、ExoIII或S1核酸酶，可產(chǎn)生缺失突變體。通過(guò)將所述DNA與核酸酶保溫達(dá)增長(zhǎng)的時(shí)間，可導(dǎo)致調(diào)節(jié)序列中的逐漸更大的缺失(參見例如Ausubel等，1989，參見上文)。在合適的宿主細(xì)胞中，評(píng)價(jià)改變了的序列指導(dǎo)異源編碼序列進(jìn)行表達(dá)的能力。保持其指導(dǎo)結(jié)合到重組表達(dá)載體中的編碼序列表達(dá)能力以供進(jìn)一步使用的任何經(jīng)改變的調(diào)節(jié)序列，都在本發(fā)明范圍內(nèi)。5.2腫瘤特異性啟動(dòng)子活性的分析所述MN-CA9基因調(diào)節(jié)區(qū)顯示了選擇性的組織和細(xì)胞類型特異性，即它誘導(dǎo)基因在宮頸癌細(xì)胞、腎細(xì)胞癌細(xì)胞以及胃癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)。因此，可以使用本發(fā)明該調(diào)節(jié)區(qū)及其轉(zhuǎn)錄活性片段來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中異源基因的表達(dá)。本發(fā)明涉及使用MN-CA9基因調(diào)節(jié)區(qū)以達(dá)到靶基因的組織特異性表達(dá)。通過(guò)監(jiān)測(cè)不同類型細(xì)胞和組織中與所述MN-CA9啟動(dòng)子可操作地連接的可檢測(cè)多核苷酸的表達(dá)水平，可進(jìn)一步地評(píng)價(jià)所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的活性及特異性。正如在下文中所討論的，所述可檢測(cè)多核苷酸或者可以是一種與預(yù)先確定的寡核苷酸探針特異性雜交的多核苷酸，或者可以是一種編碼可檢測(cè)蛋白的多核苷酸。5.2.1MN-CA9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因構(gòu)成物按照本發(fā)明的調(diào)節(jié)多核苷酸可以便利地成為一種可用來(lái)在所需宿主細(xì)胞或宿主有機(jī)體中表達(dá)一種編碼序列或報(bào)道基因的重組表達(dá)載體的一部分。可以用本發(fā)明的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)及其轉(zhuǎn)錄活性片段來(lái)指導(dǎo)異源編碼序列的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性片段包括那些具有足夠長(zhǎng)度從而啟動(dòng)與所述片段可操作地連接的報(bào)道分子編碼序列轉(zhuǎn)錄的所述調(diào)節(jié)區(qū)的片段?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的各種各樣的報(bào)道基因序列，所述報(bào)道基因序列包括但不限于編碼熒光蛋白例如綠色熒光蛋白(GFP)、酶(例如CAT、β-半乳糖苷酶、熒光素酶)或抗原標(biāo)記的基因。為了方便起見，對(duì)于本發(fā)明的篩選測(cè)定，優(yōu)選通過(guò)比色測(cè)定或熒光測(cè)定而分析的酶報(bào)道分子和發(fā)光報(bào)道分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如可以使用一種生物發(fā)光蛋白、化學(xué)發(fā)光蛋白或熒光蛋白作為本發(fā)明發(fā)光報(bào)道分子。不需要底物或輔因子的發(fā)光報(bào)道分子的類型包括但不限于維多利亞水母(Victoriaaequoria)的野生型綠色熒光蛋白(GFP)(Chalfie等，1994，Science263802-805)，以及修飾的各種綠色熒光蛋白(Heim等，1995，Nature373663-4；PCT公開說(shuō)明書WO96/23810)。這種類型報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯導(dǎo)致試驗(yàn)細(xì)胞中熒光蛋白的積累，例如，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的方法，用一臺(tái)熒光計(jì)或流式細(xì)胞儀，可以測(cè)量所述熒光蛋白的積累(參見例如，Lackowicz，1983，PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy，PlenumPress，NewYork)?？梢允褂玫牧硪活愋偷膱?bào)道基因是需要輔因子而發(fā)光的酶，所述酶包括但不限于Renilla熒光素酶。熒光素酶的其它來(lái)源也是本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的，包括但不限于哈氏弧菌(Vibrioharveyi)的細(xì)菌熒光素酶(luxAB基因的產(chǎn)物)(Karp，1989，Biochim.Biophys.Acta100784-90；Stewart等，1992，J.Gen.Microbiol，1381289-1300)、以及來(lái)自螢火蟲Photinuspyralis的熒光素酶(DeWet等，1987，Mol.Cell.Biol.7725-737)；可以根據(jù)光的產(chǎn)生而測(cè)定它們(Miyamoto等，1987，J.Bacteriol.169247-253；Loessner等，1996，Environ.Microbiol.621133-1140；以及Schultz&Yarus，1990，J.Bacteriol.172595-602)?？梢杂帽壬治龇ㄟM(jìn)行分析的報(bào)道基因包括但不限于β-半乳糖苷酶(Nolan等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852603-07)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Roberts等，1989，Curr.Genet.15177-180)、熒光素酶(Miyamoto等，1987，J.Bacteriol.169247-253)或β-內(nèi)酰胺酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述報(bào)道基因序列包含一段編碼LacZ基因產(chǎn)物-β-半乳糖苷酶的核苷酸序列。該酶非常穩(wěn)定且具有寬廣的特異性，以致于允許使用不同的組織化學(xué)底物、生色底物或熒光底物；例如，但不限于5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)、乳糖2，3，5-三苯基-2H-四唑鎓(乳糖-四唑鎓)以及熒光素吡喃型半乳糖苷酶(參見Nolan等，1988，參見上文)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用大腸桿菌(E.coli)β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)的產(chǎn)物(Roberts等，1989，Curr.Genet.15177-180)作為報(bào)道基因?？梢杂貌煌慕M織化學(xué)底物和熒光底物例如X-葡糖苷酸(Xgluc)和4-甲基傘形基葡糖苷酸，來(lái)測(cè)定GUS的活性。除了例如上面描述的、提供方便比色反應(yīng)的那些報(bào)道基因序列外，可以常規(guī)地使用其它報(bào)道基因序列，例如可選擇報(bào)道基因序列。例如，可利用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的編碼序列，從而導(dǎo)致氯霉素抗性細(xì)胞生長(zhǎng)物的依賴MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的表達(dá)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，CAT的用途和可選擇報(bào)道基因的優(yōu)點(diǎn)是眾所周知的(Eikmanns等，1991，Gene10293-98)。同樣可利用其它的可選擇報(bào)道基因序列，且它們包括但不限于編碼賦予zeocin抗性(Hegedus等，1998，Gene207241-249)或卡那霉素抗性(Friedrich和Soriano，1991，Genes.Dev.51513-1523)之多肽的基因序列。也可以用其它基因，例如毒性基因產(chǎn)物、潛在毒性基因產(chǎn)物、以及抗增殖或抑制細(xì)胞之基因的產(chǎn)物。這樣的基因產(chǎn)物的實(shí)例包括靶向肝癌細(xì)胞的甲胎蛋白(Kuriyama，S.等，CellStructFunct，16503，1991)、用于胃癌的癌胚抗原(CEA)啟動(dòng)子(Tanaka，T.等，CancerRes，561341，1996)、用于殺傷黑素瘤細(xì)胞的酪氨酸酶啟動(dòng)子(Vile，R.G.等，CancerRes，546228，1994)、用于腦以靶向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Shimizu，K.NipponRinsho，523053，1994，)、以及用于殺傷骨肉瘤和前列腺癌的骨鈣蛋白啟動(dòng)子(Ko，S.C.等，CancerRes，564614，1996；Gardner，T.A.等，GeneTherapyandMolecularBiology，241，1998)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)報(bào)道基因多核苷酸或者可以是一種與預(yù)先確定的寡核苷酸探針特異性雜交的多核苷酸，或者可以是一種編碼可檢測(cè)蛋白的多核苷酸；所述可檢測(cè)蛋白包括MN-CA9多肽或其片段或其變異體。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，這類測(cè)定是眾所周知的(US5,502,176以及US5,266,488)。按照標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，可構(gòu)建MN-CA9驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因構(gòu)成物(參見例如，MethodsinEnzymology，1987，154卷，AcademicPress；Sambrook等，1989，MolecularCloning-ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborPress，NewYork；以及Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，NewYork，通過(guò)引用，將它們中的每一篇全部結(jié)合到本文中)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，分析啟動(dòng)子活性的方法是眾所周知的(參見例如Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1989)?？梢允褂玫囊环N常用方法的實(shí)例涉及一種攜帶報(bào)道基因和來(lái)自MN-CA9基因組序列之基因組序列的重組載體。簡(jiǎn)單地說(shuō)，如果將報(bào)道基因置于一種生物活性多核苷酸片段的控制下，則檢測(cè)到該報(bào)道基因(例如綠色熒光蛋白、熒光素酶、β-半乳糖苷酶或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)的表達(dá)?？梢詫⑽挥谠摶虻谝粋€(gè)外顯子上游的基因組序列克隆到任何合適的啟動(dòng)子報(bào)道基因載體中。例如，為了在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)，可將市場(chǎng)上可以買到的許多載體工程化，以插入本發(fā)明的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)。這樣的載體的非限制性實(shí)例為pSEAPBasic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Enhancer、或pEGFP-1啟動(dòng)子報(bào)道基因載體(pEGFP-1PromoterReportervectors)(Clontech，PaloAlto，CA)、或者pGL2-或pGL3-基本(basic)無(wú)啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)道基因載體(Promega，Madison，WI)。這些啟動(dòng)子報(bào)道基因載體中的每一種，包含位于報(bào)道基因上游的多克隆位點(diǎn)；所述報(bào)道基因即編碼一種可快速分析之蛋白例如分泌型堿性磷酸酶、綠色熒光蛋白、熒光素酶或β-半乳糖苷酶的報(bào)道基因。以兩種取向?qū)N-CA9基因的調(diào)節(jié)序列插入到報(bào)道基因上游的克隆位點(diǎn)，并將其引人到合適的宿主細(xì)胞中。分析報(bào)道基因之蛋白的水平，并將其與用在該克隆位點(diǎn)沒(méi)有插入片段的載體獲得的水平相比較。與對(duì)照載體相比，含有該插入片段之載體而出現(xiàn)升高的表達(dá)水平，則表明在該插入片段中存在啟動(dòng)子。包含MN-CA9基因調(diào)節(jié)區(qū)的表達(dá)載體可另外含有一種編碼可選擇標(biāo)記的基因?？墒褂枚喾N選擇系統(tǒng)，所述選擇系統(tǒng)包括但不限于單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(Wigler等，1977，Cell11223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA482026)以及腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Lowy等，1980，Cell22817)；可以分別在tk-細(xì)胞、hgprt-細(xì)胞或aprt-細(xì)胞中使用它們。同樣，可以將抗代謝物抗性用作選擇dhfr基因、gpt基因、neo基因以及hygro基因的基礎(chǔ)；dhfr基因賦予對(duì)氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA773567；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)，gpt基因賦予對(duì)霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782072)，neo基因賦予對(duì)氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501)，hygro基因賦予對(duì)潮霉素的抗性(Santerre等，1984，Gene30147)。另外的可選擇基因包括trpB、hisD、ODC；trpB允許細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸，hisD允許細(xì)胞利用組氨醇(histinol)代替組氨酸(Hartman和Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA858047)，ODC(鳥氨酸脫羧酶)賦予對(duì)鳥氨酸脫羧酶抑制劑-2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸即DFMO(McConlogueL.，1987，在CurrentCommunicationsinMolecularBiology中，ColdSpringHarborLaboratory編輯)和谷氨酰胺合成酶(Bebbington等，1992，Biotech10169)抗性。5.2.2.轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)片段的特征鑒定可分析包含MN-CA9基因調(diào)節(jié)區(qū)或其片段的融合構(gòu)成物的轉(zhuǎn)錄活性。作為啟動(dòng)子分析中的第一步，必須按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，ColdSpringHarborPress)，運(yùn)用引物延伸分析和/或RNA酶保護(hù)分析，來(lái)確定在研究之中的腫瘤特異性基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(+1位)。通常認(rèn)為+1位上游的DNA序列是負(fù)責(zé)基因調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子區(qū)。但是下游序列，包括內(nèi)含子中的序列，也可以參與基因調(diào)節(jié)。開始測(cè)試啟動(dòng)子活性，可以將-3kb至+3kb的區(qū)域(這里+1為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn))克隆到報(bào)道基因編碼區(qū)的上游。也可以制備兩種或更多種另外的報(bào)道基因構(gòu)成物，所述構(gòu)成物包含該調(diào)節(jié)區(qū)的5’和/或3’之截短形式，以幫助鑒定對(duì)腫瘤特異性表達(dá)負(fù)責(zé)的區(qū)域?；谟猛緛?lái)進(jìn)行報(bào)道基因類型的選擇。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用一種GFP報(bào)道基因構(gòu)成物。在腫瘤特異性基因啟動(dòng)子的研究中，作為報(bào)道分子的綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用是特別有用的。運(yùn)用GFP作為報(bào)道分子的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)在于這樣的事實(shí)，即在剛分離的腫瘤中不需要底物能檢測(cè)出GFP。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用一種熒光素酶報(bào)道基因構(gòu)成物。至于在轉(zhuǎn)基因小鼠方面的啟動(dòng)子分析，已經(jīng)過(guò)優(yōu)化以供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的GFP是優(yōu)選的。無(wú)啟動(dòng)子克隆載體pEGFP1(Clontech，PaloAlto，CA)編碼一種經(jīng)過(guò)優(yōu)化以便在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有更亮的熒光和更高表達(dá)的野生型GFP的紅移變異體(Cormack等，1996，Gene17333；Haas等，1996，Curr.Biol.6315)。此外，由于這種增強(qiáng)的GFP(EGFP)的最大激發(fā)峰在488nm，因而可運(yùn)用通常使用的濾光裝置，例如以450-500nm照明的異硫氰酸熒光素(FITC)光學(xué)器件，來(lái)觀察GFP熒光。對(duì)于用轉(zhuǎn)基因小鼠的啟動(dòng)子分析，pEGFP1證明作為報(bào)道基因載體是有用的(Okabe等，1997，F(xiàn)EBSLett.407313)。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，使用包含其中在熒光素酶報(bào)道基因上游具有一個(gè)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠?？梢允褂帽?br>技術(shù)領(lǐng)域：
已知方法制備推定的啟動(dòng)子片段(通常來(lái)自含有8-10kb含所述啟動(dòng)子區(qū)的基因組DNA的親代噬菌體克隆)以供克隆用。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，將啟動(dòng)子片段克隆到一種熒光素酶報(bào)道基因載體的多克隆位點(diǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，用限制性內(nèi)切核酸酶切取所述調(diào)節(jié)區(qū)片段，以便插入到該報(bào)道基因載體中。然而，這種方法的可行性依賴于該調(diào)節(jié)片段中合適限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的可用性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，運(yùn)用具有合適的限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR；Saiki等，1988，Science239487)擴(kuò)增所需要的啟動(dòng)子片段。在鄰接待擴(kuò)增調(diào)節(jié)片段的正向引物和反向引物的5’末端，包括限制性切割所必需的序列。在PCR擴(kuò)增后，通過(guò)限制性消化該P(yáng)CR產(chǎn)物而產(chǎn)生合適的末端。然后，按照標(biāo)準(zhǔn)的克隆步驟(Sambrook等，1989，參見上文)，將由任一種方法產(chǎn)生的啟動(dòng)子片段連接到所述報(bào)道基因載體的多克隆位點(diǎn)。有人建議在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之前，應(yīng)該驗(yàn)證構(gòu)成物中PCR產(chǎn)生的啟動(dòng)子片段的DNA序列。所產(chǎn)生的報(bào)道基因構(gòu)成物將包含位于該報(bào)道基因可讀框上游的推定的啟動(dòng)子片段，所述報(bào)道基因例如GFP或熒光素酶的cDNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用下面的方案。用合適的限制性內(nèi)切核酸酶消化50-100pg的所述報(bào)道基因構(gòu)成物，以釋放出轉(zhuǎn)基因片段。用一塊含有0.5μg/ml溴化乙錠的1％(w/v)的瓊脂糖凝膠及TAE緩沖液(1x0.04MTris-乙酸鹽，0.001MEDTA，pH8.0)，以5-6V/cm來(lái)電泳分離該限制性內(nèi)切核酸酶切割的產(chǎn)物。用一臺(tái)紫外線透射儀，根據(jù)大小來(lái)確定該轉(zhuǎn)基因帶；最好用長(zhǎng)波紫外燈，以減少在DNA上形成缺口；且仔細(xì)地切下含有所需帶的凝膠切片。將該凝膠切片和1ml0.5xTAE緩沖液加到一個(gè)已于pH8.0的1mMEDTA中煮沸達(dá)10分鐘(Sambrook等，1989，參見上文)的透析袋中，并夾緊透析袋的末端。將包含該凝膠切片的透析袋浸入一個(gè)裝有0.5xTAE緩沖液的水平凝膠電泳盒中，并以5-6V/cm將其電泳達(dá)45分鐘。在停止該電泳之前，使所述電泳盒中的電流反轉(zhuǎn)達(dá)1分鐘，以釋放可能附著于該透析管之管壁上的DNA。用一個(gè)新的微量離心管收集含有從該透析袋電洗脫出的DNA的TAE緩沖液?？梢栽谒鲎贤饩€透射儀上觀測(cè)該凝膠切片，以確定該DNA的電洗脫是完全的?？客ㄟ^(guò)ElutipD柱來(lái)進(jìn)一步純化經(jīng)電洗脫的DNA樣品。用1-2ml高鹽緩沖液(1.0MNaCl，20mMTris.Cl，1.0mMEDTA，pH7.5)來(lái)預(yù)洗滌該柱的填充物質(zhì)，繼之以用5ml低鹽緩沖液(0.2MNaCl，20mMTris.Cl，1.0mMEDTA，pH7.5)洗滌一次。用一支5ml注射器，將溶液加到該ElutipD柱上，避免反流。緩慢加載含有經(jīng)電洗脫的DNA的溶液。用2-3ml的低鹽緩沖液洗滌該柱，并用0.4ml高鹽緩沖液洗脫所述的DNA。添加2倍體積的95％的冷乙醇，以沉淀DNA。用一臺(tái)微量離心機(jī)，以14,000xg離心10分鐘，來(lái)收集該DNA。小心地除去乙醇、不要擾動(dòng)DNA沉淀。用70％(v/v)的乙醇洗滌該沉淀至少兩次，并將其干燥。所述的洗滌步驟與干燥步驟是重要的，因?yàn)闅堄嗟柠}和乙醇對(duì)發(fā)育中的胚胎是致命的。將該DNA重新懸浮于注射緩沖液(用Milli-Q優(yōu)質(zhì)水制備的10mMTM，0.1mMEDTA，pH7.5)中。通過(guò)用一臺(tái)分光光度計(jì)測(cè)量在A260(對(duì)50μg/ml的DNA，A260＝1)下的光密度，來(lái)確定純化的轉(zhuǎn)基因DNA片段的濃度。用這種方法制備的DNA適合于顯微注射到小鼠的受精卵中。5.2.3用轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤特異性啟動(dòng)子的分析尤其可使用MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)來(lái)指導(dǎo)報(bào)道分子編碼序列、同源基因或異源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)?？梢杂萌魏挝锓N的動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述動(dòng)物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬(micro-pigs)、山羊、綿羊、以及非人類的靈長(zhǎng)目動(dòng)物例如狒狒、猴和黑猩猩。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因的”是指表達(dá)來(lái)自不同物種的MN-CA9基因序列的動(dòng)物(例如表達(dá)MN-CA9序列的小鼠)以及已基因工程化從而過(guò)量表達(dá)內(nèi)源(即同一物種)MN-CA9序列的動(dòng)物或已基因工程化而敲除特定序列的動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在所有細(xì)胞中攜帶一種在所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)或其轉(zhuǎn)錄活性片段控制下的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因例如一種報(bào)道基因、治療劑和/或毒劑編碼序列；而且提供在某些細(xì)胞中而不是所有細(xì)胞中攜帶該轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，即鑲嵌動(dòng)物。所述的轉(zhuǎn)基因可以以單個(gè)轉(zhuǎn)基因的形式，或者可以以多聯(lián)體的形式例如頭-頭串聯(lián)體或頭尾串聯(lián)體整合。例如按照Lasko等所述方法(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896232-6236)，也可以選擇性地將所述轉(zhuǎn)基因引入到一種特定的細(xì)胞類型中，并在該特定細(xì)胞類型中使其活化。如果希望該轉(zhuǎn)基因被整合到相應(yīng)內(nèi)源基因的染色體位點(diǎn)中，則優(yōu)選基因?qū)ぐ?。?jiǎn)單地說(shuō)，如果準(zhǔn)備使用一種這樣的技術(shù)，則設(shè)計(jì)包含與所述內(nèi)源基因同源的某些核苷酸序列的載體，以便通過(guò)和染色體序列的同源重組而整合到所述內(nèi)源基因的核苷酸序列中，且破壞該內(nèi)源基因之核苷酸序列的功能?？梢杂帽绢I(lǐng)域中已知的任何技術(shù)，將在MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)控制下的轉(zhuǎn)基因引入到動(dòng)物中，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的建立者系。這樣的技術(shù)包括但不限于前核顯微注射(Hoppe和Wagner，1989，第4,873,191號(hào)美國(guó)專利)；將來(lái)自被誘導(dǎo)至靜息的培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞或成體細(xì)胞之核，核轉(zhuǎn)移到去核卵母細(xì)胞中(Campbell等，1996，Nature38064-66；Wilmut等，Nature385810-813)；將反轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移到種系中(VanderPutten等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826148-6152)；胚胎干細(xì)胞中的基因?qū)ぐ?Thompson等，1989，Cell65313-321)；胚胎的電穿孔(Lo，1983，Mol.Cell.Biol.311803-1814)；以及精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，1989，Cell57717-723；參見Gordon，1989，TransgenicAnimals，Intl.Rev.Cytol.115171-229)。例如，為了顯微注射受精卵，則從所述報(bào)道基因構(gòu)成物中切割出一段包含該調(diào)節(jié)區(qū)、報(bào)道基因以及聚腺苷酸化信號(hào)的線性DNA片段(轉(zhuǎn)基因)。用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法，可通過(guò)凝膠而純化所述的轉(zhuǎn)基因；例如用電洗脫的方法。在凝膠片段的電洗脫之后，靠通過(guò)ElutipD柱(Schleicher&Schuell，Dassel，德國(guó))而進(jìn)一步除去微量的任何雜質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Hogan，1986，ManipulatingtheMouseEmbryo，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)，將純化的轉(zhuǎn)基因片段顯微注射到得自B6CBA雌鼠的受精卵的雄性前核中。在幾個(gè)胚胎階段，短暫地分析小鼠；或者，通過(guò)建立允許更詳細(xì)分析整個(gè)發(fā)育過(guò)程中以及成年動(dòng)物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的建立者系，來(lái)短暫地研究小鼠。按照Vemet等的方法(MethodsEnzymol.1993；225434-451)，用純化自胎盤(瞬時(shí))或尾剪取部分(建立者)的基因組DNA，通過(guò)PCR，來(lái)分析轉(zhuǎn)基因的存在。最好在包含1X反應(yīng)緩沖液中的1μg基因組DNA的100μl體積中，進(jìn)行所述的PCR反應(yīng)，所述1X反應(yīng)緩沖液中還補(bǔ)充有0.2mMdNTPs、2mMMgCl2、各600μM的引物以及2.5單位的Taq聚合酶(Promega，Madison，WI)。30次PCR循環(huán)中的每次包括在94℃變性1分鐘、在54℃退火1分鐘以及在72℃延伸1分鐘。然后，使建立者小鼠與C57B1配偶交配，從而產(chǎn)生小鼠的轉(zhuǎn)基因F1系。5.3篩選測(cè)定干擾腫瘤發(fā)生和/或癌癥發(fā)展的化合物，可在不同癌癥中提供靶向缺陷的治療?？捎眠@樣的化合物來(lái)干擾各種各樣癌癥的開始或發(fā)展。也可以用激發(fā)或抑制啟動(dòng)子活性的化合物來(lái)改善癌癥的癥狀?？梢詫⒑信c報(bào)道基因可操作地連接的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)或其片段的基因工程化的細(xì)胞、細(xì)胞系、癌細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，用作篩選調(diào)節(jié)MN-CA9轉(zhuǎn)錄活性之藥物的系統(tǒng)。另外，包含MN-CA9的轉(zhuǎn)基因小鼠可提供在體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以研究出通過(guò)使藥物定向而引起疾病發(fā)展的停滯、來(lái)治療包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌的各種各樣癌癥的新方法。本發(fā)明包括設(shè)計(jì)用以鑒定調(diào)節(jié)所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)活性之化合物的篩選測(cè)定。本發(fā)明不僅包括體外和基于細(xì)胞的分析，而且包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的體內(nèi)分析。正如在下文描述的，待測(cè)試的化合物可包括但不限于寡核苷酸、肽、蛋白、小的有機(jī)化合物或無(wú)機(jī)化合物、抗體等等?；衔锏膶?shí)例可包括但不限于肽，例如可溶性肽，包括但不限于Ig尾融合蛋白和隨機(jī)肽文庫(kù)的成員；(參見例如，Lam等，1991，Nature35482-84；Houghten等，1991，Nature35484-86)；以及由D-構(gòu)型和/或L-構(gòu)型氨基酸構(gòu)成的組合化學(xué)衍生分子文庫(kù)；磷酸肽(包括但不限于隨機(jī)或部分簡(jiǎn)并的定向磷酸肽文庫(kù)的成員；參見例如Songyang等，1993，Cell72767-778)；抗體(包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗獨(dú)特型抗體、嵌合抗體或單鏈抗體，以及FAb、F(ab’)2和FAb表達(dá)文庫(kù)的片段，以及其結(jié)合表位的片段)及小的有機(jī)分子或無(wú)機(jī)分子。這樣的化合物還可包括已知改善不同癌癥癥狀的化合物，尤其是藥物或者藥類或藥系列的成員。這樣的化合包括但不限于抗抑郁藥系列，例如鋰鹽、卡馬西平、丙戊酸、麥角酰二乙胺(LSD)、對(duì)氯苯丙氨酸、例如FLA63的對(duì)丙基多巴乙酰胺二硫代氨基甲酸鹽(p-propyldopacetamidedithiocarbamate)衍生物；抗焦慮藥，例如地西泮；單胺氧化酶(MAO)的抑制劑，例如異丙煙肼、氯吉蘭、苯乙肼和異卡波肼；生物必需胺攝取阻滯劑，例如像地昔帕明、米帕明和阿米替林之類的三環(huán)抗抑郁藥；5-羥色胺重?cái)z取的抑制劑，例如氟西??；抗精神病藥，例如酚噻嗪衍生物(例如氯丙嗪(鹽酸氯丙嗪)和三氟丙嗪)、丁酰苯(例如氟哌啶醇(Haldol))、噻噸衍生物(例如氯丙硫蒽)以及二苯并二氮類(例如氯氮平)；苯并二氮類；多巴胺能激動(dòng)劑和拮抗劑，例如L-DOPA、可卡因、苯丙胺、α-甲基酪氨酸、利血平、丁苯喹嗪、benzotropine、帕吉林；去甲腎上腺素能激動(dòng)劑和拮抗劑，例如可樂(lè)定、酚芐明、酚妥拉明、環(huán)庚三烯酚酮；硝基血管舒張藥(例如硝酸甘油、硝普鹽以及NO合酶)；以及生長(zhǎng)因子(例如VEGF、FGF、血管形成素(angiopoetins)和endostatin)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以用含有與異源基因可操作地連接的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的基因工程細(xì)胞、細(xì)胞系或生殖細(xì)胞和/或體細(xì)胞的原代培養(yǎng)物，來(lái)開發(fā)分析系統(tǒng)，以篩選能抑制序列特異性的DNA-蛋白相互作用的化合物。這樣的方法包括使一種化合物與表達(dá)在MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)或其活性轉(zhuǎn)錄片段控制下的基因的細(xì)胞接觸，測(cè)定該基因表達(dá)水平或基因產(chǎn)物活性水平，并將一水平與在沒(méi)有該化合物的情況下所述細(xì)胞產(chǎn)生的基因表達(dá)水平或基因產(chǎn)物活性水平相比較，因此如果在存在該化合物的情況下得到的所述水平不同于沒(méi)有該化合物的情況下獲得的水平，則鑒定出了能夠調(diào)節(jié)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的表達(dá)的化合物?；虮磉_(dá)水平的改變可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法來(lái)測(cè)定，例如通過(guò)測(cè)定報(bào)道基因的活性，分析細(xì)胞裂解物中的mRNA轉(zhuǎn)錄物，例如通過(guò)用RNA印跡分析或其它本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法，來(lái)分析由所述細(xì)胞表達(dá)的基因產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用顯微解剖和透照。這些技術(shù)提供一種用于在包含MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因之轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中監(jiān)測(cè)所推定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用的一種快速測(cè)定。在這個(gè)實(shí)施方案中，用各種各樣方法中的任一種，將一種試驗(yàn)藥物傳遞給轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。引入一種試驗(yàn)藥物的方法可包括口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)給藥以及通過(guò)劃破(劃穿皮膚上層而，例如用一種叉狀針)或其它任一的標(biāo)準(zhǔn)給藥途徑。通過(guò)顯微解剖和透照所述的腫瘤細(xì)胞，可分析這樣的試驗(yàn)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。如果在存在所述化合物的情況下，所觀測(cè)或測(cè)定的報(bào)道基因的表達(dá)水平不同于當(dāng)該化合物不存在時(shí)所得到的水平，則鑒定出了能夠調(diào)節(jié)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)之表達(dá)的化合物。在本發(fā)明不同的實(shí)施方案中，可以用于篩選腫瘤相關(guān)疾病之調(diào)節(jié)物的化合物包括可能具有結(jié)合MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)能力并因此可能是藥物的候選物的天然存在和/或合成的(例如小分子文庫(kù)或肽文庫(kù))肽、小分子；細(xì)胞結(jié)合分子或者可溶分子、有機(jī)分子、非蛋白分子以及重組分子。另一方面，所述蛋白和化合物包括在體內(nèi)與MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)序列相互作用的細(xì)胞內(nèi)源組分。可以在細(xì)胞裂解物或組織勻漿中篩選與MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)或其片段結(jié)合的蛋白或其它化合物。這樣的內(nèi)源組分可為藥物干預(yù)和治療干預(yù)提供新的靶。在一個(gè)實(shí)施方案中，可篩選文庫(kù)?？梢杂帽?br>技術(shù)領(lǐng)域：
已知的許多文庫(kù)，例如肽文庫(kù)、化學(xué)合成文庫(kù)、重組體文庫(kù)(例如噬菌體展示文庫(kù))、以及基于體外翻譯的文庫(kù)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以用肽文庫(kù)來(lái)篩選與MN-CA9連接的報(bào)道基因表達(dá)的激動(dòng)劑或拮抗劑?？梢杂枚鄻有缘奈膸?kù)例如隨機(jī)或組合肽文庫(kù)或非肽文庫(kù)，來(lái)篩選特異性地調(diào)節(jié)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)活性的分子?？墒褂眠B接到一種固相支持物上的、包括所有可能之氨基酸組合的隨機(jī)肽文庫(kù)，來(lái)鑒別能夠激活或抑制調(diào)節(jié)區(qū)之活性的肽(Lam，K.S.等，1991，Nature35482-84)。篩選肽文庫(kù)在發(fā)現(xiàn)通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)相互作用而激發(fā)或抑制MN-CA9之表達(dá)的藥物方面，可能具有治療價(jià)值。在下述文獻(xiàn)中，描述了化學(xué)合成文庫(kù)的實(shí)例Fodor等，1991，Science251767-773；Houghten等，1991，Nature35484-86；Lam等，1991，Nature35482-84；Medynski，1994，BioTechnology12709-710；Gallop等，1994，J.MedicinalChemistry37(9)1233-1251；Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010922-10926；Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111422-11426；Houghten等，1992，Biotechniques13412；Jayawickreme等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA911614-1618；Salmon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011708-11712；PCT公布號(hào)WO93/20242；以及Brenner和Lerner，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895381-5383。在下述文獻(xiàn)中，描述了噬菌體展示文庫(kù)的實(shí)例Scott和Smith，1990，Science249386-390；Devlin等，1990，Science249404-406；Christian等，J.Mol.Biol.227711-718；Lenstra，1992，J.Immunol.Meth.152149-157；Kay等，1993，Gene12859-65；以及于1994年8月18日公布的PCT公布號(hào)WO94/18318。作為非肽文庫(kù)的實(shí)例，一種苯并二氮雜文庫(kù)(參見例如Bunin等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA914708-4712)適合于使用。也可以使用類肽(peptiod)文庫(kù)(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA899367-9371)。Ostresh等描述了另一個(gè)可使用的文庫(kù)的實(shí)例(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111138-11142)，在所述文庫(kù)中，全甲基化了肽中的酰胺官能團(tuán)，從而產(chǎn)生一種化學(xué)轉(zhuǎn)變組合文庫(kù)(chemicallytransformedcombinatoriallibrary)。在下面，描述了一種這樣的體外篩選測(cè)定的具體實(shí)施方案。運(yùn)用所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)-報(bào)道基因載體來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，由所述轉(zhuǎn)基因小鼠建立MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)-報(bào)道基因載體生殖細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。用適合于所述細(xì)胞系的培養(yǎng)基，在96孔板上，每孔接種總體積100μl中的大約10000個(gè)細(xì)胞。將MN-CA9基因表達(dá)的候選抑制劑添加到所述細(xì)胞上。通過(guò)測(cè)定由MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因的反應(yīng)，可確定MN-CA9基因活化之抑制劑的效應(yīng)。這種測(cè)定能夠容易地以高通量篩選方式建立，以供在96孔板中評(píng)價(jià)降低(或增加)報(bào)道基因活性、但無(wú)細(xì)胞毒性的化合物文庫(kù)。在溫育6小時(shí)后，向所述細(xì)胞添加100μl的DMEM培養(yǎng)基+2.5％胎牛血清(FBS)至1.25％的血清終濃度；將其溫育達(dá)總計(jì)24小時(shí)(另加18小時(shí))。在24小時(shí)之時(shí)，用PBS洗滌所述板，且將其吸干并于-80℃冷凍。第二天，融化所述板，并分析所述板上報(bào)道基因活性的存在。在一個(gè)體內(nèi)篩選測(cè)定的優(yōu)選實(shí)施例中，可以將來(lái)源于轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤細(xì)胞移殖到具有正常表型或其它所需表型的小鼠中(Brinster等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111298-302；Ogawa等，1997，Int.J.Dev.Biol.41111-12)。然后，可將這樣的小鼠用來(lái)試驗(yàn)所述化合物和其它各種因子對(duì)腫瘤相關(guān)疾病的效應(yīng)。除了上面列舉的化合物和因子外，可以用這樣的小鼠來(lái)分析用其它方法可能難以研究的因素或條件；例如飲食效應(yīng)、內(nèi)部pH、溫度等等。一旦鑒別出了抑制或增強(qiáng)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)活性的化合物，就可以在一項(xiàng)基于動(dòng)物的測(cè)定中測(cè)試，以確定該化合物是否顯示出作為改善包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌的各種各樣癌癥癥狀之藥物的能力。首先可根據(jù)小規(guī)模(即在試管中)測(cè)定來(lái)優(yōu)化本發(fā)明的測(cè)定，然后將其按比例擴(kuò)大到高通量測(cè)定。運(yùn)用純化的組分或細(xì)胞裂解物，可以在體外即在試管中進(jìn)行本發(fā)明的篩選測(cè)定。也可以用培養(yǎng)物中完整的細(xì)胞以及用動(dòng)物模型進(jìn)行本發(fā)明的篩選測(cè)定。按照本發(fā)明，將用培養(yǎng)的細(xì)胞以及動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)一步體內(nèi)分析在體外顯示出調(diào)節(jié)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)活性的、如同本文所描述的試驗(yàn)化合物，以確定是否該試驗(yàn)化合物在體內(nèi)具有類似的作用，且確定所述試驗(yàn)化合物對(duì)各種各樣癌癥的效應(yīng)。5.4用于MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)核苷酸的治療應(yīng)用的組合物和方法可以用MN-CA9多核苷酸或其轉(zhuǎn)錄活性片段，來(lái)治療可以通過(guò)以腫瘤特異性方式改變MN-CA9或與MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)連接之異源基因的水平或表達(dá)得以改善的疾病、病癥或紊亂。本文描述了用于這種治療性治療的方法。在基因治療方案中，可使用所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)來(lái)達(dá)到組織特異性表達(dá)。在這樣的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞的情況下，可以以特異性靶向包含MN-CA9表達(dá)所需反式作用因子之腫瘤細(xì)胞的癌基因治療形式，應(yīng)用MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)對(duì)細(xì)胞毒性產(chǎn)物的誘導(dǎo)。這樣，所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)可作為一種針對(duì)各種各樣表達(dá)MN-CA9蛋白之癌的基因治療方法的給藥途徑。這些癌癥的實(shí)例包括但不限于腎細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌以及宮頸癌。另外，運(yùn)用目前描述的表達(dá)構(gòu)成物，可以將反義核酸、反基因(antigene)適體(Aptameric)寡核苷酸傳遞到細(xì)胞中。也可以在細(xì)胞中表達(dá)核酶或單鏈RNA，從而抑制一種所關(guān)注靶基因的表達(dá)。這些反義核酸或核酶分子的靶基因應(yīng)該是編碼細(xì)胞維持所必需的基因產(chǎn)物的那些基因。為了各種各樣的目的，例如，為了減量調(diào)節(jié)MN-CA9基因表達(dá)，或者，另一方面，為了實(shí)現(xiàn)異源基因的腫瘤特異性、階段特異性表達(dá)；可使用本發(fā)明的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)及其轉(zhuǎn)錄活性片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，可以靶向內(nèi)源MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)，以特異性減量調(diào)節(jié)MN-CA9基因的表達(dá)。例如，可以設(shè)計(jì)互補(bǔ)于所述調(diào)節(jié)區(qū)的寡核苷酸，并將其傳遞到細(xì)胞中。這樣的寡核苷酸可以退火到該調(diào)節(jié)序列上而阻止轉(zhuǎn)錄激活。另一方面，可以將該調(diào)節(jié)序列或其部分以飽和濃度傳遞到細(xì)胞中，從而競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。關(guān)于基因治療方法的一般綜述，參見Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy12488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science260926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；May，1993，TIBTECH11155-215。在Ausubel等(編輯)CurrentProtocolsinMolecularBiology1993，JohnWiley&Sons，NY中以及在Kriegler，1990，GeneTransferandExpression(ALaboratoryManual，StocktonPress，NY中，描述了本領(lǐng)域通常已知的可使用的重組DNA技術(shù)的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于改善各種各樣癌癥的基因治療方法。使用MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)序列來(lái)驅(qū)動(dòng)藥物或毒素的腫瘤特異性表達(dá)，并將所述序列引入到腫瘤中。該方法包括將與一種藥物或毒素基因可操作相連的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)序列引入到腫瘤中。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于治療癌癥或其它增生性疾病的基因治療方法。用MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)來(lái)指導(dǎo)一種或更多種蛋白特異性地在患者腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。這樣的蛋白例如可以是腫瘤抑制基因、胸苷激酶(與無(wú)環(huán)鳥苷聯(lián)用)、參與細(xì)胞殺傷的毒素或蛋白例如參與細(xì)胞程序死亡途徑的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種可用于毒性基因治療的、包含MN-CA9啟動(dòng)子的治療藥。這種方法包括一種真核傳遞載體和一種毒性基因。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該載體為腺病毒(Ad)，且該基因?yàn)樾剀占っ?TK)。因此，該治療物用式Ad-MN-CA9-TK表示，但實(shí)際上，在本文中包含的所述新概念是作為異源編碼序列的癌特異性表達(dá)的驅(qū)動(dòng)力的MN-CA9啟動(dòng)子?？梢詫⒕幋a所關(guān)注的翻譯或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的DNA，基因重組到確保大規(guī)模復(fù)制所述DNA以供制備本發(fā)明載體的各種各樣的載體系統(tǒng)中。可設(shè)計(jì)這些載體，使其包含對(duì)于指導(dǎo)由癌細(xì)胞吸收的DNA序列轉(zhuǎn)錄和/或翻譯必需的元件?？墒褂玫妮d體包括但不限于衍生于重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA的那些載體。例如，可使用諸如pBR322、pUC19/18、pUC118、119以及M13mp系列載體之類的質(zhì)粒載體。噬菌體載體可包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R以及EMBL系列的噬菌體載體?？墒褂玫恼沉］d體包括但不限于pJB8、pCV103、pCV107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16以及卡隆粒9系列的載體。也可以使用便于RNA體外轉(zhuǎn)錄的載體，例如SP6載體，以產(chǎn)生大量的、可被插入到病毒載體中的RNA。另一方面，可以將有復(fù)制能力或無(wú)復(fù)制能力的重組病毒載體工程化，所述病毒載體包括但不限于衍生于病毒例如皰疹病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺伴隨病毒或牛乳頭瘤病毒的那些載體。雖然可使用整合型載體；但對(duì)于非疾病相關(guān)修復(fù)和再生而言，優(yōu)選不遺傳所述基因產(chǎn)物到子細(xì)胞達(dá)許多代的非整合型系統(tǒng)。這樣，該基因產(chǎn)物在修復(fù)過(guò)程期間表達(dá)，而在后代中因?yàn)樵摶虮幌♂?，因而表達(dá)的基因產(chǎn)物量減少。當(dāng)病毒介導(dǎo)的基因傳遞導(dǎo)致正常細(xì)胞被感染時(shí)，驅(qū)動(dòng)治療基因表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用會(huì)另外減弱治療基因?qū)︵徑＜?xì)胞的毒性作用。這會(huì)是特別重要的，在此或許能利用系統(tǒng)給藥而傳遞一種治療載體遍及全身、卻將轉(zhuǎn)基因的表達(dá)維持在有限及特定數(shù)目的細(xì)胞類型。此外，由于例如TGF-β的許多骨生長(zhǎng)因子具有多效性作用，因而如果在所有細(xì)胞中表達(dá)該生長(zhǎng)因子，則可能會(huì)顯示出許多有害的副作用。在某些情況下，所述啟動(dòng)子元件可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；且可以在合適的條件下使用它們，以指導(dǎo)所關(guān)注基因的高水平表達(dá)或可調(diào)型表達(dá)。組成型啟動(dòng)子控制下的基因表達(dá)則不需要存在特定的底物來(lái)誘導(dǎo)基因表達(dá)，且基因表達(dá)將發(fā)生于細(xì)胞生長(zhǎng)的所有條件下。比較起來(lái)，由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的基因表達(dá)則對(duì)誘導(dǎo)劑的存在或不存在有反應(yīng)。例如，如果用一種誘導(dǎo)型的治療性轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染細(xì)胞，則在該個(gè)體的生存期內(nèi)有可能控制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。對(duì)于所插入的蛋白編碼序列的充分翻譯，同樣需要特定的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括起始密碼子ATG以及鄰近的序列。在將包含起始密碼子及鄰近序列的整個(gè)編碼序列插入到合適的表達(dá)載體中的情況下，可以不需要另外的翻譯控制信號(hào)。但是，在僅插入編碼序列的一部分的情況下，則必須提供包括起始密碼子ATG的外源性翻譯控制信號(hào)。此外，該起始密碼子必須符合所述蛋白編碼序列的可讀框，從而確保整個(gè)插入片段的翻譯。這些外源性翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可具有各種各樣的起源；所述起源既包括天然的起源，又包括合成的起源。通過(guò)包含轉(zhuǎn)錄衰減序列、增強(qiáng)子元件等等，可提高表達(dá)的效率及增強(qiáng)對(duì)表達(dá)的控制。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于治療癌癥和其它增生性疾病的方法，所述方法包括傳遞一種治療劑到腫瘤中。所述治療劑包括一種含有MN-CA9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的毒性胸苷激酶(Tk)的重組腺病毒載體(Ad)。本發(fā)明另外的一個(gè)方面，提供一種借助于添加合適的前體藥物來(lái)調(diào)節(jié)Tk表達(dá)的方法；所述前體藥物包括但不限于無(wú)環(huán)鳥苷(AcV)。在存在一種合適的前體藥物的情況下，可以將含所述MN-CA9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的毒性基因治療的治療劑給予癌；所述癌包括但不限于宮頸癌、腎細(xì)胞癌以及胃癌和結(jié)腸癌。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)可編碼各種各樣的、具有免疫調(diào)節(jié)功能的基因和/或其它基因；所述具有免疫調(diào)節(jié)功能的基因例如編碼細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素，包括白細(xì)胞介素1至15在內(nèi)，尤其是例如IL2、IL12；γ-干擾素；腫瘤壞死因子；GMCSF；所述其它基因例如為在WO88/00971(CSIRO，AustralianNationalUniversityRamshaw等)和WO94/16716(VirogeneticsCorp；Paoletti等)的說(shuō)明書中所提到的那些基因。本發(fā)明的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)也可編碼下面的基因干擾素α、干擾素β或干擾素γ的基因；腫瘤壞死因子的基因；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的基因、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的基因、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(N-CSF)的基因，例如嗜中性白細(xì)胞激活蛋白NAP、巨噬細(xì)胞趨化及激活因子MCAF、RANTES、巨噬細(xì)胞炎性肽MIP-1a與MIP-1b的趨化因子的基因、補(bǔ)體組分及其受體的基因，例如87.1、87.2、ICAM-1.2或3的輔助分子的基因，或者細(xì)胞因子受體的基因。在插入編碼不止一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列的情況下，它們可包括不止一種細(xì)胞因子，或者可以是細(xì)胞因子與輔助分子的組合。5.4.1反義核酸調(diào)節(jié)法、核酶調(diào)節(jié)法以及三股螺旋調(diào)節(jié)法在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用眾所周知反義核酸法、基因“敲除”法、核酶法和/或三股螺旋法來(lái)降低MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的表達(dá)水平，從而降低MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)活性的水平，可改善與腫瘤細(xì)胞有關(guān)的病癥、紊亂或疾病的癥狀。在可能顯示出調(diào)節(jié)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的活性、表達(dá)或合成之能力、包括改善不同癌癥及相關(guān)疾病的癥狀之能力的化合物中，有反義分子、核酶分子和三股螺旋分子。可以設(shè)計(jì)這樣的分子，來(lái)減少或抑制未受損的或變異的(如果合適)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的活性。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，生產(chǎn)和使用這樣分子的技術(shù)是眾所周知的。反義RNA和DNA分子通過(guò)雜交到靶mRNA上并且阻止蛋白質(zhì)翻譯而直接阻斷mRNA翻譯。反義方法牽涉到設(shè)計(jì)與靶基因之mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸。所述反義寡核苷酸將結(jié)合到互補(bǔ)的靶基因之mRNA轉(zhuǎn)錄物上，從而阻止翻譯。雖然優(yōu)選完全的互補(bǔ)，但并不需要完全互補(bǔ)。正如在本文中提到的，一種“互補(bǔ)”于RNA一部分的序列意指具有足夠的互補(bǔ)性而能夠與該RNA雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的序列；因此，在雙鏈反義核酸的情況下，可測(cè)試雙鏈體DNA的一條鏈，或可以分析三鏈體形成。雜交的能力將既取決于互補(bǔ)的程度，又取決于反義核酸的長(zhǎng)度。通常，雜交核酸越長(zhǎng)，它可容納的與一種RNA的堿基錯(cuò)配則越多，且仍可形成穩(wěn)定的雙鏈體(或三鏈體，視情況而定)。通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)方法確定雜交復(fù)合體的解鏈溫度，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定容許錯(cuò)配的程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠在一種反義方法中運(yùn)用互補(bǔ)于所關(guān)注基因之非編碼區(qū)的寡核苷酸，來(lái)抑制內(nèi)源mRNA的翻譯。反義核酸應(yīng)該至少長(zhǎng)六個(gè)核苷酸，最好是長(zhǎng)度范圍從6至約50個(gè)核苷酸的寡核苷酸。在具體的方面，所述寡核苷酸為至少10個(gè)核苷酸、至少17個(gè)核苷酸、至少25個(gè)核苷酸或至少50個(gè)核苷酸。無(wú)論選擇何種靶序列，優(yōu)選首先進(jìn)行體外研究，以定量測(cè)定反義寡核苷酸抑制靶基因表達(dá)的能力。優(yōu)選這些研究使用鑒別寡核苷酸的基因反義抑制和非特異性生物學(xué)效應(yīng)的對(duì)照。同樣優(yōu)選的是，這些研究將靶RNA或蛋白的水平與內(nèi)部對(duì)照RNA或蛋白的水平相比較。另外，設(shè)想將用反義寡核苷酸獲得的結(jié)果與用對(duì)照寡核苷酸獲得的結(jié)果相比較。優(yōu)選的是對(duì)照寡核苷酸與所述試驗(yàn)寡核苷酸具有大致相同的長(zhǎng)度，且對(duì)照寡核苷酸的核苷酸序列與反義序列的差異僅僅是防止特異性地雜交到所述靶序列上所必需的差異。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或其衍生物或其修飾形式，可以是單鏈或者雙鏈?？梢栽趬A基部分、糖部分或磷酸主鏈上修飾所述的寡核苷酸，從而例如改善所述分子的穩(wěn)定性、雜交等等。該寡核苷酸可包括其它的附加基團(tuán)，例如肽(例如，用于在體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞受體)，或有助于穿過(guò)細(xì)胞膜(參見例如，Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A866553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A84648-652；1988年12月15日公開的WO88/09810號(hào)PCT公開說(shuō)明書)或者穿越血腦屏障(參見例如1988年4月25日公開的WO89/10134號(hào)PCT公開說(shuō)明書)轉(zhuǎn)運(yùn)的因子，或雜交觸發(fā)切割因子(參見例如，Krol等，1988，BioTechniques6958-976)，或嵌入劑(參見例如，Zon等，1988，Pharm.Res.5539-549)。為此，可以將寡核苷酸綴合到另一種分子上，所述另一種分子例如肽、雜交觸發(fā)交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)因子、雜交觸發(fā)切割劑等等。所述反義寡核苷酸可包括至少一個(gè)經(jīng)修飾的堿基部分，所述堿基部分選自5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、以及2，6-二氨基嘌呤。所述反義寡核苷酸也可以包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾的糖部分包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸包括至少一種經(jīng)修飾的、選自以下的磷酸主鏈硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯、以及formacetal或其類似物。再又一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸為一種α-端基異構(gòu)寡核苷酸。α-端基異構(gòu)寡核苷酸與互補(bǔ)的RNA形成特殊的雙鏈雜合體，在所述雙鏈雜合體中，與通常的β-單位相反，鏈相互平行地伸展(Gautier等，1987，Nucl.AcidsRes.156625-6641)。該寡核苷酸是一種2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucl.AcidsRes.156131-6148)，或是一種嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等，1987，F(xiàn)EBSLett.215327-330)。可以用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過(guò)用一臺(tái)DNA自動(dòng)合成儀(例如市售的，來(lái)自Biosearch、AppliedBiosystems)，來(lái)合成本發(fā)明的寡核苷酸。作為實(shí)例，可以用Stein等的方法(1988，Nucl.AcidsRes.163209)，來(lái)合成硫代磷酸寡核苷酸；通過(guò)用可控孔隙的玻璃聚合體支持物，可制備甲基膦酸寡核苷酸(Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A857448-7451)；等等。雖然能夠用互補(bǔ)于靶基因編碼區(qū)序列的反義核苷酸，但最優(yōu)選互補(bǔ)于轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)的那些反義核苷酸。應(yīng)該將反義分子傳遞到體內(nèi)表達(dá)所述靶基因的細(xì)胞之中。已發(fā)展了許多用于傳遞反義DNA或RNA至細(xì)胞的方法，例如，可以將反義分子直接注射到組織部位里，或者，可系統(tǒng)地給予設(shè)計(jì)用于靶向所需細(xì)胞的經(jīng)修飾的反義分子(例如，與特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面上表達(dá)的受體或抗原之肽或抗體相連接的反義分子)。一種達(dá)到足以抑制內(nèi)源mRNA翻譯的反義分子胞內(nèi)濃度的優(yōu)選方法利用一種重組DNA構(gòu)成物；在所述構(gòu)成物中，反義寡核苷酸被置于強(qiáng)啟動(dòng)子polIII或polII的控制之下。用這樣的構(gòu)成物來(lái)轉(zhuǎn)染患者體內(nèi)的靶細(xì)胞，將導(dǎo)致足夠量的、將與內(nèi)源靶基因轉(zhuǎn)錄物形成互補(bǔ)堿基對(duì)因此阻止靶基因之mRNA翻譯的單鏈RNA的轉(zhuǎn)錄。例如，可引入一種載體，以致于例如該載體被細(xì)胞吸收，并且指導(dǎo)反義RNA的轉(zhuǎn)錄。只要這樣的載體能被轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生所需的反義RNA，則它可以以附加體保持，或成為染色體整合的。用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)方法，可構(gòu)建這樣的載體。載體可以是用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒、病毒載體或本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的其它載體。用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中且最好在人細(xì)胞中起作用的任何啟動(dòng)子，可以進(jìn)行編碼反義RNA序列的表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。這樣的啟動(dòng)子包括但不限于SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Bernoist和Chambon，1981，Nature290304-310)、勞斯肉瘤病毒的包含于3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列中的啟動(dòng)子(Yamamoto等，1980，Cell22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，Nature29639-42)等等。可以用任何類型的質(zhì)粒、粘粒、YAC或病毒載體，來(lái)制備能被直接引入到所述組織部位中的重組DNA構(gòu)成物。另一方面，可以用選擇性感染所需組織的病毒載體，在這種情況下，可以由別的途徑來(lái)完成給予(例如經(jīng)靜脈內(nèi)給予、口服給予或諸如此類的系統(tǒng)給予)。也可以用設(shè)計(jì)用以催化切割靶基因之mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子，來(lái)阻止靶基因之mRNA的翻譯，且因此阻止靶基因產(chǎn)物的表達(dá)(參見例如，1990年10月4日公開的PCT國(guó)際公布說(shuō)明書WO90/11364；Sarver等，1990，Science2471222-1225)。核酶是能夠催化特異性切割RNA的酶性RNA分子。(有關(guān)綜述，參見Rossi，1994，CurrentBiology4469-471)。核酶作用的機(jī)制涉及核酶分子與互補(bǔ)靶RNA的序列特異性雜交和隨后的內(nèi)切核酸切割事件。核酶分子的組成必須包括一段或更多段互補(bǔ)于靶基因之mRNA的序列，且必須包括眾所周知的負(fù)責(zé)切割mRNA的催化序列。對(duì)于這一序列，參見例如5,093,246號(hào)美國(guó)專利；通過(guò)引用，將其全部結(jié)合到本文中。雖然可以用在特異性識(shí)別位點(diǎn)切割mRNA序列的核酶，來(lái)破壞靶基因的mRNA；但優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶在與靶mRNA形成互補(bǔ)堿基對(duì)的側(cè)翼區(qū)所限定的位置上切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有下面的兩個(gè)堿基的序列5’-UG-3’。錘頭狀核酶的結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生是本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的，且在下述文獻(xiàn)中有更全面的描述Myers，1995，MolecularBiologyandBiotechnologyAComprehensiveDeskReference，VCHPublishers，NewYork，(尤其參見第833頁(yè)的圖4)，以及Haseloff和Gerlash，1998，Nature，334585-591；通過(guò)引用，將所述文獻(xiàn)全部結(jié)合到本文中。最好將核酶工程化，以便使切割識(shí)別位點(diǎn)位于靶基因之mRNA的5’末端附近；即提高效率且將細(xì)胞內(nèi)無(wú)功能mRNA轉(zhuǎn)錄物的積累減至最小量。本發(fā)明的核酶也包括RNA內(nèi)切核酸酶(在下文稱為“Cech型核酶”)，例如天然存在于嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)中的且已被ThomasCech及合作者多方面描述的一種RNA(稱為IVS或L-19IVSRNA)內(nèi)切核酸酶(Zaug等，1984，Science，224574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231470-475；Zaug等，1986，Nature，324429-433；已公布的UniversityPatentsInc.的WO88/04300號(hào)國(guó)際專利申請(qǐng)；Been和Cech，1986，Cell，47207-216)。Cech型核酶具有一個(gè)八個(gè)堿基對(duì)的活性位點(diǎn)，所述活性位點(diǎn)與靶RNA序列雜交，在所述雜交后發(fā)生靶RNA的切割。本發(fā)明包括那些靶向存在于靶基因中的八個(gè)堿基對(duì)活性位點(diǎn)之序列的Cech型核酶。與在反義方法中一樣，所述核酶可由經(jīng)修飾的寡核苷酸組成(例如為了改善穩(wěn)定性、尋靶等等)，且應(yīng)該將其傳遞到體內(nèi)表達(dá)靶基因的細(xì)胞之中。一種優(yōu)選的傳遞方法涉及使用一種在組成型強(qiáng)啟動(dòng)子polIII或polII控制下“編碼”核酶的DNA構(gòu)成物，以致轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將產(chǎn)生足夠量的核酶來(lái)破壞內(nèi)源靶基因信息而抑制翻譯。因?yàn)楹嗣覆煌诜戳x分子，是催化性的，所以由于其效率而需要較低的細(xì)胞內(nèi)濃度。也可以通過(guò)用定向同源重組，來(lái)使靶基因或其啟動(dòng)子失活、或“剔除”靶基因或其啟動(dòng)子，從而減少內(nèi)源靶基因的表達(dá)(例如參見Smithies等，1985，Nature317230-234；Thomas和Capecchi，1987，Cell51503-512；Thompson等，1989，Cell5313-321；通過(guò)引用，將它們中的每篇全部結(jié)合到本文中)。例如，可以用一種帶有或沒(méi)有一種選擇標(biāo)記和/或一種負(fù)選擇標(biāo)記的、鄰接與內(nèi)源靶基因(或者靶基因的編碼區(qū)、或者靶基因的調(diào)節(jié)區(qū))同源的DNA的變異型無(wú)功能靶基因(或一種完全不相關(guān)的DNA序列)，來(lái)轉(zhuǎn)染在體內(nèi)表達(dá)靶基因的細(xì)胞。通過(guò)定向同源重組插入DNA構(gòu)成物，導(dǎo)致所述靶基因失活。這樣的方法特別適合于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域；在所述農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中，修飾ES(胚胎干)細(xì)胞可以被用來(lái)產(chǎn)生具有無(wú)活性靶基因的動(dòng)物后代(例如參見Thomas和Capecchi，1987以及Thompson，1989，參見上文)。但是，如果用合適的病毒載體，來(lái)直接給予所述重組DNA構(gòu)成物，或使重組的DNA構(gòu)成物靶向體內(nèi)所要求的位點(diǎn)；則可以使這種方法適合于人類使用。另一方面，可通過(guò)把互補(bǔ)于靶基因調(diào)節(jié)區(qū)的脫氧核糖核酸序列(即靶基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)作為靶，來(lái)形成在體內(nèi)靶細(xì)胞中阻止靶基因轉(zhuǎn)錄的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)，而減少內(nèi)源靶基因的表達(dá)。(通常參見Helene，1991，AnticancerDrugDes.，6(6)569-584；Helene等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.，66027-36；以及Maher，1992，Bioassays14(12)807-815)。待用于形成三鏈螺旋以抑制轉(zhuǎn)錄的核酸分子應(yīng)該是單鏈的且應(yīng)該由脫氧核糖核酸組成。必須設(shè)計(jì)這些寡核苷酸的堿基組成，以促進(jìn)借助于堿基配對(duì)法則的三鏈螺旋的形成；這通常需要存在于雙鏈體之一條鏈上的相當(dāng)大的嘌呤或嘧啶序列段。核苷酸序列可以是基于嘧啶的序列，這將產(chǎn)生橫過(guò)所得到的三鏈螺旋之三條相聯(lián)鏈的TAT和CGC+三聯(lián)體。富含嘧啶的分子提供與雙鏈體中平行于該嘧啶鏈的一條單鏈上之富含嘌呤區(qū)的堿基互補(bǔ)性。另外，可以選擇富含嘌呤例如含有一段G殘基的核酸分子。這些分子將和富含GC對(duì)的DNA雙鏈體形成三鏈螺旋，在該三鏈螺旋中，大部分嘌呤殘基位于靶雙鏈體的一條鏈上，產(chǎn)生橫過(guò)三鏈螺旋中的三條鏈的GGC三聯(lián)體。另一方面，通過(guò)產(chǎn)生一種所謂的“之字形(switchback)”核酸分子，可增加可以作為靶以供三鏈螺旋形成的潛在序列。以一種交替的5’-3’、3’-5’的方式，來(lái)合成之字形分子；這樣以使它們首先與雙鏈體的一條鏈進(jìn)行堿基配對(duì)，然后與另一條鏈進(jìn)行堿基配對(duì)；從而省去了對(duì)雙鏈體之一條鏈上存在相當(dāng)大的嘌呤或嘧啶序列段的需要。在利用本文描述的反義分子、核酶分子和/或三鏈螺旋分子來(lái)抑制變異基因表達(dá)的情況下，可能是所述技術(shù)可如此有效地減少或抑制由正常靶基因之等位基因產(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄(三鏈螺旋)和或翻譯(反義分子、核酶)，以致存在的正常靶基因產(chǎn)物的濃度可能低于正常表型所必需濃度的可能性可能上升。因此，在這樣的情況下，為了確保維持靶基因活性的大體上正常的水平，可通過(guò)基因治療的方法，將編碼和表達(dá)顯示正常靶基因活性之靶基因多肽的核酸分子引入到細(xì)胞中；所述基因治療的方法例如在下面5.4.2節(jié)中描述的不包含對(duì)正在使用反義分子、核酶或三鏈螺旋處理的任何一種敏感之序列的那些方法。另一方面，在靶基因編碼一種胞外蛋白的情況下，為了維持必要的靶基因活性水平，共給予正常的靶基因蛋白也許是優(yōu)選的。用正如上面討論的、本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的、用于DNA和RNA分子合成的任何方法，可制備本發(fā)明的反義RNA和反義DNA、核酶以及三鏈螺旋分子。這些方法包括本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)合成寡脫氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技術(shù)，諸如例如固相亞磷酰胺化學(xué)合成法之類的技術(shù)。另一方面，通過(guò)在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼反義RNA分子的DNA序列，可產(chǎn)生RNA分子?？梢詫⑦@樣的DNA序列插入到各種各樣的、含有合適RNA聚合酶啟動(dòng)子例如T7或SP6聚合酶啟動(dòng)子的載體中。另一方面，可以將組成型或誘導(dǎo)型地合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)成物穩(wěn)定引入到細(xì)胞系中；所述的組成型或誘導(dǎo)型取決于所用的啟動(dòng)子。5.4.2基因替代治療可使用在上面5.1節(jié)中描述的本發(fā)明的核酸序列來(lái)轉(zhuǎn)移重組核酸序列到細(xì)胞之中，且在受體細(xì)胞中表達(dá)所述的序列?？梢允褂眠@樣的技術(shù)，例如將其用于標(biāo)記細(xì)胞、或用來(lái)治療各種各樣的癌癥和相關(guān)疾病。這種治療可以是以基因替代治療的形式。具體地講，可以用載體將指導(dǎo)顯示正?；蚬δ苤虍a(chǎn)物生產(chǎn)的正?；蚧蛩龌蛞徊糠值囊粋€(gè)或更多個(gè)拷貝引入到患者體內(nèi)的合適細(xì)胞中；所述載體除了例如脂質(zhì)體的將DNA引入到細(xì)胞中的其它粒子之外，包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒載體以及反轉(zhuǎn)錄病毒載體。將基因引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以供表達(dá)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。通常，對(duì)于這樣的基因治療方法，則直接將核酸體內(nèi)給予到一種表達(dá)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)的靶細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因小鼠中；其中所述MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)可操作地連接于一種異源編碼序列。用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的任一方法，可完成這一步；例如，通過(guò)將其構(gòu)建為合適的核酸表達(dá)載體之一部分，且將其給予，以致它成為細(xì)胞內(nèi)的；例如通過(guò)用一種缺陷型或減毒型反轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它病毒載體感染(參見4,980,286號(hào)美國(guó)專利)；通過(guò)直接注射裸露的DNA；通過(guò)用微粒轟擊(例如，一種基因槍；Biolistic，Dupont)；通過(guò)用脂質(zhì)、細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被；通過(guò)包封于脂質(zhì)體、微粒或微囊中；通過(guò)以連接到一種已知進(jìn)入細(xì)胞核的肽上的方式給予所述核酸；或者通過(guò)以連接到一種易受受體介導(dǎo)的胞吞作用之配體上的方式，給予所述的核酸(參見例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)，這可被用來(lái)靶向特異性表達(dá)所述受體的細(xì)胞類型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可形成核酸-配體復(fù)合體，在所述復(fù)合體中，所述配體包含一種病毒基因融合肽以破壞內(nèi)體，從而允許該核酸避免溶酶體的降解。在再一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)靶向特異性受體，可使所述核酸在體內(nèi)定向，供細(xì)胞特異性吸收及表達(dá)(參見例如，1992年4月16日公布的PCT公開說(shuō)明書WO92/06180，1992年12月23日公布的PCT公開說(shuō)明書WO92/22635，1992年11月26日公布的PCT公開說(shuō)明書WO92/20316，1993年7月22日公布的PCT公開說(shuō)明書WO93/14188，1993年10月14日公布的PCT公開說(shuō)明書WO93/20221)。另一方面，可以將所述核酸引入細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)同源重組使其在宿主細(xì)胞DNA內(nèi)插入，而用于表達(dá)(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra等，1989，Nature342435-438)。因?yàn)榭梢栽谀X中表達(dá)本發(fā)明的核酸，所以這樣的基因替代治療技術(shù)理應(yīng)能夠傳遞基因序列到患者體內(nèi)的這些細(xì)胞類型。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)(參見例如1988年4月25日公開的WO89/10134號(hào)PCT公開說(shuō)明書)，使基因序列能夠容易地穿過(guò)血腦屏障且傳遞所述序列至腦中的細(xì)胞。關(guān)于能夠穿過(guò)血腦屏障的傳遞，病毒載體是優(yōu)選的，所述病毒載體例如諸如上面描述的那些病毒載體之類的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于傳遞的技術(shù)涉及直接給予，例如，通過(guò)立體定向(stereotactic)傳遞這樣的基因序列到所述細(xì)胞中將表達(dá)所述基因序列的位點(diǎn)。可以用來(lái)增加基因表達(dá)和/或基因產(chǎn)物活性總體水平的另外方法包括運(yùn)用上面描述的定向同源重組法，通過(guò)插入一種異源DNA調(diào)節(jié)元件，以使所插入的調(diào)節(jié)元件可操作地與所討論的內(nèi)源基因相連接，從而來(lái)改變細(xì)胞或微生物中內(nèi)源基因的表達(dá)特性。因此，可用定向同源重組來(lái)激活“轉(zhuǎn)錄沉默的”(即不正常表達(dá)的或以非常低的水平正常表達(dá)的)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄、或增強(qiáng)正常表達(dá)的內(nèi)源基因的表達(dá)；所述“轉(zhuǎn)錄沉默的”。此外，通過(guò)按足以改善各種各樣癌癥及相關(guān)疾病之癥狀的位置和數(shù)量引入合適的表達(dá)靶基因的細(xì)胞(優(yōu)選自身細(xì)胞)到患者體內(nèi)，可增加靶基因表達(dá)和/或基因產(chǎn)物活性的總水平。這樣的細(xì)胞或者可以是重組的，或者可以是非重組的。如果待給予的細(xì)胞是非自體細(xì)胞，則可以用眾所周知的防止宿主針對(duì)所引入細(xì)胞之免疫應(yīng)答產(chǎn)生的技術(shù)，將其給予。例如，可以以包封形式引入所述細(xì)胞，所述封裝的形式雖然與緊靠的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境交換組分，但不允許所引入的細(xì)胞被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別。另外，用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可給予能夠調(diào)節(jié)MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)之活性的化合物，例如借助于諸如上面描述的那些技術(shù)之類的技術(shù)鑒別的那些化合物。在待給予的化合物將涉及與腦細(xì)胞的相互作用的情況下，所述給予技術(shù)應(yīng)該包括眾所周知的便于穿過(guò)血腦屏障的技術(shù)。5.5藥用制劑和給藥方法可以以治療有效劑量，將所確定的改變MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)活性或基因產(chǎn)物活性的化合物給予患者，以治療或改善各種各樣癌癥及相關(guān)疾病的癥狀。治療有效劑量是指足以導(dǎo)致改善這樣一種疾病的癥狀的所述化合物之量。5.5.1有效劑量可以按標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法，用細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物來(lái)測(cè)定這樣的化合物的毒性和療效；例如，測(cè)定LD50(致死達(dá)群體的50％的劑量)和ED50(在群體的50％中有治療效應(yīng)的劑量)。毒性作用和治療作用之間的劑量比率為治療指數(shù)，且可以將其以比率LD50/ED50來(lái)表示。優(yōu)選顯示出大治療指數(shù)的化合物。雖然可使用呈現(xiàn)毒副作用的化合物，但為了將對(duì)非感染細(xì)胞的潛在損害減至最小，且因此減少副作用，則應(yīng)該小心設(shè)計(jì)把這樣的化合物靶向受影響組織之位點(diǎn)的傳遞系統(tǒng)。在制訂出人用的劑量范圍方面，可以使用得自細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定及動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)。這樣的化合物的劑量最好保持在包括幾乎沒(méi)毒性或無(wú)毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。該劑量可以隨所用的劑量形式和所利用的給藥途徑而在這范圍內(nèi)變化。對(duì)用于本發(fā)明方法的任何化合物，可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定而初步估計(jì)治療有效劑量。可以用動(dòng)物模型制訂出一種劑量，以達(dá)到包括用細(xì)胞培養(yǎng)物確定的IC50(即達(dá)到癥狀之半最大抑制的試驗(yàn)化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍?？墒褂眠@樣的信息，更準(zhǔn)確地確定人用的有用劑量。例如用高效液相層析，可測(cè)量血漿中的水平。5.5.2制劑與使用可以用一種或更多種生理上可接受的載體或賦形劑，以常規(guī)方式配制按照本發(fā)明使用的藥用組合物。因此，可配制所述化合物及其生理上可接受的鹽及溶劑化物，用于通過(guò)吸入或吹入法(或者通過(guò)口、或者通過(guò)鼻)或口服、口腔含化、非腸道、或直腸給藥來(lái)給予。對(duì)于口服給予，所述藥用組合物可采取例如按常規(guī)方法用藥學(xué)可接受的賦形劑制備的片劑或膠囊的形式，所述賦形劑例如粘合劑(例如，預(yù)膠凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)、填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)、潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或硅石)、崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)、或濕潤(rùn)劑(例如十二烷基硫酸鈉)。片劑可以按本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的方法來(lái)包衣。用于口服給予的液體制劑可采取例如溶液、糖漿或混懸劑的形式，或者可以將它們作為一種使用前用水或其它合適溶媒來(lái)配制的干制品提供?？梢园闯Ｒ?guī)方法用藥學(xué)上可接受的添加劑來(lái)制備這樣的液體制劑，所述添加劑例如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)、乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯樹膠)、非水溶媒(例如杏仁油、油狀酯、乙醇或分級(jí)植物油)、以及防腐劑(例如，甲基或丙基-對(duì)-羥基苯甲酸酯或山梨酸)。當(dāng)合適時(shí)，所述的制劑也可以包含緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑以及甜味劑。可以適當(dāng)?shù)嘏渲朴糜诳诜o予的制劑，從而產(chǎn)生所述活性化合物的控釋。至于口腔含化給予，組合物可采取按常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。至于通過(guò)吸入給予，通過(guò)使用一種合適的拋射劑，以來(lái)自加壓包裝或霧化器的氣霧劑噴霧呈現(xiàn)形式，方便地傳遞按照本發(fā)明而使用的化合物；所述拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，可通過(guò)提供一種閥來(lái)送遞計(jì)量的量，從而確定劑量單位?？梢耘渲乒┪肫骰虼等肫饔玫?、例如明膠的膠囊和藥筒，所述膠囊和藥筒包含所述化合物與例如乳糖或淀粉的一種合適粉末基質(zhì)的粉劑混合物?？梢耘渲仆ㄟ^(guò)注射而非腸道給予的化合物，所述通過(guò)注射例如通過(guò)大劑量注射或連續(xù)輸注。可以以單位劑量的形式，例如在安瓿中或在多劑的容器中，添加一種防腐劑，提供用于注射的制劑。所述組合物可采用像油狀溶媒或含水溶媒中的混懸劑、溶液或乳劑這樣的形式，且所述組合物可包含例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的配制劑(formulatoryagents)。另一方面，該活性成分可以呈粉劑狀態(tài)，供使用前與一種例如無(wú)熱原無(wú)菌水的合適溶媒配制。也可以將所述的化合物配制成直腸組合物，例如如包含常規(guī)栓劑基質(zhì)例如可可脂或其它甘油酯的栓劑或保留灌腸劑。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥用組合物局部給予需要治療的區(qū)域可能是所希望的。這可以通過(guò)例如(但不限于)以下的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)通過(guò)在外科手術(shù)期間的局部輸注、例如在外科手術(shù)后連同傷口敷料一起的局部應(yīng)用，通過(guò)注射，借助于導(dǎo)管，用栓劑，或者借助于移植物，所述移植物為多孔材料、非多孔材料或凝膠材料，包括例如sialastic膜的膜或纖維材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予可以是通過(guò)在惡性腫瘤或腫瘤組織或腫瘤發(fā)生前組織之位點(diǎn)的直接注射。對(duì)于局部應(yīng)用，可以將所述化合物與一種載體混合，以便基于所需活性而傳遞有效的劑量。除了先前描述的制劑外，也可以將所述化合物配制成一種緩釋型制劑?？赏ㄟ^(guò)移植(例如皮下或肌內(nèi)移植)或通過(guò)肌內(nèi)注射而給予這種長(zhǎng)效制劑。因此，例如，可以用合適的聚合材料或疏水材料(例如作為在一種可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂，來(lái)配制所述化合物；或者可配制作為微溶衍生物例如作為一種微溶鹽的所述化合物。如果需要，則可以在可包含一份或更多份含有活性成分之單位劑量形式的包裝或分配裝置中提供所述組合物。該包裝可例如包括金屬箔或塑料箔，例如泡罩片。所述包裝或分配裝置可附有給藥說(shuō)明。6.引用的參考文獻(xiàn)在這里描述和要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)該被限制于本文公開的具體實(shí)施方案的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些實(shí)施方案用來(lái)作為本發(fā)明幾個(gè)方面的說(shuō)明。任何等同的實(shí)施方案都將落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員而言，根據(jù)先前的描述，除了本文顯示與描述的以下的本發(fā)明各種各樣的修改將成為顯而易見的。這樣的修改屬于所附權(quán)利要求書的范圍。通過(guò)引用，將本說(shuō)明書中提到所有出版物、專利及專利申請(qǐng)結(jié)合到本文中，從而達(dá)到與具體而單獨(dú)地表明通過(guò)引用結(jié)合每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)相同的程度。權(quán)利要求1.一種分離的多核苷酸或其轉(zhuǎn)錄活性片段，該寡核苷酸包括圖1所示的核苷酸序列。2.一種分離的多核苷酸或其互補(bǔ)物，所述多核苷酸在高度嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求1的任何一種分離的多核苷酸雜交。3.一種重組載體，所述載體包含權(quán)利要求2的分離的多核苷酸。4.一種表達(dá)載體，所述載體包含權(quán)利要求2的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸與一種控制在宿主細(xì)胞內(nèi)所述核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸可操作相連。5.一種基因工程細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求2的分離的多核苷酸。6.一種非人類的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述動(dòng)物已被基因工程化，從而包含一種包括權(quán)利要求2之分離的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因。7.一種治療劑，所述治療劑包含一種MN-CA9啟動(dòng)子、一種傳遞載體以及一種毒性、治療和/或異源編碼序列。8.權(quán)利要求7的治療劑，所述治療劑還包括一種前體藥物。9.權(quán)利要求8的治療劑，其中所述的前體藥物選自無(wú)環(huán)鳥苷(“ACV”)和更昔洛韋(“GCV”)。10.權(quán)利要求7的治療劑，其中所述的傳遞載體包括一種病毒載體。11.權(quán)利要求10的治療劑，其中所述的病毒載體是腺病毒。12.權(quán)利要求7的治療劑，其中所述的傳遞載體包括一種脂質(zhì)體。13.權(quán)利要求7的治療劑，其中所述的毒性編碼序列選自胸苷激酶和胞嘧啶脫氨酶。14.權(quán)利要求7的治療劑，其中所述的治療編碼序列選自生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、治療蛋白、激素和激素的肽片段、細(xì)胞因子的抑制劑、肽生長(zhǎng)與分化因子、白細(xì)胞介素、趨化因子、干擾素、集落刺激因子以及血管生成因子。15.權(quán)利要求7的治療劑，其中所述的異源編碼序列是一種報(bào)道基因。16.權(quán)利要求15的治療劑，其中所述的報(bào)道基因是一種熒光素酶。17.一種鑒定能夠調(diào)節(jié)腫瘤特異性基因表達(dá)的試驗(yàn)化合物的方法，所述方法包括(a)使化合物與在MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)或其轉(zhuǎn)錄活性片段控制下表達(dá)一種報(bào)道基因的細(xì)胞接觸；以及(b)測(cè)量該報(bào)道基因在存在和不存在所述試驗(yàn)化合物情況下的表達(dá)水平，因此如果在存在所述試驗(yàn)化合物的情況下所獲得的水平不同于當(dāng)所述試驗(yàn)化合物不存在時(shí)所獲得的水平，那么則鑒定出調(diào)節(jié)腫瘤特異性基因表達(dá)的化合物。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述報(bào)道基因的表達(dá)產(chǎn)生一種熒光信號(hào)。19.一種藥用組合物，所述組合物包括按權(quán)利要求17鑒定出的試驗(yàn)化合物。20.一種用于藥物傳遞的方法，該方法包括將一種載體引入到受治療者的腫瘤中，所述載體包含一種可操作地連接異源基因的MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)序列或其轉(zhuǎn)錄活性片段。21.一種治療和/或改善癌癥或其它增生性疾病的方法，所述方法包括向受治療者的所述癌癥或其它增生性疾病的細(xì)胞中，引入一種包含MN-CA9調(diào)節(jié)區(qū)序列或其轉(zhuǎn)錄活性片段、一種傳遞載體以及基因產(chǎn)物能夠殺傷所述細(xì)胞的一種毒性、治療和/或異源編碼序列的載體。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的癌癥或其它增生性疾病選自宮頸癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)腸癌以及胃癌。23.權(quán)利要求21的方法，該方法還包括引入一種前體藥物。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的前體藥物選自ACV和GCV。25.權(quán)利要求21的方法，其中所述的引入包括經(jīng)直接應(yīng)用的給予、或者通過(guò)靜脈內(nèi)給予、動(dòng)脈內(nèi)給予、腫瘤內(nèi)給予、灌注以及口服給予的系統(tǒng)性應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及指導(dǎo)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它調(diào)節(jié)元件，包括來(lái)自控制腎細(xì)胞癌相關(guān)蛋白MN－CA9表達(dá)的5’調(diào)節(jié)區(qū)的核苷酸序列及其轉(zhuǎn)錄活性片段。特別提供表達(dá)其中MN－CA9調(diào)節(jié)區(qū)能夠控制異源基因表達(dá)、能夠過(guò)量表達(dá)內(nèi)源基因或病理過(guò)程的抑制劑、或者能夠使在癌癥發(fā)生和/或發(fā)展中被認(rèn)為是重要的特定基因的表達(dá)失效的載體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明也涉及使用所述載體、細(xì)胞和動(dòng)物來(lái)篩選作為癌癥發(fā)生和/或發(fā)展之激動(dòng)劑和拮抗劑的候選分子的方法。本發(fā)明另外涉及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)化合物表達(dá)的組合物和方法，且涉及篩選調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)之化合物的組合物與方法。也提供應(yīng)用通過(guò)篩選測(cè)定而鑒定的分子與化合物進(jìn)行治療性治療的方法。文檔編號(hào)A61P35/00GK1447920SQ01813165公開日2003年10月8日申請(qǐng)日期2001年5月24日優(yōu)先權(quán)日2000年5月25日發(fā)明者T·A·加納,C·考,S·－C·柯,F·楊,L·W·K·鐘申請(qǐng)人:弗吉尼亞大學(xué)專利基金會(huì)