專利名稱：抑制免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注損傷的方法和組合物的制作方法
背景技術(shù)：
補體系統(tǒng)參與先天性和適應(yīng)性免疫(Muller-Eberhard，H.J.(1988)Ann.Rev.Biochem.57，321-347；Carroll，M.C.(1998)Ann.Rev.Immunol 16，545-568；Fearon等，(1995)Annu.Rev.Immunol 13，127-149)。最近使用血清補體或補體受體的特定成分缺陷型小鼠(例如，CD21/CD35)的研究不僅證實了補體的許多已知作用，而且清楚地顯示了在天然和適應(yīng)性免疫中重要的新機制(Carroll，M.C.(1998)出處同上)。例如，補體增強對T-依賴型抗原產(chǎn)生記憶反應(yīng)的一種機制是通過CD21/CD19/Tapa-1共同受體介導(dǎo)在生發(fā)中心(GC)B細(xì)胞中的殘存信號。另外，缺陷型小鼠在證實將傳統(tǒng)途徑鑒定為誘導(dǎo)損傷所必需的重要性中是重要的(Weiser等，(1996)J Exp.Med.1857-1864)。
局部缺血再灌注(reperfusion)(I/R)損傷表現(xiàn)為在低含氧量組織的再灌注后對內(nèi)皮和下面的實質(zhì)組織的炎癥性損傷。它是導(dǎo)致對包括諸如心肌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，下肢和腸的各種組織急性和慢性損傷的全身性綜合征。局部缺血再灌注損傷可導(dǎo)致壞死和不可逆的細(xì)胞損傷。例如，局部缺血性骨骼肌的再灌注導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其特征在于帶有滲透性水腫的血管滲漏(Weiser等，(1996)J.Exp.Med.1857-1864)，小腸再灌注導(dǎo)致粘膜破壞(Williams，等，(1999)J；Appl.Physiol.，938-942)。一般來說，局部缺血的時間越長，炎癥性反應(yīng)越顯著。I/R損傷的程度也由諸如局部缺血區(qū)域的大小和涉及的具體組織等因素來決定(Williams，等，(1999)J.Appl.Physiol.，938-942)。
I/R損傷的主要介質(zhì)是補體系統(tǒng)。Weisman等報道了在大鼠心臟模型中使用補體C3b的可溶性抑制劑(sCR1)部分抑制I/R損傷的機制(Weisman等(1990)Science 249，146-151)?？扇苄訡R1受體在滅活C3轉(zhuǎn)化酶(convertase)，即將天然C3轉(zhuǎn)化成其活性C3b形式的酶復(fù)合物中非常有效。CR1受體充當(dāng)在C3b的因子I裂解中和在從轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)移C3b中的輔因子。局部缺血誘導(dǎo)前用sCR1靜脈內(nèi)注射小鼠明顯減小對處理動物的再灌注損傷。處理動物的組織學(xué)檢查揭示出在心肌中補體沉積水平和組織損傷程度減小(Weisman等，(1990)出處同上)。在下肢損傷模型中用sCR1預(yù)處理小鼠獲得了相似的結(jié)果(Hill等(1992)J.Immunol.149，1723-1730)。在該模型中，通過在下肢放置止血器使流向下層下肢的血流被阻斷大約2小時。在流向該組織的血流恢復(fù)前，小鼠靜脈內(nèi)施用放射性碘標(biāo)記的白蛋白作為滲透性的標(biāo)記。
盡管這些研究確定了損傷由補體介導(dǎo)，但他們沒有闡述引發(fā)損傷的機理問題。Weiser等證實了抗體缺陷型小鼠部分防止在下肢模型中的損傷。通過用正常的小鼠血清重建可回復(fù)損傷。Williams等將該觀察延伸到小腸模型中并證實了純化的IgM足以在抗體缺陷型小鼠中回復(fù)損傷。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于對致病性免疫球蛋白(Ig)，特別是識別局部缺血特異性抗原的致病性IgM的鑒定。不受理論的約束，據(jù)信這些致病性IgM與局部缺血特異性抗原的結(jié)合觸發(fā)特別是補體途徑的激活，最終導(dǎo)致再灌注或局部缺血損傷。申請人還揭示了致病性IgM由本文稱為“B-1細(xì)胞”的B細(xì)胞亞群產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明的特征在于一種治療或預(yù)防受試者中免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括給受試者施用有效量的致病性免疫球蛋白，例如，致病性IgM與局部缺血特異性抗原之間相互作用的抑制劑，從而減少與局部缺血特異性抗原結(jié)合的致病性免疫球蛋白的數(shù)目，以便抑制或減小損傷。
在一個優(yōu)選的實施方案中，再灌注或局部缺血損傷在自然出現(xiàn)的發(fā)作，例如中風(fēng)后產(chǎn)生。再灌注或局部缺血損傷可在手術(shù)操作期間和/或之后出現(xiàn)。引起損傷的舉例性手術(shù)操作包括選自血管成形術(shù)，斯騰特氏印模放置操作，粥樣硬化斑切除術(shù)和旁路手術(shù)的血管矯正技術(shù)。在一個優(yōu)選的實施方案中，再灌注或局部缺血損傷在心血管組織，例如心臟中發(fā)生。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的抑制劑通過一種或多種下列活性拮抗致病性免疫球蛋白(i)抑制或減少致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間的相互作用(例如，結(jié)合)；(ii)抑制或減少致病性免疫球蛋白和補體途徑的成分之間的相互作用(例如，結(jié)合)；(iii)中和致病性免疫球蛋白，例如，通過螯合免疫球蛋白和/或瞄準(zhǔn)其降解；或(iv)抑制或減少致病性免疫球蛋白的產(chǎn)生，例如抑制致病性抗體的合成，裝配，和/或翻譯后修飾。該抑制劑可以是蛋白質(zhì)或肽；小分子；抗體或其片斷，例如，抗獨特型抗體；糖類；或糖蛋白。在另一優(yōu)選的實施方案中，抑制劑可以是本文所述的修飾抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，在幾小時，幾天，幾周，幾月或幾年的時間內(nèi)一次或連續(xù)接觸施用該抑制劑。抑制劑可在引起損傷的自然發(fā)生的發(fā)作之前，期間和/或之后施用。該抑制劑也可在手術(shù)操作，例如與再灌注或局部缺血損傷相關(guān)的手術(shù)操作之前，期間和/或之后施用。在一個優(yōu)選的實施方案中，該抑制劑可與其它治療劑，例如，抗凝劑，補體抑制劑結(jié)合施用。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種治療或預(yù)防受試者中免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括給受試者施用有效量的致病性免疫球蛋白，例如，致病性IgM與補體途徑的成分之間相互作用的抑制劑，從而減少激活補體活性的致病性免疫球蛋白的數(shù)目，以便抑制或減小損傷。
在一個優(yōu)選的實施方案中，致病性免疫球蛋白是IgM或IgG(例如，IgG1和IgG3)。優(yōu)選的是，致病性免疫球蛋白是IgM，且更優(yōu)選的是，它是IgM亞類。在另一優(yōu)選的實施方案中，致病性免疫球蛋白由B細(xì)胞的一個亞群，例如，B-1細(xì)胞產(chǎn)生，或者致病性免疫球蛋白由將以保藏號＿保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生。致病性免疫球蛋白具有包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。在一個優(yōu)選的實施方案中，局部缺血特異性抗原存在于內(nèi)皮細(xì)胞和/或?qū)嵸|(zhì)組織的表面。
在優(yōu)選的實施方案中，補體途徑是傳統(tǒng)的補體途徑，且補體途徑的成分可以是C1分子或其亞基(例如，C1q)。在另一實施方案中，受試者是哺乳動物，例如，嚙齒類(例如，小鼠)或靈長類(例如，人類)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，再灌注或局部缺血損傷在自然出現(xiàn)的發(fā)作，例如中風(fēng)后產(chǎn)生。再灌注或局部缺血損傷可在手術(shù)操作期間和/或之后出現(xiàn)。引起損傷的舉例性手術(shù)操作包括選自血管成形術(shù)，斯騰特氏印模放置操作，粥樣硬化斑切除術(shù)和旁路手術(shù)的血管矯正技術(shù)。在一個優(yōu)選的實施方案中，再灌注或局部缺血損傷在心血管組織，例如心臟中發(fā)生。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的抑制劑通過一種或多種下列活性拮抗致病性免疫球蛋白(i)抑制或減少致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間的相互作用(例如，結(jié)合)；(ii)抑制或減少致病性免疫球蛋白和補體途徑的成分之間的相互作用(例如，結(jié)合)；(iii)中和致病性免疫球蛋白，例如，通過螯合免疫球蛋白和/或瞄準(zhǔn)其降解；或(iv)抑制或減少致病性免疫球蛋白的產(chǎn)生，例如抑制致病性抗體的合成，裝配，和/或翻譯后修飾。該抑制劑可以是蛋白質(zhì)或肽；小分子；抗體或其片斷，例如，抗獨特型抗體；糖類；或糖蛋白。在另一優(yōu)選的實施方案中，抑制劑可以是本文所述的修飾抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，在幾小時，幾天，幾周，幾月或幾年的時間內(nèi)一次或連續(xù)接觸施用該抑制劑。抑制劑可在引起損傷的自然發(fā)生的發(fā)作之前，期間和/或之后施用。該抑制劑也可在手術(shù)操作，例如與再灌注或局部缺血損傷相關(guān)的手術(shù)操作之前，期間和/或之后施用。在一個優(yōu)選的實施方案中，該抑制劑可與其它治療劑，例如，抗凝劑，補體抑制劑結(jié)合施用。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種治療或預(yù)防受試者中免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括從受試者中除去或滅活致病性免疫球蛋白，例如，本文所述的致病性IgM，和/或產(chǎn)生致病性免疫球蛋白的B細(xì)胞(例如，本文所述的B-1細(xì)胞)，從而減少受試者中存在的致病性免疫球蛋白和/或B細(xì)胞的量。
在一個優(yōu)選的實施方案中，除去或滅活步驟回體(ex vivo)進(jìn)行。在一個實施方案中，致病性免疫球蛋白或B細(xì)胞可通過血灌注除去。在另一實施方案中，可使用B細(xì)胞特異性抗體(例如，抗-B-1抗體或抗-CD5抗體或抗CD11G/CD18)除去B細(xì)胞?？赏ㄟ^用固定的抗原(例如，局部缺血特異性抗原)或固定的抗獨特型抗體接觸來自受試者的血液除去致病性免疫球蛋白，例如，IgM。在一個優(yōu)選的實施方案中，致病性免疫球蛋白的除去或滅活步驟通過給受試者施用抗獨特型抗體進(jìn)行。在另一實施方案中，B細(xì)胞的除去或滅活步驟通過給受試者施用與毒素，例如，蓖麻毒或白喉毒素偶連的B細(xì)胞靶向半分子(例如，抗體或其抗原結(jié)合片斷，或抗原)進(jìn)行。在一個優(yōu)選的實施方案中，受試者是哺乳動物，例如，嚙齒類(例如，小鼠)或靈長類(例如，人類)。在一個優(yōu)選的實施方案中，再灌注或局部缺血損傷在自然發(fā)生的發(fā)作，例如，中風(fēng)后產(chǎn)生。優(yōu)選的是，除去步驟在自然發(fā)生的發(fā)作后幾分鐘，1至5小時，5至10小時，10至24小時，1至5天內(nèi)進(jìn)行。在一個優(yōu)選的實施方案中，再灌注或局部缺血損傷在心血管組織，例如，心臟中發(fā)生。在另一實施方案中，通過在手術(shù)操作之前，期間，和/或之后從受試者除去致病性免疫球蛋白，和/或B細(xì)胞預(yù)防和/或減小再灌注或局部缺血損傷。例如，可在手術(shù)操作前至少1到5小時，5到10小時，10到20小時，或1，2或3天進(jìn)行除去步驟。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的致病性免疫球蛋白，例如本文所述的致病性IgM。優(yōu)選的是，致病性免疫球蛋白具有一種或多種下列特性(i)能與局部缺血特異性抗原相互作用；(ii)能固定補體；或(iii)由B細(xì)胞的一個亞群產(chǎn)生。在一個優(yōu)選的實施方案中，致病性免疫球蛋白由B細(xì)胞的一個亞群，例如，B-1細(xì)胞產(chǎn)生。在另一實施方案中，致病性免疫球蛋白由將在ATCC保藏，具有保藏號＿＿的雜交瘤產(chǎn)生。致病性免疫球蛋白可具有包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一實施方案中，致病性免疫球蛋白具有包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。在另一實施方案中，致病性免疫球蛋白與存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面的局部缺血特異性抗原相互作用(例如，結(jié)合)。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種致病性免疫球蛋白，例如，本文所述的致病性IgM。在一個優(yōu)選的實施方案中，致病性免疫球蛋白與局部缺血特異性抗原相互作用(例如，結(jié)合)。致病性免疫球蛋白可顯示出降低激活補體的能力。在一個優(yōu)選的實施方案中，致病性免疫球蛋白具有一個或多個氨基酸取代，缺失，和/或插入。例如，涉及補體結(jié)合和/或激活的一個或多個氨基酸殘基被突變。在一個優(yōu)選的實施方案中，致病性免疫球蛋白是由將在ATCC保藏，具有保藏號＿＿的細(xì)胞系產(chǎn)生的致病性免疫球蛋白。在其它實施方案中，致病性抗體，或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)或其片斷。在其它實施方案中，致病性抗體至少包含SEQ ID NO10的CDR1區(qū)，或其抗原結(jié)合部分，和/或至少一個SEQID NO12的CDR2區(qū)，或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選的是，致病性抗體至少包含SEQ ID NO10的CDR1區(qū)，和SEQ ID NO12的CDR2區(qū)，或其抗原結(jié)合部分。在另一實施方案中，致病性抗體，或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)或其片斷。在其它實施方案中，致病性抗體至少包含SEQ ID NO4的CDR1區(qū)，或其抗原結(jié)合部分，和/或至少一個SEQ ID NO6的CDR2區(qū)，或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選的是，致病性抗體至少包含SEQ ID NO4的CDR1區(qū)，和SEQ ID NO6的CDR2區(qū)，或其抗原結(jié)合部分。
在另一實施方案中，致病性抗體，或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ IDNO8所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或其抗原結(jié)合片斷，以及包含SEQID NO2所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，或其抗原結(jié)合片斷。致病性抗體可以是對局部缺血特異性抗原具有的結(jié)合親和力類似于，例如大于，小于，或等于由將在ATCC保藏，具有保藏號＿＿的雜交瘤產(chǎn)生的致病性抗體的結(jié)合親和力的人抗體。在另一實施方案中，致病性抗體可以是非人抗體，例如，奶牛，山羊，小鼠，大鼠，綿羊，豬或兔抗體。優(yōu)選的是，非人抗體是鼠抗體。致病性抗體可以是重組抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，致病性抗體是人源化的抗體。在另一實施方案中，分離的致病性免疫球蛋白與由將在ATCC保藏，具有保藏號＿＿的雜交瘤產(chǎn)生的免疫球蛋白具有相同的抗原特異性。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種用于分離局部缺血特異性抗原的方法，包括提供一種致病性免疫球蛋白，例如，致病性IgM，例如本文所述的致病性IgM，在允許致病性免疫球蛋白與樣品特異性結(jié)合的條件下接觸含有局部缺血特異性抗原的樣品，例如生化分離物(例如，內(nèi)皮細(xì)胞分離物)，或蛋白質(zhì)庫(例如，表達(dá)文庫)與致病性免疫球蛋白，檢測致病性抗體與樣品的結(jié)合水平相對于對照的任何改變，其中樣品中存在的致病性免疫球蛋白結(jié)合水平相對于在對照中所檢測到的改變是特異性結(jié)合的指標(biāo)，以及從樣品中分離，例如純化局部缺血特異性抗原。在一個優(yōu)選的實施方案中，樣品富集局部缺血特異性抗原，例如，所述抗原從再灌注或局部缺血損傷的受試者(例如，人類患者)中獲得。在其它實施方案中，樣品是生化分離物，例如內(nèi)皮組織，或者表達(dá)文庫，例如來自內(nèi)皮組織的文庫。在一個優(yōu)選的實施方案中，接觸步驟在體外發(fā)生。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種從一種或多種(例如，眾多的)試驗化合物中鑒定致病性免疫球蛋白，例如致病性IgM與局部缺血特異性抗原之間相互作用的抑制劑的方法，包括在允許致病性免疫球蛋白與局部缺血特異性抗原發(fā)生結(jié)合的條件下提供包括致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原(例如，從帶有再灌注或局部缺血損傷的受試者(例如，人類患者)獲得的內(nèi)皮組織或裂解產(chǎn)物)的反應(yīng)混合物，接觸致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原與一種或多種試驗化合物(例如，組合文庫的成員)，并檢測存在給定試驗化合物時致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原結(jié)合相對于不存在該試驗化合物時檢測到的結(jié)果的任何改變，其中存在該試驗化合物時致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間的結(jié)合水平相對于不存在該試驗化合物時所檢測到的水平的改變(例如，下降)表明該試驗化合物是致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間相互作用的抑制劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，接觸步驟在體內(nèi)實現(xiàn)。該方法可進(jìn)一步包括用一種或多種試驗化合物預(yù)處理致病性免疫球蛋白。然后可將預(yù)處理的致病性免疫球蛋白注射進(jìn)致病性免疫球蛋白缺陷型小鼠中。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種從一種或多種(例如，眾多的)試驗化合物中鑒定致病性免疫球蛋白，例如致病性IgM與補體途徑的成分之間相互作用的抑制劑的方法，包括在允許致病性免疫球蛋白與補體途徑的成分發(fā)生結(jié)合的條件下提供包括致病性免疫球蛋白和補體途徑的成分的反應(yīng)混合物，使致病性免疫球蛋白和補體途徑的成分與一種或多種試驗化合物(例如，組合文庫的成員)接觸，并檢測存在給定試驗化合物時致病性免疫球蛋白和補體途徑的成分結(jié)合相對于不存在該試驗化合物時檢測到的結(jié)果的任何改變，其中存在該試驗化合物時致病性免疫球蛋白和補體途徑的成分之間的結(jié)合水平相對于不存在該試驗化合物時所檢測到的水平的改變(例如，下降)表明該試驗化合物是致病性免疫球蛋白和補體途徑的成分之間相互作用的抑制劑。在優(yōu)選的實施方案中，致病性免疫球蛋白是本文所述的致病性IgM，且局部缺血特異性抗原從帶有再灌注或局部缺血損傷的受試者(例如，人類患者)獲得的內(nèi)皮組織或裂解產(chǎn)物獲得。在另一實施方案中，該方法在體外進(jìn)行。在一個優(yōu)選的實施方案中，致病性免疫球蛋白或局部缺血特異性抗原之一(或兩者)用可檢測的信號，例如，熒光團(tuán)，比色酶，放射性同位素，發(fā)光化合物等標(biāo)記。該方法可進(jìn)一步包括重復(fù)至少一個步驟，例如，與文庫的第二個或下一個成員或多個成員的接觸步驟。在一個優(yōu)選的實施方案中，檢測了眾多試驗化合物，例如，文庫成員。眾多的試驗化合物，例如文庫成員可包括至少10，102，103，104，105，106，107，或108個化合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，眾多的試驗化合物，例如文庫成員共有一種結(jié)構(gòu)或功能特性。試驗化合物可以是肽或有機小分子。在另一實施方案中，補體途徑是經(jīng)典補體途徑。在一個優(yōu)選的實施方案中，補體途徑的成分是C1分子或其亞基(例如，C1q)。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種編碼致病性IgM抗體，或其片斷的分離的核酸。在優(yōu)選的實施方案中，分離的核酸編碼SEQ ID NO8的輕鏈可變區(qū)。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸序列編碼包含SEQ ID NO10的CDR1的輕鏈可變區(qū)，或其抗原結(jié)合部分。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO12的CDR2，或其抗原結(jié)合部分。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)包含SEQ IDNO10的CDR1，或其抗原結(jié)合部分，和SEQ ID NO12的CDR2，或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，該核酸編碼鼠源，人源的輕鏈可變區(qū)或鼠與人氨基酸序列的組合。例如，該核酸可編碼包含SEQ ID NO10的CDR1和/或SEQ ID NO12的CDR2的輕鏈可變區(qū)，和人的框架序列。
在其它優(yōu)選的實施方案中，該分離的核酸編碼SEQ ID NO2的重鏈可變區(qū)。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸序列編碼含有SEQ ID NO4的CDR1的重鏈可變區(qū)，或其抗原結(jié)合部分。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸序列編碼含有SEQ ID NO6的CDR2的重鏈可變區(qū)，或其抗原結(jié)合部分。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO4的CDR1，或其抗原結(jié)合部分，以及SEQ ID NO6的CDR2，或其抗原結(jié)合部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，該核酸編碼鼠源，人源的重鏈可變區(qū)或鼠與人氨基酸序列的組合。例如，該核酸可編碼包含SEQ ID NO4的CDR1和/或SEQ ID NO6的CDR2的重鏈可變區(qū)，和人的框架序列。在另一實施方案中，該分離的核酸編碼包含SEQ ID NO8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種分離的核酸分子及其片斷。在一個優(yōu)選的實施方案中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO7的輕鏈核苷酸序列。在另一實施方案中，該核酸分子包含SEQ ID NO9的輕鏈CDR1核苷酸序列，或其部分。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸分子包含SEQ IDNO11的輕鏈CDR2核苷酸序列，或其部分。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸分子包含SEQ ID NO9的輕鏈CDR1核苷酸序列，或其部分以及SEQID NO11的輕鏈CDR2核苷酸序列，或其部分。包含輕鏈序列，例如SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，或其組合的本發(fā)明的核酸分子包含與其具有70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，和99％的序列相同性的核苷酸。另外，包含輕鏈序列，例如SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ IDNO11，或其組合的本發(fā)明的核酸分子包含在嚴(yán)格條件下，例如，低度，中度，高度或更高嚴(yán)格條件下與其雜交的核苷酸。
在另一實施方案中，本發(fā)明的特征在于與編碼輕鏈多肽，例如，SEQ IDNO8，SEQ ID NO10，和SEQ ID NO12的輕鏈多肽的核酸分子具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，和99％的序列相同性的核酸分子。在另一實施方案中，本發(fā)明的特征在于與編碼致病性抗體的輕鏈可變區(qū)或其部分，例如SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，和SEQ ID NO12的輕鏈可變區(qū)的核酸序列雜交的核酸分子。
在其它優(yōu)選的實施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO1的重鏈核苷酸序列。在另一實施方案中，該核酸分子包含SEQ ID NO3的重鏈CDR1核苷酸序列，或其部分。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸分子包含SEQ IDNO5的重鏈CDR2核苷酸序列，或其部分。在另一優(yōu)選的實施方案中，該核酸分子包含SEQ ID NO3的重鏈CDR1核苷酸序列，或其部分以及SEQID NO5的重鏈CDR2核苷酸序列，或其部分。包含重鏈序列，例如SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，或其組合的本發(fā)明的核酸分子還包含與其具有70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，和99％的序列相同性的核苷酸。另外，包含輕鏈序列，例如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，或其組合的本發(fā)明的核酸分子包含在嚴(yán)格條件下，例如，低度，中度，高度或極高嚴(yán)格條件下與其雜交的核苷酸。
在另一實施方案中，本發(fā)明的特征在于與編碼重鏈多肽，例如，SEQ IDNO2，SEQ ID NO4，和SEQ ID NO6的重鏈多肽的核酸分子具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，和99％的序列相同性的核酸分子。在另一實施方案中，本發(fā)明的特征在于與編碼致病性抗體的重鏈可變區(qū)或其部分，例如SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，和SEQ ID NO6的重鏈可變區(qū)的核酸序列雜交的核酸分子。
本發(fā)明的另一方面的特征在于分離的多肽及其片斷。在優(yōu)選的實施方案中，分離的多肽包括，例如，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，或SEQ ID NO12的氨基酸序列，或片斷或其組合；或SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6，或片斷或其組合。本發(fā)明的多肽包括與SEQ ID NO8，SEQID NO10，或SEQ ID NO12；或SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ IDNO6具有至少，但不超過20，10，5，4，3，2，或1個氨基酸不同的多肽。優(yōu)選的多肽是保留生物學(xué)活性，例如，結(jié)合局部缺血特異性抗原的能力，和/或結(jié)合補體的能力的多肽。在另一實施方案中，該多肽包含與輕鏈可變區(qū)或其部分，例如SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，或SEQ IID NO12的輕鏈可變區(qū)多肽具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，和99％的序列相同性的多肽。在另一實施方案中，該多肽包含與重鏈可變區(qū)或其部分，例如SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ IID NO6的重鏈可變區(qū)多肽具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，和99％的序列相同性的多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明的特征在于包含SEQ ID NO8和SEQ IDNO2的氨基酸序列，還包含一個IRES序列的多肽。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含編碼SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，或SEQ ID NO12或片斷或其組合，或SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6或片斷或其組合的本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)載體。在一個優(yōu)選的實施方案中，表達(dá)載體包含編碼具有包括SEQ ID NO8的氨基酸序列的可變區(qū)的抗體輕鏈或其部分的核酸分子，和編碼具有包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的可變區(qū)的抗體重鏈或其部分的核苷酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞可包含至少1個或2個或多個表達(dá)載體，即編碼輕鏈，例如SEQ IDNO8或其部分的一個表達(dá)載體，編碼重鏈，例如SEQ ID NO2或其部分的一個表達(dá)載體。在另一實施方案中，宿主細(xì)胞可包含能表達(dá)輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的表達(dá)載體。本文所用的術(shù)語“載體”是指能轉(zhuǎn)運與其連接的另一核酸分子的核酸分子，可包括質(zhì)粒，粘?；虿《据d體。載體可以是能夠自主復(fù)制的，或者可整合進(jìn)宿主DNA中。病毒載體包括，例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒。
使用本文所述的方法鑒定的致病性免疫球蛋白/局部缺血抗原，和/或致病性免疫球蛋白/補體成分相互作用的抑制劑也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
附圖簡述

圖1是表示腸局部缺血和再灌注后或者無損傷(假性對照)的近交小鼠腸滲透性改變的線段圖。WT表示Cr2-/-小鼠的親本品系。Cr2-/-用合并的IgG或IgM或生理鹽水對照重建。處理前大約1小時靜脈內(nèi)施用合并的IgM或IgG(0.5mg)。數(shù)值是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；n＝實驗中各組小鼠的數(shù)目。
圖2是在腹膜B-1淋巴細(xì)胞的陽性選擇中補體和補體受體預(yù)期作用的示意圖。
圖3A顯示了用來自22個單獨的B-1細(xì)胞雜交瘤克隆的合并的IgM在抗體缺陷型小鼠(RAG-1)中重建I/R損傷。合并24μg的各雜交瘤IgM并在開始剖腹術(shù)前30分鐘靜脈內(nèi)注射。在再灌注結(jié)束時，獲得血液且以干燥的腸與血液的125I計數(shù)的比率計算滲透性指數(shù)。數(shù)值代表平均值±SE；n＝實驗中各組使用的小鼠數(shù)目。1＝生理鹽水；2＝合并的雜交瘤；3＝50μg雜交瘤22A5；4＝400μg合并的IgM。
圖3B證實了來自雜交瘤克隆22A5的IgM回復(fù)(restore)RAG-1小鼠中的I/R損傷。用IgM重建的小鼠接受總血清IgM(400μg)或者22A5雜交瘤IgM(各50μg)。數(shù)值代表平均值±SE；n＝實驗中各組使用的小鼠的數(shù)目。1＝生理鹽水；2＝合并的雜交瘤；3＝50μg雜交瘤22A5；4＝400μg合并的IgM。
圖4A顯示了B-1雜交瘤22A5的IgM序列分析。顯示了22A5 IgM的重鏈核酸序列(SEQ ID NO1)。從22A5雜交瘤細(xì)胞純化RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用5’VH和3’Cm特異性的寡核苷酸引物經(jīng)半嵌套式PCR擴(kuò)增免疫球蛋白重鏈cDNA。cDNA產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上純化且通過自動測序測定核苷酸序列?？蚣軈^(qū)(FWR)和互補決定區(qū)(CDR)在核苷酸上面表示。在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)，22A5重鏈與免疫球蛋白序列VMU-3.2(注冊號X03088)共有95％的同源性。
圖4B顯示了B-1雜交瘤22A5的IgM序列分析。顯示了22A5 IgM的輕鏈核酸序列(SEQ ID NO7)。從22A5雜交瘤細(xì)胞純化RNA且逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用5’Vk和3’Ck特異性的寡核苷酸引物經(jīng)半嵌套式PCR擴(kuò)增免疫球蛋白輕鏈cDNA。cDNA產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上純化且通過自動測序測定核苷酸序列?？蚣軈^(qū)(FWR)和互補決定區(qū)(CDR)在核苷酸上面表示。在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)，22A5輕鏈與免疫球蛋白序列Vk19-23基因(保藏號AJ235961)享有同源性。
圖5A顯示了相應(yīng)于SEQ ID NO1的重鏈核酸序列的氨基酸序列(SEQID NO2)?？蚣軈^(qū)(FWR)和互補決定區(qū)(CDR)在氨基酸殘基上面表示。
圖5B顯示了相應(yīng)于SEQ ID NO7的輕鏈核酸序列的氨基酸序列(SEQID NO8)。框架區(qū)(FWR)和互補決定區(qū)(CDR)在氨基酸殘基上面表示。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于對致病性免疫球蛋白(Ig)，特別是識別局部缺血特異性抗原的致病性IgM的鑒定。據(jù)信這些致病性IgM與局部缺血特異性抗原的結(jié)合觸發(fā)特別是補體途徑的激活，最終導(dǎo)致再灌注或局部缺血損傷。申請人還揭示了致病性IgM由本文稱為“B-1細(xì)胞”的B細(xì)胞亞群產(chǎn)生。因此，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防受試者中由致病性免疫球蛋白，即致病性IgM引起的再灌注后組織損傷的方法和組合物。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的描述前，為了方便，這里收集了在說明書，實施例和所附權(quán)利要求書中使用的某些術(shù)語。
術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中可互換使用。
本文使用的術(shù)語“免疫球蛋白”(或縮寫形式“Ig”)和“抗體”是指含有以二硫鍵互相連接的至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈的一個糖蛋白。每個重鏈包含一個重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR或VH)和一個重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個結(jié)構(gòu)域CH1，CH2和CH3，或?qū)τ贗gM有4個結(jié)構(gòu)域，即CH1，CH2，CH3，和CH4。每個輕鏈包含一個輕鏈可變區(qū)和一個輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域CL。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分成散布在更保守的，稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域中的，稱為互補決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)。VH和VL各由3個CDR和4個FR組成，從氨基末端到羧基末端按下列順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈可變區(qū)含有一個與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白結(jié)合宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和傳統(tǒng)補體系統(tǒng)的第一成分(C1q)。
有多達(dá)5種主鏈重鏈類型，稱為α，δ，ε，γ和μ，γ鏈進(jìn)一步細(xì)分成γ1，γ2，γ3和γ4，α鏈分成α1和α2鏈。兩種輕鏈類型稱為κ和λ。重鏈的存在產(chǎn)生免疫球蛋白的主要類型IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。IgG可進(jìn)一步細(xì)分成IgG1，IgG2，IgG3和IgG4亞類，IgA可分成IgA1和IgA2亞類。
本文使用的術(shù)語“免疫球蛋白M”或“IgM”是指由J鏈連接的5個IgM單體的五聚體。單體IgM分子與上述免疫球蛋白分子具有相同的基本結(jié)構(gòu)。IgM是在抗體反應(yīng)中合成的第一種免疫球蛋白。作為一個五聚體，它具有多個功能域且因此是一種強效的補體激活劑。
術(shù)語“致病性免疫球蛋白”是指介導(dǎo)再灌注后組織損傷的上述免疫球蛋白分子。在一個實施方案中，致病性免疫球蛋白可定位于內(nèi)皮表面或?qū)嵸|(zhì)組織上，例如，通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面或?qū)嵸|(zhì)組織上存在的抗原(例如，局部缺血特異性抗原)結(jié)合來定位。一旦定位到內(nèi)皮表面或?qū)嵸|(zhì)組織表面，致病性免疫球蛋白可介導(dǎo)免疫細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)或傳統(tǒng)補體系統(tǒng)的成分，例如，C1q的結(jié)合，從而觸發(fā)組織損傷?？贵w可以是各種同種型，包括IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，IgA1，IgA2，IgA小類，IgD，或IgE。優(yōu)選的是，致病性免疫球蛋白是作為補體激活劑的抗體同種型。優(yōu)選的是，致病性免疫球蛋白是IgM。致病性免疫球蛋白優(yōu)選是全長的(例如，IgM或IgG(例如，IgG1和IgG3)抗體)。
本文使用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”或“片斷”)是指抗體的一個或多個保留與抗原(例如，靶抗原，例如，局部缺血抗原)自特異性結(jié)合能力的片斷。包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)的結(jié)合片斷的例子包括(i)Fab片斷，由VL，VH，CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片斷；(ii)F(ab′)2片斷，包含由鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接的兩個Fab片斷的二價片斷；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片斷；(iv)由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片斷，(v)dAb片斷(Ward等，(1989)Nature341544-546)，由VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)。另外，盡管Fv片斷的兩個結(jié)構(gòu)域，VL和VH由分離的基因編碼，但可使用重組方法用合成接頭將它們連接起來，使得可作為單個蛋白質(zhì)鏈來制備它們，其中VL和VH區(qū)域?qū)π纬蓡蝺r分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。該單鏈抗體也打算包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。這些抗體片斷可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并按與完整抗體相同的方式篩選該片斷用途。
本文使用的“再灌注”是指在例如，局部缺血中血流狹窄或阻塞后恢復(fù)血管中的血流的過程。
術(shù)語“局部缺血性再灌注”是指局部缺血的組織再灌注后的急性炎癥反應(yīng)。再灌注可在自然出現(xiàn)的發(fā)作，例如中風(fēng)后，或者在故意阻斷血管中血流的手術(shù)操作期間產(chǎn)生。由于，例如，阻斷血管中血流的血凝塊可觸發(fā)血管的狹窄或阻塞。在諸如此類的情況下，內(nèi)皮的完整性被破壞，結(jié)果可開始凝血級聯(lián)并形成位于原始凝塊阻塞下游的更小的毛細(xì)血管中的新凝塊。組織損傷在這種再流動期間發(fā)生。
“免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注損傷”是指由免疫球蛋白，例如，致病性免疫球蛋白直接或間接介導(dǎo)的內(nèi)皮完整性的破壞。不受理論的約束，據(jù)信局部缺血期間，新抗原(例如，局部缺血特異性抗原)在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)或者暴露于其上。然后這些新抗原被靠近損傷位點聚集的致病性免疫球蛋白識別。集中的致病性免疫球蛋白能觸發(fā)內(nèi)皮組織損傷，例如通過激活效應(yīng)細(xì)胞功能或補體途徑。
本文使用的術(shù)語“局部缺血”是指器官或組織血流的暫時或持久性不足。在心血管組織中，局部缺血可引起至少兩種心血管疾病，即心絞痛和急性心肌梗塞(心臟病發(fā)作)。一般來說，涉及心肌的局部缺血可由諸如動脈粥樣硬化或痙攣的冠狀動脈疾病引起。術(shù)語“局部缺血損傷”是指由組織或器官血流暫時或持久不足引起的在例如，組織或器官中的內(nèi)皮完整性破壞。
本文使用的術(shù)語“局部缺血特異性抗原”是指存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原。優(yōu)選的是，局部缺血特異性抗原響應(yīng)損傷，例如局部缺血損傷而表達(dá)或暴露。
本文使用的“B-1細(xì)胞”是指B細(xì)胞的一個產(chǎn)生致病性免疫球蛋白的亞群。一般來說，B-1細(xì)胞表達(dá)低水平的IgD和CD23，這些細(xì)胞的一個主要級分表達(dá)細(xì)胞表面蛋白CD5(Hardy等，(1994)Immunol.Rev.137，91；Kantor等，(1993)Annu.Rev Immunol.11，501-538)。它們一般返回腹膜和腸系膜組織且至少在小鼠中不出現(xiàn)循環(huán)(Herzenberg等，(1986)Immunol.Rev.9381-102；Martin等，Cur Op.Immunol.13195-201)。與常規(guī)B-細(xì)胞不同，它們不經(jīng)歷體細(xì)胞(somatic)高變和親和力成熟。它們在胎兒和新生兒發(fā)育期間出現(xiàn)且通過成人骨髓移植不容易再生。通過在外周淋巴結(jié)和脾臟中有限的出現(xiàn)率和通過主要位于腹膜腔中可進(jìn)一步區(qū)分這些細(xì)胞。
術(shù)語“補體”是指由超過20種蛋白質(zhì)(包括調(diào)控因子)組成的蛋白質(zhì)級聯(lián)。與凝血系統(tǒng)一樣，該系統(tǒng)的激活啟動級聯(lián)事件，其中酶原被依次激活，通過蛋白裂解產(chǎn)生細(xì)胞表面受體的配體，潛在的生物活性肽和插入細(xì)胞膜中導(dǎo)致細(xì)胞死亡的末期復(fù)合物。中央成分是第三成分或C3。它可通過3種不同的途徑，即，傳統(tǒng)，凝集素或旁路途徑激活(Reid等，(1981)Semin.Immunopathol.15307-326；Muller-Eberhard，(1988)Ann.Rev.Biochem.57321-347)。
在一個實施方案中，致病性免疫球蛋白可通過傳統(tǒng)補體途徑起作用。傳統(tǒng)途徑通過抗原和抗體相互作用形成免疫復(fù)合物而被激活?？贵w只有在與其抗原反應(yīng)后才可結(jié)合或“固定”補體。復(fù)合物的形成誘導(dǎo)抗體分子中的構(gòu)象改變，暴露結(jié)合第一補體成分C1的位點。C1是由分別稱為C1q的三個肽的6條鏈和各兩個的C1s和C1r組成的多聚體化合物。6個C1q鏈本身成“束”排列且4個C1r和C1s分子以鈣依賴型相互作用附著。當(dāng)抗體結(jié)合兩個或多個C1q頭時，C1r裂解產(chǎn)生活性分子C1r，后者裂解C1s。C1s通過將下一個補體成分C4裂解成C4b和C4a延伸激活過程，C4b繼續(xù)反應(yīng)過程。C4裂解成C4b露出一個內(nèi)部硫酯鍵，它即刻被結(jié)合的水分子滅活，除非它與細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或糖類形成共價鍵。如果這樣，C4b變得相對穩(wěn)定且在鎂依賴型反應(yīng)中結(jié)合C2。C2然后被C1s裂解形成復(fù)合物C4b2a，稱為傳統(tǒng)途徑C3轉(zhuǎn)化酶。C3是C4的相似分子，具有內(nèi)部硫酯鍵。C3裂解產(chǎn)生兩種片斷。其中的較小片斷C3a具有強大的生物學(xué)特性。較大的C3b展示出不穩(wěn)定的結(jié)合位點，允許該分子結(jié)合C4b2a。C3b與C4b2a的結(jié)合導(dǎo)致產(chǎn)生傳統(tǒng)途徑的最后一個酶C4b2a3b，稱為傳統(tǒng)途徑C5轉(zhuǎn)化酶，它裂解C5，即膜攻擊途徑的一種成分。
在另一實施方案中，致病性免疫球蛋白可通過補體旁路途徑起作用。在這種旁路途徑中，C3產(chǎn)生C3b，C3bB和C3bBb，而C3bBb裂解C3。如果活化酶穩(wěn)定在細(xì)菌的細(xì)胞壁，或者如果從傳統(tǒng)途徑產(chǎn)生更多的C3b則加速該過程。這種旁路途徑產(chǎn)生C5轉(zhuǎn)化酶C3bBb3b。
本文使用的語言“受試者”打算包括人類和非人動物。優(yōu)選的人類動物體包括局部缺血再灌注損傷的病人。本發(fā)明的術(shù)語“非人動物”或“非人”包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，例如，非人靈長類，嚙齒類，綿羊，狗，奶牛，雞，兩棲類，爬行類等。
本文使用的“抑制劑”是指減小或抑制(完全或部分)致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間相互作用；或減小或抑制致病性免疫球蛋白和補體途徑的成分，例如C1q之間的相互作用的一種試劑。術(shù)語“相互作用”是指兩個或多個分子之間的物理聯(lián)系，例如，結(jié)合。相互作用可以是直接或間接的。優(yōu)選的是，抑制劑拮抗致病性免疫球蛋白的一種或多種下列活性(i)抑制或減小致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間的相互作用(例如，結(jié)合)；(ii)抑制或減少致病性免疫球蛋白和補體途徑的成分，例如C1q之間的相互作用(例如，結(jié)合)；(iii)中和致病性免疫球蛋白，例如，通過螯合免疫球蛋白和/或瞄準(zhǔn)其降解；或(iv)抑制或減少致病性免疫球蛋白的產(chǎn)生，例如抑制致病性抗體的合成，裝配，和/或翻譯后修飾。該抑制劑可以是蛋白質(zhì)(例如，抗體，例如抗獨特型抗體或其片斷)，肽；小的有機分子。術(shù)語“抑制劑”和“試劑”在本文中可互換使用。
本文使用的抑制劑的“有效量”是指試劑的量在單次或多次劑量施用給受試者，例如患者時，在減小或消去再灌注或局部缺血損傷方面是有效的。再灌注損傷的這種減小或消去可反映為，比沒有該治療時所預(yù)期的受試者(例如患者)的存活期延長，或者相對于沒有該治療的受試者的預(yù)后的任何改善。抑制劑可用于治療(例如，減小或消去已有的損傷)或預(yù)防(例如，延遲其發(fā)作的發(fā)生或復(fù)發(fā))再灌注或局部缺血損傷。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會預(yù)料到有些因素可影響有效治療受試者所需的劑量和時間選擇，包括但不限于疾病或紊亂的嚴(yán)重性，以前的治療，受試者的總體健康狀況和/或年齡，和存在的其它疾病。
本文使用的術(shù)語“共有序列”是指由相關(guān)序列的一個家族中最常出現(xiàn)的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(參見，例如，Winnaker，F(xiàn)rom Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，德國1987))。在蛋白質(zhì)家族中，共有序列中的各位置被在該家族中在該位置最常出現(xiàn)的氨基酸占據(jù)。如果兩個氨基酸以相等的頻率出現(xiàn)，在共有序列中可包含兩者中的任一氨基酸?！肮灿锌蚣堋笔侵冈诠灿忻庖咔虻鞍仔蛄兄械目蚣軈^(qū)。
本文使用的術(shù)語“在低度嚴(yán)格，中度嚴(yán)格，高度嚴(yán)格或極高嚴(yán)格條件下雜交”描述了雜交和洗滌的條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的指導(dǎo)可參見CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y(1989)，6.3.1-6.3.6，它被作為參考文獻(xiàn)引用。在該參考文獻(xiàn)中描述了含水的和不含水的方法且可使用任一種。本文涉及的具體雜交條件如下1)在大約45℃的6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著在0.2XSSC，0.1％SDS中在至少50℃下洗滌兩次(低度嚴(yán)格條件的洗滌溫度可增加到55℃)的低度嚴(yán)格條件；2)在大約45℃的6X SSC中雜交，接著在0.2XSSC，0.1％SDS中在60℃下洗滌一次或多次的中度嚴(yán)格條件；3)在大約45℃的6X SSC中雜交，接著在0.2XSSC，0.1％SDS中在65℃下洗滌一次或多次的高度嚴(yán)格條件；和優(yōu)選4)極高嚴(yán)格條件是在65℃的0.5M磷酸鈉，7％SDS中雜交，接著在0.2XSSC，1％SDS中在65℃下洗滌一次或多次。極高嚴(yán)格條件(4)是優(yōu)選的條件且是應(yīng)使用的條件，除非另有說明。
序列之間的同源性或序列相同性(該術(shù)語在本文中可互換使用)的計算按如下進(jìn)行。
為了測定兩個氨基酸序列，或兩個核酸序列的相同性百分?jǐn)?shù)，對比該序列以達(dá)到最佳比較的目的(例如，為了最佳對比可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個或兩個序列中導(dǎo)入缺口且為了進(jìn)行比較可不考慮非同源性序列)。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于比較目的而對比的參考序列的長度占參考序列長度的至少30％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，60％，且甚至更優(yōu)選至少70％，80％，90％，100％。然后比較在相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)在第一序列中的一個位置被與第二序列相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，那么分子在該位置是相同的(本文使用的氨基酸或核酸“相同性”等價于氨基酸或核酸“同源性”)。兩序列之間的相同性百分?jǐn)?shù)是序列所共有的相同位置數(shù)的函數(shù)，同時考慮為了兩序列的最佳對比而需要導(dǎo)入的缺口數(shù)，和各缺口的長度。
序列比較和兩序列之間相同性百分?jǐn)?shù)的測定可使用數(shù)學(xué)算法進(jìn)行。在一個優(yōu)選的實施方案中，兩個氨基酸序列之間的相同性百分?jǐn)?shù)使用編入GCG軟件包(可在http//WWW.gcg.com獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48444-453)算法，使用Blossum 62模型(matrix)或PAM250模型，缺口權(quán)重為16，14，12，10，8，6，或4且長度權(quán)重為1，2，3，4，5，或6來測定。在另一優(yōu)選的實施方案中，兩個核苷酸序列之間的相同性百分?jǐn)?shù)使用在GCG軟件包(可在http//www.gcg.com獲得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP模型，缺口權(quán)重為40，50，60，70，或80且長度權(quán)重為1，2，3，4，5，或6來測定。特別優(yōu)選的參數(shù)組(且是應(yīng)使用的參數(shù)組，除非另有說明)是缺口罰分為12，缺口伸長罰分為4和移碼缺口罰分為5的Blossum 62計分模型。
兩個氨基酸或核苷酸序列之間的相同性百分?jǐn)?shù)可使用已編入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，411-17)算法，使用PAM120權(quán)重剩余表，缺口長度罰分為12且缺口罰分為4來測定。鑒定致病性免疫球蛋白抑制劑的方法在一個方面，本發(fā)明提供了從一種或多種(例如，眾多的)試驗化合物中鑒定能抑制致病性免疫球蛋白與局部缺血特異性抗原，或者致病性免疫球蛋白與補體途徑的一種成分之間相互作用的抑制劑的方法。該抑制劑可以是一種蛋白質(zhì)(例如，抗體或其片斷)；肽；糖類；糖蛋白；或者有機小分子。試驗化合物的文庫抑制劑可以是有機小分子，例如組合文庫的一個成員。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制劑的文庫。組合文庫的合成是本領(lǐng)域熟知的且已有綜述(參見，例如，E.M.Gordon等，J Med.Chem.(1994)371385-1401；DeWitt，S.H.；Czarnik，A.W.Acc.Chem.Res.(1996)29114；Armstrong，R.W.；Combs，A.P.；Tempest，P.A.；Brown，S.D.；Keating，T.A.Acc.Chem.Res.(1996)29123；Ellman，J.A.Acc.Chem.Res.(1996)29132；Gordon，E.M.；Gallop，M.A.；Patel，D.V Acc.Chem.Res.(1996)29144；Lowe，G.Chem.Soc.Rev.(1995)309，Blondelle等Trends Anal.Chem.(1995)1483；Chen等，J Am.Chem.Soc.(1994)1162661；美國專利5,359,115，5,362,899，和5,288,514；PCT公開號WO92/10092，WO93/09668，WO91/07087，WO93/20242，WO94/08051)。
本發(fā)明的化合物文庫可按各種方法來制備，其中的一些方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，“分開-合并(split-pool)”策略可按下述方式實施在眾多反應(yīng)容器中放置功能化聚合體支持物的珠；適合于固相肽合成的各種聚合體支持物是已知的，且有些是商業(yè)上可獲得的(例如，參見，例如，M.Bodansky“Principles of Peptide Synthesis”，第二版，Springer-Verlag，柏林(1993))。向每等分的珠中加入不同的活化氨基酸的溶液，允許反應(yīng)進(jìn)行以產(chǎn)生眾多固定的氨基酸，每個反應(yīng)容器中一種。然后洗滌等分的衍生珠，“合并”(即，重組)，并再分開該珠的合并物，每個等分放在分離的反應(yīng)容器中。然后向各等分的珠中加入另一種活化的氨基酸。重復(fù)該合成循環(huán)直到獲得所需的肽長度。可隨機選擇在每次合成循環(huán)中加入的氨基酸殘基；另外，可選擇氨基酸以提供“偏向性(biased)”文庫，例如，非隨機選擇抑制劑的某些部分以提供例如，與已知肽具有已知結(jié)構(gòu)相似性或同源性的抑制劑的文庫，該已知肽能與抗體相互作用，例如抗獨特型抗體的抗原結(jié)合位點?？深A(yù)料到以這種方式可容易地產(chǎn)生各種肽類，肽模擬物，或非肽化合物。
“分開-合并”策略產(chǎn)生諸如抑制劑的肽文庫，可用于制備本發(fā)明的試驗化合物的文庫。在另一舉例性的合成中，以Hobbs DeWitt等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.906909(1993))的方法構(gòu)建“多樣體文庫(diversomerlibrary)”。也可使用包括Houghten的“茶包(teabag)”技術(shù)(參見，例如，Houghten等，Nature35484-86(1991))的其它合成方法合成根據(jù)本發(fā)明的化合物的文庫。
可篩選化合物文庫以測定該文庫的任何成員是否具有所需活性，且如果有，則鑒定為活性種類。篩選組合文庫的方法已有描述(參見，例如，Gordon等，J Med.Chem.，出處同上)?？扇苄曰衔镂膸炜捎煤线m的受體以親和色譜法篩選以分離該受體的配體，接著通過常規(guī)技術(shù)(例如，質(zhì)譜分析法，NMR等)鑒定分離的配體。固相化合物通過用可溶性受體與化合物接觸可篩選；優(yōu)選的是，可溶性受體結(jié)合到可被檢測以指示配體結(jié)合的標(biāo)記(例如，熒光團(tuán)，比色酶，放射性同位素，發(fā)光化合物等)上。另外，固相化合物可選擇性釋放并允許通過膜擴(kuò)散以便與受體相互作用。下面描述了用于篩選本發(fā)明的文庫的舉例性試驗。
在一個實施方案中，通過試驗各化合物直接結(jié)合免疫球蛋白或抑制免疫球蛋白與局部缺血抗原之間相互作用的活性，例如，通過在例如，單孔平板或諸如標(biāo)準(zhǔn)96孔微量滴定板的多孔平板中將試驗化合物與免疫球蛋白和一種裂解產(chǎn)物，例如內(nèi)皮細(xì)胞裂解產(chǎn)物一起溫育，可篩選本發(fā)明的化合物與致病性免疫球蛋白相互作用的能力。在該實施方案中，可測定各單個化合物的活性?？墒褂脽o試驗化合物的一個孔或多個孔作為對照。溫育后，可通過分析各孔而測定各試驗化合物的活性。因此，可平行測定眾多試驗化合物的活性。蛋白質(zhì)或肽抑制劑蛋白質(zhì)或肽抑制劑可使用例如，上文所述的組合系統(tǒng)來鑒定。另外，可使用致病性免疫球蛋白，靶抗原或補體途徑成分中任一種的片斷或肽抑制這些蛋白質(zhì)間的相互作用。
包含“非必需”氨基酸取代的致病性免疫球蛋白，靶抗原或補體途徑成分中任一種的片斷或肽的變異體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。非必需氨基酸取代是指不消除或更優(yōu)選的是，基本上不改變生物學(xué)活性的對野生型序列做出的改變，而“必需”氨基酸殘基導(dǎo)致這樣一種改變。
“保守氨基酸取代”是氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)的氨基酸。因此，在致病性免疫球蛋白中預(yù)測的非必需氨基酸殘基可優(yōu)選被來自相同側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基取代。作為選擇，在另一實施方案中，可在全部或部分致病性免疫球蛋白的編碼序列中通過例如，飽和誘變隨機導(dǎo)入突變，并篩選所得的突變體的生物學(xué)活性。
在另一方面，本發(fā)明還有一個特征在于一種例如，用作興奮劑(模擬物)或用作拮抗劑的修飾的致病性免疫球蛋白。優(yōu)選的是，修飾的致病性免疫球蛋白用作補體激活的拮抗劑。致病性免疫球蛋白的變異體可通過誘變，例如分散的點突變，插入或缺失序列或致病性免疫球蛋白的截短來產(chǎn)生。致病性免疫球蛋白的興奮劑可基本上保留蛋白質(zhì)的天然存在形式的相同或一部分(subset)生物學(xué)活性。致病性免疫球蛋白的拮抗劑可通過，例如能與局部缺血特異性抗原結(jié)合，但不能激活補體途徑來抑制致病性免疫球蛋白的天然存在形式的一種或多種活性。因此，可通過用限制功能的變異體處理來產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)。
在一個實施方案中，可誘變致病性免疫球蛋白(例如，致病性IgM)內(nèi)結(jié)合C1q的位點使其不再能夠結(jié)合C1q。例如，可誘變已知含有C1q結(jié)合位點的IgG的CH2結(jié)構(gòu)域和IgM的CH4結(jié)構(gòu)域(參見WO 94/29351)。例如，可突變表現(xiàn)出介導(dǎo)C1q結(jié)合和隨后的補體激活的IgG的CH2結(jié)構(gòu)域的羧基末端一半(殘基231至239，優(yōu)選在234至239內(nèi))。作為另一例子，Wright等證實了在IgM恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域中的單個核苷酸改變產(chǎn)生在起動補體依賴型細(xì)胞裂解方面有缺陷的抗體。單核苷酸改變導(dǎo)致在第三個恒定區(qū)的氨基酸位置436處編碼絲氨酸殘基，而不是正常的脯氨酸殘基(Wright等1988，J.Biol.Chem.26311221)。為了改變補體結(jié)合或活性而對抗體做出的氨基酸取代是本領(lǐng)域中熟知的(參見例如，Wright等，1988，J.Biol.Chem.26311221；Shulman等(1986)，Proc.Natl.Acad Sci.USA 837678-7682；Arya等，(1994)J.Immunol.2531206-1212；Poon等，(1995)J.Biol.Chem.2708571-8577，這里引用所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容以供參考)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體具有改變補體結(jié)合或活性的突變。加入，缺失或取代了氨基酸的抗體本文稱為修飾的抗體或改變的抗體。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員會預(yù)料到的，用于在核苷酸或氨基酸序列中引起該改變的方法將依賴于所需的結(jié)果而改變。
致病性免疫球蛋白的變異體可通過篩選致病性免疫球蛋白的突變體，例如截短突變體的組合文庫的興奮劑或拮抗劑活性來鑒定。
致病性免疫球蛋白編碼序列的片斷，例如N末端，C末端或內(nèi)部片斷的文庫可用于產(chǎn)生多樣化的片斷群體用于篩選和隨后選擇該蛋白質(zhì)的變異體。特別優(yōu)選加入或缺失半胱氨酸殘基或加入或缺失糖基化殘基的變異體。
用于篩選由點突變或截短制備的組合文庫的基因產(chǎn)物的方法，和用于篩選具有選定特性的基因產(chǎn)物的cDNA文庫的方法。循環(huán)整體誘變(REM)是一種提高文庫中功能性突變體的頻率的技術(shù)，它可與篩選試驗結(jié)合使用來鑒定變異體(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave等，(1993)Protein Engineering 6(3)327-331)。
可開發(fā)基于細(xì)胞的試驗以分析多樣化文庫。例如，可將表達(dá)載體文庫轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞系，例如，一般以底物依賴型方式應(yīng)答該蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。然后可從評價為抑制，或者任選加強由致病性免疫球蛋白-底物產(chǎn)生的信號的細(xì)胞中回收質(zhì)粒DNA，并進(jìn)一步鑒定單個的克隆。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種制備致病性免疫球蛋白，例如具有非野生型活性的致病性免疫球蛋白，例如，天然存在的致病性免疫球蛋白的拮抗劑，興奮劑，或超興奮劑的方法。該方法包括通過例如取代或缺失本文公開的非保守區(qū)，結(jié)構(gòu)域或殘基的一個或多個殘基改變致病性免疫球蛋白的序列，并檢測改變的多肽的所需活性。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種制備改變了天然致病性免疫球蛋白生物學(xué)活性的致病性免疫球蛋白片斷或類似物的方法。該方法包括通過例如取代或缺失致病性免疫球蛋白的一個或多個殘基，例如改變本文公開的非保守區(qū)序列，或結(jié)構(gòu)域或殘基，并檢測改變的多肽的所需活性。免疫球蛋白的產(chǎn)生在其它實施方案中，抑制劑可以是抗體或其片斷，例如，抗獨特型抗體或其抗原結(jié)合片斷。
本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”(mAb或mAbs)是指單分子成分的抗體分子。單克隆抗體成分表現(xiàn)出對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。因此，術(shù)語“人單克隆抗體”是指具有來自人類種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的表現(xiàn)出單一結(jié)合特異性的抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與永生細(xì)胞融合的從具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的B細(xì)胞。
生產(chǎn)抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，抗靶(例如，致病性免疫球蛋白或細(xì)胞上的局部缺血特異性抗原)的單克隆抗體可通過各種技術(shù)來生產(chǎn)，包括常規(guī)單克隆抗體方法學(xué)，例如Kohler和Milstein，Nature256495(1975)的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。盡管優(yōu)選體細(xì)胞雜交方法，但原則上可采用用于產(chǎn)生單克隆抗體的其它技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。制備雜交瘤的優(yōu)選動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。在小鼠中的雜交瘤生產(chǎn)是非常成熟的方法。免疫方法和分離用于融合的免疫脾細(xì)胞的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。融合對象(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合方法也是已知的。
使用攜帶非小鼠系統(tǒng)的人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可產(chǎn)生人單克隆抗體。來自用目的抗原免疫的這些轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞用于生產(chǎn)分泌對人蛋白質(zhì)的表位具有特異性親和力的人mAbs的雜交瘤(參見，例如，Wood等，國際申請WO 91/00906，Kucherlapati等，PCT公開號WO 91/10741；Lonberg等，國際申請WO 92/03918；Kay等，國際申請92/03917；Lonberg，N.等，1994 Nature 368856-859；Green，L.L.等，1994 Nature Genet.713-21；Morrison，S.L.等，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855；Bruggeman等，1993 Year Immunol 733-40；Tuaillon等，1993 PNAS 903720-3724；Bruggeman等，1991 Eur J Immunol 211323-1326)。
在一個實施方案中，雜交瘤可由人CD5+，B-1細(xì)胞產(chǎn)生。另外，可使用識別交叉反應(yīng)性“局部缺血抗原”的“人源化”鼠雜交瘤。
單克隆抗體也可用重組DNA技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方法產(chǎn)生。稱為“組合抗體展示(display)”方法的另一方法已被開發(fā)用于鑒定和分離具有特定抗原特異性的抗體片斷并可用于產(chǎn)生單克隆抗體(關(guān)于組合抗體展示的描述，參見例如，Sastry等，1989 PNAS 865728；Huse等，1989 Science2461275；和Orlandi等1989 PNAS 863833)。用上述免疫原免疫動物后，克隆所得B-細(xì)胞庫的抗體庫。使用寡聚體引物的混合物和PCR獲得免疫球蛋白分子的不同群體的可變區(qū)的DNA序列的方法是公知的。例如，相應(yīng)于5’前導(dǎo)(信號肽)序列和/或框架(FR1)序列的混合寡核苷酸引物以及保守的3’恒定區(qū)引物可用于PCR擴(kuò)增許多鼠抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)(Larrick等，1991，Biotechniques 11152-156)。相似的方法也可用于擴(kuò)增人抗體的人重鏈和輕鏈可變區(qū)。(Larrick等，1991，Methods；Companion to Methods inEnzymology 2106-110)。
在一個舉例性的實施方案中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，美國專利號4,683,202；Orlandi，等，PNAS(1989)863833-3837；Sastry等，PNAS(1989)865728-5732；和Huse等(1989)Science2461275-1281)從B淋巴細(xì)胞，例如外周血細(xì)胞，骨髓或脾制品中分離RNA。使用重鏈恒定區(qū)及κ和λ輕鏈各自特異性的引物以及信號序列的引物合成第一鏈cDNA。使用可變區(qū)PCR引物分別單獨或者組合擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)，并連接進(jìn)合適的載體中用于在制備展示包裝體中進(jìn)一步操作。用于擴(kuò)增方案的寡核苷酸引物可以是單一序列或簡并序列或可在簡并位置摻入肌苷。限制性核酸內(nèi)切酶識別序列也可插入引物中以便允許將擴(kuò)增片斷在預(yù)定的閱讀框克隆進(jìn)載體中用于表達(dá)。
從免疫產(chǎn)生的抗體庫克隆的V-基因文庫可通過展示包裝體的群體，優(yōu)選來自絲狀噬菌體的群體進(jìn)行表達(dá)以形成抗體展示文庫。理想的是，展示包裝體包含允許極大多樣化抗體展示文庫的取樣，每輪親和分離后迅速分類和容易從純化的展示包裝體分離抗體基因的系統(tǒng)。除了商業(yè)上可獲得的用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫的試劑盒(例如，Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，目錄號27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號240612)外，特別適用于產(chǎn)生多樣化抗體展示文庫的方法和試劑的例子可參見，例如，Ladner等，美國專利號5,223,409；Kang等，國際公開號WO 92/18619；Dower等，國際公開號WO 91/17271；Winter等，國際公開號WO 92/20791；Markland等，國際公開號WO 92/15679；Breitling等，國際公開WO 93/01288；McCafferty等，國際公開號WO 92/01047；Garrard等，國際公開號WO 92/09690；Ladner等，國際公開號WO 90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology91370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas381-85；Huse等(1989)Science2461275-1281；Griffths等，(1993)EMBO J12725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol226889-896；Clackson等(1991)Nature352624-628；Gram等(1992)PNAS893576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology91373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res194133-4137；和Barbas等(1991)PNAS887978-7982。
在有些實施方案中，重鏈和輕鏈的V區(qū)結(jié)構(gòu)域可在通過彈性接頭連接的同一多肽上表達(dá)以形成單鏈Fv片斷，并將scFV基因隨后克隆進(jìn)所需表達(dá)載體或噬菌體基因組中。按McCafferty等，Nature(1990)348552-554中的一般性描述，以彈性(Gly4-Ser)3接頭連接的抗體的完整VH和VL結(jié)構(gòu)域可用于產(chǎn)生單鏈抗體，該抗體可產(chǎn)生基于抗原親和性可分離的展示包裝體。與抗原免疫反應(yīng)的分離的scFV抗體隨后配制成藥用制品用于本方法。
一旦在展示包裝體(例如，絲狀噬菌體)的表面展示，可用靶抗原或其肽片斷篩選抗體文庫以鑒定和分離表達(dá)對靶抗原具有特異性的抗體的包裝體?？蓮恼故景b體(例如，從噬菌體基因組)中回收編碼選定抗體的核酸并通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)亞克隆進(jìn)其它表達(dá)載體中。
對表面蛋白具有高親和力的特異性抗體分子可按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法，例如包含文庫篩選的方法(Ladner，R.C.，等，美國專利5,233,409；Ladner，R.C.等，美國專利5,403,484)來制備。另外，可使用篩選這些文庫的方法獲得作為抗體結(jié)構(gòu)性決定簇的模擬物的結(jié)合決定簇。
具體地說，特定抗體分子結(jié)合Fv的表面按照蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的原則與其靶配體相互作用，因此VH和VL的序列數(shù)據(jù)(后者可以是κ或λ鏈型的數(shù)據(jù))是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的蛋白質(zhì)工程技術(shù)的基礎(chǔ)。使用從NMR研究或晶體學(xué)數(shù)據(jù)獲得的來自其它抗體的以前測定的三維結(jié)構(gòu)通過模擬方法可從抗體序列信息獲得包含結(jié)合決定簇的蛋白質(zhì)表面的詳情。參見，例如，Bajorath，J.和S.Sheriff，1996，ProteinsStruct，F(xiàn)unct.，and Genet.24(2)，152-157；Webster，D.M.和A.R.Rees，1995，“抗體結(jié)合位點的分子模型”，參見S.Paul，編輯，Methods in Molecular Biol.51，抗體工程方法，Humana Press，Totowa，NJ，第17-49頁；和Johnson，G，Wu，T.T.和E.A.Kabat，1995，“SeqhuntA program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences”，見Methodsin Molecular Biol.51，op.cit.，第1-15頁。
在一個實施方案中，多樣化肽文庫由展示包裝體群來表達(dá)以形成肽展示文庫。理想的是，展示包裝體包含允許極大多樣化的肽展示文庫的取樣，每輪親和分離后迅速分類和容易從純化的展示包裝體分離編碼肽的基因的系統(tǒng)。肽展示文庫可以在，例如原核生物和病毒中，它可被迅速擴(kuò)增，相對容易操作，且允許產(chǎn)生大量克隆。優(yōu)選的展示包裝體包括例如，無性繁殖的細(xì)菌細(xì)胞，細(xì)菌芽孢，且最優(yōu)選細(xì)菌病毒(特別是DNA病毒)。然而，本發(fā)明也包含使用包括酵母及其孢子的真核細(xì)胞作為潛在的展示包裝體。噬菌體展示文庫在上文中描述。
其它技術(shù)包括用合適的“受體”，例如，靶抗原進(jìn)行親和層析，接著以常規(guī)技術(shù)(例如，質(zhì)譜法和NMR)鑒定分離的結(jié)合試劑或配體。優(yōu)選的是，將可溶性受體偶連標(biāo)記物(例如，熒光團(tuán)，比色酶，放射性同位素，或發(fā)光化合物)，檢測該標(biāo)記就可指示與配體的結(jié)合。另外，可選擇性釋放固相化合物并允許通過膜擴(kuò)散與受體相互作用。
化合物的組合文庫合成后可以帶有編碼文庫各成員身份的“標(biāo)記”(參見，例如，W.C.Still等，國際申請WO 94/08051)。一般來說，該方法的特征在于使用附著到固相支持物或化合物上的惰性但容易被檢測的標(biāo)記。當(dāng)檢測活性化合物時，通過鑒定特有的伴隨標(biāo)記確定化合物的身份。這一標(biāo)記方法允許合成大型文庫，其中可在文庫的全套所有化合物中鑒定極低水平的化合物。
術(shù)語“修飾的抗體”打算包括通過例如，缺失，加入或取代該抗體的一部分而進(jìn)行了修飾的抗體，例如單克隆抗體，嵌合抗體，和人源化抗體。例如，可通過缺失鉸鏈區(qū)，從而產(chǎn)生單價抗體來修飾抗體。本發(fā)明的抗體可以是其可變區(qū)或其部分，例如互補決定區(qū)(CDR或CDRs)在非人生物體，例如大鼠或小鼠中產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明包括嵌合的，CDR-嫁接的(grafted)和人源化的抗體。本發(fā)明包括在非人生物體，例如大鼠或小鼠中產(chǎn)生的，且然后在例如可變框架或恒定區(qū)被修飾以降低在人體中的抗原性的抗體。任何修飾都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要該抗體具有至少一個抗原結(jié)合部分。
嵌合抗體(例如，小鼠-人單克隆抗體)可用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，編碼鼠(或其它物種)單克隆抗體分子Fc恒定區(qū)的基因用限制性酶消化以取出編碼鼠Fc的區(qū)域，并取代編碼人Fc恒定區(qū)的基因的對等部分(參見Robinson等，國際專利申請PCT/US86/02269；Akira，等，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等，歐洲專利申請173,494；Neuberger等，國際申請WO 86/01533；Cabilly等，美國專利號4,816,567；Cabilly等，歐洲專利申請125,023；Better等(1988 Science 2401041-1043)；Liu等(1987)PNAS 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；和Shaw等，1988，J.NatlCancer Inst.801553-1559)。
用來自人類Fv可變區(qū)的對等序列取代不直接涉及抗原結(jié)合的Fv可變區(qū)序列可進(jìn)一步人源化嵌合抗體。產(chǎn)生人源化抗體的常規(guī)方法參見Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207，Oi等，1986，BioTechniques 4214，和Queen等US 5,585,089，US 5,693,761和US 5,693,762，這里引入所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容以供參考。這些方法包括分離，操作，和表達(dá)編碼來自至少一個重鏈或輕鏈的全部或部分免疫球蛋白Fv可變區(qū)的核酸序列。該核酸的來源是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，例如可從7E3和生產(chǎn)抗-GPIIbIIIa抗體的雜交瘤獲得。然后可將編碼嵌合抗體或其片斷的重組DNA克隆進(jìn)合適的表達(dá)載體中。合適的人源化抗體可任選通過CDR取代產(chǎn)生。美國專利5,225,539；Jones等，1986 Nature 321552-525；Verhoeyan等，1988 Science 2391534；和Beidler等，1988 J.Immunol.1414053-4060。
人源化的或CDR-嫁接的抗體可通過CDR-嫁接或CDR取代產(chǎn)生，其中可取代免疫球蛋白鏈的一個，兩個，或全部CDR。參見例如，美國專利5,225,539；Jones等，1986 Nature 321552-525；Verhoeyan等，1988 Science 2391534；Beidler等，1988.J.Immunol.1414053-4060；Winter US 5,225,539，這里清楚地引入所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容以供參考。Winter描述了一種可用于制備本發(fā)明的人源化抗體的CDR-嫁接方法(英國專利申請GB 2188638A，申請日為1987年3月26日；Winter US 5,225,539)，清楚地引用其內(nèi)容以供參考。
人源化的或CDR-嫁接的抗體有至少一個或兩個，但一般是所有的受體的(重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白鏈的)CDR用供體CDR取代。優(yōu)選的是，供體是嚙齒類抗體，例如大鼠或小鼠抗體，受體是人的框架或人的共有框架。一般來說，提供CDR的免疫球蛋白稱為“供體”，提供框架的免疫球蛋白稱為“受體”。在一個實施方案中，供體免疫球蛋白是非人的(例如，嚙齒類)。受體框架可以是天然存在的(例如，人的)框架或共有框架，或與其大約85％或更高，優(yōu)選90％，95％，99％或更高相同的序列。
特定抗體的所有CDRs可用非人CDR的至少一部分取代，或者只有一部分CDRs被非人CDRs取代。只需要取代人源化抗體與Fc受體結(jié)合所需數(shù)目的CDRs。
取代，缺失或加入了特定氨基酸的嵌合和人源化抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具體地說，優(yōu)選的人源化抗體在框架區(qū)具有氨基酸取代以便例如提高與抗原的結(jié)合。例如，人源化抗體具有與供體框架殘基或者與除受體框架殘基以外的另一氨基酸相同的框架殘基。作為另一例子，在具有小鼠CDRs的人源化抗體中，位于人框架區(qū)的氨基酸可用位于小鼠抗體相應(yīng)位置的氨基酸取代。已知在有些情況下該取代提高人源化抗體與抗原的結(jié)合。
如上所述，本文使用的術(shù)語“抗原結(jié)合部分”或“抗體部分”或“片斷”是指保留特異性結(jié)合抗原(例如，靶抗原，例如局部缺血抗原)的能力的抗體的一個或多個片斷。使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得本發(fā)明的抗體片斷。例如，用胃蛋白酶消化抗體產(chǎn)生F(ab′)2片斷和多個小片斷。巰基乙醇還原抗體產(chǎn)生獨立的重鏈和輕鏈。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生獨立的Fab片斷和Fc片斷。如上所述按與完整抗體相同的方式篩選抗體片斷的用途。
22A5 IgM重鏈可變區(qū)的核苷酸序列在圖4A(SEQ ID NO1)中顯示，22A5 IgM重鏈可變區(qū)的氨基酸序列在圖5A(SEQ ID NO2)中顯示。重鏈可變區(qū)的CDR1結(jié)構(gòu)域相應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸大約30至34(SEQ IDNO4)且包含SEQ ID NO1的核苷酸大約91-105(SEQ ID NO3)，重鏈可變區(qū)的CDR2結(jié)構(gòu)域相應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸49至65(SEQ ID NO6)且包含SEQ ID NO1的核苷酸148-198(SEQ ID NO5)。
22A5 IgM輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列在圖4B(SEQ ID NO7)中顯示，22A5 IgM輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列在圖5B(SEQ ID NO8)中顯示。輕鏈可變區(qū)的CDR1結(jié)構(gòu)域相應(yīng)于SEQ ID NO8的氨基酸大約23至33(SEQ IDNO10)且包含SEQ ID NO7的核苷酸大約71-103(SEQ ID NO9)，輕鏈可變區(qū)的CDR2結(jié)構(gòu)域相應(yīng)于SEQ ID NO8的大約氨基酸49至55(SEQ IDNO12)且包含SEQ ID NO7的核苷酸大約149-169(SEQ ID NO11)。
技術(shù)人員會預(yù)料到編碼本發(fā)明的抗體或其片斷(例如，CDR結(jié)構(gòu)域，例如CDR2結(jié)構(gòu)域，或片斷)的核苷酸序列可使用遺傳密碼和標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)從本申請所述的核苷酸和氨基酸序列產(chǎn)生。而且，技術(shù)人員會預(yù)料到由于遺傳密碼的簡并性，其它核苷酸序列可編碼本文所列的氨基酸序列。
盡管通常是天然序列(除了修飾的限制性位點等以外)，但是可從cDNA，基因組或混合體突變本發(fā)明的核酸成分，由此按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提供基因序列。對于編碼序列，這些突變可影響所需的氨基酸序列。具體地說，本發(fā)明包含基本上相同于或來自于本文所述的天然V，D，J，恒定區(qū)，轉(zhuǎn)換區(qū)和其它這類序列的核苷酸序列(其中“來自于”是指一個序列相同于另一序列或者由它修飾而來)。
在一個實施方案中，分離的核酸包含具有圖4A(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列，或與其具有至少96％，97％，98％，99％或更高相同性的序列的22A5 IgM重鏈可變區(qū)核苷酸序列。在另一實施方案中，該分離的核酸編碼具有圖4B(SEQ ID NO7)所示核苷酸序列，或與其具有至少96％，97％，98％，99％或更高相同性的序列的22A5 IgM輕鏈可變區(qū)核苷酸序列。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的重鏈CDR1結(jié)構(gòu)域或其片斷或修飾形式的分離核酸。該核酸可僅編碼CDR1區(qū)或者可編碼完整的抗體重鏈可變區(qū)。例如，該核酸可編碼具有包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的CDR2結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域或其片斷或修飾形式的分離核酸。該核酸可僅編碼CDR2區(qū)或者可編碼完整的抗體重鏈可變區(qū)。例如，該核酸可編碼具有包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的CDR1結(jié)構(gòu)域的輕鏈可變區(qū)。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的輕鏈CDR1結(jié)構(gòu)域或其片斷或修飾形式的分離核酸。該核酸可僅編碼CDR1區(qū)或者可編碼完整的抗體輕鏈可變區(qū)。例如，該核酸可編碼具有包含SEQ ID NO12的氨基酸序列的CDR2結(jié)構(gòu)域的輕鏈可變區(qū)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含SEQ ID NO12的氨基酸序列的輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域或其片斷或修飾形式的分離核酸。該核酸可僅編碼CDR2區(qū)或者可編碼完整的抗體輕鏈可變區(qū)。例如，該核酸可編碼具有包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的CDR1結(jié)構(gòu)域的輕鏈可變區(qū)。藥用組合物和用藥本發(fā)明的抑制劑可摻入適合于給受試者用藥的藥用組合物中。一般來說，藥用組合物包含本發(fā)明的抑制劑(例如，修飾的致病性免疫球蛋白)和藥用上可接受的載體。本文使用的“藥用上可接受的載體”包括生理學(xué)上可配伍的任意和所有溶劑，分散介質(zhì)，糖衣，抗細(xì)菌和抗真菌試劑，等滲劑和吸收延遲劑等。藥用上可接受的載體的例子包括水，鹽水，磷酸鹽緩沖液，葡萄糖，甘油，乙醇等中的一種或多種，以及其組合。在許多例子中，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如，糖，諸如甘露醇，山梨醇等多元醇，或氯化鈉。藥用上可接受的載體可進(jìn)一步包含增加抗體或抗體部分貨架壽命或效力的少量輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑，保存劑或緩沖液。
藥用組合物配制成與其計劃的用藥途徑相配伍。用藥途徑的例子可包括，例如，腸胃外，例如靜脈內(nèi)，真皮內(nèi)，皮下，經(jīng)口的(例如，吸入)，經(jīng)皮膚的(局部)，經(jīng)粘膜的和直腸用藥。因此，本發(fā)明的組合物可以是各種形式。它們包括，例如，液體，半固體和固體配藥形式，例如液體溶液(例如，可注射的和可灌輸?shù)娜芤?，分散體或懸液，片劑，丸劑，粉劑，脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式依賴于計劃的用藥方式和治療應(yīng)用。一般優(yōu)選的組合物是可注射的或可灌輸?shù)娜芤旱男问?，例如相似于用其它抗體被動免疫人體所用的那些組合物。優(yōu)選的用藥方式是腸胃外的(例如，靜脈內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)的)。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過靜脈內(nèi)灌輸或注射施用抗體。在另一優(yōu)選的實施方案中，通過肌肉內(nèi)或皮下注射施用抗體。
用于腸胃外，例如真皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸液可包括，例如下列成分諸如注射用水，鹽水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶劑等無菌稀釋劑；諸如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯等抗細(xì)菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉等抗氧化劑；諸如乙二胺四乙酸等螯合劑；諸如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽等緩沖劑和諸如氯化鈉或葡萄糖等用于調(diào)節(jié)滲透壓的試劑。pH可用諸如鹽酸或氫氧化鈉等酸或堿調(diào)節(jié)。腸胃外制劑可密封在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多劑量小瓶中。
適合于注射使用的藥用組合物包括無菌水溶液(如果是水溶性的)或分散體和用于臨時配制無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)用藥，合適的載體包括生理鹽水，抑菌水，Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的且流動性應(yīng)達(dá)到容易注射的程度。它在生產(chǎn)和存貯條件下應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定且必須防止諸如細(xì)菌和真菌等微生物的污染。載體可以是含有例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液態(tài)聚乙二醇等)，及其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)。通過，例如使用諸如卵磷脂等糖衣，通過在分散體的情況中維持所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑可維持合適的流動性。防止微生物的活動可通過各種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯類，氯丁醇，酚，抗壞血酸，硫柳汞等來實現(xiàn)。在許多情況中，組合物中優(yōu)選包括等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇，山梨醇，氯化鈉?？勺⑸涞慕M合物的延遲吸收可通過在組合物中包含延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)。
治療性組合物一般在生產(chǎn)和存貯條件下必須是無菌的和穩(wěn)定的。該組合物可配制成溶液，微乳狀液，分散體，脂質(zhì)體，或適合于高藥物濃度的其它有序結(jié)構(gòu)。可在具有上文所列一種或多種成分的合適溶劑中摻入所需量的活性化合物(即，抗體或抗體部分)，然后過濾除菌制備無菌可注射溶液。一般來說，通過將活性化合物摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的上述其它成分的無菌載體中制備分散體。對于用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥以產(chǎn)生活性成分加上來自前面無菌過濾溶液的任何其它所需成分的粉末。可通過，例如，使用諸如卵磷脂等糖衣，對于分散體通過維持所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑來維持溶液的合適流動性。
本發(fā)明的抑制劑可通過本領(lǐng)域已知的各種方法來給藥，但對于許多治療應(yīng)用而言，優(yōu)選的給藥途徑/方式是靜脈內(nèi)注射或灌輸。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員可預(yù)料到的，給藥的途徑和/或方式可隨所需的結(jié)果而變化。在某些實施方案中，活性化合物可用防止該化合物迅速釋放的載體來制備，例如控釋制劑，包括植入體，皮下植入塊，和微包裹傳遞系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾?，生物相容的聚合體，例如乙烯乙酸乙酯，聚酐類，聚乙酸(polyglycolicacid)，膠原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸。制備這種制劑的許多方法已有專利或是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。參見，例如，Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems，J.R.Robinson，編輯，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些實施方案中，本發(fā)明的抑制劑可用例如，惰性稀釋劑或可同化的食用載體口服給藥。該化合物(和其它成分，如果需要)也可密封在硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓成片劑，或直接摻入受試者飲食中。對于口服治療給藥，該化合物可摻入賦形劑并以可吞咽的片劑，口含片，錠劑，膠囊劑，酏劑，懸浮劑，糖漿劑，糯米紙囊劑等的形式使用。為了通過非腸胃外給藥施用本發(fā)明的化合物，必須用一種材料包裹該化合物，或者使該化合物與一種材料一起施用以防止其失活。為了通過吸入給藥，從增壓容器或含有合適的推進(jìn)劑，例如，諸如二氧化碳等氣體的分配器，或者噴霧器中以氣溶膠噴霧的形式遞送該化合物。
本發(fā)明的抑制劑可用防止該化合物從身體迅速釋放的載體來制備，例如控釋制劑，包括植入體和微包裹傳遞系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾?，生物相容的聚合體，例如乙烯乙酸乙酯，聚酐類，聚乙酸(polyglycolic acid)，膠原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸。制備該配制品的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。該材料也可從Alza Corporation and Nova Pharmaceutical，Inc.以商品形式買到。脂質(zhì)體懸液也可用作藥用上可接受的載體。按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法，例如美國專利號4,522,811所述的方法可制備它們。
藥用組合物可與給藥說明一起包含在容器，包裝或分配器中。
實施例實施例1局部缺血-再灌注損傷的機理本實施例顯示了補體系統(tǒng)缺陷型小鼠對局部缺血-再灌注損傷有抗性。
為了檢查局部缺血-再灌注損傷的機理，在下肢模型中處理補體C3缺陷型小鼠?；谕感灾笖?shù)減少大約50％，C3-/-小鼠有針對損傷的部分保護(hù)作用(參見，Weiser等(1996)J.Exp.Med.1857-1864)。因此，補體C3是在該鼠模型中誘導(dǎo)完全損傷所必需的。
在Weiser等的實驗中沒有鑒定如何激活補體。血清補體系統(tǒng)可通過至少三種不同的途徑，即傳統(tǒng)途徑，凝集素途徑或旁路途徑被激活。了解所涉及的途徑是重要的，因為它暗示著損傷的機理。例如，傳統(tǒng)途徑通過免疫球蛋白的IgM和IgG同種型或者通過血清識別蛋白C-反應(yīng)蛋白非常有效地被激活。凝集素途徑在結(jié)合甘露聚糖的凝集素(MBL)識別諸如甘露聚糖等特異性糖類后激活(Epstein等，(1996)Immunol 8，29-35)。在兩種途徑中，補體C4在與催化中央成分C3裂解的C2形成酶復(fù)合物中是必需的。相反，兩者擇一的途徑自發(fā)激活導(dǎo)致C3轉(zhuǎn)變成其活性形式(C3b)且附著到外來或自身組織上。該途徑受到嚴(yán)密調(diào)控，因為所有的宿主細(xì)胞通過失活或者轉(zhuǎn)移C3轉(zhuǎn)化酶表達(dá)補體途徑放大的抑制劑(Muller-Eberhard，H.J.，(1988)Ann.Rev.Biochem.57321-347)。確定所涉及的途徑的一種方法是使用C4缺陷型小鼠，即不能通過傳統(tǒng)或凝集素途徑形成C3轉(zhuǎn)化酶。在下肢模型中比較C3或C4缺陷型小鼠與野生型(WT)對照揭示了C4也是誘導(dǎo)完全損傷所必需的(Weiser等，出處同上)。這一發(fā)現(xiàn)是重要的，因為它表明可能涉及抗體或MBL。
實施例2天然IgM介導(dǎo)局部缺血再灌注(I/R)損傷本實施例顯示了免疫球蛋白缺陷型小鼠對局部缺血-再灌注損傷有抗性。
為了確定抗體是否參與介導(dǎo)I/R損傷，在腸模型中鑒定了免疫球蛋白完全缺陷型，RAG2-/-(重組酶激活基因-2缺陷型)小鼠以及補體缺陷型動物。有意義的是，RAG-2-/-小鼠的保護(hù)水平相似于在補體缺陷型動物中觀察到的水平(Weiser等，出處同上)。由于RAG2-/-動物也缺少成熟的淋巴細(xì)胞，因此重要的是確定致病性效應(yīng)是抗體依賴型的(Shinkai等(1992)Cell68，855-867)。為了證實損傷由血清抗體介導(dǎo)，用正常的小鼠血清(Weiser等，出處同上)或純化的IgM(Williams等(1999)J.Appl Physiol 86；938-42)重建缺陷型動物。在兩種情況下，重建的RAG-2-/-小鼠不再受到保護(hù)并回復(fù)(restored)損傷。在后一種實驗中，使用腸損傷模型，因為在該模型中，認(rèn)為損傷主要是由補體介導(dǎo)。
這些結(jié)果的解釋是，在局部缺血期間，新抗原在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)或暴露。循環(huán)IgM表現(xiàn)出識別新的決定簇，結(jié)合并激活補體的傳統(tǒng)途徑。盡管不知道該抗原的性質(zhì)，但似乎IgM而不是IgG主要負(fù)責(zé)補體的激活，因為用合并的IgG重建缺陷型小鼠不能明顯回復(fù)小鼠的損傷。另一假設(shè)是存在另一起動事件，例如識別改變的內(nèi)皮表面，誘導(dǎo)低水平的補體激活，接著暴露新的抗原位點的MBL途徑并通過結(jié)合IgM放大該途徑。
實施例3致病性IgM是B-1細(xì)胞的產(chǎn)物由于據(jù)認(rèn)為大多數(shù)循環(huán)IgM代表天然抗體，即重排種系基因的產(chǎn)物，因此，可能有B-1淋巴細(xì)胞缺陷的小鼠也受到保護(hù)。B-1細(xì)胞具有與更常規(guī)的B-2細(xì)胞不同的表型在于它們表達(dá)低水平的IgD和CD23且大多數(shù)表達(dá)細(xì)胞表面蛋白CD5(Hardy等，(1994)Immunol.Rev.137，91；Kantor等(1993)Annu.Rev.Irnmunol.11，501-538，1993)。B1細(xì)胞的區(qū)別還在于在小鼠中循環(huán)減少，在外周淋巴結(jié)和脾臟中出現(xiàn)頻率有限且主要位于腹膜腔內(nèi)。為了檢查B-1細(xì)胞作為致病性IgM來源的作用，抗體缺陷型小鼠(RAG-2-/-)用5×105個腹膜B-1細(xì)胞重建并在處理前靜息大約30天。在接受轉(zhuǎn)移后1月內(nèi)循環(huán)IgM水平達(dá)到接近正常的范圍。在腸局部缺血模型中對B-1細(xì)胞重建的小鼠的鑒定證實B-1細(xì)胞是致病性IgM的主要來源(參見Williams等(1999)，出處同上)。這是一個重要的觀測結(jié)果，因為B-1細(xì)胞天然抗體庫比常規(guī)B-2細(xì)胞預(yù)期的抗體庫有限得多。因此，可能致病性抗體代表了種系的產(chǎn)物。
實施例4Cr2-/-小鼠受到防止局部缺血再灌注損傷的保護(hù)最初對Cr2-/-敲除小鼠的鑒定揭示了B-1a或CD5+B-1細(xì)胞的出現(xiàn)率減少了大約50％(Aheam等(1996)Immunity 4251-262)。但對Cr2-缺陷型小鼠的另一品系的鑒定沒有鑒別出相似的減少(Molina等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,3357-3361)。CD5+細(xì)胞出現(xiàn)率的差別是由品系背景差別還是由環(huán)境差別引起尚不清楚。盡管在Cr2-/-小鼠中B-1a細(xì)胞的出現(xiàn)率減少，但I(xiàn)gM的循環(huán)水平在正常范圍內(nèi)。這些發(fā)現(xiàn)表明IgM庫可能在Cr2-缺陷型動物中有所不同。為了檢驗該假設(shè)，鑒定了腸I/R模型小鼠。令人驚奇的是，Cr2-/-小鼠與抗體徹底缺陷型小鼠同等地受到保護(hù)(圖1)。在腸模型中在處理后5天內(nèi)比較存活率表明與Cr2-缺陷型動物相比WT的死亡率顯著增加。與死亡率增加一致，從處理的WT或Cr2-/-缺陷型小鼠獲得的組織切片中觀察到損傷顯著減小。
在野生型小鼠或用合并的IgM或B-1細(xì)胞重建的Cr2-/-小鼠中觀察到腸粘膜層的廣泛損傷。相比之下，從處理的Cr2-/-小鼠分離的組織切片相似于假性對照。因此，盡管IgM循環(huán)水平正常，但Cr2-缺陷型小鼠可防止損傷。這些結(jié)果不僅證實了B-1細(xì)胞作為致病性抗體來源的重要性，而且表明補體系統(tǒng)以某種方式參與天然抗體庫的形成或維持。例如，補體可參與B-1細(xì)胞的陽性選擇。
實施例5致病性IgM的鑒定本實施例描述了從正常B-1細(xì)胞產(chǎn)生特異性雜交瘤克隆和鑒定產(chǎn)生致病性IgM的一個克隆。顯示了致病性IgM回復(fù)抗體缺陷型小鼠的體內(nèi)損傷。
在攜帶補體受體CD21/CD35缺陷的小鼠中進(jìn)行的研究揭示了該小鼠缺少致病性抗體。該發(fā)現(xiàn)是意想不到的，因為在它們的血液中具有正常的IgM水平。這些發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了這樣的假設(shè)，即B-1細(xì)胞這種特殊的B細(xì)胞群體負(fù)責(zé)分泌致病性IgM。例如，用來自正常小鼠的B-1細(xì)胞植入受體缺陷型小鼠(Cr2-/-)可回復(fù)損傷，證實了B-1細(xì)胞的重要性。為了鑒定負(fù)責(zé)損傷的具體抗體，從收獲自正常小鼠的腹膜B-1細(xì)胞的富集庫構(gòu)建一組雜交瘤克隆。從腹膜細(xì)胞的富集部分制備雜交瘤的一般方法包括，從7天前用IL-10處理的小鼠收獲腹膜細(xì)胞，隨后通過用磁珠進(jìn)行陰性選擇來富集CD23+B細(xì)胞。用IgM，Mac-1和CD23特異性Mab染色后通過FACS分析所富集的B細(xì)胞。通過用LPS培養(yǎng)24小時進(jìn)一步激活富集的群體。激活的細(xì)胞與融合配偶體骨髓瘤細(xì)胞在PEG存在的條件下混合并在HAT-選擇性培養(yǎng)基中生長。通過ELISA篩選雜交瘤中分泌IgM的克隆，擴(kuò)增陽性孔用于純化IgM。
通過從每個克隆收集等量的IgM產(chǎn)物分析22個分泌IgM的雜交瘤克隆。用收集的IgM處理抗體缺陷型小鼠可回復(fù)損傷，相似于使用從血清收集的IgM所見的結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)證實了致病性IgM確實存在于所產(chǎn)生的22個雜交瘤中。通過將抗體庫分成兩個部分，即1-11和12-22，用這兩個部分處理小鼠，發(fā)現(xiàn)用包括克隆號22的抗體庫分離到致病性抗體。最后，用克隆17或22重建小鼠。克隆22能回復(fù)損傷而其它克隆不能(見圖3A和3B)。
實施例6補體參與對B-1細(xì)胞的選擇已提出了兩個不同的模型以解釋B-1細(xì)胞的發(fā)育。譜系假說提出，B-1細(xì)胞在早期胎兒時期作為不同的群體發(fā)育(Kantor等(1993)出處同上)。另一種假說是，B-1細(xì)胞從與常規(guī)B細(xì)胞相同的祖先發(fā)育，但依賴于其環(huán)境，即與抗原的相遇，它們發(fā)育成B-1或保留B-2細(xì)胞表型(Wortis，H.H.(1992)Int.Rev.Immunol.8，235；Clarke，J.(1998)Exp.Med.187，1325-1334)。不論其起源，已知B-1細(xì)胞以不同于B-2細(xì)胞的頻率從成人骨髓中補充且其表型更相似于早期胎兒肝臟B細(xì)胞或新生兒骨髓(BM)細(xì)胞。雖然有相同的早期起源，它們的細(xì)胞庫易于偏向表達(dá)更多的鄰近VH基因且N-核苷酸的添加有限(Gu等，(1990)EMBO J9，2133；Feeney，J.(1990)Exp.Med.172，1377)。似乎合理的是，雖然成人BM干細(xì)胞補充減少，但B-1細(xì)胞將自我更新且抗原刺激可能在其更新，擴(kuò)增或者甚至起始選擇中是重要的(Hayakawa等，(1986)Eur.J.Immunol.16，1313)。事實上根據(jù)常規(guī)模型，B-1細(xì)胞可能是抗原選擇的。
支持B-1細(xì)胞陽性選擇需要B-細(xì)胞受體(BCR)信號的證據(jù)來自于攜帶改變BCR信號的突變的小鼠。例如，通過CD19(19，20)，vav(21)或Btk(22)削弱BCR信號顯著影響B(tài)-1細(xì)胞的發(fā)育。相比之下，諸如在CD22-或SHP-1缺陷型小鼠中陰性選擇的喪失可導(dǎo)致B-1細(xì)胞頻率增大(O′Keefe等(1996)Science 274，798-801；Shultz等(1993)Cell 73，1445)。最近，用攜帶兩個不同Ig轉(zhuǎn)基因，VH12(B-1細(xì)胞表型)或VHB1-8(B-2細(xì)胞表型)的小鼠的精采研究支持這樣的觀點，即B-1細(xì)胞通過自身抗原陽性選擇。例如，VH12單獨表達(dá)或與B1-8一起表達(dá)的B細(xì)胞發(fā)育成B-1細(xì)胞表型。然而，如果有B細(xì)胞的話，只有少量鑒定為表達(dá)B1-8tg。因此，這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因B細(xì)胞與自身-PtC相遇導(dǎo)致表達(dá)VH12的那些細(xì)胞擴(kuò)增。最近由Hardy等(1994)Immunol.Rev.137，91)報道了B-1細(xì)胞的選擇。在其模型中，在表達(dá)同源(cognate)抗原的小鼠中選擇并擴(kuò)增表達(dá)對Thy1.1特異性的免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的B細(xì)胞。相比之下，在表達(dá)另一同種異型Thy1.2的小鼠中未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因+B-1細(xì)胞。
補體在何處適應(yīng)B-1細(xì)胞發(fā)育？B-1a細(xì)胞頻率的總體減少和更具體的表達(dá)與I/R損傷相關(guān)的IgM的B-1細(xì)胞的損失表明了CD21/CD35在陽性選擇或B-1a細(xì)胞維持中的作用。補體的一個可能的作用是在與同源抗原相遇時它增強BCR信號。對CD21/CD35缺陷型小鼠的生化研究和分析證實了共同受體信號在常規(guī)B細(xì)胞的激活和存活中的重要性(Carroll，M.C.，(1998)Ann.Rev.Immunol 16，545-568；Fearon等(1995)Annu.Rev.Immunol 13，127-149)。很可能B-1細(xì)胞同樣地利用共同受體信號來增強BCR信號。例如，細(xì)菌表達(dá)諸如磷酯酰膽堿等典型B-1細(xì)胞抗原且理所當(dāng)然的是用補體配體C3d包裹細(xì)菌會增強共同受體與BCR的交聯(lián)并增強總體信號。因此，以較低濃度表達(dá)的抗原可能需要補體增強以便同源B細(xì)胞識別它并擴(kuò)增或陽性選擇。補體受體的另一作用是將抗原定位在淋巴區(qū)室內(nèi)的濾泡樹突狀細(xì)胞(FDC)上。然而，由于B-1細(xì)胞的主要群體占據(jù)腹膜組織，不清楚它們是否在淋巴結(jié)構(gòu)內(nèi)遇到FDC。B-1細(xì)胞進(jìn)行陽性選擇的實際位點是未知的?？赡芩鼈冊谠缙谂咛グl(fā)育或在新生兒BM中遇到同源抗原。如果是這樣，可預(yù)期這些區(qū)室內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞上的補體受體結(jié)合抗原以呈遞給B細(xì)胞?？赡苎a體受體會參與兩個發(fā)育階段。首先，它們可能增強最初陽性選擇中的抗原信號。其次，由于選擇的B-1細(xì)胞在外周位點得到補充，因此補體受體可能再次參與BCR信號的增強。
圖2是在腹膜B-1淋巴細(xì)胞的陽性選擇中補體和補體受體預(yù)定作用的示意圖。補體-配體包裹的抗原(自身抗原和非自身抗原)的相互作用導(dǎo)致CD21/CD19共同受體和細(xì)胞表面BCR的共連接，產(chǎn)生增強的信號和陽性選擇。
等價形式使用不超出常規(guī)的實驗，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，或者能確定本文所述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等價形式。這些等價形式打算由下面權(quán)利要求書包括。
序列表序列表<110>血液研究中心(CBR，Inc.)<120>抑制免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注損傷的方法和組合物<130>10861-024WO1<140>PCT/US01/18510<141>2001-06-08<150>US 60/210,272<151>2000-06-08<160>12<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>338<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)...(338)<400>1gag gtg cag ctg cag gag tct ggg gct gag ctg gtg aag cct ggg gcc 48Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15tca gtg aag att tcc tgc aaa gct tct ggc tac gca ttc agt agc tac 96Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr20 25 30tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga aag ggt ctt gag tgg att144Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45gga cag att tat cct gga gat ggt gat act aac tac aac gga aag ttc192Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac240Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg cag ctc agc agc ctg acc tct gag gac tct gcg gtc tat ttc tgt288Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95gca aga gaa gat tac tac ggt agt gac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc336Ala Arg Glu Asp Tyr Tyr Gly Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly100 105 110ag 338<210>2<211>111<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>2Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser1 5 10 15Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp20 25 30Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly35 40 45Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys50 55 60Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met65 70 75 80Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala85 90 95Arg Glu Asp Tyr Tyr Gly Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly100 105 110<210>3<211>15<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)...(15)<400>3agc tac tgg atg aac 15Ser Tyr Trp Met Asn1 5<210>4<211>5<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>4Ser Tyr Trp Met Asn1 5<210>5<211>51<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)...(51)<400>5cag att tat cct gga gat ggt gat act aac tac aac gga aag ttc aag48Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys1 5 10 15ggc51Gly<210>6<211>17<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>6Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>7<211>349<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(5)...(349)<400>7tgat att gtg atg acc cag tct cac aaa ttc atg tcc aca tca gta gga49Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15gac agg gtc agc atc acc tgc aag gcc agt cag gat gtg ggt act gct 97Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala20 25 30gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tct cct aaa cta ctg att145Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tac tgg gca tcc acc cgg cac act gga gtc cct gat cgc ttc aca ggc193Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc att agc aat gtg cag tct241Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser65 70 75gaa gac ttg gca gat tat ttc tgt cag caa tat agc agc tat cct ctc289Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu80 85 90 95acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg ggc tga tgc tgc337Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly * Cys Cys100 105 110acc aaa act gta349Thr Lvs Thr Val<210>8<211>114<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>8Ile Val Met Thr Gln Ser Hi s Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp1 5 10 15Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val20 25 30Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr35 40 45Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu65 70 75 80Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr85 90 95Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Cys Cys Thr Lys100 105 110Thr Val<210>9<211>33<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)...(33)<400>9aag gcc agt cag gat gtg ggt act gct gta gcc 33Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala1 5 10<210>10<211>11<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>10Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala1 5 10<210>11<211>21<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221>CDS<222>(1)...(21)<400>11tgg gca tcc acc cgg cac act21Trp Ala Ser Thr Arg His Thr1 5<210>12<211>7<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>12Trp Ala Ser Thr Arg His Thr1 權(quán)利要求
1.一種在受試者中治療或預(yù)防免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括給受試者施用有效量的致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間相互作用的抑制劑；從而減少與局部缺血特異性抗原結(jié)合的致病性免疫球蛋白的數(shù)目，以便抑制或減少損傷。
2.一種在受試者中治療或預(yù)防免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括給受試者施用有效量的致病性免疫球蛋白和補體途徑成分之間相互作用的抑制劑；從而減少激活補體活性的致病性免疫球蛋白的數(shù)目，以便抑制或減少損傷。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中致病性免疫球蛋白是IgM。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中致病性免疫球蛋白是IgM的一個亞類。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中致病性免疫球蛋白由B細(xì)胞的一個亞群產(chǎn)生。
6.權(quán)利要求1的方法，其中局部缺血特異性抗原存在于內(nèi)皮細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)組織的表面。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中受試者是哺乳動物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中哺乳動物是人。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其中再灌注或局部缺血損傷由自然發(fā)生的事件引起。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中再灌注或局部缺血損傷發(fā)生在手術(shù)操作期間或之后。
11.權(quán)利要求10的方法，其中手術(shù)操作選自血管成形術(shù)，斯騰特氏印模放置操作，粥樣硬化斑切除術(shù)和旁路手術(shù)。
12.權(quán)利要求1或2任一項的方法，其中抑制劑選自蛋白質(zhì)，肽，有機小分子，抗體或其片斷，碳水化合物和糖蛋白。
13.權(quán)利要求1或2任一項的方法，其中損傷發(fā)生在心血管組織。
14.一種治療或預(yù)防受試者中免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括從受試者除去或滅活致病性免疫球蛋白或產(chǎn)生該致病性免疫球蛋白的B細(xì)胞，從而減少受試者中存在的致病性免疫球蛋白或B細(xì)胞的量。
15.權(quán)利要求14的方法，其中除去或滅活步驟回體進(jìn)行。
16.權(quán)利要求15的方法，其中致病性免疫球蛋白的除去或滅活步驟通過給受試者施用抗獨特型抗體進(jìn)行。
17.權(quán)利要求16的方法，其中B細(xì)胞的除去或滅活步驟通過給受試者施用與毒素偶連的靶向B細(xì)胞的半分子進(jìn)行。
18.權(quán)利要求14的方法，其中受試者是哺乳動物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中哺乳動物是人。
20.權(quán)利要求14的方法，其中損傷發(fā)生在體內(nèi)。
21.權(quán)利要求14的方法，其中損傷發(fā)生在心血管組織。
22.一種分離的致病性免疫球蛋白，或其抗原結(jié)合部分，具有一種或多種下列特性(i)能與局部缺血特異性抗原相互作用；(ii)能固定補體；或(iii)由B細(xì)胞的一個亞群產(chǎn)生。
23.權(quán)利要求22的致病性免疫球蛋白，它是IgM。
24.一種修飾的致病性免疫球蛋白，它具有改變補體結(jié)合或活性的突變。
25.權(quán)利要求24的修飾的致病性免疫球蛋白，它能與局部缺血特異性抗原相互作用。
26.權(quán)利要求24的修飾的致病性免疫球蛋白，它是IgM。
27.一種用于分離局部缺血特異性抗原的方法，包括提供一種致病性免疫球蛋白；在允許致病性免疫球蛋白與樣品特異性結(jié)合的條件下，使含有局部缺血特異性抗原的樣品與致病性免疫球蛋白接觸；檢測致病性抗體與樣品的結(jié)合水平相對于對照的任何改變，其中樣品中存在的致病性免疫球蛋白結(jié)合水平相對于在對照中所檢測到的水平的改變是特異性結(jié)合的指標(biāo)；和從樣品中分離局部缺血特異性抗原。
28.權(quán)利要求27的方法，其中該樣品富含局部缺血特異性抗原。
29.權(quán)利要求27的方法，其中該樣品從具有再灌注或局部缺血損傷的受試者獲得。
30 權(quán)利要求27的方法，其中該樣品是生化分離物。
31 權(quán)利要求27的方法，其中該樣品是表達(dá)文庫。
32.一種從眾多試驗化合物中鑒定致病性免疫球蛋白與局部缺血特異性抗原之間相互作用的抑制劑的方法，包括在允許致病性免疫球蛋白與局部缺血特異性抗原發(fā)生結(jié)合的條件下，提供包括致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原的反應(yīng)混合物；使致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原與一種或多種試驗化合物接觸，和檢測存在給定試驗化合物時致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原的結(jié)合相對于不存在該試驗化合物時檢測到的結(jié)果的任何改變，其中存在該試驗化合物時致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間的結(jié)合水平相對于不存在該試驗化合物時所檢測到的水平的改變表明，該試驗化合物是致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間相互作用的抑制劑。
33.一種從眾多試驗化合物中鑒定致病性免疫球蛋白與補體途徑成分之間相互作用的抑制劑的方法，包括在允許致病性免疫球蛋白與補體途徑成分發(fā)生結(jié)合的條件下，提供包括致病性免疫球蛋白和補體途徑成分的反應(yīng)混合物；使致病性免疫球蛋白和補體途徑成分與一種或多種試驗化合物接觸，和檢測存在給定試驗化合物時致病性免疫球蛋白和補體途徑成分的結(jié)合相對于不存在該試驗化合物時檢測到的結(jié)合的任何改變，其中存在該試驗化合物時致病性免疫球蛋白和補體途徑成分之間的結(jié)合水平相對于不存在該試驗化合物時所檢測到的水平的改變表明，該試驗化合物是致病性免疫球蛋白和補體途徑成分之間相互作用的抑制劑。
34.權(quán)利要求32或33任一項的方法，其中致病性免疫球蛋白是致病性IgM。
35.權(quán)利要求32或33任一項的方法，其中局部缺血特異性抗原從內(nèi)皮組織或內(nèi)皮裂解產(chǎn)物獲得。
36.權(quán)利要求32或33任一項的方法，它在體外進(jìn)行。
37.權(quán)利要求32或33任一項的方法，其中致病性免疫球蛋白用可檢測的信號標(biāo)記。
38.權(quán)利要求32或33任一項的方法，其中局部缺血特異性抗原用可檢測的信號標(biāo)記。
39.權(quán)利要求32或33任一項的方法，還包括重復(fù)至少一個步驟。
40.權(quán)利要求32或33任一項的方法，其中眾多試驗化合物包括至少10，102，103，104，105，106，107，或108種化合物。
41.權(quán)利要求32或33任一項的方法，其中該試驗化合物是肽或有機小分子。
42.用權(quán)利要求32的方法鑒定的致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間相互作用的抑制劑。
43.用權(quán)利要求33的方法鑒定的致病性免疫球蛋白和補體途徑成分之間相互作用的抑制劑。
44.一種治療或預(yù)防免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括給受試者施用通過下述方法測定的具有抑制致病性免疫球蛋白與局部缺血特異性抗原之間相互作用的特性的一種試劑；在允許致病性免疫球蛋白與局部缺血特異性抗原發(fā)生結(jié)合的條件下，提供包括致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原的反應(yīng)混合物；使致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原與該試劑接觸，和檢測存在該試劑時致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原的結(jié)合相對于不存在該試劑時檢測到的結(jié)合的任何改變，其中存在該試劑時致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間的結(jié)合水平相對于不存在該試劑時所檢測到的水平的改變表明，該試劑是致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間相互作用的抑制劑。
45.一種治療或預(yù)防免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括給受試者施用通過下述方法測定的具有抑制致病性免疫球蛋白與補體途徑成分之間相互作用的特性的一種試劑在允許致病性免疫球蛋白與補體途徑成分發(fā)生結(jié)合的條件下，提供包括致病性免疫球蛋白和補體途徑成分的反應(yīng)混合物；使致病性免疫球蛋白和補體途徑成分與該試劑接觸，和檢測存在該試劑時致病性免疫球蛋白和補體途徑成分結(jié)合相對于不存在該試劑時檢測到的結(jié)合的任何改變，其中存在該試劑時致病性免疫球蛋白和補體途徑成分之間的結(jié)合水平相對于不存在該試劑時所檢測到的水平的改變表明，該試劑是致病性免疫球蛋白和補體途徑成分之間相互作用的抑制劑。
46.一種治療或預(yù)防免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括給受試者施用一種試劑，其中在下述試驗中檢測時所述的試劑能抑制致病性免疫球蛋白與局部缺血特異性抗原之間的相互作用在允許致病性免疫球蛋白與局部缺血特異性抗原發(fā)生結(jié)合的條件下，提供包括致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原的反應(yīng)混合物；使致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原與該試劑接觸，和檢測存在該試劑時致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原的結(jié)合相對于不存在該試劑時檢測到的結(jié)合的任何改變，其中存在該試劑時致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間的結(jié)合水平相對于不存在該試劑時所檢測到的水平的抑制表明，該試劑是致病性免疫球蛋白和局部缺血特異性抗原之間相互作用的抑制劑。
47.一種治療或預(yù)防免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法，包括給受試者施用一種試劑，其中在下述試驗中檢測時所述的試劑能抑制致病性免疫球蛋白與補體途徑成分之間的相互作用在允許致病性免疫球蛋白與補體途徑成分發(fā)生結(jié)合的條件下，提供包括致病性免疫球蛋白和補體途徑成分的反應(yīng)混合物；使致病性免疫球蛋白和補體途徑成分與該試劑接觸，和檢測存在該試劑時致病性免疫球蛋白和補體途徑成分的結(jié)合相對于不存在該試劑時檢測到的結(jié)合的任何改變，其中存在該試劑時致病性免疫球蛋白和補體途徑成分之間的結(jié)合水平相對于不存在該試劑時所檢測到的水平的抑制表明，該試劑是致病性免疫球蛋白和補體途徑成分之間相互作用的抑制劑。
48.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白由B-1細(xì)胞產(chǎn)生。
49.權(quán)利要求22的分離的致病性抗體，它由以保藏號＿保藏在ATCC的雜交瘤產(chǎn)生。
50.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，它具有包含SEQ ID NO8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
51.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，它具有包含SEQ IDNO2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
52.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有包括CDR1區(qū)的輕鏈可變區(qū)，其中所述CDR1區(qū)包含SEQ ID NO10所示氨基酸序列。
53.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有包括CDR2區(qū)的輕鏈可變區(qū)，其中所述CDR2區(qū)包含SEQ ID NO12所示氨基酸序列。
54.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有包括CDR1區(qū)的重鏈可變區(qū)，其中所述CDR1區(qū)包含SEQ ID NO4的氨基酸序列。
55.權(quán)利要求22的分離的致病性抗體，其中該免疫球蛋白具有包括CDR2區(qū)的重鏈可變區(qū)，其中所述CDR2區(qū)包含SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
56.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
57.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
58.權(quán)利要求22的分離的致病性抗體，其中該免疫球蛋白是非人免疫球蛋白。
59.權(quán)利要求58的分離的致病性免疫球蛋白，其中非人抗體來自哺乳動物。
60.權(quán)利要求59的分離的致病性免疫球蛋白，其中該哺乳動物選自奶牛，山羊，小鼠，大鼠，綿羊，豬和兔。
61.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是重組抗體。
62.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白包含SEQ ID NO4和SEQ ID NO6所示的重鏈CDR1和CDR2區(qū)，或其抗原結(jié)合片斷，和SEQ ID NO10和SEQ ID NO12所示的輕鏈CDR1和CDR2區(qū)，或其抗原結(jié)合片斷。
63.權(quán)利要求62的分離的致病性抗體，其中該免疫球蛋白包含人框架區(qū)。
64.一種分離的核酸分子，它選自a)包含與SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列有至少96％相同的核苷酸序列的核酸分子；b)包含SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列的核酸分子；和c)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1的核苷酸序列雜交的核酸分子。
65.編碼包含SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的氨基酸序列的多肽的分離的核酸分子。
66.權(quán)利要求64的核酸分子，它還包含載體核酸序列。
67.含有權(quán)利要求64的核酸分子的宿主細(xì)胞。
68.權(quán)利要求66的宿主細(xì)胞，它是哺乳動物宿主細(xì)胞。
69.一種分離的核酸分子，它選自a)包含與SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的核苷酸序列有至少96％相同的核苷酸序列的核酸分子；b)包含SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11的核苷酸序列的核酸分子；c)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO7的核苷酸序列雜交的核酸分子。
70.編碼包含SEQ ID NO8，SEQ ID NO10或SEQ ID NO12的氨基酸序列的多肽的分離的核酸分子。
71.權(quán)利要求69的核酸分子，它還包含載體核酸序列。
72.含有權(quán)利要求69的核酸分子的宿主細(xì)胞。
73.權(quán)利要求72的宿主細(xì)胞，它是哺乳動物宿主細(xì)胞。
74.一種分離的多肽，含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ IDNO6的氨基酸序列。
75.權(quán)利要求74的多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
76.一種分離的多肽，含有SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，或SEQ IDNO12的氨基酸序列。
77.權(quán)利要求76的多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO8的氨基酸序列。
78.一種生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括在表達(dá)核酸分子的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求67的宿主細(xì)胞。
79.一種生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括在表達(dá)核酸分子的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求72的宿主細(xì)胞。
80.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有包含SEQ ID NO12所示氨基酸序列和SEQ ID NO10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
81.權(quán)利要求22的分離的致病性免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有包含SEQ ID NO4所示氨基酸序列和SEQ ID NO6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療或防止受試者中免疫球蛋白介導(dǎo)的再灌注或局部缺血損傷的方法和組合物。提供了鑒定致病性免疫球蛋白和局部缺血抗原或補體途徑的成分之間相互作用的抑制劑的方法。還公開了致病性免疫球蛋白及其突變形式。
文檔編號A61K45/00GK1443074SQ01813215
公開日2003年9月17日 申請日期2001年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月8日
發(fā)明者邁克爾·C·卡羅爾, 小弗朗西斯·D·穆爾, 赫伯特·B·赫克特曼 申請人:血液研究中心