專利名稱：用益生菌對粘膜表面的細菌或病毒感染進行治療或免疫治療及用于此的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過增強非特異性粘膜免疫適于治療或預防與粘膜表面相關的疾病，特別是治療粘膜處感染性病癥的方法和組合物。
以上集中于由特定抗原引起的特異免疫。非特異性免疫應答“坐落”于一系列細胞和分子上，并通過它們起作用，這些細胞和分子是強有力的效應器結構，其作用不具有通過抗原受體賦予的特異性。
對一系列包括在多種食物或配制形式中的腸道微生物(益生菌)的健康促進價值，人們的認識已有一段時間了。有關這些益生菌的價值的論斷大部分是非特異性的，不具有科學依據，而且很大程度上以臨床印象為基礎。益生菌被認為通過重建推測的有益正常菌群來促進健康。目前已報道了益生菌在治療某些特定腸道疾病中的用途。但是常被夸大的斷言除降低其可信度外，并未鞏固治療益處。
在許多區(qū)域中，發(fā)生粘膜疾病(如，變態(tài)反應，感染)的傾向性的改變方式越來越多地與微生物/腸粘膜“經歷”聯系起來，這些包括與環(huán)境“無菌”和腸道細菌菌群改變相聯系的變態(tài)反應和哮喘發(fā)生率改變以及接觸過無毒大腸桿菌的嬰兒中腸道感染和變態(tài)反應的減少。
因此，需要預防或治療粘膜疾病(如感染，變態(tài)反應等)的改進的制劑和方法。也需要能用于阻止病毒再活化或再感染、和能用于治療與病毒感染或再感染相關的疾病和并發(fā)癥的制劑和方法。
本發(fā)明的目的在于克服或改進現有技術中的至少一些缺陷，或提供有用的替代方案。
發(fā)明簡述本發(fā)明部分基于如下觀察，即某些微生物，特別是乳芽孢桿菌屬(lactobacillus)細菌能通過誘導特定的細胞因子“樣式”致敏粘膜表面，從而造成不利于微生物寄居和/或微生物致病的環(huán)境；并部分基于有關非抗原激活的細胞可在共有粘膜系統(tǒng)內遷移的新證明。
對實施本發(fā)明有用的微生物可以具有也可以不具有傳統(tǒng)的益生菌作用，但它們能改變細胞因子樣式或平衡，或誘導Th1-型細胞應答。為方便起見，所述的有用微生物或其成分在這里也可以稱為益生菌，而不論它們實際上是否有益生菌的作用。這一術語(“益生菌”)旨在將其他能誘導Th1-型細胞應答的佐劑包括在其范圍內。
由此，第一方面，提供用于預防或治療非腸粘膜表面的粘膜表面的慢性或急性感染或非期望的微生物寄居的方法，該方法包括向需要此治療的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
在本發(fā)明的這一實施方案中，所述的粘膜表面優(yōu)選地選自口的，鼻咽的，呼吸道的，胃的，生殖道的和腺體的粘膜表面。所述的感染或寄居可以是急性的或慢性的，并可以是細菌性，真菌性或病毒性的?？梢岳斫獾氖牵圆《靖腥景承┛梢云鹪从诓《靖腥镜牟l(fā)癥，例如慢性疲勞綜合征等。
第二方面，提供預防或治療慢性或急性呼吸道粘膜表面疾病的方法，該方法包括對需要此治療的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
優(yōu)選地，所述呼吸道粘膜表面是上呼吸道粘膜表面，更優(yōu)選地是口腔或肺的粘膜。
優(yōu)選地，將所述益生菌或含益生菌的組合物施用于胃或腸的粘膜表面。
第三方面提供預防或治療由擾亂細胞因子平衡或缺乏T細胞免疫應答所引起的慢性或急性粘膜表面疾病的方法，該方法包括對需要此治療的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
優(yōu)選地，所述粘膜表面選自口的，鼻咽的，呼吸道的，胃的，腸的，生殖道的和腺體的粘膜表面。
評價細胞因子平衡的有用標記是一種或多種干擾素-γ(IFN-γ)，白介素-4(IL-4)和白介素-12(IL-12)。但其他已知的作為Th1或Th2細胞應答標記的細胞因子對于這一目的也是有用的。
優(yōu)選地，所述益生菌是細菌，例如其可選自但不限于，乳酸細菌，分枝桿菌(Mycobacterium)種或雙歧桿菌(Bifidobacterium)種。更優(yōu)選的是使用能誘導Th1細胞應答的嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillusacidophilus)L.acidophilus)，發(fā)酵乳芽孢桿菌(Lactobacillus fermentum)L.fermentum)或牝牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)(M.vaccae)，或其部分。特別優(yōu)選的是嗜酸乳芽孢桿菌。嗜酸乳芽孢桿菌，發(fā)酵乳芽孢桿菌或牝牛分枝桿菌可以以活的或滅活制劑的形式使用，條件是它們能誘導Th1應答。優(yōu)選嗜酸乳芽孢桿菌和發(fā)酵乳芽孢桿菌以活制劑的形式使用。應當理解其他細菌也可能適合于作為此處定義的益生菌(無論其是否具有益生菌效果)，例如熟知的佐劑細菌，如干酪乳芽孢桿菌(L.casei)，植物乳芽孢桿菌(L.plantarum)，鼠李糖乳芽孢桿菌(L.rhamnosus)，短雙歧桿菌(Bifidobecterium breve)等。
所需的劑量依粘膜表面疾病的性質而異，而不論是預防性還是治療性使用、以及所涉及的生物體或瘤的類型。治療參數和所需劑量是本領域的技術人員易于評定的。當所述益生菌是完整的活益生細菌時，優(yōu)選的益生菌劑量是約1×108到約1×1012個生物體。
所述的益生菌可與一種或多種抗生素或一種或多種其他藥物活性試劑結合施用。所述的益生菌可在抗生素治療或其他活性劑治療之前，同時或之后給藥。
優(yōu)選地，所述粘膜表面疾病是細菌感染，例如由假單胞菌(Pseudomonas)種，鏈球菌(Streptococcus)種，葡萄球菌(Staphylococcus)種，假絲酵母(Candida)種，螺桿菌(Helicobacter)種或嗜血桿菌(Haemophilus)種引起的感染。更優(yōu)選的是非典型的流感嗜血桿菌(Haemophilus IFNluenzae)，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，白假絲酵母(Candidaalbicans)和/或幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)。所述的粘膜疾病也可以是不適當的細菌或其他微生物寄居。例如所述的粘膜疾病可以涉及病毒例如埃-巴二氏病毒(EBV)，巨細胞病毒(CMV)，皰疹病毒等的慢性或急性寄居或感染。本領域的技術人員明白本發(fā)明的方法和組合物也可用于治療其他病毒的感染和/或寄居。
優(yōu)選地，需要接受治療的對象選自具有高感染危險的個體。但應當理解的是本發(fā)明的治療方法適用于在任何對象中預防粘膜疾病。例如，可以適當地給暴露于各種應激物的對象應用本發(fā)明的治療方法，其中所述應激物為能影響對象的免疫狀況從而使其傾向于受到感染的應激物。例如疲勞和/或生理應激物，如運動員常會遇到的那些，易使這些對象發(fā)生呼吸道感染。這似乎是由粘膜表面免疫狀況，特別是IgA分泌受損造成的。
在運動或訓練之前、期間或之后，施用如本文所述的益生菌制劑能恢復他們的免疫系統(tǒng)狀況，特別是呼吸道粘膜表面的免疫狀況，從而對抗或預防感染。
優(yōu)選地，所述益生菌或含益生菌的組合物是片劑或膠囊形式。但本領域的技術人員明白所述的益生菌組合物也可以是液體或其它固體制劑形式，還可以存在于食物源中，例如酸奶或其他乳產品，或類似的以諸如大豆為基礎的非乳產品。
所述的治療可以包括在遠離具有疾病的粘膜表面的位置施用益生菌或含益生菌的組合物。例如所述的益生菌或含益生菌的組合物可施用于腸粘膜表面以治療鼻咽的，胃的或上呼吸道的粘膜感染。
第四方面，提供改變對象的粘膜表面細胞因子平衡的方法，該方法包括給需要它的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
第五方面，提供在對象的粘膜表面誘導Th1細胞免疫應答的方法，該方法包括給需要它的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
第六方面，提供增強對象粘膜表面的干擾素-γ分泌的方法，該方法包括給需要它的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
第七方面，提供減少對象粘膜表面的白介素-4分泌的方法，該方法包括給需要它的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
第八方面，提供使對象粘膜表面恢復正常的細胞因子平衡的方法，該方法包括給需要它的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
第九方面，提供致敏粘膜表面以實施免疫治療的方法，該方法包括給需要它的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
優(yōu)選地，所述免疫治療是施用治療性或預防性疫苗。還優(yōu)選這樣的操作步驟，籍此所述的益生菌或含益生菌的組合物在給予所述疫苗之前或同時施用?？稍谑┯靡呙缰罄^續(xù)施用所述的益生菌或含益生菌的組合物一段時間。
第十方面，提供適于預防或治療慢性或急性粘膜表面疾病的藥物組合物，其包含有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
優(yōu)選地所述益生菌是細菌，例如其可選自但不限于，乳酸細菌，分枝桿菌種或雙歧桿菌種。更優(yōu)選的是使用能誘導Th1細胞應答的嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillus acidophilus)(L.acidophilus)，發(fā)酵乳芽孢桿菌(Lactobacillus fermentum)(L.fermentum)或牝牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)(M.vaccae)，或其部分。特別優(yōu)選的是嗜酸乳芽孢桿菌(L.acidophilus)。對于嗜酸乳芽孢桿菌、發(fā)酵乳芽孢桿菌(L.fermentum)或牝牛分枝桿菌(M.vaccae)，可應用活的或滅活的制劑，條件是它們能誘導Th1應答。優(yōu)選嗜酸乳芽孢桿菌(L.acidophilus)和發(fā)酵乳芽孢桿菌(L.fermentum)以活制劑的形式使用?？梢岳斫馄渌毦部赡苓m合作為此處定義的益生菌(無論其是否具有益生菌的作用)，例如熟知的佐劑細菌，例如干酪乳芽孢桿菌(L.casei)，植物乳芽孢桿菌(L.plantarum)，鼠李糖乳芽孢桿菌(L.rhamnosus)，短雙歧桿菌(Bifidobecterium breve)等。
優(yōu)選地，所述的藥物組合物包括活生物體，但應當理解的是也可以使用被殺死的生物體。而且，單一生物體制劑或包含多種生物體的制劑均是可設想到的。所述的生物體可以是完整的或破裂的。
當所述的益生菌是完整的活益生細菌時，優(yōu)選的益生菌含量是可遞送劑量為約1×108到約1×1012個生物體的量。
優(yōu)選的組合物制劑是固體劑量形式，例如片劑或膠囊。然而，可以理解的是，其也可以配制成食品的形式，例如基于大豆或乳的產品。
第十一方面，提供預防或治療粘膜表面與慢性或急性感染、或與非期望的細菌寄居或再活化有關的癥狀和/或并發(fā)癥的方法，該方法包括給需要它的對象施用有效量的能非特異地激活共有粘膜系統(tǒng)的藥劑。
優(yōu)選地，所述的有待治療的癥狀和/或并發(fā)癥是慢性疲勞綜合征。
優(yōu)選的所述藥劑是益生菌或含益生菌的組合物。還優(yōu)選所述的益生菌是活的完整生物體，或含益生菌的組合物包含活的完整生物體。
優(yōu)選地，有待治療的對象選自EBV陽性的運動員，突發(fā)CFS的對象，運動后持久疲勞的對象，具低水平唾液IgA或IgA1的對象，和被證明為患有傳染性單核細胞增多癥的對象。
圖2在用白假絲酵母(Candida albicans)侵染后喂嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillus acidophilus)的動物唾液中NO的分泌。
圖3在用白假絲酵母(Candida albicans)侵染后，益生菌對IL-12產生的影響。
圖4在用白假絲酵母侵染后，益生菌對IL-14產生的影響。
圖5喂嗜酸乳芽孢桿菌的動物的抗感染能力。
圖6在用白假絲酵母侵染后，益生菌對唾液IFN-γ的影響。
圖7在用白假絲酵母侵染后，益生菌對子宮頸淋巴結的影響。
圖8用白假絲酵母侵染后的唾液IFN-γ。
圖9在小鼠中用L-MLNA進行處理對清除白假絲酵母的影響。
本發(fā)明的方法和組合物也可有效地用于治療急性的和慢性的病毒感染。特別是可以設想到治療人群中普遍存在的、與多種癥狀和疾病相關的慢性埃-巴二氏病毒(EBV)，巨細胞病毒(CMV)和其他皰疹類病毒感染，這是特別有用的用途。還可以設想到的有用用途是將本發(fā)明的方法和組合物用于治療如下疾病，所述疾病可以起源于群體中流行的病毒感染或由之觸發(fā)并且其可使人衰弱，但尚無已知的或被充分闡釋的治療方案，例如慢性疲勞綜合征(“CFS”)。
目前有相當多被診斷為“CFS”的患者由于粘膜免疫受損表現出反復激活的EBV(或類似的皰疹類病毒感染)。這可通過測定唾液中的IgA1或IFN-y，或通過PCR檢測游離病毒進行監(jiān)測?？赡茼憫嫔委煹哪切┑牡湫?但非限制性)臨床特征包括以“病毒性疾病”開始，留下慢性復發(fā)性疲勞狀態(tài)。急性惡化伴隨“感染”(通常以咽喉炎為標志)或過度鍛煉出現。
病毒性感染并不一定引起立即可識別的癥狀，其可以在健康強壯的個體中潛伏相當長時間，但一旦提供引發(fā)因素則可以被再次激活。例如，在運動員接受高強度訓練或運動時，低粘膜含量的EBV可導致身體機能受損，這將使病毒重新活化并排出，由此又導致機能受損和/或疲勞。因此，EBV陽性并伴有機能受損的運動員，特別是當檢測出唾液中的IgA或IgA1水平低時(例如低于50mg/100ml)，接受本發(fā)明的制劑進行治療是有益的。
當然，本發(fā)明的制劑和方法也可以用于其他對象，例如被診斷為“CFS”的患者，當病毒(通常為EBV，但也可以是CMV，Ross River病毒等)被再次激活及疲勞尤其是因運動引起時。但是，對于下述的患者接受本發(fā)明制劑進行治療也是有益的，即任何被證實患有傳染性單核細胞增多癥且?guī)字軆葲]有改善并產生疲勞的患者，和任何在病毒性疾病臨床(血清學)跡象出現后產生持久性疲勞的患者，或突發(fā)CFS的個體，患復發(fā)性咽喉炎的個體，運動后疲勞顯著加劇的個體，表現出低水平的唾液IgA或IgA1(例如，低于50mg/100ml)的個體。
可以設想到，施用益生菌或含益生菌的組合物也將有助于治療與病毒感染相關的上述癥狀和/或病癥。
所述的益生菌對遠離益生菌施用位點的粘膜表面可產生作用。因此，廣義上說，本發(fā)明涉及益生菌產品，特別是屬于或包括乳芽孢桿菌的產品，但也可以包括其他細菌或細菌的組合，或實際上其他能夠誘導Th-1型細胞應答的佐劑，所述產品可作為大丸劑施用，或優(yōu)選地有規(guī)律地喂食，以便通過致敏粘膜T細胞或維持這些細胞的致敏狀態(tài)使所有粘膜表面保持最佳的粘膜保護狀態(tài)。這些T細胞含有IFNγ并能夠通過非特異性機制被觸發(fā)而釋放IFN-γ。因此，其他能夠非特異地激活共有粘膜系統(tǒng)的藥劑也可有利地用于本發(fā)明的制劑和方法中。
而且，本發(fā)明的益生菌可與其他治療相結合使用以加強或輔助其效力。例如，近20％接受抗生素治療幽門螺桿菌(H.pylori)感染的患者無法根除該生物體。這種對抗生素治療的耐受性可能是由于向Th0應答(即IFN-γ減少，而IL-4增多)的遷移所致。在進行抗生素治療之前，同時或之后施用益生菌可以是有益的，因為這可使應答轉回為更顯著的Th1應答，從而補充或輔助抗生素治療以根除患者體內的該生物體。
因此，施用益生菌可用于阻止或治療粘膜感染，異常或不適當的生物體在粘膜表面的寄居，和病毒的再激活或再感染。
下面參照非限定性的實施例對本發(fā)明進行更具體的描述。
簡要地說，24-孔微滴定板的板孔用俘獲抗-IL-4抗體包被。在室溫下溫育1小時后，洗孔并將生物素?；目?IL-4抗體加到每孔中。再溫育1小時后，洗孔并向每孔中加入鏈霉親和素-過氧化物酶偶聯物。溫育30分鐘后，洗孔并加入TMB底物。在ELISA平板讀數器中于450/620nm下讀取顯示的顏色。在未知的樣品中IL-4的水平利用標準曲線通過插值法定量。用類似的步驟測定IFN-γ。
在

圖1A和B中顯示的結果表明飼喂嗜酸乳芽孢桿菌導致IL-4的產生以劑量依賴方式受到抑制(圖1A)而IFN-γ的產生增強(圖1B)。
實施例2益生菌對唾液中一氧化氮(NO)分泌的影響如下述實施例3中所述，用嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillusacidophilus)喂DBA/2小鼠(每組n＝3到5)，然后再用白假絲酵母(Candida albicans)侵染上述小鼠。經口注入后在不同時間，注射毛果蕓香堿以促進唾液流出，然后收集唾液。依照Gree等的方法((1982)Anal.Biochem 126131-138)通過Griess反應確定唾液中NO的濃度。
數據表明，在喂嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillus acidophilus)(經口施用5×109CFU)的動物唾液中NO的分泌量在用白假絲酵母(Candidaalbicans)侵染后早期有顯著地升高，但在后期顯著地下降(圖2)。
實施例3喂食益生細菌后對白假絲酵母(C.albicans)的抗性每兩天一次用0.2mL PBS中的5×109個嗜酸乳芽孢桿菌(L.acidophilus)以胃內方式喂DBA/2小鼠H2d雄性小鼠(每組n＝3-5)，共兩周。最后一次飼喂后一天，用108個白假絲酵母(Candida albicans)芽生孢子侵染小鼠，所述的侵染是通過細頭無菌藥簽涂抹小鼠口腔而進行的。在感染后的不同天中測定口腔粘膜中的白假絲酵母(C.albicans)數量。口腔(頰，舌和軟腭)用細頭棉簽徹底擦拭。將所述的棉簽置于1mLPBS中，用渦旋混和器混合以懸浮酵母細胞，然后于37℃下，在添加了氯霉素的沙氏葡糖瓊脂上培養(yǎng)10倍系列稀釋物。所得結果以CFU/mL表示(圖5)。
與喂食PBS的對照小鼠相比，喂食嗜酸乳芽孢桿菌(L.acidophilus)的小鼠在所有的時間點上均有更強的抗感染性。不遲于第6天，幾乎所有的酵母細胞均從喂食了嗜酸乳芽孢桿菌(L.acidophilus)的小鼠中被清除掉。
實施例4IL-4，IFN-γ和IL-12的產生用實施例3中所述的模型進一步研究對白假絲酵母(Candidaalbicans)感染的應答。
通過在MSE Soniprep中超聲處理，從新鮮培養(yǎng)的白假絲酵母(Candida albicans)制備假絲酵母抗原。將超聲處理物于2000g離心10min，然后收集上清液于PBS中透析。評估蛋白質后，將所述溶液過濾除菌并貯存于-20℃以備需要。
過篩切割子宮頸淋巴結組織以制備子宮頸淋巴結(CLN)細胞的單細胞懸浮物。將所述細胞收集在添加了10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，離心洗兩次，然后以每孔4×106個細胞在有2.5μg/mL假絲酵母抗原的24-孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)3天。
收集培養(yǎng)物上清液，用匹配的抗體對以及作為對照的重組細胞因子(Pharmingen，San Diego，CA)通過ELISA分析IL-4，IL-12和IFN-γ。細胞因子ELISA的靈敏度為31pg/mL，結果以扣除背景后的凈量表示。
依實施例2中所述方法獲得唾液樣品。
IL-4和IL-12研究的結果如圖3(IL-12)和圖4(IL-4)所示。
IFN-γ的研究結果如圖6(唾液的IFN-γ)和7(子宮頸淋巴結IFN-γ)所示。
對照數據表明，僅有很弱的且持繼時間不佳的對白假絲酵母(Candida albicans)口腔感染的應答，且直到感染后的第6天也沒有檢測到IFN-γ。而有關喂食了嗜酸乳芽孢桿菌(L.acidophilus)的小鼠的研究數據表明，在未感染的小鼠中沒有IFN-γ應答，但當小鼠受白假絲酵母(C.albicans)侵染后即有早期應答(第2天)，并且與未喂食嗜酸乳芽孢桿菌(L.acidophilus)的對照小鼠相比，其在經白假絲酵母(C.albicans)侵染后有更持久的IFN-γ應答。這一最初效果在第15天于淋巴結中和第8天于唾液中均仍可觀察到。
不希望受到任何具體作用機制的約束，但似乎通過施用乳芽孢桿菌可使粘膜表面致敏以在受侵染后分泌IFN-γ，而且在這一模型中IFN-γ起到阻止病原體白假絲酵母(Candida albicans)向真菌的菌絲體(侵襲性)形式轉化的作用并加強了細胞免疫和一氧化氮產生。
實施例5.IFN-γ和NO的抗感染作用為確定保護的免疫參數，在白假絲酵母(C.albicans)感染后的不同時間測定IFN-γ水平。如圖8所示，與未免疫的小鼠相比，免疫小鼠唾液中IFN-γ水平在經白假絲酵母(C.albicans)侵染后即刻以及侵染后1天明顯升高。所述的水平可維持15天以上，與未免疫的小鼠相比，在第10天和第15天檢測到顯著更高的水平。由于一氧化氮的產生與宿主的寄生感染防御相關，故在兩個具有相同H2d MHC單倍型的小鼠品系中定量感染后的NO量。在這一實驗中小鼠經白假絲酵母(C.albicans)感染后腹膜內注射NO合酶抑制劑，在三天中每天注射NG-L-精氨酸單甲基一乙酸酯(MNLA)，然后測定酵母的清除速度。如圖9所示，在兩個小鼠品系中，與未經處理的小鼠相比，在不同的時間點用MNLA處理的小鼠均延遲了清除酵母的時間，這表明NO產生的減少與抗性相關。
實施例6飼喂嗜酸乳芽孢桿菌的大鼠肺中非典型流感嗜血桿菌的清除增加將0.75 mL PBS中的嗜酸乳芽孢桿菌(2.5×1010個每只大鼠)或單獨的PBS通過胃內途徑喂食DA大鼠(200-250克，8-10周齡，AnimalResource Centre，Perth，WA)，每2天一次共7天，其間所述大鼠通過腔內途徑給予福爾馬林滅活的流感嗜血桿菌(每只大鼠5×109個)進行免疫(見下組)。繼續(xù)飼喂大鼠，每2天一次共2周，之后，經氣管內途徑用50μl福爾馬林滅活的流感嗜血桿菌(每只大鼠5×108個)進行加強。繼續(xù)飼喂嗜酸乳芽孢桿菌7天后，用50μL5×108個活流感嗜血桿菌侵染大鼠肺部。
免疫組(5只大鼠/組)1PBS(腔內)2流感嗜血桿菌(腔內)+流感嗜血桿菌(氣管內加強)3PBS(腔內)+嗜酸乳芽孢桿菌(每2天喂一次)4流感嗜血桿菌(腔內)+流感嗜血桿菌(氣管內加強)+嗜酸乳芽孢桿菌(每2天喂一次)侵染后4小時處死大鼠，在支氣管灌洗液(BAL)和肺勻漿物(LH)中檢測肺內的寄居水平。清除水平通過將10倍系列稀釋的支氣管灌洗液或肺勻漿物接種到巧克力瓊脂平板上進行測定。所得結果以菌落形成單位數(CFU)表示。
結果如表1所示。喂嗜酸乳芽孢桿菌并用滅活的流感嗜血桿菌免疫的大鼠對肺部的流感嗜血桿菌感染有更強的抗性。而且，用重復劑量的嗜酸乳芽孢桿菌口服喂養(yǎng)的大鼠比僅用單一嗜酸乳芽孢桿菌大丸劑喂養(yǎng)的大鼠具有更強的抗感染能力，這提示，增強的清除作用有可能是由于重復喂食后嗜酸乳芽孢桿菌在腸道內的寄居增強所致。
表1喂食嗜酸乳芽孢桿菌的大鼠肺部中流感嗜血桿菌的清除增強

實施例7.在用滅活的沙門氏菌疫苗免疫后的小鼠中嗜酸乳芽孢桿菌(VRI 011)對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella tyhimurium)轉移的影響革蘭氏陰性細菌穿過腸上皮的轉移特別會在經外科手術或胃腸感染后的個體中出現。若不進行治療可導致內毒素血癥。在這一實施例中，檢測了喂食嗜酸乳芽孢桿菌對腸道病原體鼠傷寒沙門氏菌轉移的影響。
雌性BALB/c小鼠，6-8周齡，從Animal Resource Centre(Perth，WA)獲得。嗜酸乳芽孢桿菌菌株(VRI 011)和病原體鼠傷寒沙門氏菌由the School of Microbiology and Immunology Type Culture Collection，University of New South Wales獲得。
在兩周的時間內給予小鼠5劑嗜酸乳芽孢桿菌(VRI 011)(每劑1×108cfu)或PBS，此后用滅活的口服沙門氏菌疫苗胃內免疫所述小鼠。免疫后兩周將小鼠處死，收集其脾臟以計算嗜酸乳芽孢桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的數量。
與喂食PBS的小鼠相比，在口服滅活的沙門氏菌疫苗之前或同時給小鼠喂食嗜酸乳芽孢桿菌(VRI 011)可以更好地阻止口服活細菌侵染后沙門氏菌的轉移(表1)。用滅活的口服疫苗免疫降低了鼠傷寒沙門氏菌向脾臟的轉移，但喂食嗜酸乳芽孢桿菌可進一步加強這種作用。病原細菌通過腸道上皮的轉移可通過口服益生菌予以阻止。
實施例8在經滅活的口服沙門氏菌疫苗免疫的小鼠中發(fā)酵乳芽孢桿菌對病原鼠傷寒沙門氏菌從腸道發(fā)生轉移的影響2周時間內，在施用108個滅活的鼠傷寒沙門氏菌疫苗之前或同時給BALB/c雌性小鼠(6-8周齡)喂食108個發(fā)酵乳芽孢桿菌VRI012(由University of New South Wales，School of Microbiology andImmunology Culture Collection，Sydney，澳在利亞獲得)四次。口服施用后兩周，以口服途徑施用活鼠傷寒沙門氏菌以侵染上述小鼠。將小鼠處死后，測定鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella tyhimurium)在小鼠脾臟中的寄居水平。表2表明，與喂食PBS的小鼠相比，在施用鼠傷寒沙門氏菌免疫之前或同時喂食發(fā)酵乳芽孢桿菌的小鼠中僅出現低水平的轉移。表2在經滅活的鼠傷寒沙門氏菌疫苗免疫的小鼠中發(fā)酵乳芽孢桿菌VRI012增強對鼠傷寒沙門氏菌轉移的抑制

實施例9.發(fā)酵乳芽孢桿菌對清除NTHi細菌的影響對6只雌性、無特定病原體的黑刺豚鼠(DA)組成的實驗組單次給予PBS或活發(fā)酵乳芽孢桿菌(2.5×1010)，所述的給藥在通過剖腹手術暴露出腸道后直接注射到十二指腸腔中完成。21天后，用5×108個活的非典型流感嗜血桿菌(NTHi)氣管內感染所述的大鼠。4小時后用過量的戊巴比妥處死上述大鼠。其肺臟用10mLPBS灌洗以獲得支氣管肺泡灌洗液(BAL)。經灌洗的肺臟在10mL PBS中進行組織勻漿。將20ul10倍系列稀釋的BAL和肺勻漿物(LH)接種在巧克力瓊脂平板上，于10％CO2孵箱中37℃下培養(yǎng)過夜。菌落記數并確定在BAL和LH制品中的活細菌數，以菌落形成單位(CFU)表示回收的活NTHi細菌，如下表3.

*與PBS組相比這些數據表明用發(fā)酵乳芽孢桿菌向腸道單次給藥可增強對后續(xù)急性NTHi呼吸道感染的清除。
實施例10.嗜酸乳芽孢桿菌對幽門螺桿菌的清除的影響通過管飼法連續(xù)三天(第1，2和3天)施用約109個活幽門螺桿菌，以幽門螺桿菌(Sydney菌株1)感染兩組小鼠，其中每組5只雌性C57BL/6小鼠。在第28，30，32，35，37和39天通過管飼法用嗜酸乳芽孢桿菌(5×109個在0.2 mL水中)或水(對照組)對小鼠給藥。
21天(第50天)后用過量的戊巴比妥(腹膜內施用)處死小鼠并取出它們的胃。將胃對半切開，一半置于1mL去離子水中勻漿。將胃勻漿物的10倍系列稀釋物接種于含兩性霉素，萬古霉素，桿菌肽和萘啶酮酸的巧克力瓊脂平板上。在37℃微需氧條件下培養(yǎng)3天后，對菌落進行記數，并確定在最初的胃勻漿物中的活幽門螺桿菌總數。從胃中回收到的活幽門螺桿菌的結果以菌落形成單位表示，見下表。
表4

兩組有顯著的不同(P＝0.013)這些結果表明施用嗜酸乳芽孢桿菌的小鼠比對照組小鼠具有較低水平的胃內幽門螺桿菌感染。這是一個關于嗜酸乳芽孢桿菌對預先建立的幽門螺桿菌(H.pylori)感染的治療效果的實例。
實施例11在用益生菌預處理的小鼠中對幽門螺桿菌感染的抗細菌治療(甲硝基羥乙唑)幽門螺桿菌感染的小鼠(每組5只)在用甲硝基羥乙唑(0.08mg/只動物)治療1周以前，持繼2周每周口服3次嗜酸乳芽孢桿菌(每只動物1×109個)。
下述結果表明，與用鹽水處理的對照組相比，在下列處理小鼠中觀察到胃中的細菌被非常顯著地清除掉，所述處理小鼠為用益生菌預處理后用抗生素治療的小鼠(70％，p＝0.009)，單獨用益生菌治療的小鼠(58％，p＝0.013)，和單獨用甲硝基羥乙唑治療的小鼠(55％，p＝0.025)。
表6

與對照數值相比a，p＜0.01；b，p＜0.02；c，p＜0.005上述實施例闡明，益生細菌可通過驅動特定的細胞因子平衡(來自腸道來源的但于粘膜中重新定位的T細胞)建立一種較不適于特定微生物生長的環(huán)境。
盡管本發(fā)明參照優(yōu)選的實施方案進行了描述，但應當理解的是符合本文所述的本發(fā)明概念的變化形式也包括在本發(fā)明的范圍之內。
權利要求
1.預防或治療非腸粘膜表面的粘膜表面的慢性或急性感染或非期望的微生物寄居的方法，該方法包括向需要它的對象施用有效量的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述的粘膜表面選自口的，鼻咽的，呼吸道的，胃的，生殖道的和腺體的粘膜。
3.預防或治療呼吸道粘膜表面的慢性或急性疾病的方法，該方法包括向需要它的對象施用有效量的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述的粘膜表面是口腔粘膜。
5.如權利要求3所述的方法，其中，所述的粘膜表面是肺粘膜。
6.如前述任意一項權利要求所述的方法，其中，所述的本文中所定義的益生菌，或含益生菌的組合物被施用于胃或腸粘膜表面。
7.預防或治療由擾亂細胞因子平衡或缺乏適當的T細胞免疫應答所引起的慢性或急性粘膜表面疾病的方法，該方法包括向需要它的對象施用有效量的益生菌或含益生菌的組合物。
8.如權利要求6或7所述的方法，其中，所述的粘膜表面選自口的，鼻咽的，呼吸道的，胃的，腸的，生殖道的和腺體的粘膜表面。
9.如權利要求3-8中任意一項所述的方法，其中，所述的疾病是感染或不適當的微生物寄居。
10.如權利要求9所述的方法，其中，所述的感染是由下述一種或多種細菌引起的細菌感染，所述的細菌選自假單胞菌種，鏈球菌種，葡萄球菌種，假絲酵母種，螺桿菌種和嗜血桿菌種。
11.如權利要求10所述的方法，其中，所述的一種或多種細菌選自非典型的流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌，肺炎鏈球菌，白色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，白假絲酵母和幽門螺桿菌。
12.如權利要求9所述的方法，其中，所述的疾病是感染或不適當的病毒寄居。
13.如權利要求12所述的方法，其中，所述的病毒選自埃-巴二氏病毒(EBV)，巨細胞病毒(CMV)，Ross River病毒(RRV)，皰疹類病毒等。
14.如權利要求9或12所述的方法，其中，所述的疾病是慢性疲勞綜合征(CFS)。
15.如權利要求7-14中任意一項所述的方法，其中所述的細胞因子是干擾素-γ，白介素-4和/或白介素-12。
16.如權利要求9-15中任意一項所述的方法，其中，所述的適當的T細胞免疫應答是Th1應答。
17.如權利要求1-16中任意一項所述的方法，其中，所述的本文中所定義的益生菌是，或含益生菌的組合物包含乳芽孢桿菌屬或分枝桿菌屬種。
18.如權利要求17所述的方法，其中，所述的本文中所定義的益生菌是，或含益生菌的組合物包含嗜酸乳芽孢桿菌、發(fā)酵乳芽孢桿菌、干酪乳芽孢桿菌和/或牝牛分枝桿菌。
19.如權利要求17或18所述的方法，其中所述的本文中所定義的益生菌，或含益生菌的組合物包括活的生物體。
20.如權利要求1-19中任意一項所述的方法，其中，所述的有效量在約108到1012CFU的范圍內。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述的有效量是約1011CFU。
22.如權利要求1-21中任意一項所述的方法，其中，所述的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物是固體劑型。
23.如權利要求22所述的方法，其中，所述的劑型是片劑或膠囊。
24.如權利要求1-23中任意一項所述的方法，其進一步包括施用一種或多種藥學上的活性劑。
25.如權利要求24所述的方法，其中，一種或多種藥學上的活性劑是抗生素。
26.如權利要求24或25所述的方法，其中，所述的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物在施用一種或多種藥學上的活性劑之前，同時或之后施用。
27.如權利要求1-26中任意一項所述的方法，其中所述的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物的施用位點遠離有病癥的粘膜表面。
28.如權利要求27所述的方法，其中，所述的本文中所定義的益生菌，或含益生菌的組合物被施用于腸粘膜表面以治療口的，鼻咽的，胃的，呼吸道的，生殖道的或腺體的粘膜感染。
29.改變對象粘膜表面細胞因子平衡的方法，該方法包括向需要它的對象施用有效量的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
30.誘導對象粘膜表面產生Th1細胞免疫應答的方法，該方法包括向需要它的對象施用有效量的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
31.增強對象粘膜表面的干擾素-γ分泌的方法，該方法包括向需要它的對象施用有效量的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
32.降低對象粘膜表面的白介素-4分泌的方法，該方法包括向需要它的對象施用有效量的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
33.恢復對象粘膜表面的正常細胞因子平衡的方法，該方法包括向需要它的對象施用有效量的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
34.致敏粘膜表面以進行免疫治療的方法，該方法包括向需要它的對象施用有效量的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
35.如權利要求34所述的方法，其中，所述的免疫治療是施用治療性或預防性的疫苗。
36.如權利要求34或35所述的方法，其中，所述的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物在施用所述的疫苗之前或同時施用。
37.如權利要求35或36所述的方法，其中，在施用所述疫苗之后再施用所述的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
38.適用于預防或治療粘膜表面的慢性或急性疾病的藥物組合物，其包含有效量的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
39.如權利要求38所述的藥物組合物，其中，所述的本文中所定義的益生菌是，或含益生菌的組合物包含乳芽孢桿菌屬或分枝桿菌屬種。
40.如權利要求39所述的藥物組合物，其中，所述的本文中所定義的益生菌是，或含益生菌的組合物包含嗜酸乳芽孢桿菌，發(fā)酵乳芽孢桿菌，干酪乳芽孢桿菌和/或牝牛分枝桿菌。
41.如權利要求38到40中任意一項所述的藥物組合物，其中，所述的本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物包括活的生物體。
42.如權利要求38到41中任意一項所述的藥物組合物，其中該組合物包含約108到約1012CFU。
43.如權利要求42所述的藥物組合物，其中該組合物包含約1011CFU。
44.如權利要求38到43中任意一項所述的藥物組合物，其中，所述的藥物組合物是固體劑型。
45.如權利要求44所述的藥物組合物，其中，所述的劑型是片劑或膠囊。
46.預防或治療粘膜表面與慢性或急性感染或非期望的微生物寄居或再活化相關的癥狀和/或并發(fā)癥的方法，所述的方法包括給需要它的對象施用有效量的能非特異性激活共有粘膜系統(tǒng)的藥劑。
47.如權利要求46所述的方法，其中所述的癥狀和/或并發(fā)癥是慢性疲勞綜合征。
48.如權利要求46或47所述的方法，其中，所述的藥劑是本文中所定義的益生菌或含益生菌的組合物。
49.如權利要求48所述的方法，其中，所述的本文中所定義的益生菌是，或含益生菌的組合物包含活的完整生物體。
50.如權利要求46到49中任意一項所述的方法，其中，所述對象選自EBV陽性的運動員，突發(fā)CFS的對象，運動后持久疲勞的對象，具低水平唾液IgA或IgA1的對象和被證明為患有傳染性單核細胞增多癥的對象。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過尤其是利用益生菌，如乳芽孢桿菌或牝牛分枝桿菌增強非特異性的粘膜免疫，用于治療或預防與粘膜表面相關的疾病，特別是治療粘膜處感染性病癥的方法和組合物。
文檔編號A61P31/10GK1444484SQ01813439
公開日2003年9月24日 申請日期2001年6月19日 優(yōu)先權日2000年6月19日
發(fā)明者R·克蘭西, G·派恩, T·博羅蒂, M·鄧克利, P·L·康韋 申請人:穆科普羅泰科有限公司