專利名稱：用于聯合治療的crf的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體的藥物組合物；并且涉及治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，本發(fā)明的CRF受體配體是所述CRF受體的激動劑或拮抗劑。除了作為CRF受體的本發(fā)明的藥物目標之外，本發(fā)明還涉及針對CRF1和CRF2受體mRNA的藥用制劑。
背景技術：
大量研究業(yè)已證實了促腎上腺皮質素釋放因子(CRF)在控制腦垂體-腎上腺皮質系統(tǒng)，以及在調節(jié)對應激的行為、自主神經和免疫應答方面的重要性。因此，這種肽被認為參與了影響疾病的病理生理學。目前，業(yè)已鑒定了兩種能介導CRF的作用的兩個7次跨膜受體CRF1和CRF2。這兩種受體在大腦中是普遍表達的，盡管在這兩種受體亞型的高度表達部位之間幾乎不存在明顯的重疊。業(yè)已報導了CRF過表達轉基因小鼠表現出致焦慮(產生焦慮)行為的增加(Stenzel-Poore等，促腎上腺皮質素釋放因子在轉基因小鼠體內的超量表達致焦慮行為的遺傳學模型。J.Neuroscience 14，2579-2584，1995)。特別重要的問題是，上述致焦慮反應是否是由CRF對CRF1受體、CRF2受體或對這兩者的作用而介導的。
促腎上腺皮質素釋放因子(CRF)拮抗劑披露于被以全文形式收作本文參考的以下美國專利中US4605642，5874227，5962479，5063245，5861398和6083948。若干公開的專利申請也披露了促腎上腺皮質素釋放因子拮抗化合物，其中包括杜邦Merck公司的PCT申請US94/11050，輝瑞公司的WO95/33750，輝瑞公司的WO95/34563，輝瑞公司的WO95/33727和US5424311。在US5063245和Pham.Rev.，43425-473(1991)中，討論了被認為可以用CRF拮抗劑治療的疾病。
業(yè)已推測CRF在以下疾病的病因學和病理生理學方面起作用阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、神經性厭食癥、漸進性核上麻痹和肌萎縮性側索硬化，因為它們與中樞神經系統(tǒng)中的CRF神經元的功能障礙相關[有關綜述參見E.B.De Souza，Hosp.Practice2359，1988，G.N.Smagin，L.A.Howell，D.H.Ryan，E.B.De Souza和R.B.S.Harris Neuroreport 9，1601-1601，1988；和J.Pharmacol.Exp.Therap.，293，700-806，2000]。被以全文形式收作本文參考的US6051578披露了可用于治療和預防以下疾病的(CRF)受體拮抗劑頭部創(chuàng)傷、脊髓創(chuàng)傷、缺血性神經元損傷(例如，大腦缺血，如大腦海馬缺血)、興奮性毒性神經元損傷、癲癇、中風、應激誘導的免疫功能障礙、恐怖癥、肌肉痙攣、帕金森氏病、亨廷頓氏病、尿失禁、阿爾茨海默型老年癡呆、多梗塞性癡呆、肌萎縮性側索硬化、化學制品依賴性和成癮(例如，對酒精、可卡因、海洛因、苯并二氮卓類或其他藥物的依賴性)、和低血糖癥。
被以全文形式收作本文參考的美國專利US6001807披露了可用于治療和預防嘔吐的(CRF)受體拮抗劑。通過披露于以下文獻中的方法進行的實驗證實了CRF-拮抗劑的抗嘔吐活性Ueno等，LifeSciences 41513-518，1987；和Rudd等，British Journal ofPharmacology119931-936，1996。
另外，有多份文件披露了CRF1受體拮抗劑，例如Chen等，J.Med.Chem.394358-4360，1996；Whitten等，J.Med.Chem.394354-4357，1996；Chen等，J.Med.Chem.40(11)1749-1754，1997；Lundkvist等，Eur.J.Pharmacoloy309，198-200，1996；和Mansbach等，Eur.J.Pharmaco loy323，21-26，1997，以上文獻被以全文形式收作本文參考。更具體地講，Gilligan等(BioOrganic MedicinalChem.8，181-189，2000，被以全文形式收作本文參考)披露了CRF1受體配體DPC904。
另外，在以下文獻中披露了諸如蛙皮降壓肽、尿皮質素(urocortin)和其他CRF2肽的CRF2受體配體Ho等，Mol.BrainRes.6，11，1998；J.Spiess等，Trends Endocrinology andMetabolism9，140-145，1998 CRF受體的分子特性；和D.P.Behan等，Mol.Psychiatryl，265-277，1996，以上文獻被以全文形式收作本文參考。
盡管業(yè)已在動物上證實通過選擇性拮抗劑阻斷CRF1受體，能夠產生抗焦慮(緩解焦慮)和抗抑郁作用，對CRF2受體的功能進行的研究還不夠。原位雜交和受體放射自顯影實驗證實，所述受體主要位于大腦的邊緣和下丘腦部位，這表明它在介導CRF的致焦慮和厭食作用方面起作用。最近，業(yè)已證實了CRF2選擇性拮抗劑(抗-蛙皮降壓肽-30)(Gulyas J.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，10575-579)。業(yè)已鑒定了一種具有CRF1和CRF2的雙重活性的肽Astressin(Ruhmann，A.，Bonk，I.，Lin，C.R.Rosenfeld，M.G.&Spiess，J.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，15264-15269)。在缺乏這種受體的特異性激動劑或拮抗劑的條件下，對CRF2受體表達的反義抑制可以提供有關該受體在正常生理學中的作用的證據。
反義核苷酸是設計出來的與感興趣的mRNA分子的互補的短的寡核苷酸(長度通常為大約15-大約25個核苷酸)。反義寡核苷酸通過沃森-克里克堿基配對與其mRNA靶子的雜交，啟動了一連串的事件，這些事件止于所述目標mRNA分子的定位于寡核苷酸的降解。這種mRNA降解的直接后果是，抑制了所編碼的蛋白的合成。在存在明顯降低了的水平的所述靶蛋白的情況下進行研究可以揭示其功能。在缺乏小分子配體(例如CRF2受體的配體)的情況下，反義寡核苷酸可能是用于蛋白功能研究的非常有用的工具。另外，可以將它們用于以小分子配體通常不可能實現的方式區(qū)分蛋白家族的密切相關的成員(如CRF1和CRF2)。
有效的反義序列的設計和選擇并非是輕而易舉的工作。反義寡核苷酸有很大的不同，并且無法預測其活性，因為其mRNA靶具有明顯的二級和三級結構，這種結構會使得mRNA分子的大部分無法進行雜交。僅有20-35％的反義序列具有明顯的抑制活性(50％或更高)。使用我們開發(fā)的分子技術鑒定了CRF2受體mRNA上的多個可及區(qū)(Ho等，通過用寡核苷酸文庫對RNA可及位點進行作圖合理選擇了人多種藥物抗性-1mRNA的高效反義寡核苷酸。Nucl.Acids Res.24，1901-1907，1996；Ho等，通過寡核苷酸文庫對反義實驗的RNA可及位點進行作圖。Nature Biotech.16，59-63，1998)。針對所述可及位點的反義寡核苷酸，能夠在體內對125I-蛙皮降壓肽與CRF2受體的結合產生至少50％的抑制作用。
業(yè)已報導了研究CRF2受體功能的兩個反義研究結果。這兩項研究都沒有發(fā)現CRF2受體參與介導CRF2的致焦慮作用的證據。不過，在一項研究中(Heinrichs等，促腎上腺皮質素釋放因子CRF1而不是CRF2受體能介導致焦慮樣行為。Reg.Peptides71，15-21，1997)，CRF2受體僅僅減少了15-20％，而所使用的寡核苷酸產生了毒性副作用(顯著的體重下降)，這一結果使得混淆了學實驗的結果。在第二項報導中提供了很少的細節(jié)(Montkowski等，Biol.Psychiatry 39，566，1996；和Liebsch，G.Landgraf.R.，Engelmann，M.，Lorscher，P.&Holsboer，F.1999，J.Psychiatric Res.33，153-163)。
不過，在披露于以其全文形式收作本文參考的國際專利申請?zhí)朠CT/US00/0819和美國專利申請?zhí)?9/481981中披露的使用CRF2反義寡核苷酸進行的一項研究中，我們發(fā)現抑制CRF2受體表達能在動物體內產生抗焦慮作用。
另外，我們發(fā)現當CRF2受體反義寡核苷酸與CRF1受體配體同時給藥時，可以大大加強抗焦慮作用。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體。
在一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF1受體配體是CRF1受體的激動劑。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF1受體配體是CRF1受體的拮抗劑。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者服用治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體配體是CRF2受體的激動劑。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體配體是CRF2受體的拮抗劑。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被選自下列一組的修飾過的核苷酸殘基所取代2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-甲氧基-乙氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-氟代-核糖核苷磷酸二酯、5-(1-丙炔基)胞嘧啶硫代磷酸酯、5-(1-丙炔基)尿嘧啶硫代磷酸酯、5-甲基胞嘧啶硫代磷酸酯、2’-脫氧核糖核苷-N3’-P5’氨基磷酸酯和聚酰胺核酸，和具有以下結構式的閉鎖(locked)核酸； 或 其中，B是嘌呤或嘧啶堿基。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代，其中，所述寡核苷酸的長度為大約15-大約25個核苷酸。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸的60-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是包含以下序列的反義寡核苷酸(a)TGT ACG TGT TGC GCA AGA GG；(b)GGT GGG CGA TGT GGG AAT G；(c)GGA TGA AGG TGG TGA TGA GG；和(d)TGA CGC AGC GGC ACC AGA CC。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述疾病是精神疾病。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的精神疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述精神疾病選自下列一組焦慮癥、強迫性神經失調、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應激疾病、恐怖癥、神經性厭食、和抑郁癥。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述疾病選自下列一組頭部創(chuàng)傷、脊髓創(chuàng)傷、缺血性神經元損傷(例如，大腦缺血，如大腦海馬缺血)、興奮性毒性神經損傷、癲癇、中風、應激誘導的免疫功能障礙、驚恐性障礙、肌肉痙攣、帕金森氏病、亨廷頓氏病、尿失禁、阿爾茨海默型老年癡呆、多梗塞性癡呆、肌萎縮性側索硬化、化學制品依賴性和成癮(例如，對酒精、可卡因、海洛因、苯并二氮卓類或其他藥物的依賴性)、和低血糖癥。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，CRF1受體配體和CRF2受體配體是同時給藥的。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，CRF1受體配體和CRF2受體配體是序貫給藥的。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括讓有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體與一種含有CRF1受體和CRF2受體的組合物接觸。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括讓有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸與含有CRF1受體的組合物接觸，其中，CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
在另一種實施方案中，本發(fā)明涉及治療與CRF2受體活性相關的疾病，包括讓有效量的CRF2受體配體與一種含有CRF2受體的組合物接觸。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該組合物含有CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，以及藥用載體。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療或預防與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的藥用試劑盒，所述試劑盒包括多個獨立的容器，其中，至少有一個所述容器裝有CRF1受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且至少有另一個所述容器裝有CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且所述容器選擇性地裝有一種藥用載體。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療或預防與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的藥用試劑盒，所述試劑盒包括多個獨立的容器，其中，至少有一個所述容器裝有CRF1受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且至少有另一個所述容器裝有CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且所述容器選擇性地裝有一種藥用載體。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療精神疾病的具有CRF1受體配體活性和CRF2受體配體活性的化合物。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了針對CRF2受體的mRNA的反義寡核苷酸，它能顯著減弱CRF2受體在嚙齒類動物腦中的表達。用上述寡核苷酸抑制CRF2受體功能，能在動物體內產生明顯的抗焦慮(緩解焦慮)的作用。上述資料首次提供了CRF2受體在介導促腎上腺皮質素釋放因子的致焦慮(產生焦慮)作用方面起著重要作用的功能性證據。另外，以上資料證實了包括小分子在內的CRF2受體拮抗劑用于有效治療包括焦慮癥、強迫性神經失調、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應激疾病、恐怖癥和抑郁癥在內的多種精神疾病的潛力。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療包括，但不限于患者的焦慮癥、強迫性神經失調、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應激疾病、恐怖癥和抑郁癥的精神疾病的方法，包括給所述需要治療的患者服用治療有效量的藥用組合物，該組合物包括由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種篩選化合物以便確定用于治療包括，但不限于焦慮癥、強迫性神經失調、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應激疾病、恐怖癥和抑郁癥的精神疾病的活性的方法。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
附圖簡述業(yè)已出于解釋和說明目的選擇了本發(fā)明的某些實施方案，不過，這些實施方案并不是要以任何方式限制本發(fā)明的范圍。這些實施方案示于下面所介紹的附圖中。


圖1a反義序列選擇的示意圖。
圖1b嵌合的、半隨機的寡核苷酸文庫的性質。
圖2a在反義研究中最常使用的核苷酸類似物的結構；硫代磷酸酯的改變會產生CNS毒性作用。
圖2b修飾過的寡核苷酸類似物結構，它保留了藥物效力，但消除了在摻入寡核苷酸上用于CNS用途時的毒性。
圖2c嵌合寡核苷酸的若干種可能的構型之一。
圖3a反義寡核苷酸對大鼠凍結行為的影響。
圖3b在所述凍結測定中，反義治療的大鼠的對側間隔中的125I-蛙皮降壓肽結合的抑制作用。
圖4a反義治療對嚙齒類動物在抬高的正迷宮中的行為的影響。
圖4b在所述較高的正迷宮測定中反義治療的大鼠側間隔中對125I-蛙皮降壓肽結合的抑制作用。
圖5抗蛙皮降壓肽-30對大鼠凍結行為的影響。
圖6CRF2受體反義寡核苷酸與CRF1拮抗劑的結合對大鼠凍結行為的影響。
發(fā)明詳述并不是所有的反義寡核苷酸都能具有強效抑制活性，針對CRF2受體mRNA的寡核苷酸也不例外?；钚苑戳x序列的鑒定是一項更重要的參數，它能決定反義實驗的成功。影響反義序列效力的因素是復雜的，并且對它的了解也不充分；因此，只有20-35％的測試過的反義寡核苷酸具有對目標蛋白合成產生50％抑制作用的足夠活性。
活性反義序列的選擇在很大程度上是憑經驗進行的，并且相當花費時間。因此，設計了一種用于定位mRNA分子上的最有可能與反義寡核苷酸雜交的位點的方法(Ho等，1996；Ho等，1998)。這一目的是通過用化學合成的、半隨機的寡核苷酸文庫(圖1b)探測RNA轉錄物而實現的(圖1a)。在混合在一起之后，mRNA上的可及區(qū)能夠與存在于所述文庫中的互補序列雜交。然后用核糖核酸酶H(RNA酶H)鑒定所述區(qū)域，所述核糖核酸酶只能催化雜合的RNA-DNA雙鏈體中的RNA鏈的磷酸二酯主鏈水解性剪切。對所產生的RNA片段進行測序，可以鑒定特定mRNA序列上的能夠用作導向于反義寡核苷酸的位點的區(qū)域。將該RNA作圖方法應用于含有CRF2受體mRNA的完整編碼區(qū)的RNA轉錄物，導致鑒定了可以與反義寡核苷酸雜交的多個RNA位點(表1)。
表1可及位點位置A 315-338B 417-455C 608-625D 677-731E 763-813F 859-882G 911-941H 1018-1031I 1161-1185J 1238-1258K 1385-1417表1CRF2受體mRNA上的寡核苷酸雜交可及位點。序列信息參見RNU16253.GB＿RO(GenBank序列，編號U16253)。
可以通過將反義寡核苷酸的5’末端導向于由表1中所提供的數據確定的可及位點，設計長度為15-25個核苷酸的反義寡核苷酸。例如，在下面所披露的研究中所使用的反義寡核苷酸，是導向于可及位點E的758-777號位置的20個核苷酸的序列(TGA CGC AGC GGC ACC AGACC)。
針對上述若干位點的反義序列能在基于細胞的測定中抑制至少50％的CRF2受體合成。上述測定是通過使用125I-蛙皮降壓肽進行的CRF2放射性配體結合測定完成的。所述反義抑制是序列特異性的，因為反義寡核苷酸的4個堿基的錯配，只能導致125I-蛙皮降壓肽結合的很少的降低。另外，所述序列還能在體內抑制CRF2受體合成。
在CNS體內反義實驗中最常使用的寡核苷酸的兩種化學形式是2’-脫氧核糖核苷磷酸二酯寡核苷酸和2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯寡核苷酸(圖2a)。盡管與基因中的雙鏈DNA的化學結構相同，單鏈的磷酸二酯寡核苷酸易受核酸外切和內切降解，其血清半衰期為20分鐘。即使是在具有較低核酸酶活性水平的大腦的‘特殊’環(huán)境中，磷酸二酯寡核苷酸也能被降解，不過被降解的更緩慢一些。其中的一個非橋連磷酸氧分子被硫所取代的硫代磷酸酯寡核苷酸對降解酶的抗性更強。在血清和組織培養(yǎng)實驗中，硫代磷酸酯寡核苷酸的半衰期超過12小時，并且對從大鼠腦中提取的硫代磷酸酯進行的分析發(fā)現，這種寡核苷酸至少在24小時之內在化學上都是完整的。不過，在大腦中使用這種寡核苷酸，能產生化學相關的，但不是序列特異性的毒性作用。最近業(yè)已報導了發(fā)熱反應、炎性介質的誘導、體重減輕和各種臨床癥狀。在我們的實驗中，含有硫代磷酸酯的化合物的CRF2反義序列主要對CRF2受體產生抑制作用，但能導致顯著的體重減輕(類似于Heinrichs的報導)，并且在接受治療的動物身上產生了多種病理生理學癥狀。用很多不同的序列、反義序列和對照序列都觀察到了上述作用，這樣就排除了它們是靶相關的作用的可能性。
降低所述寡核苷酸中硫代磷酸酯的總體含量的方法在保持寡核苷酸的效力，同時又避免所述毒性作用方面是最有效的。其中最多達60％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核糖核苷磷酸二酯殘基所取代的嵌合寡核苷酸消除了體重減輕和所有其他毒性癥狀(參見圖2b)。其余的40％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基存在于一個連續(xù)的片段上，以便有利于RNA酶H對靶mRNA的剪切(圖2a)。摻入諸如5-丙炔基-2’-脫氧胞苷、5-丙炔基-2’-脫氧尿苷和5-甲基-2’-脫氧胞苷(但具有硫代磷酸酯鍵，圖2b)的其他化學類似物，也可明顯降低所述毒性作用。除了具有較弱的毒性之外，所述修飾過的核苷酸殘基對系統(tǒng)核酸酶降解的抗性，比2’-脫氧核糖核苷磷酸二酯殘基的抗性更強。
由小的反義抑制作用所導致的功能改變的缺乏，通常會導致無法解釋的結果。這是由于實驗是否產生了真實的陰性結果或者反義抑制是否不足以揭示功能性改變的不確定性。除了反義序列之外，反義抑制作用的強弱還要受反義治療時間，及其與靶蛋白的半衰期的關系的影響。盡管CRF2受體的半衰期是未知的，但是嚙齒類動物大腦內的其他7次跨膜受體(CRF2受體是其中的一員)的半衰期在2-3天的級別上。最大抑制作用通常出現在反義治療之后至少3個蛋白半衰期的時間。盡管CRF2反義給藥5天能產生對所述受體40-50％的抑制作用，將用藥時間延長到9天，可以導致對受體結合70-80％的抑制作用。另外，對定量原位雜交發(fā)現了CRF2受體mRNA的相當的減少。在上述條件下，四堿基錯配對照寡核苷酸在受體和mRNA結合中都產生了很小的減弱。因此，與Heinrichs等的結果不同，該作者的CRF2反義寡核苷酸只能產生15-20％的CRF2受體減少，同時會導致接受治療的動物體重的顯著下降，我們對反義試劑進行了優(yōu)化，以便研究CRF2受體功能。用RNA作圖方法進行反義序列篩選，同時結合優(yōu)化的寡核苷酸化學，從而得到了的有效的反義序列。在給予嚙齒類動物8-10天之后，能導致CRF2受體結合的大幅度的(大約70％)減少。
將CRF2反義寡核苷酸腦室內注射到側間隔部位，該部位是含有大量CRF2受體和mRNA的大腦部位。側間隔是邊緣腦區(qū)的一部分，已知該部分參與調節(jié)恐懼和情緒。用兩種不同的焦慮行為模型測試用鹽水、反義和錯配對照寡核苷酸處理過的大鼠。嚙齒類動物在經歷恐懼和焦慮時，都表現出特有的凍結(freezing)行為。在焦慮的凍結模型中，所述行為是通過接觸短暫的足電擊而誘導的。在經過若干天的干涉之后，將所述大鼠送回到電擊盒中時，即使是在不進行進一步的電擊處理的情況下，這些大鼠也表現出凍結行為。當預先電擊過的動物被送回到電擊盒中時，給予諸如苯并二氮卓類和選擇性的血清緊張素再吸收抑制劑的抗焦慮藥物，能縮短凍結的時間。在反義實驗中，在經過2天連續(xù)的足電擊之后開始給予寡核苷酸。在用藥第8天的最后1次給予寡核苷酸之后2小時，將大鼠送回到所述電擊盒中，并觀察10分鐘。在這一部分實驗中，檢驗了藥理學制劑對條件恐懼的作用，所述反義寡核苷酸，而不是其錯配對照能將凍結時間減少50％(圖3a)。在最初的10分鐘時間之后，對所述大鼠進行2次短暫的足底電擊，并且再觀察10分鐘時間。同樣，與鹽水或錯配寡核苷酸處理的動物相比，反義處理的大鼠表現出凍結時間降低50％(圖3a)。上述數據構成了對CRF2受體功能的首次驗證。對所述大鼠的大腦間隔區(qū)的受體放射性自顯影分析表明，在反義治療的大鼠中，125I-蛙皮降壓肽與CRF2受體的結合減弱了70％(圖3b)。因此，抑制CRF2受體會導致焦慮水平的降低，這表明CRF致焦慮作用不僅僅是通過CRF1受體介導的，而且還能通過CRF2受體介導。另外，有效抑制CRF2受體，能產生重要的功能后果，這種后果在較低的CRF2受體抑制水平上可能不明顯。以上結果表明，CRF2受體在調節(jié)恐懼和焦慮反應方面起作用。
抬高的正迷宮(elevated plus maze)(EPM)被廣泛用于測定抗焦慮或致焦慮藥物效果。該裝置包括+-形式的迷宮，高出地面50厘米。將兩個相對的臂打開并暴露于環(huán)境中，而將另外兩個臂用黑色Plexiglas側板封閉。對于嚙齒類動物來說，暴露于EPM程序會產生接近/規(guī)避沖突，這通常會導致這種動物將大部分時間花費在所述迷宮的封閉的臂中。這種接近/規(guī)避沖突被認為是導致發(fā)生某些類型的人類焦慮疾病的重要因素。重要的是，目前被推薦用于治療焦慮癥的藥物，能在EPM實驗中在嚙齒類動物中有效產生抗焦慮反應。
在反義實驗中，在對大鼠用藥8天，然后在最后1次注射寡核苷酸之后2小時在EPM中進行測試。用反義寡核苷酸治療的大鼠明顯將更多的時間花費在所述迷宮開放的、外露的臂中(圖4a)。這種行為是焦慮減輕狀態(tài)的指標。從統(tǒng)計學角度來看，錯配寡核苷酸治療的大鼠與鹽水治療的大鼠沒有差別。在該實驗中，通過反義寡核苷酸治療，可以將側間隔中125I-蛙皮降壓肽與CRF2受體的結合減弱60％(圖4b)。
對進入所述迷宮的開放的和閉合的臂中的總次數進行分析，沒有發(fā)現在三種治療組之間有差別(數據未示出)。另外，在運動器官活性實驗中，所有三種處理組同樣沒有差別(數據未示出)。綜上所述，以上結果表明，通過寡核苷酸治療沒有明顯改變大鼠的運動功能。
業(yè)已證實，反義抑制7次跨膜受體系統(tǒng)所產生的生理學效果，類似于通過用選擇性小分子拮抗劑抑制受體所獲得的效果(Ho等，1998)。因此，我們的CRF2反義結果意味著除了反義抑制CRF2受體之外，通過小分子配體抑制該受體同樣會導致抗焦慮作用。因此，CRF2受體的小分子或肽拮抗劑，應當是具有有用的治療價值的有效抗焦慮制劑。
本文所使用的術語“可以藥用的藥物前體”表示可用于本發(fā)明的化合物的藥物前體，這種藥物前體屬于正確的醫(yī)學判斷范圍，適合用于與人類和低等動物的組織接觸而又沒有過高的毒性、刺激、過敏反應等，與合理的優(yōu)點/風險比例匹配，并且能實現其預期的用途，以及如果可能的話，是本發(fā)明化合物的兩性離子形式。術語“藥物前體”表示在體內能迅速轉化成母體化合物的化合物，例如，通過在血液中水解。能通過代謝解離迅速轉變的官能團，在體內形成一種能與本發(fā)明化合物的羧基發(fā)生反應的基團。其中包括，但不限于諸如烷?；?如乙?；?、丙?；⒍□；?、未取代的和取代的芳?；?如苯甲酰基和取代的苯甲?；?、烷氧基羰基(如乙氧基羰基)、三烷基甲硅烷基(如三甲基-和三乙基甲硅烷基)、與二羧酸形成的單酯(如琥珀酰基)等。由于可用于本發(fā)明的所述化合物的可代謝解離的基團在體內很容易解離，具有所述基團的化合物可以用作藥物前體。具有可代謝解離基團的化合物的優(yōu)點是，它們具有改善了的生物利用度，因為由于所述可代謝解離基團的存在，就會使所述母體化合物具有提高了的溶解度和/或吸收速度。在以下文獻中提供了對藥物前體的充分討論Design of Prodrugs，H.Bundgaard，ed.，Elsevier，1985；Methodsin Enzymology，K.Widder等；Ed.，Academic Press，42，p.309-396，1985；A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen and H.Bundgaard，ed.，Chapter5；“Design and Applicationsof Prodrugs”p.113-191，1991；Advanced Drug Dellivery Reviews，H.Bundgard，8，p.1-38，1992；Journal of Pharmaceutical Sciences，77，p.285，1988；Chem.Pharm.Bull.，N.Nakeya et al；32，p.692，1984；Pro-drugs as Novel Delivery Systems，T.Higuchi and V.Stella，Vol.14 of the A.C.S.Symposium Series，and BioreversibleCarriers in Drug Design，Edward B.Roche，ed.，AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press，1987，以上文獻被收作本文參考。
術語“可以藥用的鹽”表示本發(fā)明化合物的相對無毒的無機和有機酸加成鹽和堿加成鹽。所述鹽可以在所述化合物的最終分離和純化期間在現場制備。具體地講，酸加成鹽可以這樣制備分別讓游離堿形式的純化的化合物與合適的有機或無機酸起反應，并分離由此形成的鹽。典型的酸加成鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽、氨基磺酸鹽、丙二酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、亞甲基-雙-b-羥基硫代萘酸鹽、二羥基苯甲酸鹽、isethionates、二-p-甲苯酰酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯甲磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽、環(huán)己基氨基磺酸鹽和奎尼酸月桂基磺酸鹽等(例如，參見S.M.Berge等，“藥用鹽”，J.Pharm.Sci.，66p.1-19，1977，該文獻被收作本文參考)。堿加成鹽也可以通過以下方法制備讓酸形式的純化化合物分別與合適的有機或無機堿起反應，并分離由此形成的鹽。堿加成鹽包括可以藥用的金屬鹽和胺鹽。合適的金屬鹽包括鈉、鉀、鈣、鋇、鋅、鎂和鋁鹽。優(yōu)選鈉鹽和鉀鹽。合適的無機堿加成鹽是用金屬堿制備的，其中包括氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鋅。合適的胺加成鹽是用具有足夠形成穩(wěn)定鹽的堿性的胺制備的，并且優(yōu)選包括通常被用于醫(yī)藥化學領域的胺，因為這種胺具有較低的毒性和可以接受的醫(yī)療用途。氨水、乙二胺、N-甲基葡糖胺、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽堿、N，N’-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羥基甲基)-氨基乙烷、四甲基氫氧化銨、三乙胺、二芐胺、ephenamine、脫氫樅胺、N-乙基哌啶、芐胺、四甲基胺鹽、四乙基胺鹽、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、堿性氨基酸，例如，賴氨酸和精氨酸，以及二環(huán)己胺等。
本文所使用的術語“CRF2反義寡核苷酸”表示被設計成互補于CRF2受體mRNA的一部分的短的寡核苷酸(其長度通常為大約15-大約25個核苷酸)。反義寡核苷酸通過沃森-克里克堿基配對與其mRNA靶位點進行的雜交啟動了一連串事件，這些事件止于CRF2受體所導向的mRNA的寡核苷酸定向降解。
本文所使用的術語“CRF2受體”表示披露于1998年7月28日授權的美國專利5786203中的細胞表面受體，該專利的內容被收作本文參考。
本文所使用的術語“限定的可及位點”表示CRF2受體mRNA上可用于與反義寡核苷酸雜交的多個位點。這些位點在上面的表1中有進一步的說明。
本文所使用的術語“修飾過的核苷酸殘基”包括，但不限于2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-甲氧基-乙氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-氟代-核糖核苷磷酸二酯、5-(1-丙炔基)胞嘧啶硫代磷酸酯、5-(1-丙炔基)尿嘧啶硫代磷酸酯、5-甲基胞嘧啶硫代磷酸酯、2’-脫氧核糖核苷-N3’-P5’氨基磷酸酯、聚酰胺核酸、和具有以下結構式的閉鎖的核酸 或 其中，B是嘌呤或嘧啶堿。
本發(fā)明的一種實施方案提供了一種用于治療患者體內的包括，但不限于焦慮癥、強迫性神經失調、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應激疾病、恐怖癥、神經性厭食、和抑郁癥的精神疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的藥物組合物，該組合物含有由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
提供所述反義寡核苷酸修飾的核苷酸殘基的優(yōu)選實施方案選自下列一組2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-甲氧基-乙氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-氟代-核糖核苷磷酸二酯、5-(1-丙炔基)胞嘧啶硫代磷酸酯、5-(1-丙炔基)尿嘧啶硫代磷酸酯、5-甲基胞嘧啶硫代磷酸酯、2’-脫氧核糖核苷-N3’-P5’氨基磷酸酯和聚酰胺核酸。
一種更優(yōu)選的實施方案提供了長度為大約15-大約25個核苷酸的反義寡核苷酸。
另一種實施方案提供了一種治療患有由CRF受體蛋白介導的疾病的患者的方法，包括(a)設計一種對CRF受體mRNA特異的嵌合反義寡核苷酸；(b)確定模擬所述反義寡核苷酸的生物學作用的組合物；和(c)給予所述患者能抑制內源配體與其CRF受體結合的所述組合物。
另一種實施方案提供了一種用于治療患有由CRF受體蛋白介導的疾病的患者的方法，包括
(a)設計一種對CRF受體mRNA特異的嵌合反義寡核苷酸；(b)確定模擬所述反義寡核苷酸的生物學作用的組合物；和(c)給予所述患者能模擬內源配體在CRF受體上的作用的組合物。
本發(fā)明的另一種實施方案提供了一種用于治療患有由CRF介導的疾病的患者的方法，包括給予所述患者能有效抑制CRF或其他密切相關的肽與CRF2受體結合的組合物。
本發(fā)明的另一種實施方案提供了一種設計CRF2受體抑制劑的方法，包括以下步驟確定所述受體的三維結構，分析所述三維結構，尋找可能的底物結合位點，合成一種能結合推測的反應位點的分子，以及確定所述分子的受體抑制活性。
本發(fā)明的另一種實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，15-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，20-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，25-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，30-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，35-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，40-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，45-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，50-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，55-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，60-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案提供了具有位于特定進入位點內的靶堿基、具有位于所述特定進入位點內的任何堿基上的起始位點、以及具有大約15-大約25個堿基長度的反義寡核苷酸。
本發(fā)明的一種最優(yōu)選的實施方案提供了包含以下序列的反義寡核苷酸(a)TGT ACG TGT TGC GCA AGA GG；(b)GGT GGG CGA TGT GGG AAT G；(c)GGA TGA AGG TGG TGA TGA GG；和(d)TGA CGC AGC GGC ACC AGA CC。
本發(fā)明的另一種實施方案提供了一種用于利用反義寡核苷酸確定可用于治療精神疾病的化合物的篩選測定，所述疾病包括，但不限于焦慮癥、強迫性神經失調、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應激疾病、恐怖癥、和抑郁癥。
本發(fā)明的另一種實施方案提供了一種確定CRF2受體的結合區(qū)域的結構的方法。
CRF1受體配體和CRF2受體配體的聯合給藥，能夠提供超過聯合給藥CRF1受體配體和CRF2受體配體單獨給藥的效力，并且在聯合給藥時，可以使用較低劑量的每一種配體。較低的劑量減少了副作用的可能性，從而提供了較大的安全范圍。本發(fā)明化合物與所述其他治療劑的聯合優(yōu)選是協同聯合。例如，正如Chou和Talalay(Adv.EnzymeRegu1.2227-55，1984)所披露的，協同作用是指當所述化合物和制劑聯合給藥時所產生的治療效果大于CRF1受體配體和CRF2受體配體單獨給藥時的累加效果的現象。一般，協同作用在CRF1受體配體或CRF2受體配體各自單獨的治療性次最佳水平上表現的最明顯，不過，在聯合以后具有很高效力。
CRF1受體拮抗劑能在若干種焦慮動物模型中起作用(Lundkvist，J.，Chai.Z.，Teheranian，R.，Hasanvan，H.，Bartfai，T.，Jenck，F.，Widmer，U.&Moreau，J.L.，1996，Eur.J.Pharmacol.309，195-2 00；和Weninger，S.C.，Dunn，A.J.，Muglia，L.J.，Dikkes，P.Miczek，K.A.，Swiergiel，A.H.，Berridge，C.W.&Majzoub，J.A.1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，8283-8288)。在條件焦慮實驗中測試了CRF1受體的一種高度選擇性的和強效的吡唑-嘧啶拮抗劑DPC904(Gilligan，P.J.，Baldauf，C.，Cocuzza，A.，Chidester，D.，Zaczek，R.，Fitgerald，L.，McElroy，J.，Smith，M.A.，Shen，H.S.L.，Saye，J.A.，Christ，D.，Trainor，G.L.，Robertson，D.W.&Hartig，P.R.，2000，Bioorganic Med.Chem.8，181-189，2000)，并且發(fā)現了凍結持續(xù)時間的劑量依賴性減少(圖7a)。由于中樞CRF1和CRF2受體在其解剖學分布上沒有明顯的重疊(Chalmers.D.T.，Lovenberg，T.W.&DeSouga，E.B.，1995，J.Neuroscience15，6340-6350；和Rominger，D.H.，Rominger，C.M.Fitzgerald，L.W.，Grzanna，R.，Largent，B.L.&Zaczek，R.，1998，J.Pharmacol.Exp.Ther.286，459-468)，因此設計了一種研究，以便確定同時抑制這兩種受體亞型是否能導致對凍結更有效的減輕。用鹽水或反義寡核苷酸通過腦室內注射給動物用藥7天。在最后一次腦室內注射之后24小時，給大鼠口服載體(methocel)或DPC904。在DPC904或反義寡核苷酸單獨給藥的動物中，在凍結方面表現出比以前觀察到的凍結明顯減弱。在同時給予DPC904和反義寡核苷酸的動物中，凍結明顯減弱到低于在所述條件焦慮實驗中DPC904治療的或反義治療的動物的水平(圖7b)。盡管用DPC904急性治療在所述電擊再暴露實驗中縮短了凍結時間，但同時抑制這兩種受體未能產生與單獨使用CRF2反義寡核苷酸所獲得的效果不同的效果(圖7b)。在兩組反義治療的動物中，CRF2受體結合都降低到類似水平(鹽水/methocel1.20±0.05nCi/mg，鹽水/DPC9041.21±0.05nCi/mg，反義寡核苷酸/methocel0.51±0.08nCi/mg，反義寡核苷酸/DPC9040.45±0.04nCi/mg，反義組與非寡核苷酸治療組的p＜0.001)。
應當理解的是，本發(fā)明包括本文所提到的特定的和優(yōu)選的類型或實施方案的所有合適的組合。
通過以下實施例可以進一步理解本發(fā)明，其中，有關份數和百分比是以重量為基礎的，除非另有說明。
實施例1合成并純化用于體內實驗的寡核苷酸使用標準合成方案，用自動化ABI 394 RNA/DNA合成儀合成寡核苷酸。在圖3和4所示實驗中所使用的反義寡核苷酸和錯配寡核苷酸由以下序列組成反義TGA CGC agc ggc acC AGA CC錯配TGA GGC acc gga acC ACA CC其中，大寫字母表示2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯殘基，而小寫字母表示2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基。2’-甲氧基核糖核苷亞胺磷酸酯是從Chem Genes購買的，丙炔基和5-甲基胞苷亞胺磷酸酯是從Glen Research獲得的，而2’-氟代亞胺磷酸酯是從NeXstar獲得的。用于合成硫代磷酸酯鍵的Beaucage試劑和用于對寡核苷酸進行5’標記的熒光素亞磷酰胺是從Glen Research購買的。所述試劑是按照生產商的說明使用的。
在PRP-3柱(Hamilton Co.)上通過反相HPLC純化粗制寡核苷酸混合物，使用乙腈和0.1M三乙基乙酸銨水溶液的梯度洗脫。將從HPLC柱上采集的級份凍結干燥2次，以便除去多余的三乙基乙酸銨。然后用丁醇提取所述寡核苷酸的水溶液若干次。在存在0.3M乙酸鈉的條件下，使用乙醇沉淀完成陽離子交換。然后通過添加0.01M氫氧化鈉，將所述寡核苷酸溶液的pH調節(jié)到7.0。通過用NAP-25柱(Pharmacia)進行大小排阻層析，對所述寡核苷酸做進一步的純化，以便除去殘余的熒光素亞胺磷酸酯試劑。通過用0.2微米的乙酸纖維素濾膜(Rainin)過濾進行消毒，并通過紫外線光譜測定進行定量。通過毛細管凝膠電泳(PACE2100，Beckman Instruments)測定寡核苷酸的純度。將溶解在蒸餾水中的寡核苷酸母液放在-20℃下保存。
實施例2動物和手術將在手術時重量為320-360克的雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River)單獨圈養(yǎng)在不銹鋼籠子里，并且提供能自由接觸食物和水的通道。在經過4天的適應期之后，在用Rompun(100毫克/公斤)和氯胺酮(9毫克/千克)麻醉的條件下，在大鼠雙側定向植入長期的26號導管，導管定位于側心室。定向坐標為切開線位于耳間線下面3.3毫米；鹵后0.2毫米；中線側面±2.7毫米；顱骨表面腹側3.8毫米，和24°角。注射器(33號)突出超過所述導管尖0.5毫米。在手術后2天開始對所述動物進行每日的適應控制。
所有動物護理使用Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)批準的公開方法。杜邦藥物研究實驗室得到了實驗室動物管理評估和認證聯合會(國際AAALAC)的認可。
實施例3寡核苷酸給藥寡核苷酸輸注是在手術之后第8天開始的，此時大鼠體重高于手術時的重量大約20克。每天通過將凍結干燥的寡核苷酸顆粒溶解在無菌鹽水中制備新的寡核苷酸溶液。在用寡核苷酸輸液之前，每天上午9點對大鼠進行稱重。使用微處理器控制的注射泵(Stoelting)用2分鐘時間將1微升的溶液注射到每一個心室中。在每天的注射之間，用乙醇和無菌水清洗用于每一只大鼠的注射器，并且干燥。
實施例4焦慮的凍結測定電擊盒由具有壁和蓋的黑色的Plexiglas室組成。所述盒子的門用透明的Plexiglas制成，在它上面安裝了一個用于觀察的單向鏡子。所述盒子的地板包括一個Coulbourn不銹鋼電擊格柵，格柵條間隔1厘米。在手術置入所述導管之后第8天，將大鼠放入所述盒子，并讓其適應2分鐘。然后以20秒的間隔對所述格柵地板輸送總共3次不規(guī)則的、隨機的、無可逃避的足底電擊(1.0mA，持續(xù)1秒鐘)。用15分鐘時間觀察所述大鼠的凍結行為，然后將它送回到它所居住的籠子里。
在刺激處理之后次日開始寡核苷酸治療。給動物連續(xù)用藥7天。將大鼠送回到電擊盒中24小時之后，用10分鐘時間觀察凍結行為。然后進行2次足底電擊(1.0mA，持續(xù)1秒鐘，間隔20秒)，然后再用10分鐘時間觀察大鼠的凍結。在緊接著這最后的10分鐘時間之后，對所述大鼠實施安樂死。
實施例5抬高的正迷宮測定對大鼠的寡核苷酸治療始于手術后第8天。在治療的第8天用藥之后2小時，在EPM中進行實驗。在實驗開始時，將大鼠放在迷宮的中央場地上，并通過攝象機記錄在隨后的10分鐘內大鼠的探詢行為。由坐在所述實驗室外面的觀察者統(tǒng)計大鼠花費在開放的臂和閉合的臂中的時間，以及大鼠進入迷宮的每一個臂的次數。在該實驗結束之后，馬上對所述大鼠實施安樂死。
實施例6組織制備通過暴露于二氧化碳將大鼠處死。取出大腦，并在放在干冰上冷卻的甲基丁烷中凍結，然后在-80℃下保存。在低溫恒溫器(KopfInstruments)上通過側間隔切除20微米的切片，用于受體放射自顯影。
實施例7CRF2受體放射自顯影在回溫到室溫1小時之后，將大腦切片放在50mM Tris-HCl(pH7.5)中預孵育5分鐘，該緩沖液中含有10mM氯化鎂，2mM EGTA(乙二醇雙(β-氨基乙基醚)N，N，N’，N’-四乙酸)、0.1％卵白蛋白、0.08TIU抑蛋白酶肽和0.1mM桿菌肽。用0.15nM125I-蛙皮降壓肽(NewEngland Nuclear)確定總的結合。在存在1μM SC-241-CRF1選擇性受體拮抗劑的條件下測定CRF2特異性結合(D.H.Rominger等，J.Pharmacol.Exp.Therap.，286，459-468，1998)。用1μMα螺旋CRF(American Peptide)測定非特異性結合。在含有放射性配體和合適的拮抗劑的預孵育緩沖液中進行孵育150分鐘。然后用含有0.01％Triton X-100的PBS洗滌組織切片2次，每次5分鐘。在最后1次用水清洗之后，吸掉多余的水分，并將所述切片空氣風干過夜。讓所述切片和125I標準條(Amersham)對Hyper膠片μ-Max(Amersham)曝光72小時。
用NIH ImageMG1.44程序對CRF2特異性結合進行定量。使用125I標準條將光密度讀數轉換成每克蛋白組織結合的配體的nCi。對每只大鼠的7-9個相鄰的切片進行定量。
實施例8用CRF1受體拮抗劑和CRF2反義寡核苷酸聯合治療按實施例4所述方法(第一段)對32-40只大鼠進行條件足底電擊處理。在足底電擊之后，將所述動物等分成兩組。第一組連續(xù)7天腦室內注射鹽水，而第二組動物連續(xù)7天腦室內注射反義寡核苷酸(每一個側腦室注射2.5納摩爾)。在第8天，將每一組動物再分成兩組。用鹽水處理的動物的一半以10毫克/千克的口服劑量給予DPC904(溶解在methocel中)(被稱為S/R1組)。所述鹽水處理動物的另一組接受載體methocel(被稱為S/M組)。對給予反義寡核苷酸的大鼠作類似處理，即這些動物的一半以10毫克/千克的口服劑量給予DPC904(溶解在methocel中)(被稱為R2/R1組)。反義治療動物的另一半使用載體methocel(被稱為R2/M組)。在口服用藥30分鐘之后，按例4所述方法在電擊盒中對所述動物進行測試(第二段)。
在不超出本發(fā)明的精神或實質性范圍的前提下，可以用其他具體形式實施本發(fā)明。
權利要求
1.一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體。
2.如權利要求1的方法，其中，所述CRF1配體受體是CRF1受體的激動劑。
3.如權利要求1的方法，其中，所述CRF1配體受體是CRF1受體的拮抗劑。
4.如權利要求1的方法，其中，所述CRF2配體受體是CRF2受體的激動劑。
5.如權利要求1的方法，其中，所述CRF2配體受體是CRF2受體的拮抗劑。
6.一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
7.如權利要求6的方法，其中，所述修飾過的核苷酸殘基選自下列一組2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-甲氧基-乙氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-氟代-核糖核苷磷酸二酯、5-(1-丙炔基)胞嘧啶硫代磷酸酯、5-(1-丙炔基)尿嘧啶硫代磷酸酯、5-甲基胞嘧啶硫代磷酸酯、2’-脫氧核糖核苷-N3’-P5’氨基磷酸酯和聚酰胺核酸，和具有以下結構式的閉鎖核酸； 或 其中，B是嘌呤或嘧啶堿。
8.如權利要求6的方法，其中，所述寡核苷酸的長度為大約15-大約25個核苷酸。
9.如權利要求6的方法，其中，所述反義寡核苷酸的60-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過的核苷酸殘基所取代。
10.如權利要求6的方法，其中，所述反義寡核苷酸包含以下序列(a)TGT ACG TGT TGC GCA AGA GG；(b)GGT GGG CGA TGT GGG AAT G；(c)GGA TGA AGG TGG TGA TGA GG；和(d)TGA CGC AGC GGC ACC AGA CC。
11.如權利要求1或6的方法，，其中，所述疾病是精神疾病。
12.如權利要求11的方法，其中，所述精神疾病選自下列一組焦慮癥、強迫性神經失調、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應激疾病、恐怖癥、厭食、和抑郁癥。
13.如權利要求1或6的方法，其中，所述疾病選自下列一組頭部創(chuàng)傷、脊髓創(chuàng)傷、缺血性神經元損傷(例如，大腦缺血，如大腦海馬缺血)、興奮性毒性神經元損傷、癲癇、中風、應激誘導的免疫功能障礙、恐怖癥、肌肉痙攣、帕金森氏病、亨廷頓氏病、尿失禁、阿爾茨海默型老年癡呆、多梗塞性癡呆、肌萎縮性側索硬化、化學制品依賴性和成癮(例如，對酒精、可卡因、海洛因、苯并二氮卓類或其他藥物的依賴性)、和低血糖癥。
14.如權利要求1的方法，其中，CRF1受體配體和CRF2受體配體是同時給藥的。
15.如權利要求6的方法，其中，CRF1受體配體和CRF2受體配體是序貫給藥的。
16.一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括讓有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體與一種含有CRF1受體和CRF2受體的組合物接觸。
17.一種治療與CRF2受體活性相關的疾病的方法，包括讓有效量的CRF2受體配體與一種含有CRF2受體的組合物接觸。
18.一種藥物組合物，該組合物含有CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，以及藥用載體。
19.一種用于治療或預防與CRF1和CRF2受體活性相關的疾病的藥用試劑盒，所述試劑盒包括多個獨立的容器，其中，至少有一個所述容器裝有CRF1受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且至少有另一個所述容器裝有CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且所述容器選擇性地裝有一種藥用載體。
20.一種用于治療精神疾病的具有CRF1受體配體活性和CRF2受體配體活性的化合物。
21.如權利要求1的方法，其中，所述CRF1受體配體是DPC904或SC-241。
22.如權利要求4的方法，其中，所述CRF2受體配體是蛙皮降壓肽、尿皮質素或其他CRF2肽。
23.如權利要求5的方法，其中，所述CRF2受體配體是抗蛙皮降壓肽。
24.一種增強對精神疾病的治療的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體。
25.一種增強對精神疾病的治療的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的具有CRF1配體受體和CRF2配體受體活性的化合物或其可以藥用的鹽或藥物前體。
26.如權利要求25的方法，其中，所述化合物是astressin。
27.如權利要求6的方法，其中，所述反義寡核苷酸針對表1所示的區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及能顯著減少CRF
文檔編號A61P25/16GK1501976SQ01814084
公開日2004年6月2日 申請日期2001年7月19日 優(yōu)先權日2000年7月19日
發(fā)明者S·P·候, S P 候 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布藥品公司