專利名稱：Cox－2抑制劑預(yù)防免疫缺陷的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫缺陷和病毒感染治療領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及環(huán)加氧酶-2(COX-2)抑制劑或其衍生物在免疫缺陷和病毒病(特別是HIV感染和AIDS及相關(guān)疾病)治療的免疫調(diào)節(jié)中的用途。
前列腺素在炎癥過程中起重要作用，前列腺素形成的抑制是研制抗炎藥的常見靶標(biāo)。非類固醇類抗炎藥(NSAID’s)抑制環(huán)加氧酶(COX)，COX是參與由花生四烯酸生物合成前列腺素中間體的一種酶。有幾種NSAID’s已用于臨床，包括如吲哚美辛、吡羅昔康、替諾昔康、二氯芬酸、美洛昔康、替尼達(dá)帕、伊索昔康、乙酰水楊酸、二氟尼柳、舒林酸、布洛芬、萘普生和酮洛芬等藥物。
NSAID’s是當(dāng)前世界上最廣泛使用的藥物之一。
這些NSAID’s是臨床上有效的藥物，它們具有解熱、抗炎和抗血栓作用。這類藥物的主要適應(yīng)證是關(guān)節(jié)炎，包括骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，肌肉骨胳痛和全身疼痛。然而，這些藥物具有嚴(yán)重的副作用。最常見的副作用是胃腸潰瘍和出血、血小板凝集抑制和與其它藥物相互作用。
二十世紀(jì)九十年代初，克隆了該酶的第二種COX同工型。這種新的COX同工型現(xiàn)在被稱為COX-2(Vane等人，1998，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，38，97-120)。
現(xiàn)在COX有兩種眾所周知的同工型COX-1和COX-2(最近也推測存在COX-3)。COX-1存在于大多數(shù)組織中，可以視為看家酶。例如，COX-1酶活性保護(hù)胃腸道的內(nèi)層。然而，COX-2通常不存在，但在炎癥期間增多。NSAID’s的幾種副作用與COX-1酶的抑制有關(guān)。NSAID’s抑制COX-1和COX-2(見表1-3)。
表1不同NSAID’s在豚鼠巨噬細(xì)胞模型上的IC50值和COX-2/COX-1比(IC50值來自Engelhart等人，J.Inflammatory Res.，44，422-43，1995)
表2完整細(xì)胞中NSAID’s對COX-1(牛內(nèi)皮細(xì)胞)和COX-2(刺激的巨噬細(xì)胞)的IC50值(IC50值來自Taketo，J.NationalCancer Institute，90，1529-1536，1998)
表3重組人PGH合成(COX-1和COX-2)的抑制(IC50值來自Laneuvill等人，J.Pharm.Exp.Ther.，271，927-34，1994)
最近十年來，已經(jīng)確定了幾種新的選擇性COX-2抑制劑和所謂的“優(yōu)選”COX-2抑制劑。其中幾種COX-2抑制劑已經(jīng)研制，少數(shù)最近已經(jīng)進(jìn)入市場。在這些新COX-2抑制劑中，有一些在臨床劑量時不顯示抑制COX-1。對這些COX-2抑制劑的用途的廣泛臨床研究和臨床實踐表明，與非選擇性NSAID’s相比，這些新COX-2抑制劑在安全性上有很大優(yōu)勢。COX-2抑制劑的綜述參見，例如Golden等人，1999，Osteoarthritis.25，p359-379，Mitchel等人，1999，Brit.J.Pharmacol.，128，p1121-1132，Lipsky，1999，Am.J.Med.，106(5B)，p515-575，Taketo，1998，J.National Cancer Inst.，90，p1529-1537，Griswold等人，1996，Med.Res.Rev.，16，p181-206，Reitz等人，1995，Ann.Rep.Med.Chem.，30，p179-188。
關(guān)于不同COX-2抑制劑的其它文獻(xiàn)包括，例如Lane，1997，J.Rheumatol.，24(suppl.45)，p20-24，Mehlish等人，1998，Clin.Pharmacol.Ther.，63，p1-8，Zhao等人，1997，Arthritis Rheum.，40(suppl.)，S88，Ehrich等人，1997，Arthritis Rheum.，40(Suppl.)S93，Maziasz等人，1997，Arthritis Rheum.，40(suppl.)，S195，Mengle-Gaw等人，1997，Arthritis Rheum.，40(suppl.)，S93，Morrison，1999，Clin.Ther.，21，p943-953，Chan等人，1995，J.Pharmacol.Exp.Ther.，274，p1531-37，Riendeau等人，1997，Br.J.Pharmacol.，121，p105-117，Black等人，1999，J.Med.Chem.，42，p1274-81，Cuo等人，1996，J.Biol.Chem.，271，p19134-39，Geiss，1999，Scand.J.Rheumatol.，109(suppl.)，p31-37，Warner等人，1999，PNAS USA，96，p7563-68，Bjarnson等人，1997，Scand.J.Gastroenterol.，32，p126-130，Danneberg等人，1999，Semin.Oncol.，26，p499-504，Mitcheu等人，1993，PNAS USA，90，p11693-97，F(xiàn)utaki等人，1994，Prostaglandins，47，p55-9，F(xiàn)utaki等人，1993，J.Pharm.Pharmacol.，45，p753-5，Masferrer等人，1954，PNAS USA，91，p3228-32，Klein等人，1994，Biochem.Pharmacol.，48，p1605-10，Reitz等人，1994，J.Med.Chem.，37，p3878-81，Seibert等人，1994，PNAS USA，91，p12013-17，Klein等人，1996，Biochem.Pharmacol.，51，p285-90，Nantal等人，1998，第九屆國際炎癥研究協(xié)會會議，11月1-5日，Pennig等人，1997，J.Med.Chem.，40，p1347-65，Puig等人，2000，J.Med.Chem.，43，p214-223。
根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，COX-2抑制劑是相對多樣化的一組化合物。選擇性抑制COX-2的化合物在近十年的許多專利文獻(xiàn)中有描述。包括WO94/26781，WO94/20480，WO94/13635，WO95/00501，WO94/27980，WO94/15932，WO95/21817，WO95/15316，WO96/06840，WO96/03388，WO96/03387，WO96/03392，WO96/25405，WO96/24584，WO96/03385，WO96/16934，WO98/41516，WO98/43966，WO99/12930，EPO 673 366，WO98/41511，WO98/47871，WO99/20110，WO99/23087，WO99/14194，WO99/14195，WO99/15513和WO99/15503，以及美國專利號5,380,738、5,344,991、5,393,790、5,434,178、5,474,995、5,475,018和5,510,368。
現(xiàn)在研制了兩種化合物，羅非考昔(rofecoxib)(4-(4-甲磺酰)苯基)-3-苯基-2(5H)-呋喃酮)(I)，為Vioxx，和賽樂考昔(celecoxib)(4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-l-基)-苯磺酰胺)(II)，為Celebra 羅非考昔在加拿大Merck Frosst的WO93/0500501中有述，在Morrison，1999，Clin.Ther.，21，p943-953，Chan等人，1995，J.Pharmacol.Exp.Ther.，274，p1531-37和Nantel等人，1998，同上中也有描述。
賽樂考昔在Geiss，1999，Scand.J.Rheumatol.，109(suppl.)，p31-37和Penning等人，1997，J.Med.Chem.，40，p1347-65中有描述。據(jù)描述，賽樂考昔對COX-2的選擇性比對COX-1高375倍。
其它幾種COX-2抑制劑已在生物系統(tǒng)中進(jìn)行了評價，包括BF389(III)、CGP 28232(IV)、DFP、DFU(V)、DuP 697(VI)、依托度酸(VII)、FK 3311(VIII)、flosulide(IX)、L-745，337(X)、美洛昔康(Mobic，US 4233299，4-羥基-2-甲基-N-(5-甲基-2-噻唑基)-1，1-二氧化物-2H-1，2-苯并噻嗪-3-咪唑羧酰胺)(XI)、MF三環(huán)(XII)、尼美舒利(XIII)、NS-398(XIV)和SC-58125(XV)

描述的其它COX-2抑制化合物包括S-2474(來自Shionogi，EP595546，5(E)-(3，5-二叔丁基-4-羥基)苯亞甲基-2-乙基-1，2-異噻唑烷-1，1-二氧化物)(XVI)、JTE-522或RWK-57504(4-(4-環(huán)己基-2-甲基-5-噁唑基)-2-氟苯磺酰胺)(XVII)、Darbufelone甲磺酸鹽(Pfizer，WO94/03448，2-氨基-5-((3，5-二(1，1-二甲基乙基)-4-羥苯基)亞甲基-4(5H)-噻唑酮的一甲磺酸鹽)(XVIII)、6089(來自Kotobuli Pharmaceutical)(XIX)、Valdecoxib(Pharmacia，4-(5-甲基-3-苯基-4-異噁唑基)-苯磺酰胺)(XX)、Paracoxib鈉(Pharmacia，N-((4-(5-甲基-3-苯基-4-異噁唑基)-苯基)磺酰基)-丙酰胺的鈉鹽)(XXI)、4-(2-氧-3-苯基-2，3-二氫噁唑-4-基)-苯磺酰胺(Almirall-Prodespharma)(XXII)和Etoricoxib(MK-633，Merck and Co.)
上述化合物組成了在下文所述方法中使用的優(yōu)選COX-2抑制劑。
COX-2抑制劑的適應(yīng)癥是關(guān)節(jié)炎、肌肉骨骼痛和全身疼痛，這些疾病可用經(jīng)典NSAIDs治療，如吲哚美辛、二氯芬酸和萘普生。最近，也有人建議在癌癥治療中使用COX-2抑制劑，也許可以預(yù)防癌癥。COX-2抑制劑也有可能用于阿爾茨海默病和與癡呆有關(guān)的其它腦病。
COX-2抑制劑的臨床應(yīng)用的可能性在下列文獻(xiàn)中討論，例如Nature，367，p215-216(1994)，Drug News and Perspectives，7，p501-512(1994)，Annual Reports in Medicinal Chem.，30，p179-188(1995)，Oncogene，18，p7908-7916(1999)。
關(guān)于COX-2抑制劑在抗病毒治療，或更具體而言，在HIV/AIDS治療上的用途，沒有特別的建議，也沒有檢測COX-2抑制劑的抗-HIV作用。此外，對于在病毒或非病毒引起的免疫缺陷的治療中使用COX-2抑制劑(或非選擇性COX抑制劑)作為免疫刺激劑也沒有建議。
HIV感染和AIDS是一個重要的健康問題，全世界有超過3.3千萬人感染該病毒。大多數(shù)感染者位于非洲(亞撒哈拉)和亞洲的部分地區(qū)。現(xiàn)在常規(guī)臨床使用的有兩類抗-AIDS化合物HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和HIV蛋白酶抑制劑。HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑可分為非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)和核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)。
最常用的NNRTI’s有奈韋拉平、地拉夫定、efavirenz、emivirine和T180。最常用的NRTI’s包括齊多夫定、地丹諾辛、司他夫定和扎西他賓。臨床上使用的HIV蛋白酶抑制劑包括inclinavir、palinavir和沙喹那韋。
當(dāng)前對HIV感染和AIDS的治療基于幾種藥物的聯(lián)用，即所謂的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的混合物(雞尾酒)。這些組合稱為HAART(高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療)，非常有效，能使患者血液中的病毒降至不可檢測的水平。然而，HAART不能治愈患者，因為病毒仍然存在于免疫細(xì)胞中，疾病在任何時候都有可能復(fù)發(fā)；治療中斷后通常出現(xiàn)病毒血癥峰，快速發(fā)展為AIDS。此外，在HAART期間仍然具有免疫缺陷和HIV特異的T細(xì)胞功能障礙。這種治療需要終生治療，而且極其昂貴。僅藥物花費通常就超過15000美元。另外，該治療還有其它幾個問題患者適應(yīng)困難(復(fù)雜的藥物方案)、耐藥性病毒的發(fā)展、不理想的藥代動力學(xué)和副作用，如骨髓抑制和長期代謝影響。
最近發(fā)表的關(guān)于抗-HIV治療的綜述有，例如Hilgegroth，1998，Pharm.Uns.Zeit.，1998，27，p22-25，Hilgegroth，1998，Pharm.Uns.Zeit.，1998，7，p111-116，Stellbrink，1997，Dk Arztebl.，94，p2497-2503，Rettle等人，1998，Int.J.STD AIDS，9，p80-87，De-Clercq，1998，Antiviral Res.，38，p153-179，Gait等人，1995，TIBTECH，13，p430-438和Redshaw等人，《新出現(xiàn)的藥物改良藥物展望》，第6章，p127-154，1997。
總之，盡管多種藥物聯(lián)用如HAART能明顯改善HIV感染患者的預(yù)后，但HIV的抗病毒治療在醫(yī)學(xué)上仍需要新的化合物，特別是可刺激免疫系統(tǒng)的藥物。本發(fā)明即滿足了這一需要。
COX-2的表達(dá)通常只限于腦/腦過程、關(guān)節(jié)滑液和組織損傷部位。COX-2在正常淋巴結(jié)或淋巴細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)。但是現(xiàn)在驚奇地發(fā)現(xiàn)，在患免疫缺陷病MAIDs的小鼠中，淋巴結(jié)細(xì)胞表達(dá)高水平的COX-2。此外，從MAIDS淋巴結(jié)正選擇的CD4+和CD8+T細(xì)胞以及B細(xì)胞也含有高水平的COX-2(見實施例2)。有人發(fā)現(xiàn)，這種COX-2可用來緩解免疫缺陷病的癥狀，例如，作為免疫刺激劑，例如通過產(chǎn)生抗原特異的免疫應(yīng)答，來緩解T細(xì)胞功能障礙。
不受理論束縛，可以認(rèn)為COX-2活性提高了PGE2的產(chǎn)量，從而提高了cAMP的水平，cAMP激活PKA信號傳導(dǎo)途徑，使淋巴細(xì)胞功能遭受損害。對MAIDs小鼠進(jìn)行的體內(nèi)研究表明，COX-2抑制劑提高了T細(xì)胞的免疫功能(見實施例6)。
本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防免疫缺陷的新方法，特別是用于治療HIV和AIDS，包括用治療有效量的COX-2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽治療患者。
因此，第一方面，本發(fā)明提供一種方法，用于治療或預(yù)防人類或非人類動物中特征在于COX-2活性升高的疾病，如特征在于免疫功能降低的疾病(例如通過提高COX-2表達(dá))，其中對該動物施以治療有效量的COX-2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽。
在此使用時，COX-2活性提高是指由于產(chǎn)生更多的COX-2分子(例如提高表達(dá))和/或更具活性的分子(例如從潛伏形式轉(zhuǎn)化為活性形式或解除對活性形式的抑制)活性水平提高。優(yōu)選地，該疾病的特征在于免疫功能降低，即，是一種免疫缺陷病，例如，顯示淋巴細(xì)胞功能障礙。在此使用時，“免疫缺陷”是指參與正常免疫應(yīng)答的細(xì)胞(特別是B細(xì)胞和T細(xì)胞)功能受損。因而此處所述的化合物可用來實現(xiàn)免疫刺激作用，以提高免疫應(yīng)答。COX-2抑制劑被認(rèn)為具有免疫調(diào)節(jié)作用。優(yōu)選地，可以治療的疾病包括病毒誘導(dǎo)的免疫缺陷病。
因此，上述方法可用于但不限于HIV或AIDS相關(guān)疾病的治療。例如，約50％的多種常見免疫缺陷病患者具有類似于HIV感染的功能障礙，能從免疫刺激治療獲益。根據(jù)本發(fā)明，可以對需要HIV/AIDS治療的患者施用任一種COX-2抑制劑。根據(jù)本發(fā)明治療的優(yōu)選疾病包括逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，特別是HIV感染(和其它動物的相關(guān)病毒感染，例如SIV、FIV、MAIDS)和AIDS，以及多種常見免疫缺陷和與上述疾病有關(guān)的疾病的治療。
可以治療的患者優(yōu)選地是哺乳動物，優(yōu)選地是人和寵物或農(nóng)畜，如狗、貓、猴、馬、綿羊、山羊、母牛、兔、大鼠和小鼠。
此外，本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防如上所述特征在于COX-2活性升高的疾病的COX-2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽，或COX-2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防如上所述特征在于COX-2活性升高的疾病的藥物中的用途。在此使用時，“治療”是指該疾病的一種或多種癥狀(如傳染性)減輕或緩解，優(yōu)選地達(dá)到正常水平，或免疫功能障礙減輕或緩解?！邦A(yù)防”是指絕對防止，即無可檢測的病原體，例如病毒，和/或特定癥狀(例如COX-2活性)保持正常水平，或癥狀出現(xiàn)的程度或時間降低或緩解(例如延遲)。
環(huán)加氧酶2是HIV/AIDS治療的一種新靶標(biāo)。術(shù)語“COX-2抑制劑”是指以特定濃度施用時能抑制環(huán)加氧酶2而不明顯抑制環(huán)加氧酶1的化合物。優(yōu)選地包括對環(huán)加氧酶2抑制的選擇性比對環(huán)加氧酶1抑制的選擇性(例如，按照WHMA試驗，根據(jù)COX-1∶COX-2IC80比確定，見下文)至少高10倍、更優(yōu)選地至少高50倍、更優(yōu)選地至少高100倍的化合物。(一種特定化合物的選擇性比可隨生物學(xué)測定和表達(dá)形式(優(yōu)選地表示為COX-1∶COX-2 IC50或IC80比)而不同，見表1-4。)此處所述比率是指在一次或多次相關(guān)的、眾所周知的COX測定中，優(yōu)選地使用純化的人類酶所獲得的數(shù)據(jù)，例如，根據(jù)Engelhart等人，1995，同上文測定的IC50值之比。然而，優(yōu)選地采用如下所述的WHMA試驗。
對COX-1和COX-2相對效能的大量分析使用多種測定系統(tǒng)進(jìn)行，從分離的純化酶到完整的細(xì)胞和來自不同種的細(xì)胞模型。然而，目前最廣泛接受的模型是人全血測定(WBA)和改良WilliamHarvey人改良全血測定(WHMA)，這是優(yōu)選的測定方法。這些測定法利用易于獲得的人細(xì)胞測試哪一種化合物更適于人用。也考慮NSAIDs與血漿蛋白的結(jié)合。此外，當(dāng)COX-2和COX-1抑制的濃度曲線不平行，并且大多數(shù)化合物以產(chǎn)生接近80％抑制的穩(wěn)態(tài)血漿濃度的劑量使用時，優(yōu)選地以IC80而不是IC50進(jìn)行選擇性測定(Warner等人，1999，PNAS USA，96，p7563-7568)。
在WBA測定中，對于COX-1分析，血液用待測試劑處理，60分鐘后用鈣離子載體處理，溫育30分鐘，之后收集血漿。對于COX-2分析，血液用阿司匹林處理以抑制COX-1，6小時后用脂多糖和待測試劑處理，溫育18小時，之后收集血漿。隨后，通過放射免疫測定估計血漿中的血栓烷B2濃度，作為COX活性的量度。
在WHMA測定中，COX-1分析如上進(jìn)行。對于COX-2分析，血液用條件培養(yǎng)基(來自暴露于白介素1β24小時的人氣管上皮細(xì)胞(A549)的培養(yǎng)物)處理，與該培養(yǎng)基及待測試劑一起溫育60分鐘，之后加入鈣離子載體，30分鐘后加入二氯芬酸終止prosanoid的產(chǎn)生。之后收集血漿，通過放射免疫測定分析血漿中前列腺素E2的含量，作為COX-2活性的量度。在后一種測定中，COX-1和COX-2活性測定的溫育時間類似，這使得活性更易于比較，使WHMA成為優(yōu)選的測定方法。
采用該測定法，基于IC80下COX-2/WHMA-COX-1的選擇性示于表4中，其中0.2和0.02分別代表5倍和50倍的COX-2選擇性。
表4根據(jù)WHMA試驗，IC80下的COX-2/COX-1比，來自Warner等人，同上文
因此，一個優(yōu)選特征在于，根據(jù)IC80的WHMA試驗測定選擇性比，在本發(fā)明的方法中特別優(yōu)選使用COX-2∶COX-1選擇性比小于0.2、優(yōu)選地小于0.05、例如小于0.02、優(yōu)選地小于0.01、例如＜0.005的化合物。換言之，優(yōu)選化合物的COX-1∶COX-2選擇性比(根據(jù)IC80的WHMA測定)大于2，優(yōu)選地大于5，特別優(yōu)選地大于50或100，如前所述。
“抑制”在此是指可測得的環(huán)加氧酶-2活性降低。這可通過影響轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾或COX-2活性實現(xiàn)。然而優(yōu)選地是通過抑制酶活性，即干擾現(xiàn)有活性COX-2分子的活性部位來實現(xiàn)抑制。
優(yōu)選地，用于治療免疫缺陷或病毒感染，特別是HIV感染和AIDS的COX-2抑制劑的COX-2 IC50約小于0.5μmol/l，更優(yōu)選地約小于0.2μmol/l。
此處所述方法涉及COX-2抑制劑或其衍生物在預(yù)防和治療多種疾病，包括免疫缺陷和病毒感染，特別是HIV和AIDS中的用途。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的治療用COX-2抑制劑選自酸性磺胺。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用的COX-2抑制劑選自根據(jù)下列通式A的化合物，包括甲磺酰胺醚和硫醚或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽
其中，X代表一個氧或硫原子或烷基，優(yōu)選地是-CH2-基；R1代表一個環(huán)烷基或芳基，它任選地可被一個或多個基團(tuán)或原子優(yōu)選地一個或多個鹵素原子，如氟取代；R2、R3、R4和R5獨立地代表氫原子、硝基或?；蛲榛鼈?nèi)芜x地可被一個或多個基團(tuán)(例如?；?或原子取代，或者R2和R3、R3和R4或R4和R5與間插碳原子一起形成環(huán)戊酮基。
優(yōu)選地，在這些化合物中，X是一個氧原子。在其它優(yōu)選化合物中，R1是一個芳基或用一個或多個氟原子取代的芳基，或環(huán)烷基。
在其它優(yōu)選化合物中，R2和R3是氫原子，R4是-NO2或-COCH3基團(tuán)。其它優(yōu)選化合物包括R2是一個氫原子、R3和R4一起形成環(huán)戊酮基的化合物。
特別優(yōu)選地，本發(fā)明使用的通式A的化合物是此處所述稱為flosulide、NS-398、尼美舒利、FK 3311和L-745 337的化合物。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用的COX-2抑制劑選自二芳基雜環(huán)。
可在本發(fā)明中用作COX-2抑制劑的二芳基雜環(huán)家族的實例包括下列通式B的化合物或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽。

其中，Y代表一個環(huán)基，優(yōu)選地選自噁唑基、異噁唑基、噻吩基、二氫呋喃基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、咪唑基、異噻唑基、環(huán)戊烯基、苯基或和吡啶基；n是0-3的整數(shù)；m是0-4的整數(shù)；R6代表酮環(huán)基(ketocyclyl)、環(huán)烷基或芳基，該基團(tuán)可任選地被一個或多個基團(tuán)或原子優(yōu)選地一個或多個鹵素原子，如氟取代；R7各自獨立地代表一種取代基，可以是任一種功能基團(tuán)，優(yōu)選地是氫或鹵素原子，優(yōu)選地是氟或溴，或者烷基(優(yōu)選地-CH3)，烷基可以被一個或多個基團(tuán)或原子取代，優(yōu)選地一個或多個氟原子，例如-CF3；R8代表一個烷基，優(yōu)選地-CH3或NHR10，優(yōu)選地-NH2；R9代表一個鹵素原子，優(yōu)選地氟；和R10代表一個氫原子或烷基，任選地可被一個或多個基團(tuán)或原子(優(yōu)選地酰基)取代。
這類化合物在US 6,025,353中被稱為抗血管生成劑，優(yōu)選取代基和根據(jù)本發(fā)明的化合物的進(jìn)一步描述與US 6,025,353相同。
在這些化合物中，優(yōu)選地R8是-NH2或-CH3。在其它優(yōu)選化合物中，Y是吡唑基、呋喃基或噻吩基。優(yōu)選地，R6是一個芳基，任選地用一個或多個氟原子取代。優(yōu)選地，n是1或2。優(yōu)選地，R7是一個溴原子、酰基或取代烷基，如-CF3。
本發(fā)明使用的特別優(yōu)選的通式B的化合物是此處所述被稱為賽樂考昔、羅非考昔、DuP-697、SC-58125、DFP、DFU、CGP 28232和MF三環(huán)的化合物。
在此使用時，除非另外指出，術(shù)語“烷基”包括任何長鏈或短鏈、直鏈、分支或環(huán)形脂肪族飽和或不飽和烴基，任選地被羥基、烷氧基、酰氧基、硝基、烷氧羰氧基、氨基、芳基、氧或鹵素基團(tuán)單取代或多取代。不飽和烷基可以是單不飽和或多不飽和的，包括鏈烯基和烷烯基。這些基團(tuán)可含有高達(dá)40個、但優(yōu)選地1-10個碳原子。
在此使用時，環(huán)優(yōu)選地是C5-7，任選地含有一個或多個選自氧、氮和硫的雜原子。
術(shù)語“?；痹诖耸褂脮r包括羧酸和碳酸基團(tuán)，例如，酰氧基取代的烷基，包括如烷基羰氧基烷基。在這些類別中，任何烯基部分優(yōu)選地具有對于上述烷基所述的碳原子含量。優(yōu)選的芳基包括苯基和5-7個成員的單環(huán)雜芳族，特別是苯基，這些類別本身可任選地被取代。
典型的取代烷基R1包括烷氧烷基、羥烷氧烷基、多羥烷基、羥基多亞烷基氧烷基等，如烷氧甲基、烷氧乙基和烷氧丙基或酰氧甲基、酰氧乙基和酰氧丙基，如特戊酰氧基甲基。
在此使用時，除非另外指出，取代基可以被羥基、烷氧基、酰氧基、硝基、烷氧羰氧基、氨基、芳基、氧或鹵素基團(tuán)單取代或多取代。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，COX-2抑制劑選自傳統(tǒng)NSAID’s的修飾物，例如前體藥物、酯或鹽。
以傳統(tǒng)NSAID’s的化學(xué)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，生產(chǎn)了更多新的選擇性COX-2抑制劑。這種化合物可以是美洛昔康，它是一種oxecam(眾所周知的吡羅昔康的COX-2特異性類似物)或乙酸衍生物，如依托度酸(二氯芬酸的COX-2特異性類似物)。最優(yōu)選的該類化合物的其它例子有COX-2活性吲哚美辛衍生物和佐美酸。
在關(guān)于COX-2抑制劑的專利和專利申請中，例如，在上文列出的專利文件中，有根據(jù)本發(fā)明的化合物家族和亞家族的另一個清單。這些專利文件也列舉了也是根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選COX-2抑制劑的特異性化合物。
然而，特別優(yōu)選的化合物有異氟磷、L-745337、羅非考昔、NS398、SC 58125、依托度酸、美洛昔康、賽樂考昔和尼美舒利。
生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明使用的COX-2抑制劑的方法在本領(lǐng)域眾所周知，特別如上述文獻(xiàn)所述。
根據(jù)本發(fā)明，用于治療和預(yù)防此處所述疾病(例如免疫缺陷和病毒感染，特別是HIV/AIDS)的COX-2抑制劑，可含有一個或多個不對稱中心和/或一個或多個雙鍵，即本發(fā)明涉及此處公開的化合物的異構(gòu)體和消旋體的用途。所有這些可能的異構(gòu)體都屬于本發(fā)明的范圍。COX-2抑制劑可以是化合物的異構(gòu)體混合物的形式，或者更優(yōu)選地，是純化異構(gòu)體或藥學(xué)可接受的鹽的形式。
用于治療根據(jù)本發(fā)明的疾病(例如免疫缺陷和病毒感染)的COX-2抑制劑的藥用組合物能配制為藥學(xué)可接受的鹽，也可含有本領(lǐng)域眾所周知的藥學(xué)可接受的載體。
因此，本發(fā)明也涉及含有COX-2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽和藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的藥用組合物?！八帉W(xué)可接受的”是指一種成分必須與組合物中的其它成分相容，以及接受者在生理上可以接受。
在其它實施方案中，本發(fā)明也涉及這些組合物的用途，和使用這些組合物的預(yù)防/治療方法，如上文所述。
如果COX-2抑制劑是堿性的，可由藥學(xué)可接受的無毒酸(包括無機酸和有機酸)制備鹽。特別優(yōu)選的鹽是鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、檸檬酸、馬來酸、檸檬酸和酒石酸鹽。
如果COX-2抑制劑是酸性的，可由藥學(xué)可接受的無毒堿(包括無機堿或有機堿)制備鹽。特別優(yōu)選的鹽是鈉、鉀和鎂鹽。
為了治療和預(yù)防如此處所述的疾病，例如免疫缺陷或病毒疾病，包括HIV/AIDS，COX-2抑制劑能經(jīng)口、直腸、局部、頰部、吸入或以注射或輸液的形式腸胃外(例如肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi))施用。優(yōu)選的施用形式可經(jīng)口、直腸和注射或輸液施用。最優(yōu)選的施用形式適于口服。
對于所有施用形式，COX-2抑制劑均以通常含有眾所周知的藥學(xué)可接受的載體、佐劑和媒介的劑量單位制劑施用。因此，可以摻入活性成分，任選地與其它活性物質(zhì)一起作為組合制劑，含有一種或多種常規(guī)載體、稀釋劑和/或賦形劑，從而形成常規(guī)藥用制劑，如片劑、丸劑、粉劑、菱劑、香袋、膠囊劑、酏劑、懸液、乳劑、溶液、糖漿、氣霧劑(固體或液體基質(zhì))、軟膏、軟膠囊或硬膠囊、栓劑、無菌注射溶液、無菌包裝粉末等?？缮锝到饩酆衔?如聚酯、聚酐、聚乳酸或聚羥乙酸)也可用于固體植入。組合物可以利用冷凍干燥、過冷卻或Permazyme穩(wěn)定。
合適的賦形劑、載體或稀釋劑包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、糖漿、水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙烯、乙二醇、丙二醇、甲基纖維素、甲羥基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油或脂肪物質(zhì)，如硬脂或其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。組合物還可含有潤滑劑、濕潤劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑、增香劑、吸收增強劑，例如用于經(jīng)鼻給藥(膽汁鹽、卵磷脂、表面活性劑、脂肪酸、螯合劑)等等。本發(fā)明的組合物可以配制成在利用本領(lǐng)域周知的方法對患者施用后，快速、持續(xù)或延遲釋放活性成分。
施用的活性成分可以適當(dāng)修飾，以在藥用組合物中使用。例如，利用適當(dāng)?shù)奶砑觿?，如鹽或非電解質(zhì)、乙酸鹽、SDS、EDTA、檸檬酸鹽或乙酸緩沖液、甘露醇、甘氨酸、HAS或聚山梨醇酯，可以穩(wěn)定活性成分。
可以配制偶聯(lián)物以得到提高的親脂性，提高細(xì)胞運輸，提高溶解度或允許靶向。這些偶聯(lián)物可以是可切割的，使偶聯(lián)物作為前體藥物。也可利用適當(dāng)?shù)慕饘俳j(luò)合物，例如含Zn、Ca或Fe的絡(luò)合物，提供穩(wěn)定性。
活性成分可以配制于適當(dāng)載體中，用于輸送或靶向特定細(xì)胞、器官或組織。因此，藥用組合物可以采取微乳劑、脂質(zhì)體、niosome或納米顆粒的形式，其中可以吸收、摻入或結(jié)合活性成分。這能將產(chǎn)品有效地轉(zhuǎn)化為不可溶形式。
這些顆?？梢詳y帶適當(dāng)?shù)谋砻娣肿右蕴岣哐h(huán)時間(例如血清成分、表面活性劑、polyoxamine908、PEG等)，或用于位點特異性靶向的部分，如特定細(xì)胞攜帶的受體的配體。適用的給藥技術(shù)和靶向技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知，參見，例如Kreuter，1994，Eur.J.DrugMetab.Pharmacokinet.，3，p253-256；Shen，1997，J.Drug Targeting，5(1)，p11-13；Mrsny，1997，J.Drug Targeting，5(1)，p5-9；Pettit和Gombotz，1998，TIBTECH，16，p343-349；Duncan，1997，J.DrugTargenting，5(1)，p1-4，關(guān)于藥物靶向，Simari和Nabel，1996，Semin.Intervent.Cardiol.，1，p77-83；Torchilin，1998，J.Microencapsulation，15(1)，p1-19；Klyashchitsly和Owen，1998，J.Drug Targenting，5(6)，p443-458；Kreuter，1996，J.Anat.，189，p503-505；Fasano，1998，TIBTECH，16，p152-157；Kataoka等人，1993，24，p119-132；Anderson，1998，Nature，392(suppl)，p25-30；Langer，1998，Nature，392(suppl)，p5-10；Gregoriadis，1995，TIBTECH，13，p527-536；Gregoriadis等人，1997，F(xiàn)EBS Lett.，402，p107-110；Rolland，1998，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，15(2)，p143-198；Hope等人，1998，Molec.Memb.Biol.，15，p1-14；Scherman等人，1998，Curr.Opinion Biotech.，9(5)，p480-485，關(guān)于肽和核酸分子給藥。定點靶向的例子見，例如Schafer等人，1992，Pharm.Res.，9，p541-546，其中納米顆粒能在HIV感染的巨噬細(xì)胞中積累。顯然，這些方法特別適用于此處所述的本發(fā)明的方法。
這些衍生的或偶聯(lián)的活性成分屬于根據(jù)本發(fā)明使用的抑制性分子的定義范圍。
例如，用于口服的藥用組合物含有活性成分和適當(dāng)?shù)纳砜山邮艿乃幬铮孕纬善瑒?、膠囊、溶液、懸液或其它眾所周知的口服制劑。這些組合物可通過生產(chǎn)口服藥用組合物的任何方法生產(chǎn)。這些組合物能含有一種或多種生物活性劑，和一種或多種選自防腐劑、惰性稀釋劑、粘度增強劑、著色劑、甜味劑、成粒劑、崩解劑、粘合劑、滲透活性劑、濕潤劑、懸浮劑、用于制備緩釋制劑的物質(zhì)、油和水的成分。
非口服使用的藥用組合物，例如直腸施用的栓劑或注射或輸液用的溶液，能用眾所周知的方法和適用于這些制劑的添加劑制備。所有注射和輸注用制劑都應(yīng)當(dāng)是無菌制劑。
這些組合物中的活性成分可以占制劑重量的約0.01％-99％，優(yōu)選地約0.1％-50％，例如10％。
為了用COX-2抑制劑治療根據(jù)本發(fā)明的疾病，例如免疫缺陷和病毒感染，每日劑量水平應(yīng)為0.005mg-約150mg/kg體重。劑量主要取決于COX-2抑制劑化合物的選擇、臨床狀況(病毒類型、傳染狀態(tài)和患者病情)、患者年齡和體重、給藥途徑和藥物的總用量，包括療程的長短。更優(yōu)選的劑量通常為每日0.01mg-50mg/kg體重，更優(yōu)選的是每日0.05mg-20mg/kg體重。例如，對于成人口服給藥，可以每日施用25mg羅非考昔或200mg賽樂考昔。
劑量單位一般為1mg-500mg活性成分。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，一種COX-2抑制劑能與一種或多種其它COX-2抑制劑組合，治療此處所述的疾病，例如免疫缺陷或病毒感染。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，COX-2抑制劑能與一種或多種其它COX-2抑制劑或一種或多種不同作用模式的其它藥物組合，治療疾病，如免疫缺陷、HIV感染或AIDS。這類組合的實例可以是COX-2抑制劑與一種或多種NNRTIs組合，或與一種或多種NRTIs組合，或與一種或多種HIV蛋白酶抑制劑組合，或一種或多種HAART與COX-2抑制劑組合。
另一方面，本發(fā)明提供組合一種或多種COX-2抑制劑與提高活性成分耐受性的化合物的方法和/或組合物，特別是在長期治療中。典型的化合物包括抗組胺和質(zhì)子泵抑制劑。
因此，本發(fā)明涉及含有上文所述COX-2抑制劑和一種或多種其它COX-2抑制劑和/或一種或多種其它活性成分的組合物。本發(fā)明還涉及這些組合物的用途和使用上述組合物的方法。本發(fā)明還涉及含有上述成分的產(chǎn)品，作為組合制劑在治療或預(yù)防上述疾病時同時、分開或連續(xù)使用。
本發(fā)明參照下列附圖，在下列非限制性實施例中進(jìn)一步描述

圖1顯示MAIDS感染后CD8+(A)、CD4+(B)和B(C)細(xì)胞中的cAMP水平。從感染MAIDS不同時間的小鼠的淋巴結(jié)中分離單核細(xì)胞，利用DACS-細(xì)胞分選儀通過負(fù)選擇分離為CD4+、CD8+和B細(xì)胞。胞內(nèi)cAMP水平通過超聲處理和放射免疫測定法估計。條圖代表平均值±SD(n＝3個體小鼠)；圖2顯示CD4+、Thy-1.2陰性和陽性群體中的MAIDS cAMP水平。來自3只感染小鼠和三只年齡相當(dāng)?shù)膶φ招∈蟮牧馨徒Y(jié)細(xì)胞FACS-分選為CD4+，Thy-1.2+(空心條形)和CD4+，Thy-1.2-(實心條形)群體，如圖1所述測定胞內(nèi)cAMP水平。條圖代表平均值±SD(n＝3)；圖3顯示MAIDS與野生型小鼠的蛋白激酶A活性水平。(A)在含(總活性，陰影條形)或不含(游離活性，實心條形)5μmcAMP時，用肯普肽作為底物，對從小鼠脾細(xì)胞純化的淋巴結(jié)細(xì)胞的去污劑溶解的提取物測得的激酶活性。減去不被PKA特異性蛋白激酶抑制劑(PKI，1μM)抑制的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，只顯示PKA特異性活性。相對于野生型仔畜，顯示感染小鼠(MAIDS；n＝4)的活性。(B)對與(A)相同的提取物測得的[3H-cAMP]結(jié)合，計算R單體的摩爾量；圖4顯示MAIDS和野生型小鼠細(xì)胞中PKA C亞基的免疫定位。來自對照小鼠(上圖)和MAIDS感染小鼠(下面兩幅圖)的單核細(xì)胞通過細(xì)胞離心(cytospin)(400×g)附著于載玻片上，固定并用抗-PKA-C多克隆抗體和HRP-偶聯(lián)的第二抗體進(jìn)行免疫染色(染色呈褐色)。用蘇木精復(fù)染(染色質(zhì)染色呈藍(lán)色)；圖5顯示I型PKA拮抗劑Rp-8-溴-cAMP-硫逐磷酸酯(Rp-8-Br-cAMP)對MAIDS和野生型小鼠T細(xì)胞功能的影響。用自MAIDS小鼠(A)和未感染的對照小鼠(B)分離的T細(xì)胞估測TCR/CD3刺激的T細(xì)胞增殖。用相同實驗分別檢測濃度升高的cAMP激動劑(8-CPT-cAMP)對TCR/CD3刺激的自MAIDS(空圓，虛線)和對照小鼠(實圓，實線)分離的CD3+T細(xì)胞增殖的影響(C)。顯示三次測定的平均值±SD?？偨Y(jié)數(shù)據(jù)見表4(n＝11)。注意A和B的標(biāo)尺不同，而在C中，對于MAIDS和對照T細(xì)胞，將不含cAMP激動劑時TCR/CD3誘導(dǎo)的增殖標(biāo)準(zhǔn)化為100％；圖6顯示正常和MAIDS淋巴結(jié)細(xì)胞在體外的PGE2分泌。來自MAIDS感染20周后的小鼠(實心條形，n＝9)和年齡相當(dāng)?shù)膶φ招∈?陰影條形，n＝4)的未分選的淋巴結(jié)細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，之后通過ELISA測定上清液中的PGE2分泌水平；圖7顯示非選擇性COX抑制劑對正常和MAIDS感染小鼠T細(xì)胞免疫功能的影響。柱圖1--對照小鼠+抗-CD3；柱圖2--對照小鼠+抗-CD3+吲哚美辛；柱圖3--MAIDS小鼠+抗-CD3；柱圖4--MAIDS小鼠+抗-CD3+吲哚美辛。在含及不含非選擇性COX抑制劑吲哚美辛(50ng/ml)時，通過[3H]-胸苷摻入法測定未分選的淋巴結(jié)單核細(xì)胞混合群體的T細(xì)胞增殖反應(yīng)。通過抗-CD3(mAb2C11；4μg/ml)交聯(lián)實現(xiàn)T細(xì)胞激活。條圖顯示對照(n＝3)和MAIDS感染(n＝5)小鼠的平均值±SD，其它數(shù)據(jù)見表5。細(xì)胞培養(yǎng)72小時，其中后4小時含有[3H]-胸苷；圖8顯示正常(A)和MAIDS感染(B)小鼠中不同淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞亞群的COX-2表達(dá)。分別根據(jù)CD4、CD8和B220分子的表達(dá)，通過正選擇FACS分選CD4+T、CD8+T和B細(xì)胞。CD11b-細(xì)胞通過負(fù)選擇分選(根據(jù)CD11b的缺乏)。然后裂解來自MAIDS感染小鼠和正常小鼠的細(xì)胞，每一樣品對10μg蛋白質(zhì)進(jìn)行COX-2表達(dá)的免疫印跡分析。印跡同時與肌動蛋白抗體反應(yīng)作為對照；圖9顯示MAIDS和野生型淋巴結(jié)細(xì)胞的CD11b表達(dá)。顯示來自MAIDS感染小鼠和對照小鼠的不同淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+T細(xì)胞和B220+B細(xì)胞)的CD11b表達(dá)(通過流式細(xì)胞術(shù))。R1CD11b高；R2CD11b暗；R3CD11b-；圖10顯示MAIDS感染小鼠和野生型小鼠的淋巴結(jié)的COX-2表達(dá)水平。淋巴結(jié)冷凍切片，進(jìn)行COX-2免疫組化染色(染色呈褐色)。(a)正常對照淋巴結(jié)，生發(fā)中心進(jìn)行COX-2染色。(b)較高放大倍數(shù)下的正常淋巴結(jié)。HRP顏色反應(yīng)染色陽性的細(xì)胞是含攝入物質(zhì)(箭頭)的“可染色體”巨噬細(xì)胞。(c)來自MAIDS感染小鼠(感染后20周)的淋巴結(jié)。注意改變的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。(d)較高放大倍數(shù)下進(jìn)行COX-2染色的MAIDS淋巴結(jié)。注意細(xì)胞質(zhì)中免疫染色呈褐色的細(xì)胞數(shù)和大量有絲分裂形狀；圖11顯示體內(nèi)施用非選擇性COX抑制劑對HIV感染患者T細(xì)胞免疫功能的影響。對3名患者(患者1-3)根據(jù)[3H]-胸苷摻入估測CD3+T細(xì)胞的T細(xì)胞增殖反應(yīng)，這3名患者參加II期臨床試驗，除三聯(lián)治療外，還每日3次口服25mg吲哚美辛，共14天。上圖顯示第0天、第14天(治療兩周后)和第28天(停止兩周后)的T細(xì)胞免疫功能，分別標(biāo)記為柱圖1、2、3。通過抗-CD3(mAb SpVT3b)交聯(lián)實現(xiàn)T細(xì)胞激活。AT細(xì)胞激活后的基礎(chǔ)增殖；B在Rp-8-Br-cAMPS(1mM)存在下的增殖；注意通過比較上圖和下圖，cAMP介導(dǎo)的免疫缺陷程度明顯。條圖代表三次測定的平均值+SD。細(xì)胞培養(yǎng)72小時，后16小時含有[3H]-胸苷；圖12顯示體內(nèi)施用非選擇性COX抑制劑吲哚美辛對圖11所述7名HIV感染患者的T細(xì)胞增殖的影響，患者1-7分別以實心圓、空心圓、實心三角形、空心三角形、實心正方形、空心正方形和實心菱形表示。對三次測定的平均值作圖，連線表示每名患者的發(fā)展；圖13顯示COX-2特異性抑制劑羅非考昔對MAIDS感染小鼠T細(xì)胞免疫功能的影響。在含和不含濃度逐漸升高(1.9-500nM)的COX-2特異性抑制劑羅非考昔時，通過[3H]-胸苷摻入法測定未分選的淋巴結(jié)單核細(xì)胞混合群體的T細(xì)胞增殖反應(yīng)。通過抗-CD3(mAb2C11；4μg/ml)交聯(lián)實現(xiàn)T細(xì)胞激活。顯示三次測定的平均值和S形曲線擬合。細(xì)胞培養(yǎng)72小時，其中后4小時含有[3H]-胸苷；圖14顯示COX-2特異性抑制劑賽樂考昔對MAIDS感染小鼠T細(xì)胞免疫功能的影響，如圖13對于羅非考昔所述；圖15顯示羅非考昔和賽樂考昔與吲哚美辛相比，對對照小鼠(1)或MAIDS小鼠(2)的離體淋巴結(jié)(LN)細(xì)胞分泌PGE2的影響。未分選的LN細(xì)胞在含或不含PGE2誘導(dǎo)劑——脂多糖(LPS；4μg/ml)、非特異性環(huán)加氧酶抑制劑——吲哚美辛(50ng/ml)、COX-2特異性抑制劑羅非考昔(0.125μM)和賽樂考昔(0.125μM)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。48小時后，通過EIA測定上清液中的PGE2濃度。分析3只感染小鼠(第20周)和3只年齡相當(dāng)?shù)膶φ招∈?。顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；圖16顯示用羅非考昔體內(nèi)處理MAIDS小鼠對T細(xì)胞免疫功能的影響。MAIDS小鼠不處理(未處理1-3)或用羅非考昔經(jīng)口處理(3mg/kg/d，每日一次，處理1、2)7天，通過插入心室的導(dǎo)管給藥。之后，在含(0.5或1.0mM，分別柱圖B和C)及不含(柱圖A)Rp-8-Br-cAMPS時，對來自處理和未處理動物的未分選的淋巴結(jié)單核細(xì)胞混合群體，通過[3H]-胸苷摻入法體外測定其T細(xì)胞增殖反應(yīng)。所有樣品均通過抗-CD3(mAb 2C11；4μg/ml)交聯(lián)實現(xiàn)T細(xì)胞激活。對照代表未感染小鼠的T細(xì)胞增殖。顯示三次測定的平均值。細(xì)胞培養(yǎng)72小時，其中后4小時含有[3H]-胸苷；圖17顯示用羅非考昔或賽樂考昔體內(nèi)處理MAIDS小鼠對T細(xì)胞免疫功能的影響。MAIDS小鼠注射載體(脂肪乳劑intralipid)、通過腹膜內(nèi)注射以溶于脂肪乳劑中的羅非考昔處理(3mg/kg/d，每日一次，n＝6)，或通過腹膜內(nèi)注射以賽樂考昔處理(20mg/kg/d，每日一次，n＝5)18-20天。之后，如圖16所述，但不含Rp-8-Br-cAMPS，在體外測定T細(xì)胞增殖反應(yīng)。對照代表未感染小鼠的T細(xì)胞增殖。顯示三次測定的平均值(黑圓)、25-75％百分位(加框區(qū)域)和中值(框中的線)。條圖代表范圍；圖18顯示用美洛昔康體內(nèi)處理MAIDS小鼠對T細(xì)胞免疫功能的影響。將含有美洛昔康(釋放率為70μg/動物/日)或磷酸緩沖液(PBS)的滲透泵(Alzet，100μl)皮下植入MAIDS小鼠(感染后14周)和健康小鼠中14天。a)，之后，如圖17所述在體外測定T細(xì)胞增殖反應(yīng)。顯示每組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(s.e.m.)。美洛昔康處理對抗-CD3刺激的MAIDS小鼠細(xì)胞增殖(實心條形)的影響，與接受PBS的MAIDS小鼠的結(jié)果(空心條形)相差顯著(p＜0.05)。b)，美洛昔康或PBS體內(nèi)處理的a)中小鼠組的混合淋巴結(jié)培養(yǎng)物，在體外細(xì)胞培養(yǎng)液中補加美洛昔康(2.5μg/ml)，如a)所述測定抗-CD3誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，體外補加美洛昔康的影響(空心條形)與沒有補加的細(xì)胞反應(yīng)(實心條形)相比較(p＝0.005)。c)，向美洛昔康或PBS體內(nèi)處理的a)中小鼠組的混合淋巴結(jié)體外細(xì)胞培養(yǎng)物中加入Rp-8-Br-cAMPS(0.5mM)，如a)所述測定抗-CD3誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，體外Rp-8-Br-cAMPS的影響(空心條形)表示為高出沒有補加的細(xì)胞(實心條形)的誘導(dǎo)倍數(shù)。用Mann-Whitney U檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析以比較兩組動物，用Wilcoxon配對檢驗比較進(jìn)行兩種不同處理的同一組別。
實施例實施例1鼠獲得性免疫缺陷綜合征(MAIDS)小鼠具有cAMP/I型PKA誘發(fā)的T細(xì)胞功能障礙MAIDS(鼠獲得性免疫缺陷綜合征)。大量研究表明MAIDS是人類HIV感染的一個可能的模型。該綜合征在感染了編碼一種變異Pr60gag聚蛋白質(zhì)的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒后發(fā)作(Chattopadhyay等人，1991，J.Virol.，65，p4232-4241；Jolicoeur，1991，F(xiàn)ASEB J.，5，p2398-2405)。該綜合征與脾臟和淋巴結(jié)中的進(jìn)行性淋巴增生以及嚴(yán)重的免疫缺陷有關(guān)。盡管導(dǎo)致MAIDS的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒主要感染B細(xì)胞(Aziz，1989，Nature，338，p505-508)，但CD4+T細(xì)胞表現(xiàn)嚴(yán)重的功能障礙，和對體外有絲分裂原刺激的無反應(yīng)性。感染小鼠的大部分CD4+T細(xì)胞(而不是CD8+T細(xì)胞)的特征也在于異常的Thy-1陰性表型(Holmes等人，1990，Eur.J.Immunol.，20，p2783-2787；Moutschen等人，1994，Scand.J.Immunol.，39，p216-224(MAIDS))。在正常的未感染的小鼠中，生發(fā)中心選擇性地發(fā)現(xiàn)有CD4+Thy-1-T細(xì)胞，它們相當(dāng)于最近的抗原特異性遷出物。
變異Pr60gag蛋白誘發(fā)T細(xì)胞異常的機制還不清楚。感染細(xì)胞分泌的可溶性因子據(jù)說一定程度上影響T細(xì)胞的功能(Simard，J.Virol.，68，p1903-1912)，但這些介質(zhì)的性質(zhì)尚未闡明。其它研究提示，CD4+T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞的直接、同源相互作用是誘發(fā)T細(xì)胞缺陷所必需的(Green，2001，J.Virol.，70，p2569-2575；de Leval，1998，J.Virol.，72，p5285-5290)。
腺苷酸環(huán)化酶-cAMP-蛋白激酶A途徑在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起重要作用(Kammer，1991，Immunol.Today，9，p222-229)。眾所周知，濃度升高的cAMP可抑制T細(xì)胞對多種刺激物(如抗-CD3mAb和白介素-2)的增殖反應(yīng)。最近的報道提示，JAK3酪氨酸激酶的下調(diào)可能是cAMP抑制T細(xì)胞增殖的機制(Kolenko，1999，Blood，93，p2308-2318)。cAMP也能誘導(dǎo)膜蛋白的下調(diào)，因為暴露于cAMP誘導(dǎo)劑(如去甲腎上腺素)的鼠胸腺細(xì)胞或胸腺瘤細(xì)胞通過包括mRNA去穩(wěn)定的機制下調(diào)Thy-1的表達(dá)(Wajeman-Chao，J.Immunol.，161，p4825-4833)。
前列腺素E2(PGE2)是cAMP的一種強誘導(dǎo)劑，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和活化的T細(xì)胞分泌。PGE2通過抑制IL-2并提高IL-4產(chǎn)量，使平衡從1型T輔助細(xì)胞移向2型T輔助細(xì)胞(Betz和Fox，1991，J.Immunol.，146，p108-113；Meyaard，1997，Blood，89，p570-576)。它也使B細(xì)胞的分化傾向于IgE的產(chǎn)生(Fedyk和Phipps，1996，PNAS USA，93，p10978-10983)。前列腺素的合成由環(huán)加氧酶-1和-2(COX-1和COX-2)以及特異性PG合酶的連續(xù)作用完成(Smith和DeWitt，1996，Adv.Immunol.，62，p167-215)。COX-1的表達(dá)主要是組成型和普遍的，而COX-2只在特定細(xì)胞型(巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞)中由NO和炎性細(xì)胞因子(如IL-1和TNF-α)誘導(dǎo)。
對于導(dǎo)致MAIDS的T細(xì)胞功能障礙的機制仍了解極少。主要涉及CD4+T細(xì)胞，而幾篇報道提出，CD8+T細(xì)胞的改變僅僅是由于缺乏足夠的CD4+T細(xì)胞輔助。相反，B細(xì)胞反應(yīng)的抑制是固有的，不能僅僅用缺陷型CD4+淋巴細(xì)胞來解釋。因此，發(fā)明者觀察到的B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞而非CD8+T細(xì)胞中cAMP選擇性增多符合cAMP參與MAIDS相關(guān)的無反應(yīng)性過程。
據(jù)發(fā)明者所知，這第一次證明了疾病模型中cAMP的亞群選擇性增多。如果可溶性因子，如前列腺素E2，確實負(fù)責(zé)cAMP誘導(dǎo)，如何解釋其作用的亞群選擇性呢？以前的研究比較了CD4+和CD8+T細(xì)胞上不同前列腺素類受體的表達(dá)，結(jié)論是兩個亞群有類似的表達(dá)模式。正常CD8+T細(xì)胞對PGE2的cAMP誘導(dǎo)作用非常敏感。一個可能的解釋是在受體后水平發(fā)生；記憶/活化T細(xì)胞對PGE2比幼稚T細(xì)胞更具反應(yīng)性。對于MAIDS——它與MHCII類依賴的過程有關(guān)，CD4+T細(xì)胞能獲得特定的激活狀態(tài)，使它們對特定濃度的PGE2的作用更加敏感。前列腺素類作用的受體后調(diào)節(jié)主要由G受體激酶(GRK)介導(dǎo)，GRK從相應(yīng)的膜受體上解偶聯(lián)蛋白G。炎癥狀態(tài)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的特征在于GRK的下調(diào)，因而在于淋巴細(xì)胞對cAMP誘導(dǎo)劑(如兒茶酚胺)的敏感性提高。來自感染小鼠的CD4+和CD8+T細(xì)胞的GRK活性水平未知。
實施例1和2中使用的方法小鼠和細(xì)胞懸液雄性C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于發(fā)明者的實驗設(shè)施中。小鼠在4周齡和5周齡時腹膜內(nèi)注射兩次0.25ml無細(xì)胞病毒提取液。年齡相當(dāng)?shù)膶φ招∈蟾鼓?nèi)注射兩次0.25ml磷酸緩沖液(PBS)。在感染后不同時間，通過CO2窒息殺死小鼠。用注射器解離外周淋巴結(jié)(腹股溝、腋窩和頸部)，獲得單細(xì)胞懸液，并通過尼龍細(xì)胞染色器，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基洗滌三次，在臺盼藍(lán)排除后用Thoma血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。
病毒如前所述，由2個月前注射RadLV-Rs的小鼠的淋巴結(jié)制備病毒提取物。收集淋巴結(jié)，在PBS中研磨，以1.5×104g離心30分鐘。再次以1.5×104g離心上清液30分鐘。將此無細(xì)胞提取液貯存于液氮中。用XC空斑測定法定量病毒顆粒。該病毒制品含有103顆粒形成單位(PFU)新嗜性病毒/ml。
抗體用下列多克隆抗體進(jìn)行Western印跡實驗；一級抗體多克隆兔抗COX-1或兔抗COX-2抗體。(Santa Cruz Biotechnology)；第二步辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔抗體購自TransductionLaboratories(Transduction Laboratories，UK)。流式細(xì)胞分析使用如下單克隆抗體PE-偶聯(lián)的CD4/L3T4(YTS.191.1)、FITC-偶聯(lián)的CD45R/B220(RA3-6B2)、FITC-偶聯(lián)的CD11b/Mac-1(M1-70)、FITC-偶聯(lián)的CD161/NK-1.1(PK136)、FITC-偶聯(lián)的CD8a(Ly-2)和CD16/CD32(FcγIII/II受體)(2.4G2)(均購自PharmingenSan Diego，CA，USA)。CD3 moAb(145-2C11)在發(fā)明者的實驗室中純化。伴刀豆球蛋白A(ConA)購自BoehringerMannheim Biochemica，植物凝集素-M(PHA)購自Difco。
流式細(xì)胞分析和細(xì)胞分選利用FACStar-plus流式細(xì)胞分選儀和Cellquest軟件(BectonDickinson)進(jìn)行分析。用前向和側(cè)向散射門控活淋巴細(xì)胞。對于FITC(綠色)和PE(橙色)雙色分析，用氬離子激光(氣水冷卻型Spinnaker 1161；Spectra Physics，Mountain View，CA)提供488nm的藍(lán)光激發(fā)。對于細(xì)胞分選，60×106個細(xì)胞與抗-FcγII(Fc阻斷)溫育，以防止非特異性相互作用，之后在冰上用熒光染料偶聯(lián)的抗體標(biāo)記20分鐘。通過消耗CD8+B220+CD11b+細(xì)胞負(fù)選擇CD4+T細(xì)胞。類似地，通過消耗CD4+B220+CD11b+細(xì)胞負(fù)選擇CD8+T細(xì)胞，通過消耗CD8+CD4+CD11b+細(xì)胞負(fù)選擇B細(xì)胞。每次分選都用流式細(xì)胞術(shù)重新分析選擇的級分，估計純度，其總是高于97％。
cAMP定量單淋巴結(jié)細(xì)胞懸液如上所述制備，用RPMI1640洗滌兩次，以1500×g離心3分鐘。之后通過超聲處理破碎細(xì)胞，促進(jìn)胞內(nèi)cAMP向提取溶液(0.01N HCl，95％乙醇)中釋放。以13×104×g離心含有細(xì)胞裂解液的溶液15分鐘，將上清液移至新試管中。在SpeedVac濃縮器中45℃蒸發(fā)提取液，沉淀貯存于-20℃。使用前，將沉淀重懸浮于測定緩沖液中，采用125I-標(biāo)記的cAMP測定系統(tǒng)(Amersham，England)通過放射免疫測定法(RIA)測定cAMP水平。通過與曲線-線性標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，測定待測樣品中的cAMP濃度。對于陽性和陰性對照，淋巴結(jié)細(xì)胞(1×106)分別與1mM二丁酰-cAMP和0.5mM DDA(腺苷酰環(huán)化酶抑制劑)在潮濕5％CO2孵箱中37℃溫育30分鐘，之后測定cAMP濃度。
細(xì)胞勻漿和免疫印跡細(xì)胞(50×106)在含有10mM磷酸鉀(pH7.1)、250mM蔗糖、1mM EDTA、0.1％Triton X-100和各10μg/ml蛋白酶抑制劑--胰凝乳蛋白酶抑制劑、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑制劑A和抗蛋白酶的緩沖液中，通過在冰上超聲處理(2×15s)勻漿(Tasken等人，1993，J.Biol.Chem.，268，p21276-21283)，離心30分鐘(15000×g)除去不可溶物質(zhì)。通過Bradford試驗(BioRad)測定蛋白質(zhì)濃度。對于免疫印跡，通過10％SDS-PAGE分離40μg蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，與溶于含5％脫脂奶粉和0.1％BSA(Blotto)的TBS/Tween中的抗體一起溫育。用HRP偶聯(lián)的二級抗體(JacksonLaboratories/Transduction Laboratories)和ECL(Amersham)檢測一級抗體。
PKA的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性在R.Roskosli(Methods Enzymol.，1983，99，p36)所述的測定混合物中，用[γ-32P]-ATP(比活性0.25Ci/mMol，Amersham)使PKA特異的底物(Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly)(Kemp等人，1976，PNSA USA，73，p1038-1042)肯普肽，Peninsula LaboratoriesINC.)磷酸化，測定PKA的催化活性。在含及不含cAMP(5μM)和PKI(1μM)時測定磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，減去不被PKI抑制的低水平活性，測定PKA特異的活性。
cAMP結(jié)合測定溶解的PKA調(diào)節(jié)亞基的特異[3H]cAMP結(jié)合如Cobb和Corbin(Methods in Enzymology，159，p202-208，1988)所述在含有[2，8-3H]cAMP(2.25μM；比活性為5Ci/mMol；DuPont-New EnglandNuclear)的混合液中進(jìn)行定量。根據(jù)每個調(diào)節(jié)亞基單體上的兩個cAMP結(jié)合部位計算R亞基的摩爾比。
免疫細(xì)胞化學(xué)對照和感染的淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞與冷丙酮固定5分鐘，用0.1％皂苷PBS溶液洗滌兩次，每次5分鐘。在0.1％皂苷/PBS中與0.3％過氧化氫溫育15分鐘阻斷內(nèi)源過氧化物酶。用皂苷/PBS漂洗后，玻片在室溫下與阻斷緩沖液(溶于0.1％皂苷/PBS的1.5％正常山羊血清)溫育30分鐘，隨后在潮濕容器中與一級抗體溶液室溫溫育60分鐘?？笴a抗體購自Santa Cruz，用含0.1％皂苷和0.5％正常山羊血清的PBS 1∶1000稀釋。然后如前所述洗滌玻片，與生物素化山羊抗兔抗體一起溫育。后者用ABC復(fù)合物(Novastain Super ABC試劑盒，Novocastra)檢測。過氧化物酶用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(Dako)顯色，DAB在H2O2存在下產(chǎn)生褐色沉淀。玻片用蘇木精-曙紅(Sigma)復(fù)染。將cytospin與抗PKA-Cα亞基的特異肽溫育，檢測特異性。
免疫組織化學(xué)用4％低聚甲醛固定、塑料包埋的組織(JB4-JBPolysciences)制作2μm厚的組織切片，在該切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)。切片用胰蛋白酶(0.24％)在37℃下透化1分鐘，然后用Tween 20(2％)在37℃下透化30分鐘。在室溫下與H2O2(1％)溫育30分鐘，以猝滅內(nèi)源過氧化物酶。非特異性部位用正常山羊血清(1.5％)在37℃下飽和1小時。然后將切片與一級多克隆兔抗COX-1或兔抗COX-2抗體(Santa Cruz Biotechnology)4℃溫育過夜，然后與生物素化山羊抗兔抗體溫育2小時。后者用ABC復(fù)合物檢測(Novostain Super ABC試劑盒，Novocastra)。過氧化物酶用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(Dako)顯色，DAB在H2O2存在下產(chǎn)生褐色沉淀。切片用蘇木精-曙紅(Sigma)復(fù)染。將切片與正常兔血清而不是一級抗體一起溫育，檢測特異性。
MAIDS小鼠的增殖測定通過在平底96孔微孔板中以100μl體積溫育0.1×106CD3+T細(xì)胞/ml進(jìn)行增殖測定。以1∶1的細(xì)胞∶磁珠比加入綿羊抗小鼠IgG(Dynal，目錄號110.02)包被的單分散性磁珠，隨后加入終稀釋度為4μg/ml的抗-CD3(克隆2C11)，實現(xiàn)激活。開始時仔細(xì)滴定抗體的最佳濃度，始終以幾個不同的抗體稀釋度進(jìn)行平行實驗。溫育細(xì)胞72小時，其中后4小時含有[3H]-胸苷(0.4μCi)，用細(xì)胞收集器(Skatron，Sterling，VA，USA)收集到玻璃纖維濾器上，分析增殖。用閃爍分析儀(Tri-Carb，Packard，Meriden，CT，USA)計數(shù)摻入的前體。需要時，加入cAMP類似物，30分鐘后加入抗-CD3抗體激活。8-CPT-cAMP購自Sigma(St.Louis，MO)，Sp-和Rp-8-Br-cAMPS購自BioLog Life Science Company(Bremen，德國)，均用PBS溶解為4-10mM的濃度，用廠商指定的消光系數(shù)計算濃度。吲哚美辛溶解于水中，以50ng/ml濃度使用。
PGE2測定將來自對照和感染小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞的500μl 48小時培養(yǎng)上清液移至1.5ml聚丙烯管中，加入500μl水∶乙醇(1.4)和10μl冰冷的乙酸。輕輕混合試管，在室溫下放置5分鐘。隨后以2500×g離心2分鐘。收集上清液，過Amprep C18微型柱，該柱用2倍柱體積的10％乙醇初始化(prime)。然后用1倍體積的H2O和1倍柱體積的己烷洗柱。PGE2用2×0.75ml乙酸乙酯稀釋。合并級分，在氮氣下蒸發(fā)干燥。最后，每個級分用100μl測定緩沖液重建，按照廠商推薦，用Amersham EIA試劑盒測定PGE2。
統(tǒng)計學(xué)分析用Mann-Whitney U檢驗(雙尾)比較兩組個體。相關(guān)系數(shù)(r)用Spearman＝s秩和檢驗計算。統(tǒng)計學(xué)和曲線擬合分析分別用Statistica(Statsoft Inc.，Tulsa，OK)和Sigma Plot(JandelCorporation，Erkrath，德國)軟件包進(jìn)行。如不另外說明，結(jié)果表示為中值和25％-75％百分位，p值是雙向的，當(dāng)＜0.05時視為顯著。
實驗MAIDS感染使CD4+T細(xì)胞中的cAMP增多。接種逆轉(zhuǎn)錄病毒混合物(稱為RadLV-Rs，導(dǎo)致MAIDS)的小鼠在感染不同時間后殺死，用流式細(xì)胞儀/細(xì)胞分選器通過負(fù)選擇將淋巴結(jié)細(xì)胞分選為純B細(xì)胞和CD4+和CD8+T細(xì)胞。測定感染后不同細(xì)胞群體的胞內(nèi)cAMP水平。從圖1可以看出，CD4+T細(xì)胞在感染數(shù)周后cAMP水平明顯升高(超過20倍)。后期，B細(xì)胞的cAMP水平也升高，而在CD8+T細(xì)胞中只觀察到較小的變化。此外，通過陽性分選將CD4+T細(xì)胞分離為Thy-1.2+和Thy-1.2-細(xì)胞時，顯然主要是Thy-1.2-細(xì)胞的cAMP水平升高(圖2，6倍)。當(dāng)均來自于未感染的小鼠時，這一通常為低豐度的群體也顯示高于Thy-1.2+的基礎(chǔ)cAMP水平。
測定去污劑溶解提取物的核后上清液中的PKA磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，顯示MAIDS淋巴結(jié)細(xì)胞中cAMP依賴的激酶活性總水平下降，而無cAMP時活性只有較小改變(圖3A)。這符合慢性激活和導(dǎo)致C亞基降解或C移位的PKA解離。對cAMP結(jié)合的測定(圖3B)顯示PKA R亞基總水平無改變。來自MAIDS和對照小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，核中免疫反應(yīng)性PKA C亞基的水平升高(圖4)。這也符合MAIDS中cAMP-PKA途徑的激活。
I型PKA拮抗劑提高M(jìn)AIDS T細(xì)胞的T細(xì)胞增殖為了測定增多的cAMP和PKA激活對抑制TCR/CD3-誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的影響，我們使用硫取代的cAMP類似物(Rp-8-Br-cAMPS)作為I型PKA的完全拮抗劑(Gjertsen，Mellgren等人，1995 1665，同上文)。圖5A顯示，在MAIDS感染小鼠的T細(xì)胞中，TCR/CD3-刺激的增殖不到未感染對照小鼠的T細(xì)胞的10％(圖5B)。此外，當(dāng)估測I型PKA拮抗劑在MAIDS T細(xì)胞中的作用時，我們發(fā)現(xiàn)TCR/CD3誘導(dǎo)的增殖有濃度依賴的提高，在較高濃度時超過4倍(圖5A)，而對照T細(xì)胞的處理未見刺激(圖5B)。觀察11只MAIDS感染小鼠，與對照相比，它們的T細(xì)胞增殖均嚴(yán)重削弱(p＜0.001)，而對于11只小鼠中的10只，I型PKA拮抗劑增強了T細(xì)胞增殖(p＜0.001；中值2.2倍，圖5)。cAMP拮抗劑的刺激作用甚至在所用的最高濃度時仍未飽和(圖5A，對于表5中的所有小鼠獲得類似的數(shù)據(jù)(未顯示))。這表明，化合物的溶解度、親和力或細(xì)胞的利用率可能是觀察到的作用的限制因素。因此，通透性和效能更高的I型PKA拮抗劑可進(jìn)一步增強TCR/CD3-誘導(dǎo)的MAIDS T細(xì)胞增殖。
然后，用5只MAIDS感染的小鼠和4只對照小鼠研究cAMP激動劑對TCR/CD3-誘導(dǎo)的增殖的影響。來自MAIDS感染小鼠的T細(xì)胞顯示，外源加入的8-CPT-cAMP使敏感性明顯偏移至細(xì)胞增殖抑制(圖5C和表5)。而且，當(dāng)MAIDS感染小鼠的T細(xì)胞和對照T細(xì)胞的最大增殖率標(biāo)準(zhǔn)化為100％時(圖5C，數(shù)據(jù)未顯示)，顯然除了cAMP抑制曲線左移外，曲線斜率顯著不同(MAIDS小鼠的T細(xì)胞的Hill系數(shù)為0.6(0.54-1.52)，正常T細(xì)胞為2.2(1.9-2.5)，表5，p＜0.05)。cAMP類似物使敏感性提高到抑制，這提示，是由于I型PKA的初始cAMP結(jié)合部位B上內(nèi)源cAMP增多，隨后對于外源添加的cAMP類似物的A部位親和力提高。8-CPT-cAMP使曲線斜率由協(xié)同、雙配基部位結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊黠@的非協(xié)同抑制曲線，也表明B部位被增多的內(nèi)源cAMP占據(jù)。
表5Rp-8-Br-抗-CD3誘導(dǎo) cAMPS引起 8-CPT-cAMP8-CPT-cAMP的增殖(cpm) 的增殖增強 對增殖的抑制 對增殖的抑制小鼠 (提高倍數(shù)) (IC50，μM) (Hill系數(shù))1952519 6 412331224 22543915314 8 584959 37 n.d. n.d.
513791 10 521566637019 661527635722 n.d n.d.
8998642 n.d. n.d.
9569640 n.d. n.d.
10 16132 37 n.d. n.d.
11 374037 n.d. n.d.
MAIDS中值6370*2,2**0,22 0,58***(3740-9986)n＝11(1,9-3,7) (0.08-0,52) (0,54-1,52)(25-75％)n＝11 n＝5 n＝5對照中值 62281 1,1 0,40 2,24(56539-82038) (1,0-1,3) (0,33-0,46) (1,93-2,47)(25-75％)n＝6n＝6n＝4 n＝4MAIDS相對于對照；*表示0＜0.001，**表示p＜0.01，***表示p＜0.05實施例2cAMP誘導(dǎo)的MAIDS T細(xì)胞功能障礙是由于隨著COX-2水平升高，CD11b陽性細(xì)胞的PGE2產(chǎn)量提高提高的MAIDS的PGE2產(chǎn)量混合淋巴結(jié)細(xì)胞群體分離自MAIDS感染的小鼠和對照小鼠，并在體外培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后測定培養(yǎng)上清液中的PGE2分泌水平，顯示MAIDS感染的細(xì)胞比對照細(xì)胞多分泌7-8倍的PGE2。
PGE2生產(chǎn)的抑制恢復(fù)了MAIDS的T細(xì)胞增殖然后，用抗-CD3抗體激活混合淋巴結(jié)細(xì)胞，以誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，72小時后檢測[3H]-胸苷摻入。來自MAIDS感染小鼠的細(xì)胞的增殖只有未感染細(xì)胞的T細(xì)胞增殖的10-20％。然而，當(dāng)向培養(yǎng)液中加入吲哚美辛抑制混合培養(yǎng)物產(chǎn)生PGE2時，5只MAIDS感染小鼠的細(xì)胞增殖顯著提高到相當(dāng)于對照小鼠的水平(圖6)。觀察另外10只MAIDS感染的小鼠(表6)，吲哚美辛對混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物T細(xì)胞增殖的影響非常顯著(p＜0.01)。相反，用吲哚美辛處理對照培養(yǎng)物不改變增殖。
在MAIDS感染小鼠的淋巴結(jié)中，COX-2高水平表達(dá)組成型表達(dá)的COX-1是產(chǎn)生PGE2的環(huán)加氧酶活性的正常來源。然而，在MAIDS小鼠中未發(fā)現(xiàn)COX-1增多，這能說明PGE2水平提高(數(shù)據(jù)未顯示)。COX-2的表達(dá)通常只限于腦/腦過程、關(guān)節(jié)炎滑液和組織損傷部位。在淋巴結(jié)或淋巴細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)COX-2，如圖8中對照淋巴細(xì)胞所示(上圖)。我們意外地發(fā)現(xiàn)，來自MAIDS感染小鼠的粗淋巴結(jié)細(xì)胞表達(dá)高水平的COX-2(圖8，下圖)。此外，從MAIDS淋巴結(jié)正選擇的CD4+和CD8+T細(xì)胞以及B細(xì)胞含有高水平的COX-2。相反，負(fù)選擇的CD11b-細(xì)胞只含低水平的COX-2。
通過流式細(xì)胞術(shù)觀察來自MAIDS感染小鼠和對照小鼠的CD4+和CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞(B220標(biāo)記)，顯然在T或B細(xì)胞上一般不表達(dá)CD11b標(biāo)記。然而，來自MAIDS感染小鼠的CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞的不同級分是CD11b明亮的(門控標(biāo)記的R1)，另一組CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞是CD11b暗淡的(門控標(biāo)記的R2)，表明它們具有顯著但較低的CD11b表達(dá)水平。因此，MAIDS感染的CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群分別是CD11b明亮和暗淡的，而大多數(shù)B細(xì)胞為陽性。結(jié)合CD11b+細(xì)胞而不是CD11b-細(xì)胞表達(dá)COX-2的事實，表明來自MAIDS感染小鼠的淋巴結(jié)中B細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)COX-2。
通過免疫組織化學(xué)觀察來自MAIDS感染小鼠的完整淋巴結(jié)，很明顯總體結(jié)構(gòu)改變，與對照小鼠相比，MAIDS(感染后19周)中失去了生發(fā)中心(圖10，c與a)。在較高放大倍數(shù)下，COX-2免疫染色的玻片顯示，對照動物的淋巴結(jié)只是巨噬細(xì)胞的攝入物質(zhì)在HRP染色后呈褐色(假陽性“可染色”體，圖10b)，MAIDS的大多數(shù)淋巴結(jié)細(xì)胞為COX-2染色陽性(圖10d)。
表6小鼠 培養(yǎng)基 吲哚美辛 抗-CD3吲哚美辛n/抗-CD31 13041412 6245 93812 10821129 8019 479263 209 265918 13454 236 3358938 115795 47154317 6591 85456 1799ND 2932 ND7 3051ND 7436 ND8 1668ND 3594 196249 839 2363 7885 3183010 34137316 8777 42244中值 14861412 7013 15601**(25-75％) (839- (335-4317) (3594-8019) (8963-37037)3051) n＝7 n＝10 n＝8n＝10吲哚美辛(Indo)相對于對照；**表p＜0.01實施例3HIV患者當(dāng)用非選擇性COX抑制劑體內(nèi)處理時顯示邊際效應(yīng)方法外周血CD3+T細(xì)胞從HIV患者中負(fù)選擇通過負(fù)選擇從正常健康供體的血細(xì)胞層純化外周血CD3+T細(xì)胞(Ullevaal大學(xué)醫(yī)院血液中心，Oslo，挪威)。簡言之，如下分離外周血單核細(xì)胞密度梯度(Lymphoprep，NycoMed，Oslo，挪威)離心，隨后利用直接以CD14和CD19抗體包被的單分散性磁珠和以CD56抗體包被的大鼠抗小鼠IgG珠和磁鐵負(fù)選擇。磁珠均購自Dynal(Oslo，挪威，目錄號分別為111.12，111.04，110.11)，而抗-CD56抗體購自Pharmingen(San Diego，CA，目錄號31660.d)。所有步驟都在4℃下進(jìn)行。細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞術(shù)分析，顯示含有90％以上的CD3+細(xì)胞。
利用HIV患者T細(xì)胞的增殖測定通過在平底96孔微孔板中以100μl體積溫育0.75×106CD3+T細(xì)胞/ml進(jìn)行增殖測定。以1∶1的細(xì)胞∶磁珠比加入綿羊抗小鼠IgG(Dynal，目錄號110.02)包被的單分散性磁珠，隨后加入終稀釋度為1∶125000的抗-CD3(克隆SpvT3b)，實現(xiàn)激活。開始時仔細(xì)滴定抗體的最佳濃度，始終以幾個不同的抗體稀釋度進(jìn)行平行實驗。溫育細(xì)胞72小時，其中后16小時含有[3H]-胸苷，分析其增殖。洗滌細(xì)胞，收集到玻璃濾器上，隨后通過β-閃爍計數(shù)分析。需要時，加入cAMP類似物，30分鐘后加入抗-CD3抗體激活。8-CPT-cAMP購自Sigma(St.Louis，MO)。
實驗正在進(jìn)行中的II期臨床試驗用于檢測非選擇性COX抑制劑(吲哚美辛)短期治療對HIV感染患者T細(xì)胞代用品參數(shù)的免疫刺激作用。根據(jù)獲準(zhǔn)的方案，患者接受50mg吲哚美辛，每日3次(總劑量150mg/d)，共2周，于第0、14、28天(停止后2周)采樣。然而，由于副作用如上腹部疼痛和消化不良，以及最初患者停止研究，該劑量不得不削減為25mg吲哚美辛，每日3次(總劑量75mg/d)。圖11顯示如今已完成研究的3名患者(患者1-3)的T細(xì)胞免疫功能(測定為激活后的增殖)。上圖顯示開始時(0天)、完成吲哚美辛治療時(14天)和2周后(28天)T細(xì)胞激活后的增殖水平。如所見，患者1和2通過體內(nèi)施用非選擇性COX拮抗劑未提高其免疫功能。然而在患者3，T細(xì)胞反應(yīng)提高約2.5倍，在停用吲哚美辛后持續(xù)高達(dá)2周。圖11b下圖顯示在細(xì)胞培養(yǎng)物中與PKA-I選擇性cAMP拮抗劑Rp-8-Br-cAMPS體外溫育后的T細(xì)胞增殖。根據(jù)拮抗劑引起的增殖逆轉(zhuǎn)，cAMP介導(dǎo)的T細(xì)胞功能障礙程度十分明顯(比較上圖與下圖；在所有時間點，患者1和3的增殖約提高2倍，而患者2無影響)。從圖11可以清楚地看出，吲哚美辛沒有確定的作用，這可能是由于缺乏COX-2選擇性以及副作用引起的劑量限制。
實施例4HIV患者在體內(nèi)施用非選擇性COX抑制劑后顯示邊際效應(yīng)(實施例3的實驗的繼續(xù))方法使用的方法如實施例3所述。
實驗圖12顯示來自于7名正在進(jìn)行II期臨床試驗(實施例3的繼續(xù))的患者的結(jié)果，他們除三聯(lián)治療外，還口服25mg吲哚美辛，每日3次，共14天。患者1-3對應(yīng)于實施例3所述。施用吲哚美辛的問題是如上(實施例3)所述的副作用，這使劑量限于25mg，每日3次。在此許可劑量，該非選擇性COX抑制劑的作用處于邊緣。治療14天后，7名患者中只有2名具有明顯增強的T細(xì)胞免疫功能(以T細(xì)胞激活后的增殖測定)，而一名患者免疫功能降低，4名患者改變較小。停用吲哚美辛2周后，7名患者中有5名免疫反應(yīng)性比第0天時提高。然而，只有2名患者T細(xì)胞增殖提高2倍以上。
實施例5COX-2抑制劑提高體外MAIDS T細(xì)胞的免疫功能方法增殖測定中使用的方法如實施例1所述。PGE2測定如實施例1所述。
實驗增殖測定混合淋巴結(jié)細(xì)胞從感染17周后的MAIDS小鼠中分離。用抗-CD3抗體激活細(xì)胞，以誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，72小時后測定[3H]-胸苷摻入，作為免疫功能的量度。MAIDS感染小鼠的細(xì)胞增殖只是未感染T細(xì)胞增殖的5-20％(MAIDS細(xì)胞為2000-12000cpm，來自未感染小鼠的細(xì)胞平均為55000cpm)。然而，當(dāng)向培養(yǎng)液中加入羅非考昔(圖13)和賽樂考昔(圖14)時，MAIDS感染小鼠的細(xì)胞增殖以濃度依賴的方式提高2-3倍。相反，用羅非考昔或賽樂考昔處理未感染小鼠的對照培養(yǎng)物不能提高增殖(在COX-2抑制劑存在下提高0.8-1.0倍，即沒有提高，未顯示)。對于來自MAIDS小鼠的T細(xì)胞，產(chǎn)生半數(shù)最大作用(ED50)的羅非考昔和賽樂考昔濃度是，羅非考昔約0.01μM，賽樂考昔0.03μM。亞微摩爾濃度即有效的事實清楚地表明，觀察到的免疫應(yīng)答增強通過COX-2而不是COX-1的抑制介導(dǎo)，COX-1只在微摩爾濃度羅非考昔和賽樂考昔時受抑制(數(shù)值來自于Warner等人，1999，PNAS USA，96，p7563-7568)。因此，羅非考昔和賽樂考昔引起的受抑制T細(xì)胞免疫功能的逆轉(zhuǎn)通過抑制COX-2使混合培養(yǎng)物的PGE2產(chǎn)量降低，因而T細(xì)胞cAMP水平降低。
PGE2產(chǎn)生也分析了COX-2抑制劑羅非考昔和賽樂考昔對PGE2水平的影響。從圖15可以看出，來自MAIDS小鼠的粗淋巴結(jié)細(xì)胞比來自健康小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞多分泌5-6倍的PGE2(見圖6)。此外，感染小鼠中LPS引起的PGE2水平升高8-10倍，未感染小鼠約2倍。當(dāng)細(xì)胞在COX-2抑制劑羅非考昔或賽樂考昔存在下溫育時，MAIDS淋巴結(jié)細(xì)胞的PGE2分泌類似于未感染的細(xì)胞。吲哚美辛的作用(比較圖7中的增殖)作為對照。
實施例6COX-2抑制劑提高體內(nèi)MAIDS T細(xì)胞的免疫功能方法與實驗感染的小鼠(感染后17周)用對應(yīng)于人用推薦劑量(考慮嚙齒動物的清除率高7倍)的羅非考昔經(jīng)口(即口服)處理一周。MAIDS小鼠一般發(fā)展為免疫增生綜合征，伴淋巴結(jié)及脾增大。據(jù)此，未處理的感染動物平均脾重1.3g，集合淋巴結(jié)平均重1.7g。相反，接受羅非考昔7天的MAIDS小鼠平均脾重0.8g，集合淋巴結(jié)平均重0.3g，表明淋巴增生逆轉(zhuǎn)。
結(jié)果示于圖16中。當(dāng)測定來自處理和未處理的感染小鼠的粗淋巴結(jié)細(xì)胞的T細(xì)胞免疫功能時，顯然未處理的感染動物具有2000-10000cpm(平均7300cpm)的抗-CD3誘導(dǎo)的增殖，接受羅非考昔1周的感染小鼠對抗-CD3的T細(xì)胞反應(yīng)比未處理的感染小鼠提高2.7-5.6倍。此外還證明，在Rp-8-Br-cAMPS存在下，未處理的感染小鼠其抗-CD3誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖增強，在羅非考昔處理的小鼠中，沒有這種2-3倍的影響，表明體內(nèi)羅非考昔處理降低PGE2水平，并逆轉(zhuǎn)cAMP-介導(dǎo)的T細(xì)胞功能抑制。
實施例7用羅非考昔或賽樂考昔體內(nèi)處理MAIDS小鼠提高了對抗-CD3的T細(xì)胞反應(yīng)和免疫應(yīng)答方法與實驗感染小鼠用相當(dāng)于人用推薦劑量的羅非考昔和賽樂考昔處理(考慮嚙齒動物清除率高7倍，分別為3mg/kg/d和20mg/kg/d)。腸胃外給藥通過腹膜內(nèi)注射以脂肪乳劑配制的COX-2抑制劑實現(xiàn)。結(jié)果示于圖17中。
在感染18-20天后測定來自處理和未處理的感染小鼠的粗淋巴結(jié)細(xì)胞的T細(xì)胞免疫功能時，顯然未處理的感染動物具有約10000cpm的抗-CD3誘導(dǎo)的增殖，而接受羅非考昔18-20天的感染小鼠對抗-CD3的T細(xì)胞反應(yīng)比未處理的感染小鼠約提高2倍。類似地，賽樂考昔使大多數(shù)注射小鼠的細(xì)胞的免疫應(yīng)答提高到約為未處理、未感染小鼠的3倍。
實施例8美洛昔康體內(nèi)處理MAIDS小鼠提高T細(xì)胞免疫功能方法與實驗感染和健康小鼠用2.8mg/kg/d美洛昔康處理，考慮到嚙齒動物的清除率高7倍，該劑量相當(dāng)于人用的推薦劑量。腸胃外給藥通過皮下植入充滿水溶性吲哚美辛注射化合物的滲透泵實現(xiàn)。估測T細(xì)胞功能，結(jié)果示于圖18中。
在處理2周后測定來自處理和對照(PBS)處理的感染小鼠的粗淋巴結(jié)細(xì)胞的T細(xì)胞免疫功能時，顯然PBS處理的感染動物具有約500cpm的抗-CD3誘導(dǎo)的增殖，而接受美洛昔康14天的感染小鼠對抗-CD3的T細(xì)胞應(yīng)答比只接受PBS的感染小鼠顯著提高(圖18a，10倍以上，p＜0.05)。
當(dāng)在3天體外T細(xì)胞增殖測定中向細(xì)胞培養(yǎng)物中補加美洛昔康以阻止美洛昔康體內(nèi)抑制緩解，從而阻止COX-2的重新激活時，美洛昔康處理組的免疫應(yīng)答比不加美洛昔康組高2倍(p＝0.005)，與體內(nèi)接受PBS的MAIDS小鼠相比，作用也很顯著(圖18b，p＜0.05)。
相反，已經(jīng)證明，當(dāng)向抗-CD3刺激的混合淋巴結(jié)體外培養(yǎng)物中加入I型PKA選擇性cAMP拮抗劑Rp-8-Br-cAMPS時，只有體內(nèi)接受PBS的MAIDS小鼠的免疫應(yīng)答提高，而美洛昔康處理小鼠不提高(圖18c)。cAMP拮抗劑在美洛昔康處理的MAIDS小鼠中不起作用這一事實表明，體內(nèi)美洛昔康處理降低或消除了cAMP誘發(fā)的MAIDS的免疫缺陷，并且恢復(fù)了免疫功能。
權(quán)利要求
1.COX-2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防特征在于免疫缺陷的疾病的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中該疾病是一種病毒誘發(fā)的免疫缺陷病。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中該疾病是多種常見免疫缺陷，或起源于逆轉(zhuǎn)錄病毒，優(yōu)選地HIV或相關(guān)病毒感染，或者是AIDS或有關(guān)疾病。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的用途，其中該藥物適用于對人類或?qū)櫸锘蜣r(nóng)畜施用。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的用途，其中根據(jù)IC80的WHMA測定，該COX-2抑制劑的COX-1∶COX-2選擇性比＞5，優(yōu)選地＞50。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的用途，其中該COX-2抑制劑是一種甲基磺酰胺醚、甲基磺酰胺硫醚或二芳基雜環(huán)。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的用途，其中該COX-2抑制劑是一種通式A的化合物或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽 其中X代表氧或硫原子或烷基，優(yōu)選地是-CH2-基；R1代表環(huán)烷基或芳基，它任選地可被一個或多個基團(tuán)或原子取代，優(yōu)選地被一個或多個鹵素原子取代；和R2、R3、R4和R5獨立地代表氫原子、硝基或?；蛲榛?，它們可被一個或多個基團(tuán)或原子取代，或者R2和R3、R3和R4或R4和R5與間插碳原子一起形成環(huán)戊酮基
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其中X是氧原子。
9.如權(quán)利要求7或8所述的用途，其中R1是芳基或用一個或多個氟原子取代的芳基，或環(huán)烷基。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項所述的用途，其中R2和R3是氫原子，R4是-NO2或-COCH3基團(tuán)。
11.如權(quán)利要求7-10中任一項所述的用途，其中R2是氫原子，R3和R4一起形成環(huán)戊酮基。
12.如權(quán)利要求7-11中任一項所述的用途，其中該COX-2抑制劑是flosulide、NS-398、尼美舒利、FK 3311或L-745 337。
13.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的用途，其中該COX-2抑制劑是一種通式B的化合物或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽 其中Y代表環(huán)基，優(yōu)選的是噁唑基、異噁唑基、噻吩基、二氫呋喃基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、咪唑基、異噻唑基、環(huán)戊烯基、苯基或吡啶基；n是0-3的整數(shù)；m是0-4的整數(shù)；R6代表酮環(huán)基、環(huán)烷基或芳基，該基團(tuán)可任選地被一個或多個基團(tuán)或原子取代，優(yōu)選地被一個或多個鹵素原子取代；R7各自獨立地代表可以是任一種功能基團(tuán)的取代基，優(yōu)選的是氫或鹵素原子，或烷基，該烷基可以被一個或多個基團(tuán)或原子取代；R8代表烷基；R9代表鹵素原子；和R10代表氫原子或烷基，任選地可被一個或多個基團(tuán)或原子取代，優(yōu)選地被一個酰基取代。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中R8是-NH2或-CH3。
15.如權(quán)利要求13或14所述的用途，其中Y是吡唑基、呋喃基或噻吩基。
16.如權(quán)利要求13-15中任一項所述的用途，其中R6是芳基，任選地用一個或多個氟原子取代。
17.如權(quán)利要求13-16中任一項所述的用途，其中n是1或2。
18.如權(quán)利要求13-17中任一項所述的用途，其中R7是溴原子、?；蛉〈耐榛?。
19.如權(quán)利要求13-18中任一項所述的用途，其中該COX-2抑制劑是賽樂考昔、羅非考昔、DuP-697、SC-58125、DFP、DFU、CGP 28232或MF三環(huán)。
20.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的用途，其中該COX-2抑制劑是一種非類固醇類抗炎藥(NSAID)衍生物。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的用途，其中該COX-2抑制劑是異氟磷、L-745337、羅非考昔、NS 398、SC 58125、依托度酸、美洛昔康、賽樂考昔或尼美舒利。
22.如權(quán)利要求21所述的用途，其中該COX-2抑制劑是羅非考昔。
23.如權(quán)利要求21所述的用途，其中該COX-2抑制劑是賽樂考昔。
24.如權(quán)利要求21所述的用途，其中該COX-2抑制劑是美洛昔康。
25.一種藥用組合物，其含有如權(quán)利要求1-24中任一項所述的COX-2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽，和藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
26.如權(quán)利要求25所述的藥用組合物，其還含有一種或多種其它COX-2抑制劑、其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽，和/或一種或多種其它活性成分。
27.如權(quán)利要求25或26所述的藥用組合物，用作藥物，優(yōu)選地用于治療或預(yù)防如權(quán)利要求1-4中任一項所述的疾病。
28.一種產(chǎn)品，其含有一種如權(quán)利要求1-24中任一項所述的COX-2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽，和一種或多種其它COX-2抑制劑、其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽，和/或一種或多種其它活性成分，作為組合制劑，在治療或預(yù)防如權(quán)利要求1-4中任一項所述的疾病時同時、分開或連續(xù)使用。
29.如權(quán)利要求25或26所述的藥用組合物在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防如權(quán)利要求1-4中任一項所述疾病的藥物中的用途。
30.一種治療或預(yù)防人類或非人類動物中如權(quán)利要求1-4中任一項所述疾病的方法，其中對該動物施用一種如權(quán)利要求1-24中任一項所述的COX-2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽，或施用一種如權(quán)利要求25或26所述的藥用組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防特征在于免疫缺陷的疾病(如HIV)的方法，其中對患者施用一種COX－2抑制劑或其衍生物或藥學(xué)可接受的鹽，優(yōu)選的是異氟磷、L－745337、羅非考昔、NS 398、SC 58125、依托度酸、美洛昔康、賽樂考昔、flusolide或尼美舒利，和含有它們的組合物和產(chǎn)品，或它們在生產(chǎn)藥物及治療中的用途。
文檔編號A61P31/12GK1561204SQ01814319
公開日2005年1月5日 申請日期2001年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月20日
發(fā)明者K·塔斯肯, M·穆臣, S·拉穆尼-皮埃特, E·M·安達(dá)爾, P·奧克魯斯特, S·S·弗羅蘭德, C·C·約翰遜, V·漢森, J·克萊文尼斯 申請人:勞拉斯有限公司