專利名稱：兩性霉素b結(jié)構(gòu)化乳劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低毒性兩性霉素B組合物，特別涉及適用于非腸道給藥的在水包油型結(jié)構(gòu)化乳劑中低毒的兩性霉素B組合物。
背景技術(shù)：
兩性霉素B是由結(jié)節(jié)鏈霉素菌制得的大環(huán)多烯烴抗生素，其對真菌類、酵母菌類以及一些原生動物類具有廣譜的效果。
用于靜內(nèi)給藥的兩性霉素B起初是以常規(guī)的膠態(tài)形式存在。即使是發(fā)展了大約35年后的今天，由于其可靠地治療效力，因此仍廣泛地用作重要的抗真菌劑。考慮到報道的用于臨床的許多不良影響，其耐藥性低。幾乎在所有靜內(nèi)接受兩性霉素B的患者中都存在腎臟毒副作用。其它不良影響包括高血壓、低血壓、心律失常(包括心室顫動)、心搏停止、肝病。小管損傷和腎小球損傷都會發(fā)生，存在腎功能永久性損傷的危險。由于在制備兩性霉素B溶液時使用合成表面活性劑去氧膽酸鈉，所以兩性霉素B會刺激靜脈內(nèi)皮，可能在注射位置導(dǎo)致疼痛和血栓性靜脈炎。
為了降低毒性作用，在不同藥物傳遞體系中制成了兩性霉素B，所述體系如類脂復(fù)合體、脂質(zhì)體和乳劑。與以游離形式使用的藥物相比，這些組合物具有更大的效力、更低的毒性。兩性霉素B的類脂復(fù)合體和脂質(zhì)體制劑在市場上都能得到，它們在世界上得到了多個國家的批準(zhǔn)。
基于類脂復(fù)合體和脂質(zhì)體的類脂制劑的主要缺點在于其高昂的治療成本。兩性霉素B是一種親脂性藥物，它與甾醇結(jié)合，插入類脂雙分子層中，因此兩性霉素B特別適合與類質(zhì)傳遞體系一起使用。
人們在實驗室中試圖制備基于類脂乳劑形式的兩性霉素B，該藥物在更低治療成本下具有毒性低的優(yōu)點。
Volker Heinemann等人假定(Antimicrobial agents andchemotherapy1997，41(4)；728-732)類脂乳劑降低低聚體兩性霉素B量，由此減少兩性霉素B與人類細(xì)胞膜膽固醇的相互作用。剩下的單體兩性霉素B仍保持其與真菌細(xì)胞膜的麥角甾醇結(jié)合的可能性。
據(jù)Kirsh R，Goldstein R，Tarloff J等人報道(J.Infect.Dis.1998，158；1065-1070)，通過與脂肪乳劑混合制備的兩性霉素B的類脂乳劑組合物具有不失抗真菌活性下的低毒性。但是，人們發(fā)現(xiàn)這類含有兩性霉素B的類脂乳劑的物理穩(wěn)定性較差。
據(jù)Moreau P等人報道(J.Antimicro.Chemother.1992，30；535-541)，利用與兩性霉素B注射液混合的脂肪乳劑治療的患者似乎能夠顯著地降低輸注毒性和腎功能不良。
在歐洲和美國，使用與非腸道營養(yǎng)脂肪乳劑混合的兩性霉素B的頻率不斷增加。
現(xiàn)有技術(shù)中制備兩性霉素B乳劑的方法描述如下美國專利5364632(1994)/日本專利JP2290809(1990)
在該專利中，制備乳劑的方法以下述典型的實施例描述
通過槽內(nèi)超聲波降解(15分鐘)，將兩性霉素B溶解在甲醇(0.8mg/ml)中。將磷脂E-80(主要含有80％卵磷脂和8％磷脂酰乙醇胺)溶解在氯仿中?；旌线@兩種溶液，經(jīng)包含玻璃纖維預(yù)濾器和0.45μ再生纖維膜過濾器(RC5)(GF92)的組合過濾體系過濾，除去熱原質(zhì)和聚集體。在40℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將得到的清亮類脂乳液以薄膜形式沉積在圓底燒瓶的壁上。經(jīng)0.22μMillipore過濾器，過濾poloxamer、去氧膽酸鈉和丙三醇，將其注入到燒瓶中，超聲波降解分散液，直至得到均質(zhì)脂質(zhì)體。
在70℃下加熱經(jīng)0.22μMillipore過濾器過濾且含有α-生育酚的MCT(中鏈丙三醇三酸酯)油，然后混入加熱至45℃的脂質(zhì)體混合物中，在此通過磁性攪拌其分散。
在保持相同溫度的條件下，利用高剪切混合器Polytron進行乳化。迅速冷卻所得粗乳液。利用兩步均質(zhì)器，得到澄清的單分散乳液。
最后，調(diào)節(jié)乳液的pH，經(jīng)0.45μMillipore過濾器過濾，除去在乳化和均質(zhì)過程中生成的粗液滴碎屑。
所有操作過程均在無菌條件下完成。
在該實施例中最終乳液不同成分的相對量及配方中給出的范圍如下
兩性霉素B0.075％(0.015-0.15％)，MCT油20％(3-50％)，磷脂E800.5％(0.5-20％)，poloxamer2％(0.3-10％)，去氧膽酸鈉1％(0.5-5％)，丙三醇2.25％，α-生育酚0.02％和兩次蒸餾水200％。美國專利5364632(1994)/日本專利JP2290809(1990)方法的缺陷
i.由于兩性霉素B在甲醇中的溶解度低，所以溶解所需量的兩性霉素B需要大量的甲醇。這就限制了最終組合物中的藥物含量。
ii.在該方法中，必須要利用水相首先形成藥物、兩性霉素B和磷脂薄膜，熱后再水解形成的薄膜。水相含有非離子乳化劑poloxamer、表面活性劑去氧膽酸鈉及丙三醇。
iii.采用的油相為含有α-生育酚的MCT油。通過向維持在45℃的水相中加入維持在70℃下的油相，制備乳液。這不能保證兩性霉素B保留在油相中。如果將其置于油相中，那么該方法沒有挖掘出降低兩性霉素B毒性的全部潛力。
iv.美國專利5364632(1994)方法的產(chǎn)品是在無菌條件下制造的。藥典中指明的優(yōu)選無菌化方法是在最后的容器中高壓滅菌產(chǎn)品。進一步地，由于兩性霉素B通常是通過靜脈內(nèi)路線給藥，最后無菌化是唯一優(yōu)選的方法，這種方法能給出更高的無菌可信性。
v.即使乳化產(chǎn)品對機械應(yīng)力很穩(wěn)定，但卻沒有研究其毒性，因此產(chǎn)品的毒性仍然未知。盡管如此，為了與兩性霉素B(Fungizone)進行比較，在Balb/c小鼠中進行了體內(nèi)比較研究，F(xiàn)ungizone是一種含有去氧膽酸鈉的商業(yè)兩性霉素B制劑。該研究表明，這種產(chǎn)品比Fungizone毒性低。
vi.通過降低藥物經(jīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)攝入，使用MCT油和poloxamer可增加藥物血漿濃度。在真菌感染情況下，需要將兩性霉素B分布于感染部位的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中。日本專利11-60491(1989)
這份日本專利描述了含有以乳劑形式存在的兩性霉素B的藥劑。乳劑包含
i)兩性霉素B(1至10mg/ml最終乳劑)。
ii)油相-油相由植物油、魚油和丙三醇三酯組成(1-50％，優(yōu)選5-30％)。所使用的油油旋豆油或蓖麻油
iii)乳化劑-所使用的乳化劑為磷脂。另外也可以使用非離子乳化劑。使用的磷脂如蛋黃磷脂、大豆磷脂或由這些物質(zhì)得到的氫化產(chǎn)品。也可以使用卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷酯酸、磷脂酰丙三醇。推薦量為1-5％(油成分重量)，優(yōu)選10-30％(油成分重量)；或1-10％w/v乳劑，優(yōu)選4-6％w/v乳劑。
非離子乳化劑也可被使用，如聚烷基二醇(mol.wt.1000-10000，優(yōu)選4000-6000)，或聚氧乙烯(或聚氧丙烯聚合物)(mol.wt.1000-20000，優(yōu)選2000-10000)，氫化蓖麻油聚氧烯烴衍生物，如氫化蓖麻油聚氧乙烯-20-醚、-40-醚、-100-醚，用量小于5％w/v，優(yōu)選小于1％w/v。還可使用兩種非離子乳化劑的組合。
iv)脂肪酸及其鹽(可藥用)-最高1％，優(yōu)選0.5％w/v。
v)穩(wěn)定劑，小于5％w/v，優(yōu)選小于1％w/v，包括
a)高分子聚合物質(zhì)，如人體白蛋白；乙烯基共聚物，如聚
乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇；脂肪胺。
b)明膠、羥基乙基淀粉；膽固醇類。
vi)等滲劑-小于5％w/v，優(yōu)選小于1％w/v。
vii)丙三醇或其單酯，如單油酸酯、單棕櫚酸酯。
viii)糖類，如單糖和二糖、山梨糖醇、木糖醇，小于5％w/v，優(yōu)選小于1％w/v。
ix)抗氧化劑，如生育酚，小于5％w/v，優(yōu)選小于1％w/v。
x)pH控制劑，如酸、堿和緩沖劑。
下述制備方法是過去的報道。該方法包括，首先形成油包水乳劑(w/o)，然后通過用水稀釋，將其轉(zhuǎn)變成水包油乳劑(o/w)。在該方法中，豆油、磷脂、兩性霉素B和一些水及其它添加劑(使用時)一起混合，根據(jù)需要加熱?；旌衔锶缓笤诟邏壕|(zhì)器中均質(zhì)。加入所需的更多量的水，將w/o乳劑轉(zhuǎn)變成o/w乳劑，在進行均質(zhì)。
在典型的實施例中，根據(jù)上述方法處理200g豆油、50g磷脂和2.5g兩性霉素B及750ml水。
在另一個實施例中，在上述組合物中摻入2.2％丙三醇組合物。
乳劑的平均液滴尺寸為0.1-0.2μ。將乳劑及其液滴在冷凍條件下穩(wěn)定多至10天。日本專利11-60491(1989)方法的缺陷是
正如人們所知，乳液制劑中的兩性霉素B比常規(guī)兩性霉素B制劑的毒性低。但由于日本專利11-60491(1989)中的乳劑制備方法，該專利制劑沒有挖掘出降低毒性至該乳劑概念的全部潛力。
i.由于由日本專利11-60491(1989)得到的乳劑的平均顆粒尺寸為0.1至0.2μ，不可能挖掘經(jīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)優(yōu)先攝入較大顆粒尺寸的顯著利益。鑒于大多數(shù)真菌感染發(fā)生在該位置，通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)優(yōu)先攝入兩性霉素B是需要的。
ii.在冷凍器中研究乳劑穩(wěn)定多達(dá)10天。
iii.大量添加劑被建議加入到乳液制劑中去，包括乳化支持劑，如脂肪胺，高分子量聚合物，非離子天然表面活性劑，膽固醇類，糖類，如單糖和二糖，抗氧化劑。
iv.制造產(chǎn)品的無菌化步驟沒有指明。
日本專利4-173736(1992)描述了含有0.005％至5％兩性霉素B、0.5％至25％磷脂(優(yōu)選卵磷脂)的產(chǎn)品。該組合物的平均顆粒直徑為100nm。該產(chǎn)品不是乳劑，不含有任何油相。
美國專利5389373(1995)描述了制備溶解性差的藥物水包油(o/w)乳劑的方法。該方法包括將兩性霉素B溶解在高或低pH水溶液中，將所得到的濃度不超過100μg/ml的溶液加入到乳液中，向乳液中加入適量酸、堿或緩沖液，調(diào)節(jié)產(chǎn)品pH至所需值。該美國專利5389373(1995)方法的缺陷
該方法的主要不足在于限制了加入到乳液中的低濃度兩性霉素B。在該方法中，兩性霉素B的濃度為100μg/ml數(shù)量級，因而需要注入對治療不利的更大體積的組合物。
在美國專利5534502(1996)中，利用酸和乙醇解晶兩性霉素B，然后再均勻地分散在類脂中，接著進行乳化。在該方法中，將兩性霉素B溶解在乙醇中是實質(zhì)性的，最優(yōu)選的乙醇量為400至600ml/gm兩性霉素B。該方法的主要不足在于兩性霉素B在酸性pH中不穩(wěn)定。
歐洲專利EP0700678(1996)描述了主要含有檸檬酸或其可藥用鹽及至少選自蛋氨酸、苯基丙氨酸、絲氨酸、組胺酸及其可藥用鹽中一種成分的類脂乳劑，條件是不得同時包含蛋氨酸和苯基丙氨酸。
同時使用檸檬酸和至少一種上述氨基酸的要求是實質(zhì)性的。根據(jù)該發(fā)明制備乳劑的方法描述如下
將磷脂和用于乳化的助劑(如油酸)溶解于適當(dāng)有機溶劑(如己烷)中，然后減壓蒸餾溶劑，得到類脂膜。向所得類脂膜中加入油成分和水，通過振動劇烈攪拌初步乳化混合物。利用常用乳化劑乳化得到的液體。乳化完成后，通過加入鹽酸或氫氧化鈉，將所得乳液的pH調(diào)節(jié)預(yù)先確定水平。然后向乳液中加入檸檬酸和氨基酸，得到液態(tài)乳劑。另外，通過向上一步驟制得的液態(tài)膜中加入油成分和檸檬酸水溶液，制備液態(tài)乳劑，再將所得混合物進行乳化步驟。歐洲專利EP0700678(1996)方法的缺陷
制備兩性霉素B乳劑的方法沒有詳細(xì)描述。兩性霉素B為所列舉的描述成“可制成類脂乳劑”的大約70種藥物中的一種。
i)制備類脂乳劑的方法涉及將磷脂溶解在適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑如己烷中。
ii)在該專利的實施例中，將氨基酸和檸檬酸加入到形成的類脂乳劑中，在60℃下通過褪色進行穩(wěn)定性研究。靜內(nèi)乳劑必須在高壓滅菌的無菌化溫度下保持穩(wěn)定。
iii)一個實施例中指明的無菌化方法是在60℃下加熱1小時，每隔24小時，該無菌化方法重復(fù)三次。該方法不適于制備靜內(nèi)注射劑。
本發(fā)明的主要目的在于開發(fā)用于非腸道給藥的兩性霉素B的制備方法，該藥劑毒性很低，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)方法中缺陷和不足。
該主要目的的主要部分在于開發(fā)一種利用油包覆兩性霉素B固體粉末并將包覆油的固體兩性霉素B粉末置于水包油乳液中的方法，條件是在整個制備過程(包括無菌化高壓滅菌)中，將摻入的兩性霉素B保留在油相中，直至其貨架期或使用。
該主要目的的另一部分在于開發(fā)一種制備這類結(jié)構(gòu)化水包油乳劑的方法，所述結(jié)構(gòu)化水包油乳劑在乳液中平均油滴控制在最佳的范圍，以致其優(yōu)先分布于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中，得到低血漿濃度。由此，為了注射，該乳劑起著載有含包覆油的兩性霉素B的油珠的水合外層相乳劑的作用。
該主要目的的另外部分在于開發(fā)一種制備這類兩性霉素B乳劑的方法，該乳劑只需要最少的添加劑，所述添加劑是用于制備油包水乳劑最基本的添加劑。發(fā)明概述
由此，本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，該組合物在小鼠中的LD50至少為400mg/kg，所述組合物包括
a)選自植物油，如豆油、蓖麻油、紅花油的油相(最高30％w/v組合物)；
b)分散于油相中的兩性霉素B(0.05％至1％w/v組合物)；
c)水相；
d)選自溶解于水中的化合物，如丙三醇、甘露醇、葡萄糖的張力調(diào)節(jié)劑；以及
e)分散于水相中的乳化劑，如天然磷脂(最高3％w/v組合物)。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及制備結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物的方法，該組合物在小鼠中的LD50至少為400mg/kg，所述方法包括將兩性霉素B分散在油相中，通過將張力調(diào)節(jié)劑溶解在水中制備水相，將乳化劑分散在水相中，調(diào)節(jié)水相pH至8-11，在攪拌條件下將油相加入到水相中，得到粗的結(jié)構(gòu)化乳劑，使粗的結(jié)構(gòu)化乳劑均質(zhì)至顆粒尺寸低于2微米，在氮氣氣氛下，將均質(zhì)過的結(jié)構(gòu)化乳劑過濾至玻璃容器中，關(guān)閉玻璃容器，密封關(guān)閉的玻璃容器，通過高壓滅菌無菌化封閉的填充容器。這些操作步驟的順序非常重要。通過毒性研究表明，改變操作步驟的順序會改變?nèi)閯┑慕Y(jié)構(gòu)。
本發(fā)明方法的特征在于卵磷脂分散在水相中，而兩性霉素B粉末分散在油相中，因此，產(chǎn)物是指結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及由上述方法制備的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B的非腸道組合物。
通過本發(fā)明方法制備水包油型結(jié)構(gòu)化乳劑形式的兩性霉素B，可獲得毒性顯著降低，且可保證在不改變抗真菌活性的前提下的組合物無菌化處理。毒性較低的本發(fā)明組合物可提供在治療一些感染中增加劑量水平的范圍。
本發(fā)明結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物毒性較低，其特征在于
a)在小鼠單劑量毒性研究中的LD50至少為400mg/kg體重，在小鼠重復(fù)劑量毒性研究中的LD50至少為40mg/kg體重；
b)在大鼠單劑量毒性研究中的LD50至少為150mg/kg體重；
c)與含有去氧膽酸鈉的常規(guī)制劑相比，其對人紅血球的溶血作用低至少20倍；
d)在小鼠單劑量研究中，與含有去氧膽酸鈉的常規(guī)制劑相比，其在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中優(yōu)先組織分布，且至少兩倍于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)器官的t1/2；
e)在小鼠中注射后，沒有心臟毒力的毒性征兆，如嚴(yán)重性呼吸困難、局部刺激、腹部痛苦和擾動。發(fā)明實施方案祥述
本發(fā)明結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物中兩性霉素B含量范圍很廣泛，為0.05％至1％w/v組合物，優(yōu)選0.1至0.5％w/v組合物，特別地，可為大約0.5％或大約0.25％w/v組合物。
在本發(fā)明方法中，兩性霉素B在乳化前分散于油相中。兩性霉素B如此使用或在分散于油相前微粉化。油相含量范圍很廣，可最高30％w/v組合物，優(yōu)選5至25％w/v，更優(yōu)選10至20％w/v，特別是大約10％w/v或大約20％w/v。所使用的典型油相為植物油，可以是豆油、芝麻油、棉子油、紅花油、向日葵油、花生油、玉米油、蓖麻油或橄欖油中的一種植物油。優(yōu)選的植物油是豆油。
在本發(fā)明中，乳化劑溶解在水相中。適宜的乳化劑包括天然存在的磷脂類和改性磷脂。優(yōu)選的乳化劑為天然存在的磷脂類，如卵磷脂和大豆磷脂。本發(fā)明使用的乳化劑可以包括兩種或多種上述乳化劑的混合物。由選的天然磷脂為純化卵磷脂。
本發(fā)明結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物是在pH范圍6.0-8.5下形成的。在本發(fā)明的方法中，利用堿如氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液，調(diào)節(jié)水相pH至8&11，這樣高壓滅菌后的本發(fā)明組合物的pH就保持在6-8.5的范圍。
通過摻入張力調(diào)節(jié)劑，如丙三醇、山梨糖醇、葡萄糖或其組合，本發(fā)明結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物在與血液等滲條件下制得。優(yōu)選的張力調(diào)節(jié)劑是丙三醇，丙三醇的含量為2-3％w/v組合物，所使用的丙三醇優(yōu)選含量大約為2.25％w/v組合物。
本發(fā)明結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物是根據(jù)控制條件下的制備步驟制得的特定無菌水包油乳劑，最后利用高壓滅菌進行無菌化處理。當(dāng)乳化步驟在較高溫度下進行時，水箱或油相或兩相保持在最高75℃下。
本發(fā)明組合物的平均粒徑精確地保持在最高2μ，這樣可使兩性霉素B優(yōu)先分布在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中，從而得到低血漿濃度。
本發(fā)明通過典型的實施例描述，其中結(jié)構(gòu)化乳劑包括兩性霉素B(0.5％w/v)；油相豆油(20％w/v)；乳化劑純化卵磷脂(1.2％w/v)；張力調(diào)節(jié)劑丙三醇(2.25％w/v)和水(適量至100％(體積))。通過下述方法制備將兩性霉素B分散在豆油中；通過向水中加入丙三醇制備水相；接著將純化卵磷脂分散在水相中；調(diào)節(jié)水相pH至10.8；在攪拌條件下，向水相中加入含有兩性霉素B的豆油，得到粗的乳劑；均化粗的乳劑至粒徑低于2微米；通過2微米過濾膜過濾，在氮氣氣氛下加入到玻璃容器中，關(guān)閉玻璃容器，封閉關(guān)閉的玻璃容器，通過高壓滅菌對封閉的填充容器進行無菌化處理。
本發(fā)明水包油型乳劑結(jié)構(gòu)化的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物的結(jié)構(gòu)化乳劑毒性低、粒徑小，適合于非腸道使用。因為產(chǎn)品在不顯著損失兩性霉素B活性且不破壞乳劑穩(wěn)定性的條件下，通過最終高壓滅菌處理，所以本發(fā)明組合物的無菌化得到了保障。本發(fā)明組合物使用容易，產(chǎn)品可利用5％葡萄糖注射液或鹽水稀釋，得到非腸道使用所需要的濃度。本發(fā)明組合物也具有較長的貨架期，適于穩(wěn)定的市售產(chǎn)品。
我們研究了由本發(fā)明方法制備的乳劑的毒性情況，其中以添加兩性霉素B和純化卵磷脂的模式為變量。它們描述在以下表給出的實施例中。
在本發(fā)明方法中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩性霉素B懸浮在水相中時，得到的產(chǎn)品注射到小鼠中去，則會產(chǎn)生心臟毒性征兆，如嚴(yán)重性呼吸困難、局部刺激、腹部痛苦和擾動。但是，當(dāng)兩性霉素B懸浮在油相中時，則觀察不到這些征兆。這可能是因為乳劑油滴和Kuppfer細(xì)胞引起的油罐效應(yīng)(reservoir effect)。這種低釋放速度會導(dǎo)致注射乳劑后血漿中存在單體兩性霉素B，從而降低毒性(參見Antimicrobialagents and chemotherapy，1997；vol.41(4)Pg.728-732)。
我們也發(fā)現(xiàn)，通過在油相中加入乳化劑卵磷脂，也會產(chǎn)生上述心臟毒性征兆。在進一步實驗后，通過向水相中加入卵磷脂，克服了這個問題。這些過程研究描述在實施例I至實施例VI中。實施例II和實施例III是實施例I的改變形式，也屬于本發(fā)明；而實施例IV、V和VI不是本發(fā)明。實施例VII描述了對人紅血球細(xì)胞的體外毒性。實施例VIII和實施例XI描述了小鼠、大鼠和狗的毒性研究。實施例IX描述了兔的藥物動力學(xué)研究，實施例X描述了小鼠中的器官分布。
兩性霉素B分散在油相及卵磷脂分散在水相中的觀察結(jié)果表明，毒性很低的乳劑在油滴與兩性霉性B之間具有很強的相互作用。因此，兩性霉性B乳劑可被認(rèn)為是單體形式的兩性霉性B的儲罐，而且由于制劑穩(wěn)定性高，所以只要少量的游離兩性霉性就可以持續(xù)釋放。單體形式的兩性霉性B可以穩(wěn)定地與真菌細(xì)胞麥角固醇結(jié)合，而對宿主哺乳動物細(xì)胞的膽固醇惰性，因此造成的毒性較低。在常規(guī)的兩性霉性B制劑中，游離兩性霉性B在血漿中的高釋放水平會導(dǎo)致循環(huán)中存在自身關(guān)聯(lián)的低聚體。這些低聚體與含有宿主細(xì)胞膜的膽固醇相互作用，從而導(dǎo)致較高的毒性。這就解釋了與常規(guī)制劑相比，本發(fā)明兩性霉性B乳劑毒性低的原理。血清中較低的峰值濃度和AUC值(實施例IX)及兩性霉性B在組織中相應(yīng)較快的沉積速度(實施例X-A)也解釋了本發(fā)明兩性霉性B乳劑毒性較低的原因。通過實施例VIII-A、VIII-B和VIII-C給出的結(jié)果，我們確信了本發(fā)明乳劑毒性低的事實。
這些毒性研究表明，盡管本發(fā)明產(chǎn)品結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B的非腸道組合物與日本專利11-60491(1989)類似，但是本發(fā)明產(chǎn)品由于制備方法不同，其具有生物毒性低的特征。
由于兩性霉性B注射后在血漿中釋放速度低，本發(fā)明方法得到的乳化產(chǎn)品易形成單體，而日本專利11-60491(1989)的方法卻得不到這樣的產(chǎn)品。由此，通過毒性研究，本發(fā)明的乳劑結(jié)構(gòu)不同于日本專利得到的產(chǎn)品，所以我們將本發(fā)明乳劑稱為結(jié)構(gòu)化乳劑。
在本發(fā)明的主要實施方案中，兩性霉素B分散在油相中，兩性霉素B粉末被油包覆。用作乳化劑的卵磷脂分散在水相中。
在本發(fā)明的另一實施方案中，均質(zhì)步驟重復(fù)循環(huán)進行，從而得到低于2μ的顆粒分布。
在本發(fā)明的另一實施方案中，最終結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B的非腸道組合物在最后進行高壓滅菌無菌化處理。與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別
由下述可以看出本發(fā)明方法不同于其他專利。
a)本發(fā)明方法不同于美國專利5364632(1994)本發(fā)明不使用兩性霉素B的任何溶劑；不經(jīng)過制備兩性霉素B核磷脂膜及接著的氫化過程；不使用含有α-生育酚的MCT油；調(diào)節(jié)含卵磷脂的水相pH至8-11；具有最后的無菌化步驟-以及產(chǎn)品具有毒性低且在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)中分布好。
使用這么多的溶劑使得方法難以適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同實施例中的顆粒尺寸小于100nm，但組合物的毒性沒有報道。
在本發(fā)明的方法中，低毒性甚至維持在5mg/ml，這對于治療有利，注射所需的體積很低。
b)本發(fā)明方法不同于日本專利11-60491(1989)，日本專利的乳劑粒徑為0.1-0.2μ，本發(fā)明最高為2μ。
在本發(fā)明方法中，卵磷脂被加到水相中，水相的pH調(diào)節(jié)至8-11。
本發(fā)明產(chǎn)品的貨架期超過2年，而日本專利只有10天或幾周的數(shù)量級。
在日本專利方法中，需要大量的乳液支持劑，而這在本發(fā)明藥物乳劑卻不需要。
本發(fā)明方法提供了無菌產(chǎn)品，最后通過高壓無菌進行無菌處理，而現(xiàn)有技術(shù)日本專利沒有無菌化處理步驟。
c)日本專利4-173736(1992)的方法制得的產(chǎn)品不包含直徑大于1μm的顆粒，該產(chǎn)品不包括在油成分中，因此不同于本發(fā)明組合物。
d)在美國專利5389373(1995)中，兩性霉素B被加入到預(yù)先制得的乳劑中，而本發(fā)明方法中的兩性霉素B分散在油相中。
e)在歐洲專利EP0700678(1996)中，沒有描述這類兩性霉素B乳劑。它只是所列舉的描述成“可制成類脂乳劑”的大約70種藥物中的一種。
該專利描述的乳劑實質(zhì)上必須含有氨基酸和檸檬酸或其鹽，而在本發(fā)明中根本無需這些。
該專利制備乳劑的方法實質(zhì)上是從制備含有或不含有藥物的磷脂膜開始的；而本發(fā)明方法不一點也需要這一步驟。
在制備乳劑的方法中，必須指定不同模式的添加乳化劑步驟，而本發(fā)明只需要在水相中加入乳化劑。
歐洲專利EP0700678(1996)提及的發(fā)明目的實質(zhì)上是利益檸檬酸和氨基酸克服類脂乳劑褪色的問題，而本發(fā)明的目的是開發(fā)一種水包油型乳及結(jié)構(gòu)化包覆油的兩性霉素B，其毒性特征是小鼠LD50至少為400mg/kg。
盡管本發(fā)明已在特定的實施方案中描述過，但對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來講，可在不脫離本發(fā)明的條件下進行各種改變和改性。實施例
本發(fā)明將通過實施例的方式加以闡述。這些實施例僅僅是說明性，絕不是用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例中使用的所有原材料均為非腸道級，使用的設(shè)備具有常規(guī)性能。整個操作在環(huán)境受到控制的區(qū)域進行。進行批量處理時需要提供氮氣氣氛。
這些實施例中使用的兩性霉素B是從符合USP說明書的Alpharma獲得的，為非腸道級。
實施例中使用的純化卵磷脂為非腸道級，由類脂獲得。
在整個藥物動力學(xué)研究、器官分布研究和毒性研究中，含去氧膽酸鈉的市購兩性霉素B注射劑是指常規(guī)的兩性霉素B注射劑。在所有研究過程中只使用一種品牌的常規(guī)組合物。實施例I
通過將1g兩性霉素B分散在40g豆油中，制備油相。
通過將4.5g丙三醇加入到150ml水中，然后再分散在2.4g卵磷脂中，制備水相。利用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至10.6。
在高速攪拌下，將上述制得的油相加入到水相中。利用水將體積調(diào)至200ml。將形成的乳劑穿過高壓均質(zhì)器。重復(fù)均質(zhì)處理，直至粒徑低于2μm。在每次均質(zhì)循環(huán)之后，立即將產(chǎn)物溫度冷卻至20℃。
通過2μ濾紙過濾均質(zhì)過的乳劑，在氮氣氣氛下將其裝入容器，封閉并通過高壓滅菌進行無菌化處理。
由該方法制得的產(chǎn)品具有下列成分
a)兩性霉素B 1.0g
b)豆油 40.0g
c)純化卵磷脂2.4g
d)丙三醇4.5g
e)氫氧化鈉 適量，調(diào)節(jié)pH
f)水適量，至200ml
將獲得的無菌化產(chǎn)品進行小鼠、大鼠和狗中毒性研究(實施例VIII-A、VIII-B、VIII-C、VIII-D)、藥物動力學(xué)研究(實施例IX)、器官分布研究(實施例X-A、X-B)。在2℃-8℃下，通過將產(chǎn)品貯存在小瓶中進行穩(wěn)定性研究，結(jié)果示于下表。
實施例I產(chǎn)品的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
毒性研究清楚地表明，由本發(fā)明方法制得的乳劑是一種協(xié)同組合物。實施例II
利用空氣噴射研磨機微粉化兩性霉素B粉末，得到粒徑范圍小于10微米粉末。
通過將1g兩性霉素B(微粉化)分散在40g豆油中，制備油相。
通過將4.5g丙三醇加入到150ml水中，然后再分散在2.4g卵磷脂中，制備水相。利用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至10.8。
在高速攪拌下，將上述制得的油相加入到水相中。利用水將體積調(diào)至200ml。將形成的乳劑穿過高壓均質(zhì)器。重復(fù)均質(zhì)處理，直至粒徑低于2μm。
通過2μ濾紙過濾均質(zhì)過的乳劑，在氮氣氣氛下將其裝入容器，封閉并通過高壓滅菌。
由該方法制得的產(chǎn)品具有下列成分
a)兩性霉素B 1.0g
(微粉化)
b)豆油 40.0g
c)純化卵磷脂2.4g
d)丙三醇4.5g
e)氫氧化鈉 適量，調(diào)節(jié)pH
f)水適量，至200ml
該實施例證實，如果使用微粉化兩性霉素B，均質(zhì)化處理過程中的冷卻步驟就不需要。實施例III
通過將1g兩性霉素B分散在預(yù)先加入至70℃的40g豆油中，制備油相。
通過將4.5g丙三醇加入到預(yù)先加熱至65℃的150ml水中，然后再分散在2.4g卵磷脂中，制備水相。利用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至10.8。
在高速攪拌下，將70℃的油相加入到65℃的水相中。利用水將體積調(diào)至200ml。將形成的乳劑穿過高壓均質(zhì)器。重復(fù)均質(zhì)處理，直至粒徑低于2μm。在每次均質(zhì)循環(huán)之后，立即將產(chǎn)物溫度冷卻至20℃。
通過2μ濾紙過濾均質(zhì)過的乳劑，在氮氣氣氛下將其裝入容器，封閉并通過高壓滅菌在110℃進行無菌化處理40分鐘。
由該方法制得的產(chǎn)品具有下列成分
a)兩性霉素B 1.0g
b)豆油 40.0g
c)純化卵磷脂2.4g
d)丙三醇4.5g
e)氫氧化鈉 適量，調(diào)節(jié)pH
f)水適量，至200ml
分析所得產(chǎn)品中兩性霉素B含量，結(jié)果非常滿意，表明乳化步驟可在較高溫度下進行。實施例IV
油相-40g豆油
通過將4.5g丙三醇加入到150ml水中，然后再分散在2.4g卵磷脂中，制備水相。將1g兩性霉素B分散在該卵磷脂溶液中，利用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至10.8。
在高速攪拌下，將油相加入到水相中。利用水將體積調(diào)至200ml。將形成的乳劑穿過高壓均質(zhì)器。重復(fù)均質(zhì)處理，直至粒徑低于2μm。在每次均質(zhì)循環(huán)之后，立即將產(chǎn)物溫度冷卻至20℃。
通過2μ濾紙過濾均質(zhì)過的乳劑，在氮氣氣氛下將其裝入容器，封閉并通過高壓滅菌進行無菌化處理。
由該方法制得的產(chǎn)品具有下列成分
a)兩性霉素B 1.0g
b)豆油40.0g
c)純化卵磷脂 2.4g
d)丙三醇 4.5g
e)氫氧化鈉適量，調(diào)節(jié)pH
f)水 適量，至200ml
根據(jù)實施例XI給出的詳細(xì)步驟，將獲得的無菌化產(chǎn)品進行毒性研究，結(jié)果產(chǎn)生了心臟毒性征兆。由此可見，將兩性霉素B加入到水相中不是本發(fā)明所推薦的。實施例V
通過在攪拌條件下，將2.4g純化卵磷脂溶解在預(yù)先加入至70℃的40g豆油中，制備油相。
通過將4.5g丙三醇加入到預(yù)先加熱至65℃的150ml水中，然后再在其中分散1g兩性霉素B，制備水相。利用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11.0。
在高速攪拌下，將70℃的油相加入到65℃的水相中。利用水將體積調(diào)至200ml。將形成的乳劑穿過高壓均質(zhì)器。重復(fù)均質(zhì)處理，直至粒徑低于2μm。在每次均質(zhì)循環(huán)之后，立即將產(chǎn)物溫度冷卻至20℃。
通過2μ濾紙過濾均質(zhì)過的乳劑，在氮氣氣氛下將其裝入容器，封閉并通過高壓滅菌進行無菌化處理。
由該方法制得的產(chǎn)品具有下列成分
a)兩性霉素B 1.0g
b)豆油 40.0g
c)純化卵磷脂 2.4g
d)丙三醇 4.5g
e)氫氧化鈉 適量，調(diào)節(jié)pH
f)水 適量，至200ml
根據(jù)實施例XI給出的詳細(xì)步驟，將獲得的無菌化產(chǎn)品進行毒性研究，結(jié)果產(chǎn)生了心臟毒性征兆。由此可見，將純化卵磷脂加入到油相并向水相中加入兩性霉素B不是本發(fā)明所推薦的。實施例VI
將40g豆油加熱至70℃，在攪拌條件下，將2.4g純化卵磷脂溶解在其中。在攪拌條件下，將1g兩性霉素B分散在油相中，得到兩性霉素B在油相至均勻分散液。利用氮氣沖洗油相15分鐘。
將150ml水加熱至65℃，在攪拌條件下向其中加入4.5g丙三醇。利用氫氧化鈉稀溶液調(diào)節(jié)pH至10.65。在高速攪拌下，將兩性霉素B油分散液加入到該水相中，得到粗的乳劑。利用水將體積調(diào)至200ml。利用APV高壓均質(zhì)器均質(zhì)該粗乳劑，直至均質(zhì)過的產(chǎn)品能夠濾過2μ玻璃纖維濾紙。在每次均質(zhì)循環(huán)之后，立即將產(chǎn)物溫度冷卻至大約20℃。在氮氣氣氛下將過濾過的產(chǎn)品裝入容器，封閉并通過高壓滅菌進行無菌化處理。
由該方法制得的產(chǎn)品具有下列成分
a)兩性霉素B 1.0g
b)豆油 40.0g
c)純化卵磷脂2.4g
d)丙三醇4.5g
e)氫氧化鈉 適量，調(diào)節(jié)pH
f)水適量，至200ml
根據(jù)實施例XI給出的詳細(xì)步驟，將獲得的無菌化產(chǎn)品進行毒性研究，結(jié)果產(chǎn)生了心臟毒性征兆。由此可見，將純化卵磷脂加入到油相不是本發(fā)明所推薦的。
下列實施例中的水包油型乳劑結(jié)構(gòu)化的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物是指兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。實施例VII
將實施例I方法制備的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)和含有去氧膽酸鈉的常規(guī)兩性霉素B制劑進行人紅血球(RBCs)體外毒性試驗。材料和方法
試驗系統(tǒng)取自正常人雄性施主的RBCs。
試驗材料根據(jù)實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
對比材料常規(guī)兩性霉素B注射劑(5mg/ml)。
研究設(shè)計將血液收集在肝素化試管中。在4℃、于450g下離心10分鐘，分離RBCs。分離血漿和血沉棕黃層，在將RBCs分散在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中之前，在4℃下利用PBS(pH7.4)洗滌三次。然后在Sysmex KX-21細(xì)胞計數(shù)器上計數(shù)RBCs，并在采集的那一天使用RBCs。為了測定RBC對兩性霉素B的敏感程度，利用兩性霉素B乳劑或常規(guī)兩性霉素B注射液，在37℃下孵育2ml PBS細(xì)胞懸浮液(5×107細(xì)胞數(shù)/ml)1小時。將RBCs在1500g下離心5分鐘，并利用PBS洗滌3次。為了分離細(xì)胞膜，將RBCs細(xì)胞塊溶解在2ml水中、攪拌并進行離心處理(1500g，5分鐘)。在細(xì)胞計數(shù)器上測量血紅細(xì)胞。以對照細(xì)胞和治療細(xì)胞之間的差計算釋放數(shù)，將其表示成占總血紅細(xì)胞含量的百分?jǐn)?shù)。
表1用于研究人RBCs體外毒性的兩性霉素B劑量統(tǒng)計分析
利用Student’s t-試驗，比較治療組與對照組，分析所得到的數(shù)據(jù)。結(jié)果和討論
表2兩性霉素B制劑的血紅細(xì)胞G/DL含量
在常規(guī)兩性霉素B注射劑和乳劑中，隨著兩性霉素B濃度增加，血紅細(xì)胞溶解量增加(參見

圖1)。常規(guī)兩性霉素B注射劑表明，劑量為5mg/L的平均溶解量為77.5％，劑量為50mg/L、100mg/L、200mg/L的平均溶解量為100％；乳劑表明，劑量為5mg/L的平均溶解量為2.04％，劑量為50mg/L的平均溶解量為4.08％，劑量為100mg/L的平均溶解量為4.18％，劑量為200mg/L的平均溶解量為9.49％。在所研究的劑量范圍內(nèi)(P＜0.05)，兩性霉素B乳劑毒性顯著地低于常規(guī)兩性霉素B注射劑。結(jié)論
由此，體外毒性數(shù)據(jù)清楚地表明，當(dāng)靶細(xì)胞為人RBCs時，實施例I制得的兩性霉素B乳劑的毒性低于常規(guī)兩性霉素B注射劑。實施例VIII
將實施例I方法制備的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)和含有去氧膽酸鈉的常規(guī)兩性霉素B進行小鼠體內(nèi)毒性研究。
研究的目的如下
從單劑量研究，評估上述兩種制劑的LD50值。
從重復(fù)劑量研究，測定上述兩種制劑的毒性作用。VIII-A)單劑量小鼠毒性研究材料和方法
試驗系統(tǒng)從Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)動物房中取出重量為20-22gm瑞士雌性小白鼠，將其用作研究。隨意地給動物提供標(biāo)準(zhǔn)的固型食物和AquaguardTM水。
試驗材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用由實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
對比材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用常規(guī)兩性霉素B注射劑(5mg/ml)。
研究設(shè)計動物被分成兩組(第一組和第二組)，每組8只。第一組接受不同劑量的常規(guī)兩性霉素B注射劑，第二組接受不同劑量的兩性霉素B乳劑。
表3用于單劑量小鼠毒性研究的兩性霉素B劑量
所有組通過靜內(nèi)路線接受注射。在72小時內(nèi)，觀察所有動物的任何臨床毒性信號及死亡情況。對所有劑量計算死亡百分?jǐn)?shù)。
統(tǒng)計分析利用正規(guī)偏差分析方法，測定所有制劑的LD50值。結(jié)果和討論
表4兩種制劑不同劑量的死亡百分?jǐn)?shù)
上表表明，常規(guī)方法制備的常規(guī)兩性霉素B注射劑的毒性大于兩性霉素B乳劑。在與劑量有關(guān)的情況下，制劑的死亡百分?jǐn)?shù)增加。通過正規(guī)偏差分析方法測定兩種制劑的LD50值。圖2給出了兩種制劑死亡百分?jǐn)?shù)與劑量之間的關(guān)系圖。結(jié)論
實施例I制備的兩性霉素B乳劑的LD50高于常規(guī)兩性霉素B注射劑，毒性低于常規(guī)兩性霉素B注射劑。VIII-B)重復(fù)劑量小鼠毒性研究材料和方法
試驗系統(tǒng)從Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)動物房中取出重量為20-22gm瑞士雌性小白鼠，將其用作研究。隨意地給動物提供標(biāo)準(zhǔn)的固型食物和AquaguardTM水。
試驗材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用由實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
對比材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用常規(guī)兩性霉素B注射劑(5mg/ml)。
研究設(shè)計動物被分成三組(第一組、第二組和第三組)，每組6只。第一組接受空白乳劑載體(對照)，第二組接受不同劑量的常規(guī)兩性霉素B注射劑，第三組接受不同劑量的兩性霉素B乳劑。
表5用于重復(fù)劑量小鼠毒性研究的常規(guī)兩性霉素B和兩性霉素B乳劑的劑量
所有組通過靜內(nèi)路線每天接受表5劑量注射。對照組接受最大體積的載體。觀察所有動物的任何臨床毒性信號。在14天內(nèi)，每隔一天記錄小鼠的體重。另外，在14天內(nèi)觀察死亡率。計算所有劑量的死亡百分?jǐn)?shù)。統(tǒng)計分析
為了比較研究過程中的體重變化情況，分析所得數(shù)據(jù)。在治療組之間比較這種變化。結(jié)果和討論
表6兩種制劑不同劑量的死亡百分?jǐn)?shù)
上表(參見圖3)表明，常規(guī)方法制備的常規(guī)兩性霉素B注射劑的毒性大于兩性霉素B乳劑。在與劑量有關(guān)的情況下，制劑的死亡百分?jǐn)?shù)增加。在14天內(nèi)，注射載體的治療組沒有死亡。在較高劑量條件下，結(jié)果表明，兩性霉素B乳劑的毒性小于常規(guī)兩性霉素B注射劑。
表7重復(fù)劑量小鼠毒性研究的不同劑量平均體重D表示觀察的天數(shù)；SDEV表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。Bold與對照組(利用兩性霉素B乳劑的載體治療)顯著不同。
常規(guī)兩性霉素B注射劑治療組表明，在劑量為1.5mg/kg和2.5mg/kg時，動物體重下降；而兩性霉素B乳劑表明，在劑量為20mg/kg和40mg/kg時，動物體重下降(參見圖4)。在第6、第8天，利用20mg/kg和40mg/kg兩性霉素B乳劑治療的小鼠體重明顯地低于利用10mg/kg兩性霉素B乳劑治療的小鼠體重。
組織病理學(xué)說檢查顯示了肝和腎軟組織細(xì)胞的一些退化變化，這可能是由于小鼠的一般代謝引起。感覺肌原纖維可能是死亡時的缺氧癥的結(jié)果。這種變化一般是可逆型的。兩性霉素B似乎對肝和腎的作用更大，而對心臟只是一般作用，導(dǎo)致非常急性的損傷。強度一般與劑量相關(guān)。在常規(guī)兩性霉素B注射劑中，損傷可在低劑量水平觀察到。結(jié)論
兩性霉素B乳劑的毒性低于常規(guī)兩性霉素B注射劑。VIII-C)單劑量大鼠毒性研究材料和方法
試驗系統(tǒng)從Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)動物房中取出重量為140-160gm性別任意的Wistar大白鼠，將其用作研究。隨意地給動物提供標(biāo)準(zhǔn)的固型食物和AquaguardTM水。
試驗材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用由實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
對比材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用常規(guī)兩性霉素B注射劑(5mg/ml)。
研究設(shè)計動物被分成兩組(第一組和第二組)，每組6只。第一組接受不同劑量的常規(guī)兩性霉素B注射劑，第二組接受不同劑量的兩性霉素B乳劑。
表8用于單劑量大鼠毒性研究的常規(guī)兩性霉素B注射劑和兩性霉素B乳劑的劑量
所有組通過靜內(nèi)路線接受表8所示的注射。在72小時內(nèi)，觀察所有動物的任何臨床毒性信號及死亡情況。對所有劑量計算死亡百分?jǐn)?shù)。
統(tǒng)計分析利用正規(guī)偏差分析方法，測定所有制劑的LD50值。結(jié)果和討論
表9兩種制劑不同劑量的死亡百分?jǐn)?shù)
上表(參見圖5)表明，常規(guī)方法制備的常規(guī)兩性霉素B注射劑的毒性大于兩性霉素B乳劑。在與劑量有關(guān)的情況下，制劑的死亡百分?jǐn)?shù)增加。通過正規(guī)偏差分析方法測定兩種制劑的LD50值。在兩性霉素B乳劑中，72小時后的死亡率為50％。在72小時內(nèi)，體重沒有變化。結(jié)論
兩性霉素B乳劑的毒性低于常規(guī)兩性霉素B注射劑。VIII-D)單劑量狗毒性研究
進行本研究的目的在于評估兩性霉素B乳劑在狗中的毒性和安全性。材料和方法
試驗系統(tǒng)從在本研究中使用12只性別不限、重量為10-15kg的健康狗。動物在Kennel標(biāo)準(zhǔn)條件下圈養(yǎng)，隨意地帶有食物和水的進出口。
試驗材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用由實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
對比材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用常規(guī)兩性霉素B注射劑(5mg/ml)。
研究設(shè)計動物被分成兩組(第一組和第二組)，每組6只。第一組接受常規(guī)兩性霉素B注射劑，第二組接受實施例I制得的兩性霉素B乳劑。
表10用于單劑量狗毒性研究的常規(guī)兩性霉素B注射劑和兩性霉素B乳劑的劑量
所有組通過靜內(nèi)路線接受表10所示的注射，藥劑溶解在6-20ml5％葡萄糖中。在注射后21天內(nèi)，觀察所有動物的任何臨床毒性信號及死亡情況。在觀察的V0、V2、V4、V6和V8，稱量體重。為了進行血液學(xué)和生化研究(腎功能和肝功能測試)，在V0、V4和V8采集血樣。觀察時間表
V0基線觀察
V1兩天內(nèi)基線觀察
V2V0之后3天
V3V0之后6天
V4V0之后9天
V5V0之后12天
V6V0之后15天
V7V0之后18天
V8V0之后21天統(tǒng)計分析
為了比較研究過程中由基線得到的參數(shù)變化，分析所得到的數(shù)據(jù)。在治療組之間進行了這種變化的比較。結(jié)果和討論
表11在狗的試驗中不同觀察時間，血液學(xué)參數(shù)與基線改變的平均百分?jǐn)?shù)SD表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。Bold表示兩種制劑組中V4和V8的白細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞之間的顯著差異。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組中所有血液學(xué)參數(shù)均顯示出與基線值的偏差。乳劑中白細(xì)胞數(shù)下降的百分?jǐn)?shù)顯著地高于常規(guī)注射劑，但屬于正常范圍內(nèi)，沒有臨床差別。
表12在不同觀察時間，狗的生化參數(shù)與基線改變的平均百分?jǐn)?shù)SD表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。Bold表示兩種制劑組在V4和V8之間的顯著差異。
在常規(guī)兩性霉素B注射劑中，V8時的肝功能參數(shù)(參見圖6)AST上升了334.38％，而在兩性霉素B乳劑中僅僅上升108.86％。類似的結(jié)果也在ALT和總的膽紅素中發(fā)現(xiàn)。與乳劑相比，常規(guī)組的上升在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的。
在常規(guī)兩性霉素B注射劑中，腎功能參數(shù)(參見圖7)明顯地被擾亂。兩性霉素B乳劑的偏差明顯地小于常規(guī)兩性霉素B注射劑。
作為兩性霉素B的主要毒性，足以危害腎臟的毒性導(dǎo)致了常規(guī)兩性霉素B注射劑(含去氧膽酸鈉)和哺乳動物細(xì)胞膽固醇的兩性霉素B之間的非選擇性細(xì)胞毒性相互作用。通過在含類脂的乳劑中摻入兩性霉素B，使得哺乳動物細(xì)胞毒性衰減。這就改變了兩性霉素B的親和力，降低了向黃安哺乳動物細(xì)胞的膽固醇的選擇性轉(zhuǎn)變。
表13單劑量狗毒性研究中不同劑量的平均體重SD表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
常規(guī)兩性霉素B注射劑治療組中動物體重高于兩性霉素B乳劑治療組(參見圖8)。結(jié)論
與常規(guī)兩性霉素B注射劑相比，兩性霉素B乳劑對肝臟毒性和腎臟毒性得到了保護。實施例IX
將實施例I制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)用于評價兔中與常規(guī)兩性霉素B注射劑比較的藥物動力學(xué)參數(shù)。材料和方法
試驗系統(tǒng)從Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)動物房中取出重量為1.5-2.0kg的雄性新西蘭白兔，將其用作研究。隨意地給動物提供標(biāo)準(zhǔn)的營養(yǎng)蔬菜和AquaguardTM水。
試驗材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用由實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
對比材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用常規(guī)兩性霉素B注射劑(5mg/ml)。
研究設(shè)計動物被分成兩組(第一組和第二組)，每組3只。第一組和第二組分別接受常規(guī)兩性霉素B注射劑和兩性霉素B乳劑。在靜內(nèi)單個大藥丸劑量注射后5、15、30、45和60分鐘及1、2、3、4、5、24、48小時，采集血樣。以3000-4000rpm速度離心血樣，分離出血漿。血樣存放在-20℃，直至分析。
給藥路線通過兔耳邊緣上的靜脈血管給藥。
表14用于兔藥物動力學(xué)研究的兩性霉素B制劑劑量兩性霉素B含量分析
利用C-18柱，通過相HPLC方法，分析血漿中兩性霉素B含量。利用HPLC級二甲亞砜和乙腈(比例1∶3∶1)提取血漿中的兩性霉素B。樣品在3000rpm下離心，將上清液注射到柱中。統(tǒng)計分析
為了比較治療組，通過Student’s t-試驗，分析獲得的數(shù)據(jù)。結(jié)果和討論
表15兩種制劑藥物動力學(xué)參數(shù)
兩種制劑之間的Cmax、Tmax、T1/2、Vd沒有顯著的差異。為了清理，以比常規(guī)兩性霉素B注射劑明顯快的速度，將乳劑從血漿中分離出來(P＜0.05)。這就表明乳劑分布到組織中的速度快于常規(guī)兩性霉素B注射劑(參見圖9)。實施例X
為了與常規(guī)兩性霉素B注射劑對比，利用實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)，在小鼠中進行器官分布研究。
本研究的目的是
通過單劑量研究，評價兩種制劑在小鼠中器官分布的形式；
通過重復(fù)劑量研究，測定兩種制劑在小鼠中器官分布的形式。X-A)小鼠中單劑量器官分布研究材料和方法
試驗系統(tǒng)從Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)動物房中取出重量為20-22gm瑞士雌性小白鼠，將其用作研究。隨意地給動物提供標(biāo)準(zhǔn)的固型食物和AquaguardTM水。
試驗材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用由實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
對比材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用常規(guī)兩性霉素B注射劑(5mg/ml)。
給藥路線靜內(nèi)。
研究設(shè)計動物被分成兩組(第一組和第二組)，每組20只。第一組接受劑量為1mg/kg的常規(guī)兩性霉素B注射劑，第二組接受劑量為5mg/kg的兩性霉素B乳劑。每個樣品點由4只小鼠組成。在各自時間點(0.5、1、2、4、24小時)的最后，分別討論肝、肺、腎、脾和腦器官樣本。器官立即冷凍，阻止一切酶反應(yīng)。稱量器官，加入3倍體積的水。然后進行均質(zhì)處理。
表16用于單劑量小鼠器官分布研究的常規(guī)兩性霉素B注射劑和兩性霉素B乳劑的劑量兩性霉素B含量分析
向均漿中以3∶1比例加入甲醇。然后在13,000-14,000rpm下高速離心。再將上清液注入到兩性霉素B分析HPLC柱中。統(tǒng)計分析
為了比較治療組，通過Student’s t-試驗，分析獲得的數(shù)據(jù)。結(jié)果和討論
表17兩種制劑器官分布參數(shù)*—表示兩性霉素B在組織中聚集。
與常規(guī)兩性霉素B注射劑相比，兩性霉素B乳劑除了腎之外，在所有器官中的分布水平均高(參見圖10a至10d)。乳劑較高的半衰期和較低的清除速率進一步支持了這一數(shù)據(jù)。器官攝入乳劑中的兩性霉素B的水平高于常規(guī)兩性霉素B注射劑，在脾的情況下，在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的(P＜0.05)。
肝臟毒性是與兩性霉素B治療相關(guān)的主要缺陷，并由于兩性霉素B在腎臟中含量高。由AUC(0→∞)可以清楚地看出，與常規(guī)兩性霉素B注射劑相比，乳劑達(dá)到了相當(dāng)?shù)偷乃?P＜0.05)。再者，腎臟能夠快速清除乳劑，所以與常規(guī)兩性霉素B注射劑相比，毒性低、LD50值高。
盡管血漿濃度下降，但肝和脾的含量繼續(xù)升高。據(jù)報道，脂質(zhì)體也觀測到了類似的結(jié)果，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中的脂質(zhì)體藥物與非脂質(zhì)體藥物的血漿不是自由平衡(Feilding，RM.，et al，1998)。這可能解釋了與常規(guī)兩性霉素B注射劑相比，乳劑情況下的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中的兩性霉素B滯留高。X-B)小鼠中重復(fù)劑量器官分布研究材料和方法
試驗系統(tǒng)從Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)動物房中取出重量為20-22gm瑞士雌性小白鼠，將其用作研究。隨意地給動物提供標(biāo)準(zhǔn)的固型食物和AquaguardTM水。
試驗材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用由實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
對比材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用常規(guī)兩性霉素B注射劑(5mg/ml)。
研究設(shè)計動物被分成兩組(第一組和第二組)，每組24只。第一組接受劑量為1mg/kg的常規(guī)兩性霉素B注射劑，第二組接受劑量為5mg/kg的兩性霉素B乳劑。12只動物給藥周期為7天，其它12只給藥14天。最后給藥后6小時解剖肝、肺、腎和脾。器官立即冷凍，阻止一切酶反應(yīng)。稱量器官，加入3倍體積的水。然后進行均質(zhì)處理。
給藥路線靜內(nèi)。
表18用于單劑量小鼠器官分布研究的常規(guī)兩性霉素B注射劑和兩性霉素B乳劑的劑量兩性霉素B含量分析
利用C-18柱，通過相HPLC方法，分析血漿中兩性霉素B含量。利用HPLC級甲醇，血漿與甲醇比為1∶3，提取血漿中的兩性霉素B。樣品在3000rpm下離心，將上清液注射到柱中。統(tǒng)計分析
為了比較治療組，通過Student’s t-試驗，分析獲得的數(shù)據(jù)。結(jié)果和討論
表19兩種制劑器官分布參數(shù)
非常有趣地觀察到，從第7次劑量到第14次劑量，組織濃度并沒有實質(zhì)性增加(參見圖11a和11b)，這與文獻報道相同(Olsen，SJ.et al，1991)。與此形成對照，盡管組織中兩性霉素B含量升高，但在兩性霉素B乳劑治療組中，動物沒有死亡。在研究過程中，常規(guī)兩性霉素B注射劑確實顯示出死亡。
由此可以看出，對于常規(guī)兩性霉素B注射劑和乳劑，盡管腎臟毒性差別很大，但腎臟中兩性霉素B含量相同?？赡艿脑蛟谟诖嬖谟谄鞴僦械膬尚悦顾谺，不論其以類脂復(fù)合物形式存在，還是以游離藥物形式存在。對于常規(guī)兩性霉素B注射劑，兩性霉素B主要以游離形式存在，因此具有腎臟毒性。但是，對于含類脂乳劑，兩性霉素B以類脂復(fù)合物形式存在，該復(fù)合物對組織沒有毒性。
作為兩性藥物的兩性霉素B，以可溶性單體或以自身相互關(guān)聯(lián)的低聚體，且在臨界分子團濃度至上形成分子團。調(diào)節(jié)水介質(zhì)中不同兩性霉素B類型之間的平衡可改變其總體活性和毒性。Tabosa Do Egito(1996)認(rèn)為兩性霉素B乳劑起著單體形式兩性霉素B的儲罐作用。這種高穩(wěn)定性的制劑僅有規(guī)則地釋放有限量的游離兩性霉素B單體。這種形式只可能與真菌細(xì)胞的麥角固醇結(jié)合，具有與哺乳動物細(xì)胞的膽固醇相互作用降低的功能(Tabosa Egito，et al，1996)。因此，盡管乳劑與常規(guī)兩性霉素B注射劑含量類似，卻沒有嚴(yán)重的毒性。結(jié)論
制成兩性霉素B乳劑的目的是
1.改進安全性
2.使其具有成本效益
毒性研究表明，乳劑的安全界限確實比常規(guī)兩性霉素B注射劑有所改進。這可能得益于乳劑本身以靶向真菌細(xì)胞的形式存在。常規(guī)兩性霉素B注射劑大量地釋放兩性霉素B，由此釋放的單體與形成低聚體有關(guān)，低聚體與哺乳動物細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致嚴(yán)重毒性。相反地，由于迅速地被RES嗜菌細(xì)胞分解，乳劑在血漿中不可能達(dá)到如此高的濃度，因此顯示出漸進釋放單體。這就解釋了乳劑對真菌細(xì)胞具有選擇性作用且毒性低(Tabosa Egito，et al，1996)。對其靶向能力，低血漿含量及兩性霉素B迅速地分布到器官中去也優(yōu)于常規(guī)兩性霉素B注射劑。再者，與其它含類脂的制劑(如類脂復(fù)合物&脂質(zhì)體制劑)相比，兩性霉素B乳劑是一種有成本效益的產(chǎn)品。
由此可見，本發(fā)明兩性霉素B乳劑是治療真菌感染的有前途的候補藥物。實施例XI
將實施例IV、實施例V和實施例VI制得的兩性霉素B乳劑用于進行小鼠體內(nèi)毒性研究。單劑量小鼠毒性研究材料和方法
試驗系統(tǒng)從Bharat Serums & Vaccines Ltd(BSVL)動物房中取出重量為20-22gm瑞士雌性小白鼠，將其用作研究。隨意地給動物提供標(biāo)準(zhǔn)的固型食物和AquaguardTM水。
試驗材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用由實施例IV、實施例V和實施例VI制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
對比材料以大藥丸劑量，靜內(nèi)服用由實施例I方法制得的兩性霉素B乳劑(5mg/ml)。
所有組通過靜內(nèi)路線接受注射。在72小時內(nèi)，觀察所有動物的任何臨床毒性信號及死亡情況。對所有劑量計算死亡百分?jǐn)?shù)。觀察結(jié)果
接受是實例IV、實施例V和實施例VI制得的樣品的組都顯示出了心臟毒性征兆，如嚴(yán)重性呼吸困難、局部刺激、腹部痛苦和擾動。但這些毒性征兆在接受由實施例I方法制得的樣品組中都沒有觀察到。發(fā)明優(yōu)點
根據(jù)本發(fā)明方法制備的用于非腸道給藥的水包油型結(jié)構(gòu)化乳劑兩性霉素B大大降低了其毒性并可在不改變其抗真菌活性的條件下保證無菌性。
由本發(fā)明方法制備的摻入乳劑油相的兩性霉素B在制備整個過程中保持了其穩(wěn)定性，包括高壓滅菌無菌化過程及其后的貨架期或使用。
由本發(fā)明方法制得的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物的平均液滴尺寸被控制在最大范圍，從而使其在得到低血漿濃度的條件下優(yōu)先分布于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其在小鼠中的LD50至少為400mg/kg，該組合物包括
a)選自植物油，如豆油、蓖麻油、紅花油的油相(最高30％w/v組合物)；
b)分散于油相中的兩性霉素B(0.05％至1％w/v組合物)；
c)水相；
d)選自溶解于水中的化合物，如丙三醇、甘露醇、葡萄糖的張力調(diào)節(jié)劑；以及
e)分散于水相中的乳化劑，如天然磷脂(最高3％w/v組合物)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其中油相為大約10％至20％w/v組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其中使用的植物油為豆油。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其中豆油含量為大約20％w/v組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其中兩性霉素B含量為大約0.5％w/v組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其中使用的天然磷脂為純化卵磷脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其中純化卵磷脂含量為大約1.2％w/v組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其中使用的張力調(diào)節(jié)劑為丙三醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其中丙三醇含量為大約2.25％w/v組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物，其中乳劑包括兩性霉素B(0.5％w/v組合物)；油相為豆油(20％w/v組合物)；乳化劑為純化卵磷脂(1.2％w/v組合物)；張力調(diào)節(jié)劑為丙三醇(2.25％w/v組合物)和水(適量至100％(組合物體積))。
11.制備權(quán)利要求1-10任一的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物的方法，所述組合物在小鼠中的LD50至少為400mg/kg，該方法包括
i)將兩性霉素B分散在油相中；
ii)將張力調(diào)節(jié)劑溶解在水相中；
iii)將乳化劑分散在水相中；
iv)調(diào)節(jié)水相pH至大約8-11；
v)在攪拌條件下，將油相加入到水相中，得到粗結(jié)構(gòu)化乳劑；
vi)將粗結(jié)構(gòu)化乳劑均質(zhì)至粒徑小于2微米；
vii)過濾，在氮氣氣氛下將均質(zhì)過的結(jié)構(gòu)化乳劑填充到玻璃容器中，關(guān)閉玻璃容器，封閉關(guān)閉的玻璃容器，并通過高壓滅菌無菌化封閉的填充玻璃容器。
12.制備權(quán)利要求11的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物的方法，其中油相或水相或兩相在乳化過程中維持在最高溫度75℃。
13.制備權(quán)利要求11-12任一的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物的方法，其中加入氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)含卵磷脂乳化劑的水相的pH至8與11之間。
14.制備權(quán)利要求11-13任一的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物的方法，該方法包括將兩性霉素B分散在豆油中；通過向水中加入丙三醇制備水相；接著將純化卵磷脂分散在水相中；調(diào)節(jié)水相pH至10.8；在攪拌條件下，向水相中加入含有兩性霉素B的豆油，得到粗的乳劑；均化粗的乳劑至粒徑低于2微米；通過2微米過濾膜過濾，在氮氣氣氛下加入到玻璃容器中，關(guān)閉玻璃容器，封閉關(guān)閉的玻璃容器，通過高壓滅菌對封閉的填充容器進行無菌化處理。
15.由權(quán)利要求11-14的任一方法制得的結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物的方法，權(quán)利要求1-10的任一組合物在小鼠中的LD50至少為400mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明公開了結(jié)構(gòu)化乳劑形式的包覆油的兩性霉素B非腸道組合物及其制備方法，其中所述非腸道組合物在小鼠中的LD50至少為400mg/kg。該方法實質(zhì)上需要將兩性霉素B分散在油狀載體中，并將乳化劑分散在水相中。該方法操作簡單、成本低廉且能夠獲得適于非腸道給藥的穩(wěn)定產(chǎn)品。由本發(fā)明方法制得的兩性霉素B乳劑可被人類或動物服用，用于治療真菌感染；與常規(guī)的含有兩性霉素B和脫氧核糖核酸鈉的組合物相比，其藥效基本相當(dāng)或更高，其毒性相當(dāng)或更低。
文檔編號A61K47/10GK1447682SQ0181433
公開日2003年10月8日 申請日期2001年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月22日
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