專利名稱：包含病毒唑的疫苗及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)動物(例如家養(yǎng)、運(yùn)動或?qū)櫸镂锓N)和人中疫苗效應(yīng)的組合物和方法。更具體而言，優(yōu)選實(shí)施方案涉及病毒唑作為佐劑的用途，以及具有病毒唑和抗原的組合物。
背景技術(shù)：
利用疫苗預(yù)防人、家畜、運(yùn)動動物和家養(yǎng)寵物的疾病，司空見慣。然而，用于疫苗的抗原常常免疫源性不足，難以將抗體滴度提高到足以防護(hù)后續(xù)攻擊的水平，或者保持經(jīng)過一段時間后達(dá)到該水平的潛力。另外，許多疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫完全不足，而細(xì)胞介導(dǎo)免疫是針對細(xì)菌和病毒感染主要的免疫防御。大量研究當(dāng)前集中在開發(fā)更有效的疫苗以及增強(qiáng)含抗原制劑的免疫原性。(例如參見U.S.Pat.Nos.6,056,961；6,060,068；6,063,380；以及Li等人，Science 2882219-2222(2000))。
乙型肝炎疫苗是有名的這種＂弱＂疫苗。例如針對乙型肝炎病毒的重組疫苗，如Genhevacb(Pasteur Merieux Serums et Vaccines，58，Avenue Leclerc 69007 Lyon，F(xiàn)rance)、Engerixb(Smith，Kline andSymbol French)以及Recombivaxhb(Merck，Sharp和Dhome)，只是在0、30、和60或180天至少3次注射、繼之以一年后必須加強(qiáng)以后才有效。(Chedid等人，U.S.Patent No.6,063,380)。另外，許多接受這些疫苗的患者即使有應(yīng)答，也很差。由于世界上許多地區(qū)對HBV感染具有地方性，現(xiàn)有HBV疫苗免疫源性差的特性成為極其嚴(yán)重的問題。
為了獲得更強(qiáng)的體液和/或細(xì)胞應(yīng)答，通常在能增強(qiáng)患者對疫苗中抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)中施用疫苗。最常用的疫苗規(guī)程佐劑為油制劑和明礬。(Chedid等人，U.S.Patent No.6,063,380)。需要許多安全有效佐劑。
核苷類似物因其降低病毒復(fù)制的能力，已經(jīng)廣泛用于抗病毒治療。(Hosoya等人，J.Inf.Dis.，168641-646(1993))。病毒唑(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-羧酰胺)是合成的鳥嘌呤核苷類似物，已經(jīng)用于抑制RNA和DNA病毒復(fù)制。(Huffman等人，Antimicrob.Agents.Chemother，3235(1973)；Sidwell等人，Science，177705(1972))。已經(jīng)證明病毒唑是肌醇磷酸(IMP)脫氫酶(IMPDH)的競爭性抑制物，IMPDH將IMP轉(zhuǎn)變?yōu)镮MX(其然后轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP)。De Clercq，Antiviral Agentscharacteristic activity spectrum depending on themolecular target with which they interact，Academic press，Inc.，NewYork N.Y.，pp.1-55(1993)。病毒唑長期治療引起細(xì)胞內(nèi)GTP池的消耗。
除抗病毒活性之外，研究者觀察到某些鳥嘌呤核苷類似物影響免疫系統(tǒng)。(美國專利No.6,063,772和4,950,647)。已經(jīng)表明病毒唑抑制功能性體液免疫應(yīng)答(Peavy等人，J.Immunol.，126861-864(1981)；Powers等人，Antimicrob.Agents.Chemother.，22108-114(1982))以及IgE介導(dǎo)的調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞分泌。(Marquardt等人，J Pharmacol.Exp.Therapeutics，240145-149(1987))。據(jù)有些研究者報道，病毒唑的日?？诜委煂θ撕托∈缶哂忻庖哒{(diào)節(jié)作用。(Hultgren等人，J.Gen.Virol，792381-2391(1998)和Cramp等人，Gastron.Enterol，118346-355(2000))。然而，目前關(guān)于病毒唑?qū)γ庖呦到y(tǒng)作用的理解尚處于初期。
發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病毒唑能夠用作佐劑，以增強(qiáng)或促進(jìn)對抗原的免疫應(yīng)答。此處所述本發(fā)明的實(shí)施方案包括含有抗原和病毒唑的＂強(qiáng)＂疫苗制劑。這些制劑一般具有足以增強(qiáng)或促進(jìn)對抗原免疫應(yīng)答的相當(dāng)數(shù)量病毒唑。本發(fā)明的其它方面包括增強(qiáng)或促進(jìn)動物、包括人對抗原免疫應(yīng)答的方法。例如，通過一種方法，鑒別需要對抗原有效免疫應(yīng)答的動物，然后提供相當(dāng)數(shù)量的病毒唑連同抗原。某些方法中，聯(lián)合提供病毒唑和抗原(例如于單一組合物中)，而其它方法中則分別提供病毒唑和抗原。一些實(shí)施方案還涉及制造和使用具有病毒唑和抗原的組合物。
盡管包含的組合物包括病毒唑以及實(shí)際上任何的抗原或表位，優(yōu)選的組合物包含病毒唑和肝炎病毒抗原或表位?？乖虮砦豢梢曰陔幕蚝怂?例如，編碼肽抗原的RNA或者引入受試者時表達(dá)肽抗原的構(gòu)建體)。實(shí)施方案為具有病毒唑、以及包含甲型肝炎病毒(HAV)抗原或表位的肽或者編碼所述肽的核酸的組合物。實(shí)施方案為具有病毒唑、以及包含乙型肝炎病毒HBV)抗原或表位的肽或者編碼所述肽的核酸的組合物。合適的HBV抗原包括，例如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝炎核心抗原(HBcAg)、肝炎e抗原(HBeAg)以及編碼這些分子的核酸。實(shí)施方案還是具有病毒唑、并包含丙型肝炎病毒(HCV)抗原或表位的肽或者編碼所述肽的核酸的組合物。合適的HCV抗原包括而不限于，HCV序列的一個或多個結(jié)構(gòu)域(例如NS3和/或NS4A)以及編碼所述分子的核酸。
還發(fā)現(xiàn)了新的HCV序列。從感染HCV患者克隆并測序了HCV基因組新的NS3/4A片段(SEQ.ID.NO.16)。發(fā)現(xiàn)該序列與最緊密相關(guān)的HCV序列只有93％的同源性。該新肽(SEQ.ID.NO.17)及其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段、編碼這些分子的核酸、具有所述核酸的載體以及具有所述載體、核酸或肽的細(xì)胞也是本發(fā)明的實(shí)施方案。特別優(yōu)選的實(shí)施方案是疫苗組合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.17的HCV肽、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NO.25)、或編碼所述肽或片段的核酸。
此外，人們發(fā)現(xiàn)截短的突變體以及缺少蛋白水解裂解位點(diǎn)的NS3/4A肽的突變體具有高度免疫源性。這些新肽(SEQ.ID.NO.29-32和43-49)及其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NO.26、27和33-42)、編碼這些分子的核酸、具有所述核酸的載體以及具有所述載體、核酸或肽的細(xì)胞也是實(shí)施方案。特別優(yōu)選的實(shí)施方案是疫苗組合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.29-32和43-49的至少一個HCV肽、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NO.26、27和33-42)、或編碼所述肽或片段的核酸。
另外，具有上述抗原混合物的組合物是本發(fā)明的實(shí)施方案。例如，一些組合物包含HBV抗原、HAV抗原和病毒唑，或者HBV抗原、HCV抗原和病毒唑，或者HAV抗原、HCV抗原和病毒唑，或者HBV抗原、HAV抗原、HCV抗原和病毒唑。其它實(shí)施方案包含病毒唑和編碼上述抗原混合物的核酸。某些實(shí)施方案也包括本領(lǐng)域已知的其它佐劑、粘合劑、乳化劑、載體和填料，包括但不限于明礬、油及其它增強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物。
本發(fā)明的方面也包括此處所述組合物的制造和使用方法。某些方法將病毒唑與肽或核酸抗原(例如HAV、HBV、HCV抗原)混合，制成單一組合物(例如疫苗組合物)而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的方法包括，將病毒唑與具有HCV一個或多個結(jié)構(gòu)域(例如NS3和/或NS4A)上的表位的HCV抗原混合。
此處所述組合物的優(yōu)選用法包括，提供有此需要的動物足量的病毒唑和肝炎病毒抗原(例如HBV抗原、HAV抗原、HCV抗原，或編碼這些抗原之一的核酸或其任意組合)。例如，通過一種方法，鑒別需要對肝炎病毒抗原有效免疫應(yīng)答的動物(例如，具有肝炎感染的風(fēng)險或者已經(jīng)感染上肝炎的動物)，并提供所述動物相當(dāng)數(shù)量的有效增強(qiáng)或促進(jìn)對肝炎病毒抗原免疫應(yīng)答的病毒唑和肝炎病毒抗原(于單一組合物中或者分別提供)。優(yōu)選地，鑒別需要對HCV有效免疫應(yīng)答的動物，提供所述動物一種組合物，其中包含病毒唑和含有SEQ.ID.NO.1、6、7或17所示的抗原或表位的肽、或者編碼所述肽的核酸。特別優(yōu)選的方法包括，鑒別需要對HCV有效免疫應(yīng)答的動物，并提供所述動物一種組合物，其中包含病毒唑和相當(dāng)數(shù)量的HCV抗原(例如NS3/4A(SEQ.ID.NO.17)、NS3/4A突變體SEQ.ID.NO.29-32和43-49、或其至少3、4-10、10-20、20-30、或30-50個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NO.25-27和33-42)或者編碼一種或多種這些分子的核酸)，其足以增強(qiáng)或促進(jìn)對所述抗原免疫應(yīng)答。
附圖簡述

圖1顯示當(dāng)與單劑量1mg病毒唑共同給藥時，對10和100μg重組丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)3蛋白質(zhì)(NS3)的體液應(yīng)答，由平均終點(diǎn)滴度確定。
圖2顯示當(dāng)與單劑量的0.1、1.0或10mg病毒唑共同給藥時，對20μg重組丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)3蛋白質(zhì)(NS3)的體液應(yīng)答，由平均終點(diǎn)滴度確定。
圖3顯示單劑量1mg病毒唑?qū)S3特異性淋巴結(jié)增生應(yīng)答的作用，由體外記憶性應(yīng)答確定。
圖4顯示H-2d小鼠初次免疫后針對NS3抗體滴度對時間的函數(shù)。菱形表示NS3/4A-pVAX免疫小鼠的抗體滴度，正方形表示NS3-pVAX免疫小鼠的抗體滴度。
圖5A顯示特異性CTL介導(dǎo)的SP2/0靶細(xì)胞裂解百分比對效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比值的函數(shù)。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)用作對照免疫原。
圖5B顯示特異性CTL介導(dǎo)的SP2/0靶細(xì)胞裂解百分比對效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比值的函數(shù)。質(zhì)粒NS3/4A-pVAX用作免疫原。
發(fā)明詳述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了包含病毒唑和抗原(例如，包含病原體如病毒、細(xì)菌、霉菌、酵母或寄生蟲的表位的分子)的組合物增強(qiáng)和/或促進(jìn)動物對抗原的免疫應(yīng)答。更確切地說，人們發(fā)現(xiàn)病毒唑是有效的＂佐劑＂，為本公開目的，其是指能夠增強(qiáng)或促進(jìn)對特定抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)。病毒唑顯著增強(qiáng)免疫介導(dǎo)的抗原防護(hù)、提高抗原引起的抗體滴度以及增強(qiáng)增殖性T細(xì)胞應(yīng)答證明了其佐劑活性。
此處描述了包含病毒唑和抗原或表位的幾種組合物(例如疫苗)。例如，包含病毒唑的疫苗制劑可以根據(jù)病毒唑的量、病毒唑的形式以及抗原類型而變化?？乖梢允请幕蚝怂?例如，編碼肽抗原的RNA或者引入受試者時表達(dá)肽抗原的構(gòu)建體)。優(yōu)選的組合物包含病毒唑和肝炎病毒抗原(例如HAV抗原、HBV抗原、HCV抗原、編碼這些這些的核酸或其任意組合)。特別地，希望將至少一種HCV抗原、或SEQ.ID.NO.1所示的表位、或編碼所述HCV抗原的核酸與病毒唑混合，以制備所述組合物。也就是說，某些實(shí)施方案包括而不限于含有病毒唑以及包含SEQ.ID.NO.1或其具有SEQ.ID.NO.1的至少2500、2000、1600、1200、800、400、200、100、50、10或3個連續(xù)氨基酸片段的肽的組合物。另外的實(shí)施方案涉及包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.13或其具有SEQ.ID.NO.13的至少9、12、15、20、30、50、75、100、200、500個連續(xù)核苷酸的片段的編碼核酸。
其它實(shí)施方案包括組合物(例如疫苗)，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.1的特定片段，其中所述片段對應(yīng)于HCV的特定結(jié)構(gòu)域。例如，某些實(shí)施方案包含對應(yīng)于SEQ.ID.NO.1的1-182，、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或1972-30111氨基酸的HCV片段。包含病毒唑以及編碼一種或多種這些片段的核酸的組合物也是本發(fā)明的實(shí)施方案。
另外發(fā)現(xiàn)了新的HCV序列。從感染HCV患者克隆了新的核酸以及對應(yīng)于HCV NS3/4A結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(SEQ.ID.NO.16)。Genebank檢索顯示該克隆序列與HCV序列具有最大的同源性，但與最接近的HCV親本(relative)只有93％同源性(登錄號AJ278830)。該新肽(SEQ.ID.NO.17)及其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段、編碼這些分子的核酸、具有所述核酸的載體以及具有所述載體、核酸或肽的細(xì)胞也是本發(fā)明的實(shí)施方案。另外，此處所述的某些疫苗實(shí)施方案包含病毒唑以及該新的NS3/4A肽、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NO.25)、或編碼一種或多種這些分子的核酸。
也制備了該新NS3/4A肽的突變體。人們發(fā)現(xiàn)截短的突變體(例如SEQ.ID.NO.29)以及缺少蛋白水解裂解位點(diǎn)的突變體，具有高度免疫源性。這些新肽SEQ.ID.NO.29-32和43-49及其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NO.26、27和33-42)、編碼這些分子的核酸、具有所述核酸的載體以及具有所述載體、核酸或肽的細(xì)胞也是實(shí)施方案。此外，此處所述的某些組合物包含病毒唑以及至少一種上述HCV肽突變體、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段。其它疫苗實(shí)施方案包含病毒唑以及編碼一種或多種上述肽的核酸(例如DNA)。
制備和使用上述組合物的方法也是實(shí)施方案。例如，通過提供病毒唑、提供抗原(例如包含HCV抗原的肽或編碼所述肽的核酸)以及將所述病毒唑與所述抗原混合以配制可用于增強(qiáng)或促進(jìn)受試者對所述抗原免疫應(yīng)答的組合物，可以制備上述組合物。優(yōu)選的方法要求將優(yōu)選抗原或表位(例如包含SEQ.ID.NO.1、6、7或17、或其特定片段如SEQ.ID.NO.1的1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971、1972-3011氨基酸的肽以及編碼這些分子的核酸)與病毒唑混合。其它抗原或表位也可以與病毒唑混合，包括而不限于具有SEQ.ID.NO.1至少2500、2000、1600、1200、800、400、200、100、50、10或3個連續(xù)氨基酸的片段以及編碼這些片段的核酸。特別優(yōu)選的方法涉及制備包含新發(fā)現(xiàn)的NS3/4A片段或NS3/4A突變體(例如截短的突變體或缺少蛋白水解裂解位點(diǎn)的突變體)、或其至少4個氨基酸長度的片段、或編碼一種或多種這些分子的核酸的疫苗組合物。
增強(qiáng)或促進(jìn)動物、包括人對抗原免疫應(yīng)答的方法是本發(fā)明的實(shí)施方案。例如，通過鑒別需要對抗原/表位有效免疫應(yīng)答的動物，并提供所述動物包含抗原/表位以及有效增強(qiáng)或促進(jìn)對抗原/表位免疫應(yīng)答的相當(dāng)數(shù)量病毒唑的組合物，可以實(shí)現(xiàn)這種方法。在某些實(shí)施方案中，病毒唑和抗原分別給予，而不是在單一混合物中。在這種情況下，優(yōu)選在給予抗原之前或之后短時間給予病毒唑。優(yōu)選的方法包括提供有此需要的動物病毒唑和肝炎抗原(例如HAV抗原、HBV抗原、HCV抗原、編碼這些分子的核酸或其任意組合)。其中某些方法包括HCV抗原，例如包含SEQ.ID.NO.1或其具有SEQ.ID.NO.1的至少2500、2000、1600、1200、800、400、200、100、50、10或3個連續(xù)氨基酸的片段的肽。另外的方法包括包含病毒唑和SEQ.ID.NO.13的編碼核酸或者編碼一種或多種上述片段的核酸的組合物。
例如，某些優(yōu)選的方法涉及利用組合物(例如疫苗)，其包含病毒唑以及包含SEQ.ID.NO.1或其對應(yīng)于HCV結(jié)構(gòu)域的特定片段的肽，包括但不限于包含SEQ.ID.NO.1的1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或者1972-3011氨基酸的肽。特別優(yōu)選的方法涉及利用疫苗組合物，其包含SEQ.ID.NO.17的NS3/4A片段或缺少蛋白水解裂解位點(diǎn)的NS3/4A突變體(例如SEQ.ID.NO..29-32和43-49)、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NO..26、27和33-42)。包含病毒唑以及編碼這些片段的核酸的組合物也可以用于此處所述方法。
其它實(shí)施方案涉及治療和預(yù)防HCV感染的方法。通過一種方法，病毒唑和HCV抗原或表位用于制備治療和/或預(yù)防HCV感染的藥物。通過另一種方法，鑒別需要預(yù)防和/或治療HCV感染的藥物的個體，并提供所述個體包含病毒唑和HCV抗原或表位的藥物，其優(yōu)選SEQ.ID.NO.1所示的表位，更優(yōu)選具有SEQ.ID.NO.1至少2500、2000、1600、1200、800、400、200、100、50、10或3個連續(xù)氨基酸的片段，或最優(yōu)選SEQ.ID.NO.1的例如1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或1972-3011的片段，或編碼SEQ.ID.NO.1或上述片段的核酸。特別優(yōu)選的方法涉及利用疫苗組合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.17的NS3/4A片段或缺少蛋白水解裂解位點(diǎn)的NS3/4A突變體(例如SEQ.ID.NO..29-32和43-49)、或其至少3、4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NO..25-27和33-42)、編碼一種或多種這些分子的核酸。下節(jié)更詳細(xì)討論了病毒唑作為佐劑的用途。
病毒唑可以根據(jù)草藥藥劑學(xué)的以生產(chǎn)給予動物(例如包括人在內(nèi)的哺乳動物)的藥物的常規(guī)方法制備此處所述組合物。病毒唑可以從市場供應(yīng)商處獲得(例如Sigma和ICN)。病毒唑和/或抗原可以經(jīng)過或未經(jīng)改變而配制成疫苗。例如，病毒唑和/或抗原可以改變或衍生，以制備更為穩(wěn)定的分子和/或更有效的佐劑。通過一種方法，可以將分子偶聯(lián)到支持物，例如親水聚合物(例如聚乙二醇)，從而能增強(qiáng)病毒唑和/或抗原的穩(wěn)定性。
利用合理藥物設(shè)計和組合化學(xué)的常規(guī)方法可以產(chǎn)生很多的病毒唑衍生物。例如，Molecular Simulations Inc.(MSI)以及其它許多供應(yīng)商，提供能使技術(shù)人員構(gòu)建有機(jī)分子組合文庫的軟件。例如，C2.AnalogBuilder程序可以整合MSI的Cerius2分子多樣性軟件套件，以產(chǎn)生病毒唑衍生物文庫，其能夠用于此處所述實(shí)施方案。(例如參見http//msi.com/life/products/cerius2/index.html)。
通過一種方法，在計算機(jī)可讀介質(zhì)上記錄病毒唑的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可由一種或多種模建軟件應(yīng)用程序訪問。C2.Analog Builder程序與C2Diversity程序聯(lián)用，可以使用戶基于例如每個取代基位置的R-基團(tuán)的多樣性，而產(chǎn)生非常大的虛擬文庫。然后利用常規(guī)化學(xué)方法制備或可以從商業(yè)來源獲得在虛擬文庫中創(chuàng)造的與模建病毒唑衍生物結(jié)構(gòu)相同的化合物。
然后利用試驗篩選新制備的病毒唑衍生物，確定分子的佐劑活性大小和/或其調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答能力的大小。某些試驗可以包括虛擬的藥物篩選軟件，例如C2.Ludi。C2.Ludi軟件程序使用戶探測分子(例如病毒唑衍生物)數(shù)據(jù)庫，確定其與目的蛋白質(zhì)(例如RAC2或另一種GTP結(jié)合蛋白質(zhì))的活性部位相互作用的能力。以虛擬藥物篩選軟件發(fā)現(xiàn)的預(yù)測的相互作用為基礎(chǔ)，利用常規(guī)試驗確定佐劑活性和/或分子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的大小，按另外特征排列病毒唑衍生物的優(yōu)先次序。實(shí)施例1描述了用于評價病毒唑的佐劑活性的若干試驗。
實(shí)施例1下列試驗可用于任何病毒唑衍生物或病毒唑衍生物的組合，以確定特定組合物的佐劑活性程度。第一組實(shí)驗中，在第0和第4周用10μg或100μg重組丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)3(rNS3)蛋白質(zhì)i.p(腹膜內(nèi))或s.c.(皮下)(例如在尾尖)免疫每組3-5只Balb/c小鼠(BK Universal，Uppsala，Sweden)。rNS3溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或包含1mg病毒唑(得自ICN，Costa Mesa，CA)的PBS。小鼠每次注射總體積100μl。
在首次i.p.免疫后2、4和6周，所有小鼠通過后眼窩放血取樣。收集血清樣品，分析針對rNS3抗體的存在。為確定抗體滴度，進(jìn)行酶免疫分析(EIA)。(例如參見Hultgren等人，J Gen Virol.792381-91(1998)和Hultgren等人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.4630-632(1997))。將405nm處光密度超過非免疫小鼠兩倍時的最高血清稀釋度，記為抗體水平。
接受混合1mg病毒唑的10μg或100μg rNS3的PBS的小鼠，一致顯示較高水平的NS3抗體。免疫2周后EIA檢測的抗體滴度如表1所示。具有1mg病毒唑以及10μg或100μg rNS3的疫苗制劑誘導(dǎo)的抗體滴度顯著高于僅由rNS3組成的疫苗制劑。
第二組實(shí)驗中，在第0和第4周用包含0mg、1mg、3mg或10mg病毒唑(Sigma)的10μg或50μg rNS3的100μl磷酸鹽緩沖鹽水腹膜內(nèi)免疫每組8只Balb/c小鼠。在第4、6和8周，小鼠取血，分離血清并冷凍。研究完成以后，如上所述測試血清的重組NS3抗體的水平。利用Student＇s t檢驗(參數(shù)分析)或Mann-Whitney(非參數(shù)分析)以及StatView4.5程序包(Abacus Concepts，Berkely，CA)對rNS3的平均抗體水平進(jìn)行組間比較。病毒唑以3個劑量加入10μg NS3時，其佐劑效應(yīng)列于表1。病毒唑以3個劑量加入50μg NS3時，其佐劑效應(yīng)列于表2。接受不同的10μg或50μg rNS3以及不同劑量病毒唑的小鼠，其平均rNS3抗體滴度的參數(shù)比較分別列于表3和4。接受不同的10μg或50μg rNS3以及不同劑量病毒唑的小鼠，其平均NS3抗體滴度的非參數(shù)比較分別列于表5和6。給出的數(shù)值代表重組rNS3的終點(diǎn)滴度。
表1
表2
表3
表4
顯著性水平NS＝不顯著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01；***＝p＜0.001
表5
表6
顯著性水平NS＝不顯著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01；***p＜0.001
上述數(shù)據(jù)證明，病毒唑促進(jìn)或增強(qiáng)對HCV抗原或HCV表位的免疫應(yīng)答。用包含僅僅1mg病毒唑和10μg rNS3抗原的疫苗組合物免疫以后，激發(fā)了對rNS3的有效免疫應(yīng)答。上述數(shù)據(jù)也提供了證據(jù)，表明足以促進(jìn)25-30g小鼠對抗原免疫應(yīng)答的病毒唑的量介于每次注射1-3mg。然而，應(yīng)該明白該量僅僅意在指導(dǎo)，而不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的范疇。盡管如此，數(shù)據(jù)表明包含大約1-3mg劑量病毒唑的疫苗組合物，誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答比沒有病毒唑激發(fā)的免疫應(yīng)答高出12倍多(表3和4)。因此，病毒唑?qū)游矬w液免疫應(yīng)答具有顯著的佐劑效應(yīng)，從而增強(qiáng)或促進(jìn)對抗原的免疫應(yīng)答。以下實(shí)施例描述了為更好理解增強(qiáng)或促進(jìn)對抗原免疫應(yīng)答所需的病毒唑量進(jìn)行的實(shí)驗。
實(shí)施例2為確定足以提供佐劑效應(yīng)的病毒唑劑量，進(jìn)行下列實(shí)驗。第一組實(shí)驗中，用單獨(dú)20μg rNS3或20μg rNS3與0.1mg、1mg或10mg病毒唑的混合物免疫各組小鼠(每組3只)。然后通過EIA測定針對抗原的抗體水平。繪制第1和第3周的平均終點(diǎn)滴度曲線，如圖2所示。發(fā)現(xiàn)病毒唑提供的佐劑效應(yīng)依賴所提供病毒唑的劑量而具有不同的動力學(xué)。例如，發(fā)現(xiàn)低劑量(＜1mg)病毒唑甚至在第1周而不是第3周增強(qiáng)抗體水平，然而發(fā)現(xiàn)較高劑量(1-10mg)在第3周增強(qiáng)抗體水平。
也進(jìn)行了第二組實(shí)驗。在這些實(shí)驗中，各組小鼠注射包含不同量病毒唑和rNS3的疫苗組合物，并監(jiān)控這些動物中的IgG應(yīng)答。疫苗組合物包含大約100μl磷酸鹽緩沖鹽水和20μg rNS3，以及含或不含0.1mg、1.0mg或10mg病毒唑(Sigma)。第6周小鼠取血，如前所述通過EIA確定rNS3特異性IgG水平。如表7所示，對25-30g小鼠在每次注射1-10mg劑量范圍內(nèi)，維持抗體水平的佐劑效應(yīng)最顯著。
表7
第三組實(shí)驗中，研究首次和加強(qiáng)注射后病毒唑的佐劑效應(yīng)。在這些實(shí)驗中，小鼠兩次腹膜內(nèi)注射包含10μg rNS3以及含或不含病毒唑的疫苗組合物，如前所述監(jiān)控對抗原的IgG亞類應(yīng)答。相應(yīng)的，在第0周和第4周用包含單獨(dú)10μg重組NS3、含或不含0.1或1.0mg病毒唑(Sigma)的100μl磷酸鹽緩沖液免疫小鼠。第6周小鼠取血，如前所述通過EIA確定NS3特異性IgG亞類。如表8所示，注射之前于免疫原中加入病毒唑，不改變NS3特異性免疫應(yīng)答中IgG亞類應(yīng)答。因此，Th1/Th2平衡的改變無法解釋包含病毒唑和抗原的疫苗組合物的佐劑效應(yīng)。似乎另一機(jī)理可能負(fù)責(zé)病毒唑的佐劑效應(yīng)。
表8
本實(shí)施例的數(shù)據(jù)另外證明，病毒唑可以作為佐劑給藥，并證實(shí)病毒唑的劑量可以調(diào)節(jié)佐劑效應(yīng)的動力學(xué)。以下實(shí)施例描述了為評價病毒唑增強(qiáng)或促進(jìn)對抗原免疫應(yīng)答的能力進(jìn)行的另一項試驗。
實(shí)施例3這項試驗可用于任何病毒唑衍生物或病毒唑衍生物的組合，以確定特定疫苗制劑調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答的程度。為了確定CD4+T細(xì)胞對包含病毒唑疫苗的應(yīng)答，用100μg rNS3的PBS或者100μg rNS3和1mg病毒唑的PBSs.c.免疫各組小鼠。免疫10天后處死小鼠，采集其淋巴結(jié)并引流(drain)。然后進(jìn)行體外記憶試驗。(例如參見Hultgren等人，J Gen Virol.792381-91(1998)以及Hultgren等人，Clin.Diagn.Lab.Jmnmnol.4630-632(1997))。由培養(yǎng)96h摻入的[3H]胸苷測定CD4+T細(xì)胞增殖量。
如圖3所示，用混合1mg病毒唑的100μg rNS3免疫的小鼠，其T細(xì)胞增殖應(yīng)答比用100μg rNS3的PBS免疫的小鼠大很多。這些數(shù)據(jù)提供了病毒唑增強(qiáng)或促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答(例如，通過促進(jìn)有效致敏T細(xì)胞)的進(jìn)一步證據(jù)。下節(jié)討論可用于此處所述實(shí)施方案的一些抗原和表位。
抗原和表位實(shí)際上能用于在動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的任何抗原都可以與病毒唑組合，以制備此處所述組合物。也就是說，能夠摻入該組合物(例如疫苗)的抗原包含細(xì)菌抗原或表位、真菌抗原或表位、植物抗原或表位、霉菌抗原或表位、病毒抗原或表位、癌細(xì)胞抗原或表位、毒素抗原或表位、化學(xué)抗原或表位以及自身抗原或表位。盡管這些分子中許多無需佐劑誘導(dǎo)顯著的免疫應(yīng)答，病毒唑能夠連同或結(jié)合＂強(qiáng)＂或＂弱＂抗原或表位而給藥，以增強(qiáng)或促進(jìn)對所述抗原或表位的免疫應(yīng)答。此外，利用病毒唑為佐劑可以允許使用更少量的抗原而保持免疫原性。
除肽抗原之外，基于核酸的抗原可用于此處所述疫苗組合物。已知多種基于核酸的疫苗，預(yù)期通過利用病毒唑重新配制，能夠加強(qiáng)這些組合物以及免疫治療方法。(例如參見U.S.Pat.No.5,589,466和6,235,888)。例如，通過一種方法，編碼目的多肽抗原的基因克隆到引入受試者中能夠表達(dá)該多肽的表達(dá)載體。利用與病毒唑的混合物或者連同病毒唑一起(例如，在表達(dá)構(gòu)建體之后不久，于相同位點(diǎn)給予病毒唑)，將該表達(dá)構(gòu)建體引入受試者。另選地，利用與病毒唑的混合物或者連同病毒唑一起，將編碼目的多肽抗原的RNA提供給受試者。
抗原是DNA時(例如DNA疫苗組合物制劑)，可以使用合適啟動子，包括猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、人類免疫缺陷性病毒(HIV)例如HIV長末端重復(fù)(LTR)啟動子、莫洛尼(Moloney)病毒、ALV、巨細(xì)胞病毒(CMV)例如CMV立即早期啟動子、Epstein Barr病毒(埃-巴二氏病毒，EB病毒)(EBV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)以及人類基因例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和人金屬硫蛋白的啟動子。某些實(shí)施方案，特別是生產(chǎn)人基因疫苗中利用的多腺苷酸化信號的實(shí)例，包括而不限于SV40多腺苷酸化信號和LTR多腺苷酸化信號。特別使用pCEP4質(zhì)粒(Invitrogen，San Diego Calif.)中的SV40多腺苷酸化信號(稱為SV40多腺苷酸化信號)。
除基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)元件之外，基因構(gòu)建體中還可能包括其它元件。這些另外的元件包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可能選自包括而不限于人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸以及病毒增強(qiáng)子，例如來自CMV、RSV和EBV。基因構(gòu)建體能夠具備哺乳動物復(fù)制起點(diǎn)，以使該構(gòu)建體在染色體外維持并于細(xì)胞中產(chǎn)生多拷貝的構(gòu)建體。Invitrogen(San Diego，CA)的質(zhì)粒pCEP4和pREP4包含Epstein Barr病毒復(fù)制起點(diǎn)以及核抗原EBNA-1編碼區(qū)，其不整合而產(chǎn)生高拷貝的附加型復(fù)制。一切形式的DNA，不論復(fù)制型或非復(fù)制型，只要不整合到基因組中，并且可以表達(dá)，都可以使用。以下實(shí)施例描述了包含基于核酸的抗原以及病毒唑的組合物的用途。
實(shí)施例4以下描述了用包含基于核酸的抗原以及病毒唑的疫苗免疫動物。5-6周齡雌雄Balb/c小鼠通過腹膜內(nèi)注射0.3ml 2.5％阿佛丁(Avertin)進(jìn)行麻醉。在前大腿造成1.5cm切口，四頭肌直接可見。一組小鼠注射大約20:g具有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子驅(qū)動的gp-120基因的表達(dá)構(gòu)建體，另一組小鼠注射大約5:g編碼gp-120的加帽的體外轉(zhuǎn)錄RNA(例如SP6、T7或T3(Ambion))。這兩組是對照。第三組小鼠注射與1mg病毒唑混合的大約20:g具有g(shù)p-120基因和CMV啟動子的表達(dá)載體，第四組小鼠注射與1mg病毒唑混合的大約5:g加帽的體外轉(zhuǎn)錄RNA。疫苗在0.1ml溶液中通過1cc注射器27口徑針頭注射一分鐘，從肌肉遠(yuǎn)端插入點(diǎn)大約0.5cm處插入膝部大約0.2cm深。為將來定位，注射部位放置縫線，用不銹鋼夾封閉皮膚。
注射前(第0天)直到注射后40天以上獲取血樣。各樣品血清系列稀釋，利用酵母中制備的重組gp-120蛋白質(zhì)為抗原，以標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)分析檢測抗體。所有樣品都將檢測到gp-120特異性的IgG和IgM抗體，但根據(jù)血清中檢測的抗體量和/或滴度測量包含病毒唑的第3和第4組將具有較高的對gp-120的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案包含病毒唑和病毒優(yōu)選肝炎病毒抗原或表位。例如，組合物包含病毒唑和HAV抗原、HBV抗原、HCV抗原、或一種或多種這些病毒上這些抗原和表位的任何組合。肝炎抗原可以是肽或核酸。例如，可用于抗HAV感染接種的組合物包含病毒唑以及具有SEQ ID.NO.12的長度為至少3-10個連續(xù)氨基酸、10-50個連續(xù)氨基酸、50-100個連續(xù)氨基酸、100-200個連續(xù)氨基酸、200-400個連續(xù)氨基酸、400-800個連續(xù)氨基酸、800-1200個連續(xù)氨基酸、1200-1600個連續(xù)氨基酸、1600-2000個連續(xù)氨基酸以及2000-2227個連續(xù)氨基酸的HAV肽。
此外，上述包含病毒唑和編碼一種或多種HAV肽的核酸的組合物可以用于治療或預(yù)防HAV感染。優(yōu)選的基于核酸的抗原包括HAV序列的至少9個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列(例如SEQ.ID.NO.15)。也就是說，基于核酸的抗原可以包含SEQ.ID.NO.15的至少9-25個連續(xù)核苷酸、25-50個連續(xù)核苷酸、50-100個連續(xù)核苷酸、100-200個連續(xù)核苷酸、200-500個連續(xù)核苷酸、500-1000個連續(xù)核苷酸、1000-2000個連續(xù)核苷酸、2000-4000個連續(xù)核苷酸、4000-8000個連續(xù)核苷酸以及8000-9416個連續(xù)核苷酸、或者對應(yīng)于這些序列的RNA。
類似地，優(yōu)選的HBV疫苗實(shí)施方案包含病毒唑以及HBsAg(SEQ.ID.NO.10)或HBcAg和HBeAg(SEQ.ID.NO.11)的至少3個連續(xù)氨基酸的HBV肽。也就是說，某些實(shí)施方案具有病毒唑以及具有SEQ.ID.NO.10或SEQ.ID.NO.11的長為至少3-10個連續(xù)氨基酸、10-15個連續(xù)氨基酸、50-100個連續(xù)氨基酸、100-150個連續(xù)氨基酸、150-200個連續(xù)氨基酸以及200-226個連續(xù)氨基酸的HBV肽。
此外，上述包含病毒唑和編碼一種或多種HBV肽的核酸的組合物，可以用于治療或預(yù)防HBV感染。優(yōu)選的基于核酸的抗原包括HBV的至少9個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列(例如SEQ.ID.NO.14)。也就是說，基于核酸的抗原可以包含SEQ.ID.NO.14的至少9-25個連續(xù)核苷酸、25-50個連續(xù)核苷酸、50-100個連續(xù)核苷酸、100-200個連續(xù)核苷酸、200-500個連續(xù)核苷酸、500-1000個連續(xù)核苷酸、1000-2000個連續(xù)核苷酸、2000-4000個連續(xù)核苷酸、4000-8000個連續(xù)核苷酸以及8000-9416個連續(xù)核苷酸、或者對應(yīng)于這些序列的RNA。以下實(shí)施例描述了病毒唑連同商品化HBV疫苗制劑的用途。
實(shí)施例5與包含HBsAg和明礬的兩個劑量商品化疫苗(Engerix，SKB)混合，測定病毒唑的佐劑效應(yīng)。大約0.2μg或2μg Engerix疫苗與PBS或1mg病毒唑的PBS混合，混合物腹膜內(nèi)注射各組小鼠(每組3只)。第4周給與包含相同混合物的加強(qiáng)劑量，所有小鼠第6周取血。血清樣品從1∶60稀釋到1∶37500，如上所述EIA測定稀釋物，只是以純化的人HBsAg用作固相抗原。如表9所示，具有病毒唑的疫苗制劑增強(qiáng)對2μg現(xiàn)有疫苗的應(yīng)答，即使該疫苗已經(jīng)含有明礬。也就是說，通過將病毒唑加入亞適疫苗劑量(即單獨(dú)不誘導(dǎo)可檢測抗體的劑量)，抗體變得可以檢測，提供證據(jù)證明加入病毒唑可以使在疫苗制劑中使用較低的抗原量，而不影響免疫應(yīng)答。
表9
某些HCV疫苗組合物包含病毒唑和SEQ.ID.NO.1的至少3個連續(xù)氨基酸的HCV肽、或者編碼所述HCV肽的核酸。也就是說，疫苗組合物可以包含病毒唑以及具有SEQ ID.NO.12的長度至少為3-10個連續(xù)氨基酸、10-50個連續(xù)氨基酸、50-100個連續(xù)氨基酸、100-200個連續(xù)氨基酸、200-400個連續(xù)氨基酸、400-800個連續(xù)氨基酸、800-1200個連續(xù)氨基酸、1200-1600個連續(xù)氨基酸、1600-2000個連續(xù)氨基酸、2000-2500個連續(xù)氨基酸以及2500-3011個連續(xù)氨基酸的一種或多種HCV肽、或者編碼一種或多種所述片段的核酸。
優(yōu)選的HCV組合物包含病毒唑以及HCV核心蛋白質(zhì)(SEQ.ID.NO.2)、HCV E1蛋白質(zhì)(SEQ.ID.NO.3)、HCV E2蛋白質(zhì)(SEQ.ID.NO.4)、HCV NS2(SEQ.ID.NO.5)、HCV NS3(SEQ.ID.NO.6)、HCV NS4A(SEQ.ID.NO.7)、HCV NS4B(SEQ.ID.NO.8)或者HCVNS5A/B(SEQ.ID.NO.9)的至少3個連續(xù)氨基酸的肽、或者由這些結(jié)構(gòu)域的組合組成的肽。也就是說，優(yōu)選的HCV疫苗包含病毒唑以及具有(SEQ.ID.NO.2-9)中任意一種或多種的長為至少3-10個連續(xù)氨基酸、10-50個連續(xù)氨基酸、50-100個連續(xù)氨基酸、100-200個連續(xù)氨基酸、200-400個連續(xù)氨基酸、400-800個連續(xù)氨基酸以及800-1040個連續(xù)氨基酸的肽。這些結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于SEQ.ID.NO.1的氨基酸殘基1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或1972-3011。因此，優(yōu)選實(shí)施方案也包括SEQ.ID.NO.1的1-182、183-379、380-729、730-1044、1045-1657、1658-1711、1712-1971或1972-3011中的一種或多種、或其片段。
包含病毒唑以及編碼一種或多種上述肽的疫苗組合物也是實(shí)施方案。優(yōu)選的基于核酸的抗原包括HCV的至少9個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.13)。也就是說，基于核酸的抗原可以包含SEQ.ID.NO.13中任何一個的至少9-25個連續(xù)核苷酸、25-50個連續(xù)核苷酸、50-100個連續(xù)核苷酸、100-200個連續(xù)核苷酸、200-500個連續(xù)核苷酸、500-1000個連續(xù)核苷酸、1000-2000個連續(xù)核苷酸、2000-4000個連續(xù)核苷酸、4000-8000個連續(xù)核苷酸以及8000-9416個連續(xù)核苷酸、或者對應(yīng)于這些序列的RNA。下節(jié)討論包含病毒唑和抗原的某些組合物。
包含病毒唑和抗原的組合物包含病毒唑和病原體(例如病毒、細(xì)菌、霉菌、酵母和寄生蟲)的抗原或表位的組合物(例如疫苗)可能包含其它成分，包括但不限于佐劑、粘合劑、賦形劑例如穩(wěn)定劑(以促進(jìn)長期儲存)、乳化劑、增稠劑、鹽、防腐劑、溶劑、分散劑、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑以及吸收延遲劑等。這些組合物適合于治療動物，作為預(yù)防措施避免疾病或不適、或者作為治療手段治療已經(jīng)受疾病或不適折磨的動物。
疫苗中可以存在其它許多成分。例如，病毒唑和抗原可以與常規(guī)賦形劑(例如不與病毒唑和/或抗原發(fā)生有害反應(yīng)的、適于腸道外、腸內(nèi)(例如經(jīng)口)或局部施用的、藥學(xué)可接受的有機(jī)或無機(jī)載體物質(zhì))混合使用。藥學(xué)可接受的合適載體包括而不限于水、鹽溶液、醇、阿拉伯膠、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物例如乳糖、直鏈淀粉或淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、芳香油、脂肪酸、甘油一酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羥基甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。Remmington＇s Pharmaceutical Sciences，第15版，EastonMack Publishing Company，1405-1412和1461-1487頁(1975)以及The National Formulary XIV，第14版，Washington，AmericanPharmaceutical Association(1975)描述了更多的合適載體。
此處所述基因構(gòu)建體可能用試劑配制或連同試劑一起給藥，相對于缺少該試劑時給予相同基因疫苗時細(xì)胞對基因構(gòu)建體的攝取和表達(dá)，該試劑增加細(xì)胞攝取和/或表達(dá)該基因構(gòu)建體。1993.1.26申請的美國系列No.08/008,342、1993.3.11申請的美國系列No.08/029,336、1993.9.21申請的美國系列No.08/125,012、1994.1.26申請的PCT專利申請序號PCT/US94/00899以及1994.4.1申請的美國系列No.08/221,579中描述了該試劑及其連同基因構(gòu)建體的給藥規(guī)程。該試劑的實(shí)例包括CaPO4，DEAE葡聚糖，陰離子脂類；細(xì)胞外基質(zhì)活化酶類；皂甙類；凝集素類；雌激素化合物和甾類激素；羥基化低級烷；二甲基亞砜(DMSO)；脲；以及苯甲酸酯?；桨?anilides)、脒、氨基甲酸乙酯及其鹽酸鹽，例如局部麻醉劑家族。此外，該基因構(gòu)建體封進(jìn)脂類/聚陽離子復(fù)合物膠囊內(nèi)部，或連同脂類/聚陽離子復(fù)合物一起給藥。
疫苗可以被滅菌，并且如果需要，可以混合輔助劑，例如不與病毒唑或抗原發(fā)生有害反應(yīng)的潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香物質(zhì)等。
可以根據(jù)患者個體和疾病的類型與階段，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素，改變特定疫苗制劑給藥的有效劑量和方法。利用細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游锏臉?biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序，例如ED50(50％群體的有效治療劑量)，確定疫苗的療效和毒性。細(xì)胞培養(yǎng)分析和動物研究獲取的數(shù)據(jù)，可用于制訂人用劑量范圍。疫苗劑量最好處于包括ED50而無毒的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。在此范圍內(nèi)，依賴病毒唑衍生物和抗原的類型、使用的劑型、患者的敏感性以及給藥途徑而改變劑量。
病毒唑已經(jīng)上市幾年了，已知很多劑型和給藥途徑。此處所述實(shí)施方案的范圍內(nèi)可以提供所有已知的劑型和給藥途徑。優(yōu)選地，有效增強(qiáng)動物對抗原免疫應(yīng)答的病毒唑量可以認(rèn)為是足以在動物中達(dá)到大約0.25-12.5μg/ml、優(yōu)選大約2.8μg/ml的抗原血清水平的量。某些實(shí)施方案中，根據(jù)給予疫苗的動物的體重確定病毒唑的量。因此，疫苗制劑中病毒唑的量可以為大約0.1-6.0mg/kg體重。也就是說，某些實(shí)施方案具有相當(dāng)于大約0.1-1.0mg/kg、1.1-2.0mg/kg、2.1-3.0mg/kg、3.1-4.0mg/kg、4.1-5.0mg/kg、5.1和6.0mg/kg動物體重的病毒唑的量。疫苗更常規(guī)包含大約0.25mg-2000mg病毒唑的毒唑的量。也就是說，某些實(shí)施方案具有大約250μg、500μg、1mg、25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g和2g的病毒唑。
可以通過加入足以增強(qiáng)對抗原免疫應(yīng)答的相當(dāng)數(shù)量病毒唑而改變常規(guī)疫苗制劑。也就是說，通過制劑中簡單加入病毒唑，或者通過連同病毒唑施用常規(guī)疫苗(例如在提供抗原之前或之后不久)，可以改變現(xiàn)有常規(guī)疫苗制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，疫苗中抗原量可以依賴抗原類型及其免疫原性而變化?？梢韵鄳?yīng)地改變疫苗中抗原數(shù)量。盡管如此，作為一般指導(dǎo)，疫苗可以具有大約0.25mg-5mg、5-10mg、10-100mg、100-500mg以及2000mg以上的抗原(例如肝炎病毒抗原)。
此處所述某些方法中，由醫(yī)生個人考慮所治療的患者選擇精確的病毒唑和/或抗原量。另外，病毒唑的量可以與相同或相當(dāng)量的抗原聯(lián)合或分別加入，在特定疫苗接種程序期間可以根據(jù)特定患者或特定抗原的因素調(diào)整這些量，以便提供充足水平。因此，可以考慮的特定患者和特定抗原的因素包括而不限于，患者疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、年齡和患者體重、飲食、給藥時間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性以及對治療的耐受/反應(yīng)。下節(jié)描述可用于此處所述實(shí)施方案的新的HCV基因的發(fā)現(xiàn)以及突變體HCV序列的制備。
新的NS3/44和突變體NS3/44序列從感染HCV患者克隆了新的核酸以及對應(yīng)于HCV NS3/4A結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(SEQ.ID.NOs.16和17)。檢索Genebank，顯示該克隆序列與HCV序列具有最大的同源性，但與最接近的HCV親本只有93％同源性(登錄號AJ 278830)。也制備了新NS3/4A肽的截短突變體以及缺少蛋白水解裂解位點(diǎn)的NS3/4A突變體。發(fā)現(xiàn)這些新肽和編碼所述肽的核酸是有效的免疫原，其可以混合病毒唑，從而制備提供受者對HCV有效免疫應(yīng)答的組合物。以下實(shí)施例描述了新NS3/4A結(jié)構(gòu)域的克隆以及各種NS3/4A突變體的制備。
實(shí)施例6利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從感染HCV患者(HCV基因型1a)的血清擴(kuò)增NS3/4A序列。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序從血清提取總RNA、合成cDNA、進(jìn)行PCR(Chen M等人，J.Med.Virol.43223-226(1995))。利用反義引物＂NS4KR＂(5＇-CCG TCT AGA TCA GCA CTC TTC CAT TTCATC-3＇(SEQ.ID.NO.18))起始cDNA合成。由此cDNA擴(kuò)增2079bp的HCV DNA片段，對應(yīng)于包含NS3和NS4A基因的1007-1711氨基酸。高保真度聚合酶(Expand High Fidelity PCR，Boehringer-Mannheim，Mannheim，Germany用于＂NS3KF＂引物(5＇-CCT GAA TTC ATG GCG CCT ATC ACG GCC TAT-3＇(SEQ.ID.NO.19)和NS4KR引物。NS3KF引物包含EcoRI限制酶裂解位點(diǎn)和起始密碼子，NS4KR引物包含XbaI限制酶裂解位點(diǎn)和終止密碼子。
然后測序擴(kuò)增的片段SEQ.ID.NO.16。序列比較分析揭示，該基因片段確實(shí)擴(kuò)增自基因型1a的病毒株。利用NCBI站點(diǎn)對Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行計算機(jī)BLAST檢索，揭示最靠近的HCV同源物具有93％的核苷酸序列一致性。
然后用EcoRI和XbaI消化擴(kuò)增的DNA片段，插入用相同酶消化的pcDNA3.1/His質(zhì)粒(Invitrogen)。然后用EcoRI和Xba I消化質(zhì)粒NS3/4A-pcDNA3.1，利用QiaQuick試劑盒(Qiagen，Hamburg，Germany)純化插入片段，連接到EcoRI/Xba I消化的pVAX載體(Invitrogen)，得到NS3/4A-pVAX質(zhì)粒。
通過缺失NS3/4A DNA的NS4A序列，獲得rNS3截短突變體。相應(yīng)地，利用分別包含EcoRI和Not I限制性位點(diǎn)的引物NS3KF和3＇NotI(5＇-CCA CGC GGC CGC GAC GAC CTA CAG-3＇(SEQ.ID.NO.20))，PCR擴(kuò)增NS3/4A-pVAX的NS3基因序列。NS3片段(1850bp)然后連接EcoRI和Not I消化的pVAX質(zhì)粒，得到NS3-pVAX載體。質(zhì)粒在BL21大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中擴(kuò)增。質(zhì)粒測序，利用限制性裂解檢驗，結(jié)果與依據(jù)原始序列所預(yù)期的一致。
為改變NS3和NS4A之間的蛋白水解裂解位點(diǎn)，利用QUICKCHANGETM誘變試劑盒(Stratagene)，按照廠家說明，誘變NS3/4A-pVAX質(zhì)粒。為產(chǎn)生＂TPT＂突變，利用引物5＇-CTGGAGGTCGTCACGCCTACCTGGGTGCTCGTT-3＇(SEQ.ID.NO.21)和5＇-ACCGAGCACCCAGGTAGGCGTGACGACCTCCAG-3＇(SEQ.TD.NO.22)擴(kuò)增質(zhì)粒，得到NS3/4A-TPT-pVAX。為產(chǎn)生＂RGT＂突變，利用引物5＇-CTGGAGGTCGTCCGCGGTACCTGGGTGCTCGTT-3＇(SEQ.ID.NO.23)和5＇-ACCGAGCACCCAGGTACC-GCGGACGACCTCCAG-3＇(SEQ.ID.NO.24)擴(kuò)增質(zhì)粒，得到NS3/4A-RGT-pVAX。
測序所有誘變構(gòu)建體以驗證已經(jīng)正確產(chǎn)生了突變。質(zhì)粒在感受態(tài)BL21大腸桿菌中擴(kuò)增。根據(jù)廠家說明(Qiagen GmbH，Hilden，F(xiàn)RG)，利用Qiagen DNA純化柱純化用來體內(nèi)注射的質(zhì)粒DNA。分光光度法(Dynaquant，Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)測定得到的質(zhì)粒DNA的濃度，純化的DNA以1mg/ml濃度溶于無菌磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)中。野生型和突變接頭的氨基酸序列如表10所示。下節(jié)描述編碼HCV肽的若干核酸。
表10質(zhì)粒 推測的氨基酸序列*NS3/4A-pVAX TKYMTCMSADLEVVTSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.25)NS3/4A-TGT-pVAX TKYMTCMSADLEVVTGTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.26)NS3/4A-RGT-pVAX TKYMTCMSADLEVVRGTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.27)NS3/4A-TPT-pVAX TKYMTCMSADLEVVTPTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.33)NS3/4A-RPT-pVAX TKYMTCMSADLEVVRPTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.34)NS3/4A-RPA-pVAX TKYMTCMSADLEVVRPAWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.35)NS3/4A-CST-pVAX TKYMTCMSADLEVVCSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.36)NS3/4A-CCST-pVAX TKYMTCMSADLEVCCSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.37)NS3/4A-SSST-pVAX TKYMTCMSADLEVSSSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.38)NS3/4A-SSSSCST-pVAX TKYMTCMSADSSSSCSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.39)NS3A/4A-VVVVTST-pVAX TKYMTCMSADVVVVTSTWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.40)NS5-pVAX ASEDVVCCSMSYTWTG(SEQ.ID.NO.41)NS5A/B-pVAX SSEDVVCCSMWVLVGGVL(SEQ.ID.NO.42)*NS3/4A片段的野生型序列是NS3/4A-pVAX。NS3/4A斷裂點(diǎn)由下劃線標(biāo)出，其中P1位置對應(yīng)第一個Thr(T)，P1＇位置對應(yīng)NS3/4A-pVAX序列的下一個后續(xù)氨基酸。野生型NS3/4A序列中，NS3蛋白酶在P1和P1＇位置之間斷裂。
編碼HCV肽的核酸核酸實(shí)施方案包括此處所述編碼HCV肽的核苷酸(例如SEQ.ID.NO.17、29、31、32和43-49)或其至少4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NOs.25-27以及33-42)。例如，某些實(shí)施方案包括編碼這些HCV肽的基因組DNA、RNA以及cDNA。HCV核苷酸實(shí)施方案不僅包括序列表所示DNA序列(例如SEQ.ID.NO.16)，而且包括編碼序列表所示氨基酸順序的核苷酸序列(例如SEQ.ID.NO.17)，以及在嚴(yán)謹(jǐn)條件(例如，在0.5 M NaHPO4、7.0％十二烷基磺酸鈉(SDS)、1mM EDTA、50℃下與結(jié)合濾膜的DNA雜交)以及0.2 X SSC/0.2％SDS、50℃洗滌條件下與序列表所示DNA序列雜交的任何核苷酸序列，以及在較低嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下(例如在0.5MNaHPO4、7.0％十二烷基磺酸鈉(SDS)、1mM EDTA、37℃雜交，于0.2XSSC/0.2％SDS、37℃洗滌)與編碼序列表提供的氨基酸序列(SEQ.ID.NOs.17)的DNA序列雜交的任何核苷酸序列。
核酸實(shí)施方案也包括上述序列的片段、修飾物、衍生物以及變體。例如，理想實(shí)施方案包括具有一個新的HCV序列的至少12個連續(xù)堿基的核酸或其互補(bǔ)序列，優(yōu)選片段包括編碼SEQ.ID.NO.17的NS3/4A分子的核酸的至少12個連續(xù)堿基或其互補(bǔ)序列。
在這方面，本發(fā)明核酸實(shí)施方案可以具有12-約2079個連續(xù)核苷酸。例如，本發(fā)明的某些DNA片段包括具有SEQ.ID.NO.16的至少12-15、15-20、20-30、30-50、50-100、100-200、200-500、500-1000、1000-1500、1500-2079個連續(xù)核苷酸的核酸或其互補(bǔ)序列。核酸實(shí)施方案還可以通過突變例如置換、添加或缺失而改變。例如，由于核苷酸編碼序列的簡并性，編碼與SEQ.ID.NOs17所述基本上相同的HCV氨基酸序列的其它DNA序列可用于某些實(shí)施方案。這些包括而不限于已經(jīng)改變的編碼全部或部分NS3/4A(SEQ.ID.NO.16)的核酸序列，或者與該序列全部或部分互補(bǔ)的核酸，其通過置換為編碼序列內(nèi)部功能等價的氨基酸殘基的不同密碼子而產(chǎn)生沉默變化，或者置換編碼序列內(nèi)部功能不同的氨基酸殘基的不同密碼子而產(chǎn)生可檢測的變化。
利用上述核酸序列，可以設(shè)計與這些分子互補(bǔ)的探針，并通過寡核苷酸合成制備。理想探針包含該HCV分離物特異的的核酸序列(SEQ.ID.NO.16)。這些探針可用于從患者中篩選cDNA，以分離天然來源的HCV，其中有些可能本身即是新的HCV序列。例如，可以通過濾膜雜交或PCR篩選。對于濾膜雜交，標(biāo)記探針優(yōu)選包含該NS3/4A肽特異的(SEQ.ID.NO.16)核酸序列至少15-30bp的堿基對。使用的雜交洗滌條件優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)性的介質(zhì)?？梢栽?.5M NaHPO4、7.0％十二烷基磺酸鈉(SDS)、1mM EDTA中42℃過夜進(jìn)行雜交，在0.2X SSC/0.2％SDS中42℃進(jìn)行洗滌。有關(guān)該條件的指南，參見例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSprings Harbor Press，N.Y.；以及Ausubel等人，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.
還可以利用此處所述核酸從感染HCV的患者分離HCV核酸。(也參見實(shí)施例6)。相應(yīng)地，從感染HCV的患者獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄，利用PCR或另一擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增獲得的cDNA。引物優(yōu)選自NS3/4A序列(SEQ.ID.NO.16)。
PCR技術(shù)的綜述參見Molecular Cloning to Genetic Engineering，White，B.A.Ed.inMethods in Molecular Riology67Humana PressTotowa(1997)以及題為＂PCR Methods and Applications＂(1991，ColdSpring Harbor Laboratory Press)的出版物。在本發(fā)明范疇內(nèi)，為擴(kuò)增mRNA，mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后PCR(RT-PCR)；或者使用如美國專利號5,322,770所述的單個酶進(jìn)行兩步操作。另一技術(shù)涉及利用反轉(zhuǎn)錄酶非對稱性缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse TranscriptaseAsymmetric Gap Ligase Chain Reaction，RT-AGLCR)，如MarshallR.L.等人所述(PCR Methods and Applications 480-84，1994)。
簡言之，按照標(biāo)準(zhǔn)程序分離RNA。利用擴(kuò)增片段的最5＇端寡核苷酸引物作為第一鏈合成的引物，對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后利用標(biāo)準(zhǔn)末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，將得到的RNA/DNA雜合體用鳥嘌呤＂加尾＂。然后用RNAse H消化該雜合體，用poly-C引物引發(fā)第二鏈合成。從而易于分離擴(kuò)增片段上游的cDNA序列。可以使用的克隆策略的綜述，參見例如上述Sambrook等人，1989，同前。
在其中每個擴(kuò)增程序中，待擴(kuò)增序列兩側(cè)的引物均加入適當(dāng)制備的核酸樣品、以及dNTPs和耐熱聚合酶，例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶或Vent聚合酶。樣品中核酸變性，引物與樣品中互補(bǔ)核酸序列特異性雜交。雜交的引物然后延伸。此后，開始另一輪變性、雜交和延伸的循環(huán)。循重復(fù)多次，以產(chǎn)生包含引物位點(diǎn)之間核酸序列的擴(kuò)增片段。若干專利，包括美國專利4,683,195、4,683,202和4,965,188進(jìn)一步描述了PCR。
選擇與NS3/4A分子特有的(SEQ.ID.NO.16)核酸序列的一部分基本上互補(bǔ)的引物，從而使引物之間序列被擴(kuò)增。引物優(yōu)選至少16-20、20-25或25-30個核苷酸長度。穩(wěn)定雜合體的形成有賴于DNA的解鏈溫度(Tm)。Tm取決于引物長度、溶液的離子強(qiáng)度以及G+C含量。G:C對帶有3個氫鍵，而A:T對只有2個，因而引物的G+C含量越高，解鏈溫度越高。此處所述所述擴(kuò)增引物的G+C含量優(yōu)選介于10-75％，更優(yōu)選介于35-60％，最優(yōu)選介于40-55％。在一套特定分析條件下的適當(dāng)?shù)囊镩L度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員按經(jīng)驗確定。
引物間距與欲擴(kuò)增片段的長度有關(guān)。在此處所述實(shí)施方案的范圍內(nèi)，攜帶編碼HCV肽的核酸序列的擴(kuò)增片段，其大小可以從至少大約25bp到全長HCV基因組范圍內(nèi)。典型為25-1000bp擴(kuò)增片段，優(yōu)選為50-1000bp片段，非常優(yōu)選100-600bp片段。應(yīng)當(dāng)理解，擴(kuò)增引物可以是允許特異性擴(kuò)增NS3/4A區(qū)域的任何序列，并且可以例如包括如便于克隆的限制性位點(diǎn)的修改。
可以亞克隆和測序PCR產(chǎn)物以保證擴(kuò)增序列顯示HCV肽序列。然后該P(yáng)CR片段可以通過多種方法用于分離全長cDNA克隆。例如，可以標(biāo)記擴(kuò)增片段，用于篩選cDNA文庫，例如噬菌體cDNA文庫。通過篩選基因組文庫，標(biāo)記片段可另外用于分離基因組克隆。此外，利用例如從感染患者分離的RNA合成的cDNA可以構(gòu)建表達(dá)文庫。照這樣，利用標(biāo)準(zhǔn)抗體篩選技術(shù)連同針對HCV基因產(chǎn)物產(chǎn)生的抗體，可以分離HCV基因產(chǎn)物。(篩選技術(shù)參見例如Harlow，E.和Lane，eds.，1988，AntibodiesA Iaboratory Manual.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor.)。
實(shí)施方案還包括(a)包含任何上述核酸序列和/或其互補(bǔ)序列(即反義序列)的DNA載體；(b)包含與指導(dǎo)該核酸表達(dá)的調(diào)節(jié)元件有效連接的任何上述核酸序列的DNA表達(dá)載體；以及(c)包含與宿主細(xì)胞中指導(dǎo)該編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件有效連接的任何上述核酸序列的基因工程宿主細(xì)胞。這些重組構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制。另外，重組構(gòu)建體可以整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中。這種重組多核苷酸一般包含依靠人工作半合成、或合成的HCV基因組或cDNA多核苷酸。因此，提供包含這些序列及其互補(bǔ)序列的非天然存在的重組核酸。
盡管可以使用天然存在的編碼HCV肽的核酸或者具有HCV基因互補(bǔ)序列的核酸，它們可能常常通過例如缺失、置換或插入而改變，并可以帶有人類不存在的序列。此處所用調(diào)節(jié)元件包括而不限于誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動子、增強(qiáng)子、操縱子以及為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的驅(qū)動和調(diào)節(jié)表達(dá)的其它元件。這種調(diào)節(jié)元件包括而不限于巨細(xì)胞病毒hCMV立即早期基因、SV40腺病毒早期或晚期啟動子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、噬菌體A的主要操縱子和啟動子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶啟動子、酸性磷酸酶啟動子以及酵母α-交配因子的啟動子。
此外，可以改造重組HCV肽的編碼核酸序列及其互補(bǔ)序列，以便改變其加工或表達(dá)。例如，但并非為了限制，此處所述HCV核酸可以結(jié)合啟動子序列和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)，或者在HCV肽編碼序列上游插入信號序列，而使肽分泌，因而便于收集或生物利用。另外，給定的HCV核酸可以在體外或體內(nèi)突變，以產(chǎn)生和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或者在編碼區(qū)引起變異，和/或形成新的限制性位點(diǎn)或破壞先前存在的位點(diǎn)，或便于體外進(jìn)一步改造。(參見實(shí)施例6)。可以使用本領(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)，包括而不限于體外定點(diǎn)誘變。(Hutchinson等人，J.Biol. Chem.，2536551(1978))。
此外，編碼其它蛋白質(zhì)或其它蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的核酸可以連接至HCV肽的編碼核酸以形成融合蛋白質(zhì)。編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸可以包括而不限于與無關(guān)蛋白質(zhì)或肽(例如，如下所述聚組氨酸、紅細(xì)胞凝集素、酶、熒光蛋白質(zhì)或發(fā)光蛋白質(zhì))融合的全長NS3/4A序列(SEQ.ID.NO.16)、截短的NS3/4A序列或NS3/4A序列的肽片段。
令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)NS3-pVAX和NS3/4A-pVAX載體注入免疫活性的哺乳動物時，能夠激發(fā)有效的免疫應(yīng)答。以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述了這些實(shí)驗。
實(shí)施例7為確定NS3-pVAX和NS3/4A-pVAX載體是否激發(fā)體液免疫應(yīng)答，利用Qiagen DNA純化系統(tǒng)，根據(jù)廠家說明書純化實(shí)施例6所述表達(dá)構(gòu)建體，純化的DNA載體用于免疫每組4-10只Balb/c小鼠。質(zhì)粒直接注射進(jìn)再生的脛骨前肌(TA)肌肉中，如前所述。(Davis等人，HumanGene Therapy 4(6)733(1993))。簡言之，小鼠用50ul/TA、0.01mM心臟毒素(Latoxan，Rosans，F(xiàn)rance)的0.9％無菌NaCl肌內(nèi)注射。5天后，各個TA肌肉注射包含rNS3或DNA的50μl PBS。
小鼠近交系C57/13L6(H-2b)Balb/C(H-2d)和CBA(H-2k)得自Mllegard Denmark，Charles River Uppsala，Sweden 或 B&KSollentuna Sweden的育種場。所有小鼠均為雌性，在4-8周齡使用。為了監(jiān)控體液應(yīng)答，所有小鼠每4周接受一次50μl/TA的質(zhì)粒DNA加強(qiáng)注射。此外，給予某些小鼠如此處所述純化的重組NS3(rNS3)蛋白質(zhì)。接受rNS3的小鼠僅僅免疫兩次。所有小鼠每月取血兩次。
酶免疫吸附分析(EIA)用于檢測小鼠NS3抗體的存在?；旧先?Chen等人，Hepatology 28(1)219(1998))所述進(jìn)行這些分析。簡言之，96孔微量滴定板(Nunc，Copenhagen，Denmark)4℃過夜被動吸附50mM碳酸鈉緩沖液(pH9.6)中的1ug/ml rNS3。然后用包含PBS、2％山羊血清和1％牛血清白蛋白的稀釋緩沖液37℃溫育1小時封閉平板。然后，小鼠血清從1∶60開始的系列稀釋物在平板上溫育1小時。利用堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠IgG(Sigma Cell Products，SaintLouis，MO)、隨后加入pNPP底物(1片/5ml的1M二乙醇胺、0.5mMMgCl2緩沖液)，檢測結(jié)合的小鼠血清抗體。加入1M NaOH終止反應(yīng)，讀取405nm吸光度。
4周后，用NS3/4A-pVAX免疫的5只小鼠中4只產(chǎn)生NS3抗體，而用NS3-pVAX免疫的5只小鼠中1只產(chǎn)生抗體(圖4)。6周后，用NS3/4A-pVAX免疫的5只小鼠中4只產(chǎn)生高水平(＞104)NS3抗體(平均水平10800±4830)，1只滴度為2160。盡管用NS3-pVAX免疫的所有小鼠都產(chǎn)生NS3抗體，但均未產(chǎn)生高達(dá)NS3/4A-pVAX構(gòu)建體所產(chǎn)生的水平(平均水平1800±805)。6周時，NS3/4A融合構(gòu)建體激發(fā)的抗體水平顯著高于NS3-pVAX誘導(dǎo)的抗體水平(平均秩7.6對比3.4，p＜0.05，Mann Whitney秩和檢驗，以及p＜0.01，Students t檢驗)。因此，用NS3-pVAX或NS3/4A-pVAX免疫導(dǎo)致抗NS3抗體產(chǎn)生，但NS3/4A融合基因是更有效的免疫原。以下實(shí)施例描述了為確定NS3/4A-TPT-pVAX構(gòu)建體是否激發(fā)有效免疫應(yīng)答而進(jìn)行的實(shí)驗。
實(shí)施例8為測試NS3/4A增強(qiáng)的免疫原性是否可以只歸因于NS4A的存在，或者NS3/4A融合蛋白質(zhì)此外是否必須在NS3/4A接點(diǎn)處斷裂，進(jìn)行新的實(shí)驗。一個實(shí)驗中，在Balb/c小鼠中比較NS3-pVAX、NS3/4A-pVAX和NS3/4A-TPT-pVAX載體的免疫原性。如上所述在第0周免疫小鼠，所有小鼠2周后取血，確定1∶60血清稀釋度時NS3抗體的存在(表11)。小鼠第4周再次取血。雖然NS3/4A-TPT-pVAX載體與NS3-pVAX載體相似(4/10對比0/10；NS，F(xiàn)isher＇s精確檢驗)，但NS3/4A-pVAX載體一直是最有效的免疫原。因此，所有引入小鼠的HCV構(gòu)建體都能激發(fā)針對NS3的免疫應(yīng)答，但是NS4A序列以及位于NS3和NS4A序列之間的功能性蛋白水解斷裂位點(diǎn)提供更有效的免疫應(yīng)答。
表11
在感染的慢性期，HCV在肝細(xì)胞中復(fù)制，肝內(nèi)傳播。對抗慢性和持續(xù)性病毒感染的主要因素是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫防御系統(tǒng)。CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞在HCV感染的慢性期浸潤肝臟，但不能清除病毒或預(yù)防肝損害。此外，持續(xù)性HCV感染與肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生有關(guān)。以下實(shí)施例描述了為確定NS3和NS3/4A構(gòu)建體是否能夠激發(fā)針對NS3的T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答而進(jìn)行的實(shí)驗。
實(shí)施例9為研究上述構(gòu)建體是否能夠激發(fā)針對NS3的細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答，進(jìn)行體內(nèi)腫瘤生長測定。為此制備了用NS3/4A基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SP2/0腫瘤細(xì)胞系。利用BglII消化，將包含NS3/4A基因的pcDNA3.1質(zhì)粒線性化。總共5μg線性化質(zhì)粒DNA與60μg轉(zhuǎn)染試劑(Superfect，Qiagen，Germany)混合，混合物加到35mm平皿中50％貼壁的SP2/0細(xì)胞層。轉(zhuǎn)染的SP2/0細(xì)胞(NS3/4A-SP2/0)在800μg/ml遺傳霉素(geneticin)存在下生長14天，分離單個克隆。利用PCR和RTPCR鑒定穩(wěn)定表達(dá)NS3/4A的SP2/0克隆。克隆的細(xì)胞系在包含10％胎牛血清、L-谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。
然后在Balb/c小鼠中評價SP2/0和NS3/4A-SP2/0細(xì)胞系的體內(nèi)生長動力學(xué)。小鼠右肋皮下注射2×106腫瘤細(xì)胞。每天透過皮膚確定腫瘤大小。兩個細(xì)胞系的生長動力學(xué)類似。例如，任何時間點(diǎn)兩個細(xì)胞系之間的腫瘤平均大小沒有差別(參見表12)。以下實(shí)施例描述了為確定NS3/4A構(gòu)建體免疫的小鼠是否已經(jīng)產(chǎn)生針對NS3的T細(xì)胞應(yīng)答而進(jìn)行的實(shí)驗。
表12
實(shí)施例10為檢測NS3/4A免疫是否激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答，分析免疫小鼠的免疫防御系統(tǒng)攻擊表達(dá)NS3的腫瘤細(xì)胞的能力。先前已細(xì)致描述了檢測Balb/c小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞腫瘤生長體內(nèi)抑制的方法(Encke等人，J.Immunol.1614917(1998))。此模型中腫瘤生長的抑制取決于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的引發(fā)。簡言之，各組10只小鼠用100μgNS3-pVAX或100μg NS3/4A-pVAX i.m.免疫5次，每次間隔一個月。末次免疫2周以后，每只小鼠的右肋注入2×106SP2/0或NS3/4A-SP2/0細(xì)胞。2周以后處死小鼠，測量最大腫瘤大小。NS3-pVAX免疫小鼠的SP2/0和NS3/4A-SP2/0腫瘤平均大小之間沒有差異(參見表13)。
表13
注統(tǒng)計分析(StatView)最大腫瘤大小的Student＇s t檢驗。P值＜0.05認(rèn)為顯著。
最大直徑的不配對t檢驗成組變量第1列假設(shè)差異＝0排扣除NS3DNA-腫瘤-001213平均差 DF t值 P值
NS3-sp2，NS3-spNS3最大直徑的成組信息成組變量第1列排扣除NS3DNA-腫瘤-001213計數(shù) 平均值 方差 標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)誤
NS3-sp2NS3-spNS3下一組實(shí)驗中，評價NS3/4A-pVAX免疫的Balb/c小鼠中SP2/0或NS3/4A-SP2/0腫瘤生長的抑制。NS3/4A-pVAX質(zhì)粒免疫的小鼠，其NS3/4A-SP2/0腫瘤細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的SP2/0細(xì)胞相比，生長顯著受抑制(參見表14)。因此，NS3/4A-pVAX免疫激發(fā)CTL抑制體內(nèi)NS3/4A表達(dá)細(xì)胞的生長。以下實(shí)施例描述了為分析各種包含NS3組合物激發(fā)針對NS3的細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答的效率而進(jìn)行的實(shí)驗。
表14
注意統(tǒng)計分析(StatView)最大腫瘤大小的Student＇s t檢驗。P值＜0.05認(rèn)為顯著。
最大直徑的不配對t檢驗成組變量第1列假設(shè)差異＝0排扣除NS3DNA-腫瘤-001213平均差 DF t值 P值
NS3/4-sp2，NS3/4-spNS3最大直徑的成組信息成組變量第1列排扣除NS3DNA-腫瘤-001213
計數(shù) 平均值 方差 標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)誤
NS3/4-sp2NS3/4-spNS3實(shí)施例11為分析給予包含NS3的不同組合物是否影響激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，如上所述用PBS、rNS3、無關(guān)DNA或NS3/4A構(gòu)建體免疫小鼠，測定腫瘤大小。只有NS3/4A構(gòu)建體能夠激發(fā)足以導(dǎo)致腫瘤大小統(tǒng)計上顯著降低的T細(xì)胞應(yīng)答(參見表15)。下列實(shí)施例描述了為確定腫瘤大小降低是否能夠歸因于產(chǎn)生NS3特異性T淋巴細(xì)胞而進(jìn)行的實(shí)驗。
表15
注意統(tǒng)計分析(StatView)最大腫瘤大小的Student＇s t檢驗。P值＜0.05認(rèn)為顯著。
最大腫瘤的不配對t檢驗成組變量組假設(shè)差異＝0平均差 DF t-值 p-值
p17-sp3-4，NS3-100-sp3-4p17-sp3-4，NS3/4-10-sp3-4p17-sp3-4，NS3-10-sp3-4p17-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4p17-sp3-4，PBS-sp3-4p17-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3-100-sp3-4，NS3/4-10-sp3-4NS3-100-sp3-4，NS3-10-sp3-4NS3-100-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4NS3-100-sp3-4，PBS-sp3-4NS3-100-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，NS3-10-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，PBS-sp3-4NS3/4-10-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3-10-sp3-4，NS3/4-100-sp3-4NS3-10-sp3-4，PBS-sp3-4NS3-10-sp3-4，rNS3-sp3-4NS3/4-100-sp3-4，PBS-sp3-4NS3/4-100-sp3-4，rNS3-sp3-4PBS-sp3-4，rNS3-sp3-4實(shí)施例12使用體外T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解分析確定NS3特異性T細(xì)胞是否由NS314A免疫激發(fā)。該分析先前已經(jīng)詳細(xì)描述于(Townsend等人，J.Virol.713365(1997))。簡言之，各組5只Balb/c小鼠用100μgNS3/4A-pVAX i.m免疫3次。末次注射2周以后，處死小鼠，收集脾細(xì)胞。用3×106脾細(xì)胞和3×106NS3/4A-SP2/0細(xì)胞進(jìn)行再刺激培養(yǎng)。5天后利用NS3/4A-SP2/0或SP2/0細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Cr51釋放分析。以NS3/4A-SP2/0細(xì)胞裂解與SP2/0細(xì)胞裂解之間的比值計算特異性裂解百分比。利用效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比為20∶1，5只測試小鼠的4只中，只有用NS3/4A-pVAX免疫的小鼠顯示特異性裂解超過10％(參見圖5A和B)。相應(yīng)的，NS3/4A免疫的小鼠顯示癌細(xì)胞增殖減少和/或NS3/4A引起的癌細(xì)胞裂解。下節(jié)詳細(xì)描述了包含的若干HCV多肽。
HCV肽可以利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)操作上節(jié)所述編碼HCV肽的核酸以便產(chǎn)生表達(dá)HCV肽的重組構(gòu)建體。包含的HCV肽或其衍生物包括而不限于，包含基本上如序列表(SEQ.ID.NO.17、29-32和43-49)所示全部氨基酸序列為主要氨基酸序列，及其至少4個氨基酸長度的片段(例如SEQ.ID.NO.25-27以及33-42)，包括改變的序列，其中該序列內(nèi)的殘基置換為功能相同的氨基酸殘基而導(dǎo)致沉默變化。序列SEQ.ID.NO.17、29-32以及43-49的優(yōu)選片段為至少4個氨基酸，并包含發(fā)現(xiàn)的NS3/4A肽(SEQ.ID.NO.17)特異的氨基酸序列，包括改變的序列，其中該序列內(nèi)的殘基置換為功能相同的氨基酸殘基而導(dǎo)致沉默變化。例如，HCV肽可以是至少12-15，15-20，20-25，25-50，50-100，100-150，150-250，250-500或500-704個氨基酸長度。其它片段(例如SEQ.ID.NO.25-27和33-42)也是本發(fā)明的方面。
本發(fā)明的實(shí)施方案也包括與如上所述基本上相同的HCV肽。也就是具有SEQ.ID.NO.17內(nèi)一個或多個氨基酸殘基的HCV肽及其片段，其被行使相同功能、極性相似的另一個氨基酸置換而導(dǎo)致沉默變化。序列內(nèi)部的氨基酸置換可以選自該氨基酸所屬類別的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
可以利用本領(lǐng)域已知技術(shù)，例如Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.852149(1964)，Houghten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82∶5132(1985)，Stewart和Young(Solid phase peptide synthesis，Pierce Chem Co.，Rockford，IL(1984)，以及Creighton，1983，ProteinsStructures and Molecular Principles，W.H.Freeman & Co.，N.Y.所述技術(shù)，通過化學(xué)合成方法(例如固相肽合成)方法制備此處所述HCV肽?？梢院铣砂被擞谢蛘邲]有甲硫氨酸的多肽?；瘜W(xué)合成的HCV肽可以利用這些參考文獻(xiàn)所述方法氧化，形成二硫鍵。
雖然此處所述HCV肽可以化學(xué)合成，可以利用DNA重組技術(shù)更有效地制備這些多肽。例如，該方法可用于構(gòu)建包含上述HCV核苷酸序列以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括，例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)基因重組。另外，利用例如合成儀，可以化學(xué)合成能夠編碼HCV核苷酸序列的RNA。例如參見Oligonucleotide Synthesis，1984，Gait，M.J.ed.，IRL Press，Oxford所述技術(shù)。因此，若干實(shí)施方案涉及為表達(dá)包含的HCV肽而改造的細(xì)胞系。例如，制備表達(dá)(SEQ.ID.NO.17、29-32以及43-49)的HCV肽或這些分子的片段的一些細(xì)胞。
可以利用多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)包含的HCV肽。合適的表達(dá)系統(tǒng)包括而不限于用包含HCV核苷酸序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物，例如細(xì)菌(例如大腸桿菌或枯草桿菌(B.subitlis))；用包含HCV核苷酸序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces)、畢赤氏(Pichia)酵母)；用包含HCV序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用包含HCV序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒TMV)感染、或者用包含HCV序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者帶有包含來源于哺乳動物細(xì)胞基因組(例如金屬硫因啟動子)或哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子)的啟動子的重組表達(dá)構(gòu)建體哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)所表達(dá)的HCV基因產(chǎn)物的用途，可以方便地選擇許多表達(dá)載體。例如，為制備HCV肽的藥物組合物或者為產(chǎn)生HCV肽的抗體而大量生產(chǎn)該蛋白質(zhì)時，需要指導(dǎo)高水平表達(dá)易于純化的融合蛋白質(zhì)產(chǎn)物的載體。這種載體包括而不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等人，EMBO J.，21791(1983)，其中HCV編碼序列與lacZ編碼區(qū)可以分別符合讀框地連接到該載體，以產(chǎn)生融合蛋白質(zhì))；pIN載體(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.，133101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol. Chem.，2645503-5509(1989))；等等。也可以使用pGEX載體，將外源多肽表達(dá)為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白質(zhì)。這種融合蛋白質(zhì)一般可溶，并可通過吸附谷胱甘肽瓊脂糖小珠，然后在游離谷胱甘肽存在下洗脫，能夠從裂解的細(xì)胞中進(jìn)行純化。PGEX載體設(shè)計為包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點(diǎn)，因此能夠從GST部分釋放克隆的靶基因產(chǎn)物。
在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)用作表達(dá)外源基因的載體。病毒在草地夜蛾(Spodopterafrugiprda)細(xì)胞中生長。HCV編碼序列可以分別克隆到病毒的非必需區(qū)域(例如多角體蛋白基因)，并置于AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)控制之下。HCV基因編碼序列的成功插入將導(dǎo)致多角體蛋白基因失活，產(chǎn)生非封閉型重組病毒(即缺少多角體蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)外殼)。這些重組病毒然后用于感染草地夜蛾細(xì)胞，在其中表達(dá)插入的基因。(例如參見Smith等人，J.Virol.46584(1983)；以及Smith，U.S.Pat.No.4,215,051)。
在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可以使用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。如果腺病毒用作表達(dá)載體，目的HCV核苷酸序列可以連接至腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物，例如晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。該嵌合基因然后通過體外或體內(nèi)重組插入腺病毒基因組。插入病毒基因組的非必需區(qū)(例如E1或E3區(qū))將產(chǎn)生能夠在受感染宿主中表達(dá)HCV基因產(chǎn)物的活的重組病毒。(例如參見Logan & Shenk，Proc.Natl.4cad.Sci.USA 813655-3659(1984))。有效翻譯插入的HCV核苷酸序列還會需要特定起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近序列。
然而，如果只插入一部分HCV編碼序列，可以提供外源翻譯控制信號，或許包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子可以與目的編碼序列的閱讀框架相位相符，以確保翻譯整個插入序列。這些外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是天然和合成的多種來源。通過包含合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等可以增強(qiáng)表達(dá)效率。(參見Bittner等人，Methods in Enzyrnol.，153516-544(1987))。
此外，可以選擇調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)、或按所要求的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的這種修飾(例如糖基化)和加工(例如斷裂)對于蛋白質(zhì)的功能是重要的。不同的宿主細(xì)胞具有蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾的特性和特有機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)正確的修飾和加工。為此目的，可以使用真核宿主細(xì)胞，其具有供原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適當(dāng)加工、基因產(chǎn)物糖基化和磷酸化的細(xì)胞器。這種哺乳動物宿主細(xì)胞包括而不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和W138。
為長期、高產(chǎn)率生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。例如，可以改造穩(wěn)定表達(dá)上述HCV肽的細(xì)胞系。與其利用包含病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，不如可以利用合適的表達(dá)控制元件(例如啟動子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的DNA和選擇標(biāo)志轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。引入外源DNA之后，使改造的細(xì)胞在豐富培養(yǎng)基中生長1-2天；然后轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)志賦予選擇抗性，使細(xì)胞穩(wěn)定整合質(zhì)粒到其染色體，生長形成斑點(diǎn)，其依次被克隆并擴(kuò)增為細(xì)胞系。該方法方便地用于改造表達(dá)HCV基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。
可以使用多種選擇系統(tǒng)，包括而不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11223(1977)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026(1962)，以及腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，Cell 22817(1980)基因可以分別用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞。此外，可以使用抗代謝物抗性作為基礎(chǔ)選擇下列基因帶來氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567(1980)；O＇Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527(1981)；帶來霉酚酸抗性的gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072(1981)；帶來氨基糖苷類G-418抗性的neo(ColberreGarapin等人，J.Mol.Biol.1501(1981)；以及帶來潮霉素抗性的hygro(Santerre等人，Gene 30147(1984))。
另外，利用表達(dá)的融合蛋白質(zhì)特異性的抗體能夠容易純化任何融合蛋白質(zhì)。例如，Janknecht等人描述的系統(tǒng)能迅速純化人細(xì)胞系中表達(dá)的非變性融合蛋白質(zhì)。(Janknecht等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888972-8976(1991))。在該系統(tǒng)中，目的基因亞克隆到牛痘重組質(zhì)粒，使該基因的開放閱讀框架翻譯上融合由6個組氨酸殘基組成的氨基端標(biāo)記。重組牛痘病毒感染細(xì)胞的提取物上樣Ni2+氮川乙酸瓊脂糖柱，用包含咪唑的緩沖液選擇性洗脫組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。以下實(shí)施例描述了用于表達(dá)由包含的核酸編碼的HCV肽的方法。
實(shí)施例13為了表征NS3/4A融合蛋白質(zhì)及其截短和突變的變體，體外轉(zhuǎn)錄并翻譯實(shí)施例6所述載體構(gòu)建體，通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)觀察得到的多肽。利用T7偶聯(lián)的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)，按照廠家說明，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。利用35S標(biāo)記的甲硫氨酸(Amersham International，Plc，Buckinghamshire，UK)，在30℃進(jìn)行表達(dá)構(gòu)建體的全部體外翻譯反應(yīng)。利用12％SDS-PAGE凝膠分離標(biāo)記的蛋白質(zhì)，通過X光膠片(Hyper Film-MP，Amersham)曝光6-18小時進(jìn)行觀察。
體外分析揭示，各自表達(dá)構(gòu)建體的所有蛋白質(zhì)均高量表達(dá)。rNS3構(gòu)建體(NS3-pVAX載體)產(chǎn)生大約61kDa的單肽，而TPT構(gòu)建體(NS3/4A-TPT-pVAX)和RGT構(gòu)建體(NS3/4A-RGT-pVAX)產(chǎn)生大約67kDa的單多肽，與NS3/4A-pVAX構(gòu)建體產(chǎn)生的未斷裂的NS3/4A肽的分子量相同。表達(dá)的NS3/4A肽產(chǎn)生的斷裂產(chǎn)物大約61kDa，與NS3-pVAX載體產(chǎn)生的rNS3大小相同。這些結(jié)果表明，表達(dá)構(gòu)建體是功能性的，NS3/4A構(gòu)建體具有酶活性，rNS3產(chǎn)生預(yù)計大小的肽，TPT和RGT突變完全消除了NS3-NS4A接點(diǎn)處的斷裂。
序列、構(gòu)建體、載體、克隆以及包括包含的HCV核酸和肽的其它材料可以是濃縮(enriched)或分離形式。此處所用＂濃縮＂是指物質(zhì)的濃度至少是其天然濃度的約2、5、10、100或1000倍(例如)，方便按重量為0.01％，優(yōu)選按重量至少約0.1％。也包括按重量大約0.5％、1％、5％、10％和20％的濃縮制劑。術(shù)語＂分離＂要求該物質(zhì)從其原始環(huán)境(例如，如果是天然存在，則為自然環(huán)境)移去。例如，活的動物中天然存在的多核苷酸不是分離的，但是與天然體系中某些或全部共存物質(zhì)分離的相同的多核苷酸，就是分離的。序列處于純化形式也是有利的。術(shù)語＂純化＂不要求絕對純凈；更確切些，是指相對定義。分離的蛋白質(zhì)通常純化為例如經(jīng)過考馬斯染色電泳均一性。特別包括原材料或天然物質(zhì)純度至少為1個數(shù)量級，優(yōu)選2或3個數(shù)量級，更優(yōu)選4或5個數(shù)量級。
還可以在植物、昆蟲和動物中表達(dá)此處所述HCV基因產(chǎn)物，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物。具有HCV肽的理想的轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)包括擬南芥屬(Arabadopsis)、玉蜀黍和衣藻屬(Chlamydonionas)。具有HCV肽的理想的昆蟲系統(tǒng)包括而不限于黑尾果蠅(D.mnelanogaster)和小卵翅蝗(C.elegans)。任何物種的動物，包括但不限于兩棲類、爬行類、鳥類、小鼠、倉鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、小型豬、山羊、狗、貓以及非人靈長類，例如狒狒、猴子和黑猩猩，可用于產(chǎn)生具有包含的HCV分子的轉(zhuǎn)基因動物。這些轉(zhuǎn)基因生物期望地顯示此處所述HCV肽的種系傳遞。
本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)優(yōu)選用于將HCV轉(zhuǎn)基因引入動物，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的原始系，或者敲除或替換現(xiàn)有的HCV基因。這種技術(shù)包括而不限于原核的顯微注射(Hoppe，P.C.和Wagner，T.E.，1989，U.S.Pat.No.4,873，191)；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入生殖系(Van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152(1985)；胚胎干細(xì)胞在基因打靶(Thompson等人，Cell 56313-321(1989)；胚胎的電穿孔(Lo，Mol Cell Buol.31803-1814(1983)；以及精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等人，Cell 57717-723(1989)；也參見Gordon，TransgenicAnimals，Intl.Rev.Cytol 115171-229(1989)。下節(jié)描述制備與此處所述HCV肽相互作用的抗體。
抗HCV抗體合成或表達(dá)以及分離或純化HCV肽以后，分離或純化的肽可用于產(chǎn)生抗體。根據(jù)情況，術(shù)語＂抗體＂可以包括多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fab片段以及由Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。識別HCV肽的抗體具有多種用途，包括但不限于生物技術(shù)應(yīng)用、治療/預(yù)防應(yīng)用以及診斷應(yīng)用。
為了產(chǎn)生抗體，可以通過注射HCV肽而免疫多種宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠和人等。根據(jù)宿主物種，多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這種佐劑包括而不限于病毒唑、弗氏佐劑、礦物膠例如氫氧化鋁，以及表面活性物質(zhì)，例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、乳化油、匙孔血藍(lán)蛋白和二硝基酚。BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)也是非常有用的佐劑。
用于誘導(dǎo)特異性抗體的肽可以具有由至少4個氨基酸、優(yōu)選至少10-15個氨基酸組成的氨基酸序列。一種方法，編碼NS3/4A片段的短鏈氨基酸與另一蛋白質(zhì)，例如匙孔血藍(lán)蛋白的短鏈氨基酸融合，以便產(chǎn)生針對該嵌合分子的抗體。另外，給予動物包含病毒唑以及NS3/4A(SEQ.ID.NO.17)、其至少4、6、8、10、12、15或20個氨基酸長度的片段、或編碼一種或多種這些分子的核酸的組合物。雖然通過注射小鼠對應(yīng)于HCV肽的合成的三聚體、十聚體和15聚體的肽可以產(chǎn)生能夠特異性識別HCV的抗體，利用如上所述制備的重組HCV肽可以產(chǎn)生更多種類的抗體。
為了產(chǎn)生HCV肽的抗體，從轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離基本純的肽。調(diào)整最終制劑中肽的濃度到幾微克/ml的水平，例如通過Amicon過濾裝置濃縮。因此能夠如下制備目的肽的單克隆或多克隆抗體可以利用通過培養(yǎng)的傳代細(xì)胞系提供抗體分子產(chǎn)生的任何技術(shù)制備HCV肽的單克隆抗體。這些技術(shù)包括而不限于Koehler和Milstein最先描述的雜交瘤技術(shù)(Nature 256495-497(1975)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等人，Immunol Today 472(1983)；Cote等人，Proc NatlAcad Sci 802026-2030(1983)，以及EBV雜交瘤技術(shù)Cole等人，Monoclonal Antihodies and Cancer Therapy， Alan R.Liss Inc， NewYork N.Y.，pp 77-96(1985)。此外，可以使用為制備＂嵌合抗體＂而開發(fā)的技術(shù)，將小鼠抗體基因與人抗體基因拼接，獲得具有適當(dāng)?shù)目乖禺愋砸约吧锘钚缘姆肿印?Morrison等人，Proc Natl Acad Sci816851-6855(1984)；Neuberger等人，Nature 312604-608(1984)；Takeda等人，Nature 314452-454(1985)。另外，為制備單鏈抗體而描述的技術(shù)(美國專利號4,946,778)可以適于制備HCV特異性單鏈抗體。還可以通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞群體的體內(nèi)產(chǎn)生或者篩選重組免疫球蛋白文庫或高特異性結(jié)合試劑組而制備抗體，如Orlandi等人，Proc NatlAcad Sci 863833-3837(1989)以及Winter G.和Milstein C；Nature349293-299(1991)所公開。
還可以產(chǎn)生包含HCV肽特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。例如，這種片段包括而不限于，可以由胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab＇)2片段，以及可以由還原F(ab＇)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。另外，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫，以能夠快速、容易地鑒別具有目的特異性的單克隆Fab片段。(Huse W.D.等人，Science 2561275-1281(1989))。
利用一種方法，如下制備HCV肽的單克隆抗體。簡言之，小鼠在幾周之內(nèi)反復(fù)輸注幾微克選擇的蛋白質(zhì)或由其得到的肽。然后處死小鼠，分離脾的產(chǎn)抗體細(xì)胞。脾細(xì)胞在聚乙二醇存在下與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過該體系在包含氨基蝶呤的選擇培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)中生長，破壞過剩的未融合細(xì)胞。稀釋成功融合的細(xì)胞，稀釋物等份放入微量滴定板的孔中，培養(yǎng)物繼續(xù)生長。通過免疫測定方法，例如ELISA，檢測孔中上清液的抗體，鑒定產(chǎn)生抗體克隆，如最初由Engvall，E.，Meth.Enzymol.70419(1980)及其衍生方法所述。選擇陽性克隆擴(kuò)增，收集其單克隆抗體產(chǎn)物備用。Davis，L.等人Basic Methods inMolecular Biology Elsevier，New York.21章-2描述了制備單克隆抗體的詳細(xì)步驟。
通過用如上所述表達(dá)的蛋白質(zhì)或由其得到的肽(可以未修飾、或修飾以增強(qiáng)免疫原性)免疫合適的動物，可以制備含有單個蛋白質(zhì)異源表位的抗體的多克隆抗血清。有效的多克隆抗體生產(chǎn)受與抗原和宿主物種有關(guān)的多種因素影響。例如，小分子往往比其它分子的免疫原性小，需要利用載體和佐劑。宿主動物也因接種位點(diǎn)和劑量而不同，抗原劑量不足或過量均導(dǎo)致低滴度抗血清。皮下多位點(diǎn)給予小劑量(ng水平)抗原，似乎最可靠。在Vaitukaitis，J.等人，J Clin.EndocrinolMetab.33988-991(1971)中可以找到家兔的有效免疫規(guī)程。
每隔一定間隔給以加強(qiáng)注射，其抗體滴度開始下降時收集抗血清，抗體滴度由半定量測定，例如通過針對已知濃度抗原的瓊脂雙向免疫擴(kuò)散方法。例如參見Ouchterlony，O.等人，Handbook of ExperimentalImmunology第十九章，D.Wier(ed)Blackwell(1973)?？贵w的平臺期濃度通常為0.1-0.2mg/ml血清(大約12μM)。制備競爭性結(jié)合曲線測定抗血清對抗原的親合力，例如Fisher，D.Manual of ClinicalImmunology，2d Ed，第42章.(Rose and Friedman，Eds.)Amer.Soc.For Microbiol.，Washington，D.C.(1980)所述。按照每種方法制備的抗體制劑用于確定生物樣品中抗原結(jié)合物質(zhì)的濃度的定量免疫測定法；也半定量或定性使用(例如，在鑒定生物樣品中HCV存在的診斷性實(shí)施方案中)。下節(jié)詳細(xì)描述一些診斷性實(shí)施方案。
診斷性實(shí)施方案一般根據(jù)使用基于核酸還是蛋白質(zhì)的分析，對包含的診斷進(jìn)行分類。一些診斷分析檢測從患者獲得的樣品中存在或不存在包含的HCV核酸序列，其它分析則設(shè)法鑒定從患者獲得的樣品中是否存在包含的HCV肽。另外，也包含生產(chǎn)包括此處所述試劑和方法、能快速檢測和鑒定HCV的試劑盒。這些診斷試劑盒可以包括，例如包含的特異性檢測HCV的核酸探針或抗體。一般與以下一種或多種試劑組合提供試劑盒的檢測組分。通常提供能夠吸收或結(jié)合DNA、RNA或蛋白質(zhì)的支持物?？捎玫闹С治锇ㄏ跛崂w維、尼龍或衍生的尼龍薄膜，其特征在于帶有正電荷取代基陣列。這些試劑盒可以備有一種或多種限制酶、對照試劑、緩沖液、擴(kuò)增酶以及類似小牛胸腺或鮭魚精DNA的非人多核苷酸。
基于核酸的有用的診斷包括而不限于直接DNA測序、Southern印跡分析、點(diǎn)印跡分析、核酸擴(kuò)增以及這些方法的組合。這些分析的起點(diǎn)在于，從懷疑感染HCV或者有感染HCV風(fēng)險的患者獲得的生物樣品中分離或純化核酸。從樣品中提取核酸，然后通過利用對應(yīng)于包含的HCV核酸序列(例如NS3/4A(SEQ.ID.NO.16))側(cè)翼區(qū)域的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和/或DNA擴(kuò)增。
某些實(shí)施方案中，與HCV序列特異性雜交的核酸探針按有序陣列附于支持物，其中核酸探針附于支持物的不同區(qū)域，彼此不重疊。這種有序陣列優(yōu)選設(shè)計為＂可以尋址的(addressable)＂，記錄探針的不同位置，并可作為分析程序的一部分。這些探針在不同的已知位置與支持物連接。知道每個核酸探針的精確位置，使得這些＂可尋址＂陣列對結(jié)合分析特別有用。然后通過常規(guī)方法(例如放射性或者熒光)標(biāo)記來源于若干生物樣品制劑的核酸，標(biāo)記的樣品在允許雜交的條件下施加到該陣列。
如果樣品中核酸與陣列上的探針雜交，在支持物上對應(yīng)雜合體的位置將檢測到信號。由于每種標(biāo)記樣品的身份已知，施加標(biāo)記樣品的支持物的區(qū)域已知，因此可以快速確定存在多態(tài)性變體。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的高通量診斷或檢測分析技術(shù)，這些方法易于自動化。
另外，可以使用與以上介紹相反的方法?？梢詫⑸飿悠分写嬖诘暮怂嶂糜谥С治锷袭a(chǎn)生可尋址的陣列。樣品優(yōu)選置于支持物上不重疊的已知位置。通過施加標(biāo)記的核酸探針，其在陣列上相應(yīng)于放置生物樣品的位置與編碼HCV肽的核酸互補(bǔ)，以確定每個樣品中HCV核酸的存在。由于已知生物樣品的身份及其在陣列上的位置，因此可以快速確定已經(jīng)感染HCV的患者。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的高通量診斷分析技術(shù)，這些方法也易于自動化。
可以使用本領(lǐng)域已知的任何可尋址陣列技術(shù)。一個特定的多核苷酸陣列實(shí)施方案稱為GenechipsTM，已經(jīng)一般描述于美國專利5,143,854；PCT公布WO 90/15070和92/10092。一般利用機(jī)械合成方法或者光控合成方法(其引入光刻方法以及固相寡核苷酸的組合)生產(chǎn)這些陣列。(Fodor等人，Science，251767-777，(1991))。通過開發(fā)一種通稱為＂超大規(guī)模固化聚合物合成＂(VLSPISTM)的技術(shù)(其中探針一般以高密度陣列固化于芯片的固相表面)在固相支持物上固化寡核苷酸陣列已經(jīng)成為可能。美國專利5,143,854和5,412,087以及PCT公布WO 90/15070、WO 92/10092和WO 95/11995提供了VLSPISTM技術(shù)的實(shí)例，其描述了通過例如光控合成技術(shù)形成寡核苷酸陣列的方法。在設(shè)計旨在提供固化于固相支持物上的核苷酸陣列的策略中，發(fā)展了另外的展示策略，在芯片上排序并顯示寡核苷酸陣列，試圖最佳化雜交模式和診斷信息。這種展示策略的實(shí)例公開于PCT公布WO94/12305、WO 94/11530、WO 97/29212和WO 97/31256中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種標(biāo)記和連接技術(shù)可用于多種核酸分析。有若干方法制備供雜交或PCR的標(biāo)記核酸，包括但不限于寡標(biāo)記(oligolabeling)、切口平移、末端標(biāo)記或利用標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。另外，可以將編碼HCV肽的核酸克隆到載體中，以制備mRNA探針。這種載體為本領(lǐng)域已知，能夠商業(yè)獲得，通過添加適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶，例如T7、T3或SP6以及標(biāo)記的核苷酸，可用于體外合成RNA探針。許多公司，例如Pharmacia Biotech(Piscataway N.J.)、Promega(Madison Wis.)和U.S.Biochemical Corp(Cleveland Ohio)供應(yīng)這些方法的商品試劑盒和規(guī)程。合適的報告分子或標(biāo)記包括放射性核素、酶、熒光、化學(xué)發(fā)光或生色劑，以及底物、輔因子、抑制劑、磁顆粒等。
利用常規(guī)分析和此處所述實(shí)施方案還可以檢測在來自患者的蛋白質(zhì)樣品中存在的HCV肽。例如，與公開的HCV肽免疫反應(yīng)的抗體可用于篩選生物樣品存在的HCV感染。優(yōu)選實(shí)施方案中，與包含的HCV肽反應(yīng)的抗體用于從生物樣品中免疫沉淀公開的HCV肽，或者用于Western或免疫印跡中與來自生物樣品的蛋白質(zhì)反應(yīng)。優(yōu)選的診斷性實(shí)施方案也包括酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)以及免疫酶分析(IEMA)，其包括利用公開的HCV肽特異性的單克隆和/或多克隆抗體的夾心分析。David等人在美國專利號4,376,110和4,486,530中描述了典型的夾心分析。其它實(shí)施方案使用美國專利號5,290,678；5,604,105；5,710,008；5,744,358和5,747,274公開的免疫條帶(immune-strip)技術(shù)。
另一個優(yōu)選的基于蛋白質(zhì)的診斷中，此處所述抗體以有序陣列附于支持物，其中多數(shù)抗體附于支持物的不同區(qū)域，彼此不重疊。如同基于核酸的陣列一樣，基于蛋白質(zhì)的陣列設(shè)計為＂可尋址＂的排序陣列，以便記錄不同位置，并作為分析程序的一部分。這些探針在不同的已知位置與支持物連接。知道每個核酸探針的精確位置使得這些＂可尋址＂陣列對結(jié)合分析特別有用。例如，可尋址陣列可以包含具有若干區(qū)域與多數(shù)抗體探針相連的支持物，該探針特異性識別生物樣品中存在的HCV肽，并區(qū)分此處鑒定的同型HCV。
通過一種方法，從生物樣品獲得蛋白質(zhì)，然后利用常規(guī)方法(例如放射性、生色或熒光)標(biāo)記。然后在允許結(jié)合的條件下，將標(biāo)記的樣品施加于陣列。如果樣品中蛋白質(zhì)結(jié)合陣列上的抗體探針，在支持物上對應(yīng)抗體-蛋白質(zhì)復(fù)合物的位置將檢測到信號。由于每個標(biāo)記樣品的身份已知，施加標(biāo)記樣品的支持物的區(qū)域已知，可以快速確定存在、濃度和/或表達(dá)水平。也就是說，通過使用標(biāo)記的已知濃度HCV肽的標(biāo)準(zhǔn)物，研究者可以精確測定測試樣品中特定肽的蛋白質(zhì)濃度，還可以評價HCV肽的表達(dá)水平。也可以使用常規(guī)光密度分析方法，更精確測定HCV肽的濃度或表達(dá)水平。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的高通量診斷分析技術(shù)，這些方法易于自動化。
另一個實(shí)施方案中，可以使用與以上介紹相反的方法?？梢詫⑸飿悠分写嬖诘牡鞍踪|(zhì)置于支持物上產(chǎn)生可尋址的陣列。蛋白質(zhì)樣品優(yōu)選置于支持物上不重疊的已知位置。然后通過施加標(biāo)記的、識別HCV肽特異性表位的抗體探針確定每個樣品中存在的HCV肽。由于已知生物樣品的身份及其在陣列上的位置，因此可以快速確定HCV肽的存在、濃度和/或表達(dá)水平。
也就是說，通過使用標(biāo)記的已知濃度HCV肽的標(biāo)準(zhǔn)物，研究者可以精確測定樣品中肽的濃度，并可以由此信息評價肽的表達(dá)水平。也可以使用常規(guī)光密度分析方法更精確測定HCV肽的濃度或表達(dá)水平。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的高通量診斷分析技術(shù)，這些方法也易于自動化。如上詳述，可以使用本領(lǐng)域已知的任何可尋址陣列技術(shù)。下節(jié)描述能夠具有一種或多種包含的HCV核酸或HCV肽的一些組合物。
含有包含的HCV核酸或肽的組合物某些實(shí)施方案包含至少一種與支持物連接的HCV核酸或肽。優(yōu)選地，制備這些支持物，以便產(chǎn)生多聚體介質(zhì)。這些多聚體介質(zhì)以獲得足夠的分子親合力的形式或方式提供HCV肽或核酸。通過將目的分子與大分子支持物相連可以獲得具有HCV核酸或肽的多聚體介質(zhì)。＂支持物＂可以是用于連接或固化這種分子的載體、蛋白質(zhì)、樹脂、細(xì)胞膜或任何大分子結(jié)構(gòu)。固相支持物包括而不限于反應(yīng)板(reactiontray)的孔壁、試管聚苯乙烯小珠、磁性小珠、硝化纖維素條、薄膜、微粒例如膠乳粒子、動物細(xì)胞、Duracyte、人工細(xì)胞等。HCV核酸或肽還可以通過例如羥基、羧基或氨基與載體上反應(yīng)基團(tuán)的共價鍵連接無機(jī)載體，例如二氧化硅物質(zhì)(例如硅膠、沸石、硅藻土或胺化玻璃)。
在若干多聚體介質(zhì)中，大分子支持物具有通過疏水性非共價相互作用與HCV核酸或肽的一部分相互作用的疏水表面。有時支持物的疏水表面是諸如塑料的高聚物或任何其它高聚物，其中疏水基團(tuán)已經(jīng)聯(lián)接諸如聚苯乙烯、聚乙烯或聚乙烯基。另外，HCV核酸或肽可以共價連接包含蛋白質(zhì)和寡/多糖(例如纖維素、淀粉、糖原、甲殼素(chitosane)或胺化瓊脂糖凝膠)的載體。在這些后面的多聚體介質(zhì)中，分子上的反應(yīng)基團(tuán)，例如羥基或氨基，用于連接載體上的反應(yīng)基團(tuán)，以便形成共價鍵。另外的多聚體介質(zhì)包括具有其它反應(yīng)基團(tuán)的支持物，該反應(yīng)基團(tuán)化學(xué)活化的，以便連接HCV核酸或肽。例如，使用溴化氰活化介質(zhì)、環(huán)氧活化介質(zhì)、硫化和硫丙基(thiopropyl)凝膠、硝基苯基氯甲酸酯和N-羥基琥珀酰亞胺氯甲酸酯連接物、或丙烯酸環(huán)氧乙烷支持物。(Sigma)。
供體內(nèi)使用(即供預(yù)防或治療應(yīng)用)的載體期望生理性、無毒，優(yōu)選無免疫反應(yīng)性的。供體內(nèi)使用的合適載體包括聚L-賴氨酸、聚D、L-丙氨酸、脂質(zhì)體以及Chromosorb(Johns-Manville Products，DenverCo.)。結(jié)合Chromosorb的配基(Synsorb-Pk)已經(jīng)在人中測試了其預(yù)防溶血性尿毒綜合征，據(jù)報告不存在不良反應(yīng)。(Armstrong等人，J.Infctious Diseases 1711042-1045(1995))。某些實(shí)施方案給予＂裸＂載體(即缺少結(jié)合的HCV核酸或肽)，其在生物體內(nèi)具有結(jié)合HCV核酸或肽的能力。通過這種方法，預(yù)見到＂前藥類型＂的治療，其中裸載體和HCV核酸或肽分開給予，一旦兩者均處于生物體內(nèi)，載體和HCV核酸或肽組合為多聚體復(fù)合物。
還包含插入的接頭，例如在HCV核酸或肽與支持物之間適當(dāng)長度的接頭(例如，類似λ噬菌體柔性區(qū)而改造的＂λ接頭＂)，以便促進(jìn)HCV肽、雜合體或結(jié)合配偶體更大的柔韌性，從而克服可由支持物引起的任何空間位阻。通過在本說明書詳述的分析中篩選具有不同接頭的HCV核酸或肽，可以確定產(chǎn)生最佳細(xì)胞應(yīng)答或缺乏其的適當(dāng)長度的接頭。
也預(yù)見了包含一種以上類型的HCV核酸或肽的復(fù)合體支持物。＂復(fù)合體支持物＂可以是用于結(jié)合或固化兩種或多種不同的HCV核酸或肽的載體、樹脂或任何大分子結(jié)構(gòu)。同上，也包含在HCV核酸或肽與支持物之間具有適當(dāng)長度的插入的接頭，例如λ接頭，以促進(jìn)分子中更大的柔韌性，從而克服能夠發(fā)生的任何空間位阻。通過在本說明書詳述的分析中篩選具有不同接頭的HCV核酸或肽，可以確定產(chǎn)生最佳細(xì)胞應(yīng)答或缺乏其的適當(dāng)長度的接頭。
其它實(shí)施方案中，上述多聚體和復(fù)合體支持物可以結(jié)合多聚化的HCV核酸或肽，以分別形成＂多聚化-多聚體支持物＂以及＂多聚化-組合物支持物＂。例如，利用常規(guī)分子生物學(xué)方法，串聯(lián)偶聯(lián)兩個或多個HCV核酸或肽，可以獲得多聚化配基。多聚化形式的HCV核酸或肽由于例如能夠獲得較高親合力的介質(zhì)，而可以有利于許多應(yīng)用。在組成多聚化介質(zhì)的各個結(jié)構(gòu)域之間引入接頭或間隔物，例如柔性λ接頭，也可以有利于某些實(shí)施方案。例如，在蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間插入適當(dāng)長度的λ接頭，可以促進(jìn)分子中更大的柔韌性并克服空間位阻。類似地，在多聚化HCV核酸或肽與支持物之間插入接頭，可以促進(jìn)更大的柔韌性，并限制由支持物引起的空間位阻。通過在本說明書詳述的分析中篩選HCV核酸或肽可以確定接頭的適當(dāng)長度。
如上所述，本發(fā)明的實(shí)施方案也包括基因疫苗。這些組合物優(yōu)選包含病毒唑以及編碼NS3/4A(SEQ.ID.NO.17)、NS3(SEQ.ID.NO.29)或突變體(例如SEQ.ID.NO.30-32和43-49)或其片段(例如SEQ.ID.NO.25-27和33-42)的核酸。以下實(shí)施例描述了制備適合人用的基因疫苗。
實(shí)施例14設(shè)計HCV表達(dá)質(zhì)粒用來表達(dá)NS3/4A肽。通過用EcoRl和Xbal消化，去除NS3/4A-pVAX的NS3/4A編碼序列，分離的片段插入質(zhì)粒A中，因此其位于CMV啟動子和RSV增強(qiáng)子元件的轉(zhuǎn)錄控制之下。(參見Pachuk等人，美國專利號6,235,888)。質(zhì)粒A主鏈長度為3969bp；它包含供大腸桿菌中復(fù)制的PBR復(fù)制起點(diǎn)以及卡那霉素抗性基因。插入序列，例如NS3/4A，克隆到多接頭區(qū)，其將插入序列置于啟動子和多聚腺苷酸化信號之間，并與其有效連接。在CMV啟動子和RSV增強(qiáng)子元件的控制之下，轉(zhuǎn)錄克隆的插入序列。由剛好位于克隆位點(diǎn)的3＇的SV40多聚腺苷酸信號其提供多聚腺苷酸化信號。然后將500μgrNS3/4A構(gòu)建體與1mg病毒唑混合，制備包含NS3/4A的疫苗組合物。
所述疫苗組合物可用于在哺乳動物(例如小鼠或家兔)中產(chǎn)生抗體，或者可以肌內(nèi)注射到人，產(chǎn)生抗體，優(yōu)選慢性感染HCV病毒的人。受者優(yōu)選接受該混合物3次加強(qiáng)免疫，間隔4周。通過第三次加強(qiáng)，HCV特異性抗體的滴度將顯著提高。另外，通過EIA檢測到NS3特異性抗體成分增加，RT-PCR檢測到病毒負(fù)荷減少，證明所述受試者此時將經(jīng)受增強(qiáng)的針對NS3的抗體和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
實(shí)施方案也包括NS3/4A融合蛋白質(zhì)或者編碼這些分子的核酸。例如，通過加入輔助氨基酸形成＂標(biāo)簽＂，可能有利于生產(chǎn)和純化重組蛋白質(zhì)。這種標(biāo)簽包括而不限于His-6、Flag、Myc和GST。標(biāo)簽可以加到C端、N端或NS3/4A氨基酸序列內(nèi)部。另外的實(shí)施方案包括氨基或羧基端截短、或內(nèi)部缺失、或者氨基或羧基末端、或內(nèi)部加入另外的多肽序列的NS3/4A融合蛋白質(zhì)。其它實(shí)施方案包括NS3/4A融合蛋白質(zhì)、或其截短或突變的變體，其中NS3/4A蛋白水解斷裂位點(diǎn)的殘基已經(jīng)被置換。這種置換包括而不限于，P1＇位點(diǎn)為Ser、Gly或Pro或者P1位點(diǎn)為Arg的序列，或者其P8-P4＇序列為Ser-Ala-Asp-Leu-Glu-Val-Val-Thr-Ser-Thr-Trp-Val(SEQ.ID.NO.28)。
其它實(shí)施方案涉及包含NS3/4A融合蛋白質(zhì)、或其截短或修飾的變體的免疫源，其能夠激發(fā)針對NS3的增強(qiáng)的免疫應(yīng)簽。能夠以基本純的形式提供免疫原，這意味著已經(jīng)基本使得免疫原沒有其它蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物或與其天然結(jié)合的其它化合物。實(shí)施方案也包括包含NS3/4A融合蛋白質(zhì)(SEQ.ID.NO.17)、或其截短或突變的變體(例如SEQ.ID.NO.29-32和43-49)或其片段(例如SEQ.ID.NO.25-27和33-42)以及佐劑(例如病毒唑)的疫苗組合物。以下實(shí)施例描述了制備包含NS3/4A融合蛋白質(zhì)和佐劑的疫苗組合物的方法。
實(shí)施例15為了產(chǎn)生帶標(biāo)簽的NS3/4A構(gòu)建體，通過EcoRI和XbaI消化去除NS3/4A-pVAX的NS3/4A編碼序列，分離的片段插入Xpress載體(Invitrogen)。Xpress載體能制備重組融合蛋白質(zhì)，其具有短的N端前導(dǎo)肽，對二價陽離子具有高親合力。利用鎳螯合樹脂(Invitrogen)，能夠一步純化重組蛋白質(zhì)，隨后可以用腸激酶斷裂除去前導(dǎo)序列。優(yōu)選載體為pBlueBacHis2 Xpress。pBlueBacHis2 Xpress載體是桿狀病毒表達(dá)載體，包含多克隆位點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因以及l(fā)ac z基因。消化的擴(kuò)增片段于是克隆到pBlueBacHis2 Xpress載體，感染SF9細(xì)胞。然后根據(jù)廠家說明書分離或純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。然后將100μg rNS3/4A與1mg病毒唑混合，制備包含NS3/4A的疫苗組合物。
所述疫苗組合物可用于在哺乳動物(例如小鼠或家兔)中產(chǎn)生抗體，或者可以肌內(nèi)注射到人，產(chǎn)生抗體，優(yōu)選慢性感染HCV病毒的人。受者優(yōu)選接受該混合物3次免疫加強(qiáng)，間隔4周。通過第三次加強(qiáng)，HCV特異性抗體的滴度將顯著提高。另外，通過EIA檢測到NS3特異性抗體成分增加，RT-PCR檢測到病毒負(fù)荷減少，證明所述受試者此時將經(jīng)受增強(qiáng)的針對NS3的抗體和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。下節(jié)提供涉及此處所述組合物使用方法的更多說明。
包含病毒唑和抗原的組合物使用方法此處所述疫苗的給藥途徑包括而不限于透過皮膚、腸胃外、腸胃、透過支氣管(transbronchial)以及透過肺泡(transalveolar)。透過皮膚給藥可以施用乳膏、沖洗劑、凝膠或者能夠讓病毒唑和抗原滲入皮膚的其它化合物。腸胃外給藥途徑包括而不限于，用電或直接注射，例如直接注入中央靜脈、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)或皮下注射。腸胃給藥途徑包括而不限于口服(ingestion)和直腸。透過支氣管和透過肺泡給藥途徑包括而不限于通過口腔或鼻內(nèi)吸入。
適于透過皮膚給藥的具有病毒唑和抗原的組合物包括而不限于藥學(xué)可接受的混懸液、油劑、乳膏劑和軟膏，直接施用皮膚或者摻入保護(hù)性載體，例如透皮裝置(＂透皮片＂)。例如，在Physician＇s DeskReference中可以找到合適乳膏劑、軟膏等的實(shí)例。例如，Chinen等人1989年4月4日發(fā)布的美國專利號4,818,540描述了合適的透皮裝置的實(shí)例。
適于腸胃外投藥的具有病毒唑和抗原的組合物，包括而不限于藥學(xué)可接受的無菌等滲溶液。這種溶液包括而不限于供注入中央靜脈、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)或皮下注射的鹽、磷酸鹽緩沖鹽溶液以及油制劑。
適于透過支氣管或透過肺泡給藥的具有病毒唑和抗原的組合物包括但不限于供吸入的各種類型氣霧劑。適于其透過支氣管和透過肺泡給藥的裝置也是實(shí)施方案。這種裝置包括而不限于噴霧器和汽化器?，F(xiàn)用的多種形式噴霧器和汽化器可以輕易適合輸送具有病毒唑和抗原的疫苗。
適于腸胃給藥的具有病毒唑和抗原的組合物，包括但不限于藥學(xué)可接受的口服粉劑、丸劑或液體，以及供直腸給藥的栓劑。
此處所述基因構(gòu)建體可能特別通過包括但不限于傳統(tǒng)的注射器、無針注入裝置或者＂微彈轟擊基因槍(microprojectile bombardmentgene guns)＂的方法給藥。另外，可能通過多種方法將基因疫苗引入離開個體的細(xì)胞中。這種方法包括，例如體外轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射以及微彈轟擊。細(xì)胞攝取基因構(gòu)建體以后，重新植入個體?？梢灶A(yù)計，即使免疫接種的細(xì)胞最初取自另一個體，可以將其中帶有基因構(gòu)建體的另外的非免疫原性細(xì)胞植入個體。
根據(jù)某些實(shí)施方案，利用無針注入裝置將基因構(gòu)建體給予個體。根據(jù)某些實(shí)施方案，利用無針注入裝置將基因構(gòu)建體同時皮內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi)給予個體。無針注入裝置眾所周知并廣泛應(yīng)用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按照此處指導(dǎo)，可以使用無針注入裝置輸送遺傳物質(zhì)給個體的細(xì)胞。無針注入裝置很適于輸送遺傳物質(zhì)給所有組織。它們特別用于輸送遺傳物質(zhì)給皮膚和肌肉細(xì)胞。某些實(shí)施方案中，無針注入裝置可能用來向個體的皮膚表面推進(jìn)包含DNA分子的液體。以足夠速度推進(jìn)液體，壓緊皮膚，液體滲入皮膚表面，彌漫其下的皮膚和肌肉組織。遺傳物質(zhì)從而同時皮內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi)給藥。某些實(shí)施方案中，無針注入裝置可能用來輸送遺傳物質(zhì)到其它器官的組織，將核酸分子引入該器官的細(xì)胞。
包含病毒唑和抗原的疫苗可用于治療和預(yù)防廣譜的疾病，能夠增強(qiáng)動物對抗原的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，需要治療或預(yù)防細(xì)菌性疾病、病毒性疾病、真菌性疾病以及癌癥的患者已經(jīng)給予常規(guī)疫苗。由于此處所述疫苗包括已經(jīng)通過加入病毒唑而改變的常規(guī)疫苗，此處所述方法包括利用包含抗原和病毒唑的疫苗治療和預(yù)防疾病。
優(yōu)選實(shí)施方案涉及治療或預(yù)防肝炎感染的方法。這些實(shí)施方案中，提供有此需要的動物肝炎抗原(例如肽抗原或基于核酸的抗原)以及足以在所述動物中顯示佐劑活性的相當(dāng)量的病毒唑。相應(yīng)地，利用現(xiàn)有的診斷測試或臨床評價方法，可以鑒定有此需要的動物。這些實(shí)施方案可以使用的肝炎病毒抗原的范圍多樣。優(yōu)選的肝炎病毒抗原包括HBV抗原、HAV抗原、HCV抗原、編碼這些這抗原的核酸、或其任意組合。非常優(yōu)選的實(shí)施方案包括選自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝炎核心抗原(HBcAg)以及肝炎E抗原(HBeAg)的HBV抗原，特別是上述肽和基于核酸的抗原。病毒唑和抗原可以分別或聯(lián)合提供，其它佐劑(例如油、明礬或者增強(qiáng)免疫應(yīng)答的其它試劑)也可以提供給有此需要的動物。因此，優(yōu)選實(shí)施方案包括通過鑒定受感染動物或者有感染風(fēng)險的動物，并提供所述動物肝炎抗原(例如HBsAg、HBcAg和HBeAg)以及足以顯示佐劑活性的相當(dāng)量的病毒唑，而治療或預(yù)防動物中肝炎的方法。
其它實(shí)施方案包括通過提供給有此需要的動物有效增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答的相當(dāng)量的病毒唑而增強(qiáng)對抗原免疫應(yīng)答的方法。這些實(shí)施方案中，利用現(xiàn)用的診斷測試或臨床評價方法鑒定需要增強(qiáng)對抗原免疫應(yīng)答的動物。這些個體將時常罹患疾病(例如細(xì)菌性、真菌性、霉菌性、病毒性或癌癥)，或者有感染疾病的風(fēng)險。但是，需要增強(qiáng)免疫應(yīng)答的動物可以是已經(jīng)中毒(例如受有毒昆蟲或動物叮咬)，或者已經(jīng)暴露于毒素或其它有毒化合物的動物。這些動物一旦鑒定，即提供給適當(dāng)?shù)目乖约坝行г鰪?qiáng)動物免疫應(yīng)答的相當(dāng)量的病毒唑。
同上，這些實(shí)施方案可以使用的肝炎病毒抗原，包括而不限于HBV抗原、HAV抗原、HCV抗原、編碼這些這分子的核酸或其任意組合。非常優(yōu)選的實(shí)施方案包括選自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝炎核心抗原(HBcAg)以及肝炎E抗原(HBeAg)的HBV抗原，特別是上述肽和基于核酸的抗原。病毒唑和抗原可以分別或聯(lián)合提供，其它佐劑(例如油、明礬或者增強(qiáng)免疫應(yīng)答的其它試劑)也可以提供給所需動物。因此，優(yōu)選實(shí)施方案包括通過鑒定有此需要的動物，并提供該動物肝炎抗原(例如HBsAg、HBcAg和HBeAg)以及有效增強(qiáng)動物免疫應(yīng)答的相當(dāng)量的病毒唑，而增強(qiáng)對肝炎抗原(例如HBV)免疫應(yīng)答的方法。
一種方法，例如提供給未感染個體量足以激發(fā)對NS3的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的上述疫苗組合物，以便保護(hù)所述個體免受HCV感染。另一實(shí)施方案中，鑒定HCV感染的個體，并提供給包含病毒唑以及量足以增強(qiáng)對NS3的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的NS3，以便降低或消除HCV感染。這種個體可能處于感染的慢性或急性期。另一實(shí)施方案中，提供給罹患HCC的HCV感染個體組合物，其包含病毒唑和NS3/4A融合基因，其量足以激發(fā)針對表達(dá)NS3的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。
雖然已經(jīng)參考實(shí)施方案以及實(shí)施例描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解可以不背離本發(fā)明的精神而進(jìn)行各種修飾。因此，本發(fā)明只受以下權(quán)利要求的限制。
序列表<110>TRIPEP ABMatti SALLBERGCatharina HULTGREN<120>包含病毒唑的疫苗及其使用方法<130>TRIPEP.023VPC<150>US 09/705,547<151>2000-11-03<150>US 60/229,175<151>2000-08-29<150>US 60/225,767<151>2000-08-17<160>49<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>3011<212>PRT<213>人工序列<220><223>丙型肝炎病毒序列<400>lMet Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn1 5 10 15Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly20 25 30Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala35 40 45Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro50 55 60Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly65 70 75 80Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp85 90 95Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro100 105 110Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys115 120 125Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu130 135 140Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp145 150 155 160Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile165 170 175Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr180 185 190Gln Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro195 200 205Asn Ser Ser Val Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro210 215 220Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val225 230 235 240Ala Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr245 250 255Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys260 265 270Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly275 280 285Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg His His Trp Thr Thr Gln Asp Cys290 295 300Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp305 310 315 320Asn Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln325 330 335Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His340 345 350Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp355 360 365Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu370 375 380Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val385 390 395 400Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr405 410 415Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser420 425 430Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn435 440 445Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp450 455 460Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu465 470 475 480Asp Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile485 490 495Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser500 505 510Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser515 520 525Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro530 535 540Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe545 550 555 560Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn565 570 575Asn Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys Tyr Pro Glu Ala580 585 590Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Arg Ile Thr Pro Arg Cys Met
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Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met405410 415Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys420 425 430Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu435 440 445Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly450 455 460Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly465 470 475 480Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr485 490 495Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val
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1.一種組合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.16的核酸。
2.一種組合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.17的肽。
3.一種組合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.13的核酸或其至少18個連續(xù)核苷酸長度的片段。
4.一種組合物，其包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.1的肽或其至少6個連續(xù)氨基酸長度的片段。
5.一種組合物，其包含病毒唑和抗原。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述抗原是核酸。
7.權(quán)利要求5的組合物，其中所述抗原是肽。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中所述核酸來源于選自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)以及丙型肝炎病毒(HCV)的病毒。
9.權(quán)利要求7的組合物，其中所述肽來源于選自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)以及丙型肝炎病毒(HCV)的病毒。
10.權(quán)利要求5的組合物，其中所述抗原是對應(yīng)于選自乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝炎核心抗原(HBcAg)以及肝炎E抗原(HBeAg)的抗原的核酸或肽。
11.權(quán)利要求7的組合物，其中所述肽包含選自SEQ.ID.NO.1-12的序列的至少3個連續(xù)氨基酸。
12.權(quán)利要求6的組合物，其中所述核酸包含選自SEQ.ID.NO.13-15的序列的至少9個連續(xù)核苷酸。
13.增強(qiáng)對丙型肝炎抗原免疫應(yīng)答的方法，其包含鑒定需要增強(qiáng)的對丙型肝炎抗原免疫應(yīng)答的動物；以及提供給所述動物包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.16的核酸的組合物。
14.增強(qiáng)對丙型肝炎抗原免疫應(yīng)答的方法，其包含鑒定需要增強(qiáng)的對丙型肝炎抗原免疫應(yīng)答的動物；以及提供給所述動物包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.17的肽的組合物。
15.增強(qiáng)對丙型肝炎抗原免疫應(yīng)答的方法，其包含鑒定需要增強(qiáng)的對丙型肝炎抗原免疫應(yīng)答的動物；以及提供給所述動物包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.13的核酸或其至少18個連續(xù)核苷酸長度的片段的組合物。
16.增強(qiáng)對丙型肝炎抗原免疫應(yīng)答的方法，其包含鑒定需要增強(qiáng)的對丙型肝炎抗原免疫應(yīng)答的動物；以及提供給所述動物包含病毒唑以及SEQ.ID.NO.1的肽或其至少6個連續(xù)氨基酸長度的片段的組合物。
17.制備疫苗的方法，其包含提供病毒唑；提供SEQ.ID.NO.16的核酸；以及混合所述病毒唑以及所述核酸以配制所述疫苗。
18.制備疫苗的方法，其包含提供病毒唑；提供SEQ.ID.NO.17的肽；以及混合所述病毒唑以及所述肽以配制所述疫苗。
19.制備疫苗的方法，其包含提供病毒唑；提供SEQ.ID.NO.13的核酸或其至少18個連續(xù)核苷酸長度的片段；以及混合所述病毒唑以及所述核酸以配制所述疫苗。
20.制備疫苗的方法，其包含提供病毒唑；提供SEQ.ID.NO.1的核酸或其6個連續(xù)氨基酸長度的片段；以及混合所述病毒唑以及所述核酸以配制所述疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了增強(qiáng)動物(例如家養(yǎng)、運(yùn)動或?qū)櫸镂锓N)和人中疫苗效應(yīng)的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明公開了包含病毒唑和抗原(優(yōu)選具有丙型肝炎病毒(HCV)上表位的抗原)的疫苗組合物，用于治療和預(yù)防疾病，優(yōu)選HCV感染。
文檔編號A61K48/00GK1469755SQ01815071
公開日2004年1月21日 申請日期2001年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月17日
發(fā)明者M·薩比爾格, C·胡爾特格倫, M 薩比爾格, 馗衤 申請人:特里帕普股份公司