專利名稱：塵螨屬2組的變應(yīng)原性蛋白質(zhì)的變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及螨的歐洲屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)種變應(yīng)原的新變體。
更具體地，本發(fā)明涉及變應(yīng)原Der p 2的低變應(yīng)原性變體的氨基酸序列，其通過將編碼所述變應(yīng)原的核苷酸序列進行位點專一誘變而獲得。該低變應(yīng)原性變體可用于由塵螨引起的變應(yīng)性病理現(xiàn)象的特異性免疫治療。
背景技術(shù)：
變態(tài)反應(yīng)為接觸變應(yīng)原后由產(chǎn)生的IgE類抗體而引起的速發(fā)型超敏反應(yīng)。IgE與位于效應(yīng)細胞(嗜堿性粒細胞和肥大細胞)表面的特異性受體結(jié)合，并且當(dāng)再次暴露于該變應(yīng)原時，它們誘導(dǎo)所述細胞脫顆粒，釋放介質(zhì)(如組胺和白三烯)，引起下列公知的變態(tài)反應(yīng)癥狀鼻炎、結(jié)膜炎、特應(yīng)性皮炎和哮喘。
塵螨屬的歐洲屋塵螨和美洲屋塵螨(Dermatophagoides farinae)為存在于室塵中的兩種相似的螨。來自這些節(jié)肢動物的變應(yīng)原在臨床上具有顯著的重要性。
至今已鑒定出了九種不同類型的螨變應(yīng)原，其中主要的兩類為Der p 1(Der f 1)和Der p 2(Der f 2)，它們中的每一種均與約80％變應(yīng)性受試者的IgE發(fā)生免疫反應(yīng)。
變應(yīng)原Der p 2(其核苷酸序列在GenBank中的存取代碼為AF276239)為由129個氨基酸殘基組成的分子量為約14kD的蛋白質(zhì)，其含有為免疫原性所必需的三個二硫鍵[1，2]。它與除Derf2(GenBank存取代碼D10449)外的任一其它已知蛋白質(zhì)無序列同源性。
變態(tài)反應(yīng)的唯一病原學(xué)治療表現(xiàn)為特異性脫敏免疫治療(SIT)。該治療在于將引起變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì)施用漸增的劑量，由此在患者體內(nèi)對該物質(zhì)誘導(dǎo)逐漸的脫敏反應(yīng)(3)。
雖然免疫治療構(gòu)成了對變態(tài)反應(yīng)的一種已建立的治療方案，但它并非完全沒有危險(4)。
由于在此類治療期間可發(fā)生更為嚴重的副作用，研究人員正著重研究應(yīng)用非注射途徑(經(jīng)口/舌下途徑)來施用疫苗以及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的用作疫苗的低變應(yīng)原性變體，其中所述低變應(yīng)原性變體是通過化學(xué)處理或位點專一誘變來改變變應(yīng)原而獲得的[5]。
詳細公開編碼歐洲屋塵螨的主要變應(yīng)原Der p 2的新cDNA已通過RT-PCR分離，其核苷酸序列在SEQ ID N.1報導(dǎo)。它在8個位置處不同于GenBank中的序列。分離的克隆所編碼的在SEQ ID N.3中報導(dǎo)的蛋白質(zhì)有兩個殘基Ala16和Ser63不同于變應(yīng)原Der p 2。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)成熟蛋白質(zhì)Der p 2的變應(yīng)性效應(yīng)可通過在存在賴氨酸殘基的下列位置至少之一處進行氨基酸序列的改變而減弱33、48、82、96、100、126，其中所述成熟蛋白質(zhì)Der p 2通過從SEQ ID N.3去除殘基1-16而產(chǎn)生。
此處“改變”是指在特定位置處替換一個或多個殘基，優(yōu)選地用中性和極性氨基酸替換，或者刪除存在于天然形式中的一個或多個Lys殘基，或者同時替換和刪除兩個或多個殘基。
替換所致突變在上述6個位置處的每一位置導(dǎo)入了丙氨酸殘基。最優(yōu)選的變體是在SEQ ID N.4中所示的6處替換同時存在。
本發(fā)明也包含蛋白質(zhì)Der p 2的變體，其與Der p 2的同源性大于85％，該變體在其氨基酸序列的相應(yīng)位置處具有如上所述的針對Der p 2的相同替換/刪除模式，該變體尤其是蛋白質(zhì)Der f 2。
本發(fā)明還包含來自Der p 2的氨基酸序列或來自其同源序列并含有至少一個上述替換/刪除的免疫活性肽。
在進一步的方面，本發(fā)明涉及編碼如上所述的Der p 2突變變體的核酸分子、編碼其同源變體的核酸分子、或編碼來自于它們的肽的核酸分子。
本發(fā)明的序列變體易于從成熟Der p 2的cDNA或其同源變體的cDNA開始制備，在序列變體中編碼信號肽的區(qū)域缺失且已導(dǎo)入目標(biāo)突變。
編碼具6處替換的優(yōu)選變體(SEQ ID N.4)的cDNA序列(誘變處理的堿基用黑體表示)在SEQ ID N.2中報導(dǎo)。
對歐洲屋塵螨產(chǎn)生變應(yīng)性的受試者血清中，本發(fā)明所產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)具有減輕的IgE反應(yīng)性。特別是使用對螨產(chǎn)生變應(yīng)性且具有RAST 4+反應(yīng)性的受試者的合并血清進行蛋白質(zhì)印跡試驗表明與在大腸桿菌(Escherichia coli)中產(chǎn)生的正常蛋白質(zhì)相比，SEQ ID N.4中所報導(dǎo)變體的IgE反應(yīng)性平均降低了約90％[

圖1]。該結(jié)果用可確定天然構(gòu)象中蛋白質(zhì)表位包括構(gòu)象性表位的ELISA試驗證實[圖2]。
本發(fā)明還涉及這樣的表達載體，其包含編碼任一以上定義的低變應(yīng)原性變體的核酸分子。
所述載體可為基因工程中常用的質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體或任一其它載體，并且除了本發(fā)明的核酸分子外，還可包括用于調(diào)控表達的真核或原核元件，如起始和終止轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列、增強子、啟動子、信號序列等。
而且，本發(fā)明包含轉(zhuǎn)化入本發(fā)明的載體或用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞。大體而言，將用原核細胞如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，或者用真核細胞如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)來克隆載體并表達cDNA。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)變體可如原樣產(chǎn)生或以融合蛋白產(chǎn)生。
由于降低的IgE反應(yīng)性，所述變體可用來制備疫苗，用于免疫治療由塵螨引起的變態(tài)反應(yīng)的治療目的。
本發(fā)明進一步的方面因此涉及這樣的藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的低變應(yīng)原性變體，任選地與塵螨屬或相似屬的螨的其它天然或改變了的變應(yīng)原組合，并包含可藥用賦形劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物為用于預(yù)防性或治療性處理變應(yīng)性疾病如支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎的疫苗。疫苗接種的原則和操作過程為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并在如(7)和(8)進行了描述。
下列實施例更詳細地闡述了本發(fā)明。
實施例如果沒有另外指出，下列實施例中所用的方法為Sambrook，F(xiàn)ritsch ET Maniatis“分子克隆實驗室手冊”(“Molecular cloning.A laboratorymanual”)第二版，1-2-3卷，CSH Lab Press 1989中所述的方法。
實施例1-RT-PCR分離Der p 2的cDNA用歐洲屋塵螨的mRNA通過RT-PCR產(chǎn)生相應(yīng)的cDNA，該反應(yīng)的引物為多聚dT寡核苷酸，用反轉(zhuǎn)錄酶催化該反應(yīng)。此后，通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))選擇性擴增對應(yīng)于變應(yīng)原Der p 2的cDNA，使用了兩條特異性引物，每條引物具有15個核苷酸，對應(yīng)于編碼該蛋白質(zhì)的基因區(qū)的末端。將Der p 2的cDNA克隆入載體(pBluescript-Stratagene)，用于在大腸桿菌細胞中擴增，并用自動測序儀根據(jù)Sanger法測序。
實施例2—編碼變應(yīng)原Der p 2的cDNA的位點專一誘變通過PCR擴增(聚合酶鏈反應(yīng))克隆在原核載體(pBluescript)中的同一cDNA來進行編碼變應(yīng)原Der p 2的cDNA的位點專一誘變。用作PCR反應(yīng)引物的寡核苷酸具有所需的堿基替換。對每一誘變而言，使用了與兩條DNA鏈的相應(yīng)區(qū)結(jié)合的所述寡核苷酸的互補對。擴增后，原始的未改變模板通過用限制性酶Dpn I酶促消化進行選擇性降解。然后用誘變處理過的分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞。從單個的細菌菌落所得的克隆根據(jù)Sanger法測序以證實堿基的正確改變且不存在cDNA的非特異性突變。
實施例3—蛋白質(zhì)Der p 2和其變體的產(chǎn)生當(dāng)來自Der p 2的正常cDNA以及對應(yīng)于SEQ ID N.2的誘變處理過的cDNA克隆入表達載體(pCALn-Stratagene)后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法于大腸桿菌細胞中表達，其為當(dāng)培養(yǎng)物處于指數(shù)生長(O.D.600nm＝0.6)時，向其中加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)誘導(dǎo)cDNA表達。誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成2小時后通過超聲裂解細菌細胞和通過離心去除細胞微粒來分離重組蛋白質(zhì)。通過親和層析從上清中純化蛋白質(zhì)，所使用的柱中基質(zhì)與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，其中的鈣調(diào)蛋白與融合至變應(yīng)原的CBP部分(鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白)相互作用。
實施例4—Der p 2變體變應(yīng)原性的蛋白質(zhì)印跡試驗根據(jù)Towbin所述的技術(shù)(6)，將等量的正常重組變應(yīng)原和SEQ ID N.4所示的誘變處理過的變體通過聚丙酰胺凝膠電泳并隨后通過電印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上進行分析。
將膜在含5％奶粉的TBS(飽和緩沖液)中孵育1小時，然后與一種對螨產(chǎn)生變應(yīng)性且具有反應(yīng)性RAST 4+的患者血清過夜孵育。用含0.05％吐溫-20的TBS洗三次后，將膜與過氧化物酶連接的抗人IgE抗血清孵育1小時、進一步漂洗、并用檢測系統(tǒng)檢測與膜結(jié)合的IgE抗體，其中所述檢測系統(tǒng)基于使用含H2O2的DAB(二氨基聯(lián)苯胺)溶液作為過氧化物酶的底物。
實施例5—ELISA檢測Der p 2變體對IgE的反應(yīng)性將在碳酸鹽/碳酸氫鹽50mM緩沖液，pH9.6中的等量(0.1μg)正常變應(yīng)原和其誘變處理過的變體于4℃孵育16小時而吸附于聚苯乙烯板的孔中，用于ELISA試驗。然后用洗滌液(含0.05％吐溫-20的60mM磷酸鹽緩沖液pH6.5)洗抗原，并用稀釋液(在磷酸鹽緩沖液150mM pH7.4中的25％馬血清、EDTA 1mM、0.05％吐溫20、0.01％硫柳汞)飽和游離位點。具有RAST4+反應(yīng)性的人合并血清以1∶2的比率在稀釋緩沖液中系列稀釋制備。將等量(100μl)的多個血清稀釋液加至每一樣本并在25℃孵育2小時。漂洗三次后，加入在稀釋緩沖液中1∶1500稀釋的過氧化物酶連接的抗人IgE抗血清，在25℃孵育1.5小時。漂洗三次后，加入100μl Ultra Blu試劑(Intergen，Milford，Mass.)并在25℃孵育15分鐘進行顯色反應(yīng)。該反應(yīng)通過加入100μl 1N HCl終止，并于450nm處用分光光度計評估。
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序列表<110>國家研究委員會(CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE)<120>塵螨屬2組的變應(yīng)原性蛋白質(zhì)的變體<130>Cons Naz Ric<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>444<212>DNA<213>歐洲屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)<400>1aaaatgatgt acaaaatttt gtgtctttca ttgttggtcg cagccgttgc cgctgatcaa 60gtcgatgtca aagattgtgc caatcatgaa atcaaaaaag ttttggtacc aggatgccat 120ggttcagaac catgtatcat tcatcgtggt aaaccattcc aattggaagc cgttttcgaa 180gccaaccaaa actcaaaaac cgctaaaatt gaaatcaaag cttcaatcga tggtttagaa 240gttgatgttc ccggtatcga tccaaatgca tgccattata tgaaatgtcc attggttaaa 300ggacaacaat atgatattaa atatacatgg aatgttccga aaattgcacc aaaatctgaa 360aatgttgtcg tcactgttaa agttatgggt gatgatggtg ttttggcctg tgctattgct 420actcatgcta aaatccgcga ttaa444<210>2<211>390<212>DNA<213>歐洲屋塵螨<400>2gatcaagtcg atgtcaaaga ttgtgccaat catgaaatca aaaaagtttt ggtaccagga 60tgccatggtt cagaaccatg tatcattcat cgtggtgcac cattccaatt ggaagccgtt 120ttcgaagcca accaaaactc agcaaccgct aaaattgaaa tcaaagcttc aatcgatggt 180ttagaagttg atgttcccgg tatcgatcca aatgcatgcc attatatgaa atgtccattg 240gttgcaggac aacaatatga tattaaatat acatggaatg ttccggcaat tgcaccagca 300tctgaaaatg ttgtcgtcac tgttaaagtt atgggtgatg atggtgtttt ggcctgtgct 360attgctactc atgctgcaat ccgcgattaa 390<210>3<211>145<212>PRT<213>歐洲屋塵螨<400>3Met Tyr Lys Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Val Ala Ala Val Ala Ala1 5 10 15Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val20 25 30Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly35 40 45Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys50 55 60Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val Asp65 70 75 80Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu85 90 95Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys100 105 110Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly115 120 125Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg130 135 140Asp145<210>4<211>129<212>PRT<213>歐洲屋塵螨<400>4Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val1 5 10 15Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly20 25 30Ala Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Ala35 40 45Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Asp Gly Leu Glu Val Asp50 55 60Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu65 70 75 80Val Ala Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Ala85 90 95Ile Ala Pro Ala Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly100 105 110Asp Asp Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Ala Ile Arg115 120 125Asp
權(quán)利要求
1.Der p 2的天然形式變體，或者為與Der p 2比較序列同一性高于85％的同源形式，其中至少一個存在于Der p 2位置33、44、82、96、100、126處的Lys殘基被替換和/或刪除。
2.如權(quán)利要求1中所述的變體，其中所述天然形式選自Der p 2和Derf 2。
3.如權(quán)利要求1-2中所述的變體，其中所述殘基用中性或極性氨基酸替換。
4.如權(quán)利要求1-3中所述的變體，其中所述殘基用丙氨酸替換。
5.如權(quán)利要求1-4中所述的變體，其具有序列SEQ ID N.4。
6.包含權(quán)利要求1-5的變體的免疫活性部分的肽，其中存在至少一個如權(quán)利要求1中所述的替換/刪除。
7.編碼如權(quán)利要求1-5中所述的蛋白質(zhì)變體的核酸分子，或編碼如權(quán)利要求6中所述的肽的核酸分子。
8.如權(quán)利要求7中所述的核酸分子，其序列為SEQ ID N.2。
9.包含權(quán)利要求7-8的核酸分子的載體。
10.用權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞。
11.藥物組合物，其包含有效量的如權(quán)利要求1-5中所述的蛋白質(zhì)變體或如權(quán)利要求6中所述的肽，并包含可藥用賦形劑。
12.如權(quán)利要求11中所述的組合物，其為疫苗形式。
全文摘要
歐洲屋塵螨種的變應(yīng)原變體，其具有降低的變應(yīng)原性。
文檔編號A61P29/00GK1454213SQ01815422
公開日2003年11月5日 申請日期2001年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月12日
發(fā)明者M·斯圖拉羅, A·維奧蒂, P·法拉賈尼, G·米斯特雷洛, D·龍卡羅洛, S·扎諾塔 申請人:國家研究委員會