專利名稱：細(xì)胞活化劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞活化劑、毛發(fā)細(xì)胞控制劑、毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑、毛發(fā)細(xì)胞增殖活化劑、毛囊上皮細(xì)胞增殖活化劑、外毛根鞘細(xì)胞增殖活化劑。本發(fā)明用這些藥劑作為育發(fā)劑成分，在毛發(fā)細(xì)胞活化方面發(fā)揮效果。
給毛發(fā)施用育發(fā)劑的效果有例如誘導(dǎo)生發(fā)的效果(促進(jìn)生發(fā)的效果、生長(zhǎng)期誘導(dǎo)效果)、使毛發(fā)變粗的效果、延長(zhǎng)毛發(fā)生長(zhǎng)期的效果、抑制5α-還原酶的效果、促進(jìn)血液循環(huán)的效果、殺菌效果、防止頭皮屑的效果、保濕效果、抗氧化效果等等。
然而，盡管在積極地開(kāi)發(fā)育發(fā)劑，但以往育發(fā)劑的防止脫發(fā)、生發(fā)效果等的育發(fā)作用未必足夠。這是因?yàn)槊摪l(fā)等的原因分為很多種，而且生發(fā)的機(jī)制也非常復(fù)雜。
以往的育發(fā)劑將脫發(fā)作為比較粗略的概念，換句話說(shuō)，糊里糊涂地抓住稱為“脫發(fā)”的現(xiàn)象進(jìn)行開(kāi)發(fā)，而著眼于其機(jī)理研究開(kāi)發(fā)的不多。
其主要原因之一是因?yàn)闆](méi)有充分地建立著眼于機(jī)理的、能夠簡(jiǎn)便檢測(cè)育發(fā)效果的育發(fā)藥物鑒定方法。特別是難以建立檢測(cè)毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)效果等的育發(fā)藥物鑒定方法，結(jié)果迄今為止提供的育發(fā)劑多著眼于在毛周期的生長(zhǎng)期內(nèi)誘導(dǎo)毛發(fā)進(jìn)行育發(fā)的生發(fā)誘導(dǎo)效果。
本發(fā)明人建立了在體外進(jìn)行的簡(jiǎn)便的育發(fā)藥物鑒定方法，使用所述育發(fā)藥物鑒定方法研究多種化合物，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供成為養(yǎng)發(fā)劑等成分的育發(fā)相關(guān)效果藥物。
此外，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)細(xì)胞控制劑。
再者，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑。
此外，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)細(xì)胞增殖活化劑。
再者，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿疑掀ぜ?xì)胞增殖活化劑。
此外，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值耐饷始?xì)胞增殖活化劑。
再者，本發(fā)明提供以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)張力、彈性改善劑。
圖2顯示毛發(fā)的扭矩增加。
在本發(fā)明中所使用的?；撬崾且苑肿邮紿2NCH2CH2SO3H表示的化合物，以前未正確地確認(rèn)其作為細(xì)胞活化劑、毛發(fā)細(xì)胞控制劑、毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑、毛發(fā)細(xì)胞增殖活化劑、毛囊上皮細(xì)胞增殖活化劑、外毛根鞘細(xì)胞增殖活化劑、毛發(fā)張力、彈性改善劑的效果。
本發(fā)明為以?；撬嶙鳛橛行П匦璩煞值拿l(fā)相關(guān)藥物，具有作為混合到育發(fā)劑、養(yǎng)發(fā)劑中的“個(gè)別效能藥物”的特征；通過(guò)下述的育發(fā)藥物鑒定方法，能夠通過(guò)至少維持或促進(jìn)毛囊上皮細(xì)胞的分裂增殖活性而確認(rèn)?；撬嵊芯S持或延長(zhǎng)毛發(fā)生長(zhǎng)期的效果。
本發(fā)明是對(duì)例如由于毛根附近的毛囊上皮細(xì)胞增殖緩慢等而生長(zhǎng)期變短，與生長(zhǎng)期毛發(fā)相比休止期毛發(fā)的比例相對(duì)變多而引起的脫發(fā)特別有效的藥物。此外，通過(guò)與其它有個(gè)別效能的育發(fā)藥物聯(lián)用，有可能增強(qiáng)對(duì)各種脫發(fā)癥的綜合及協(xié)同效果。也就是說(shuō)本發(fā)明藥物的用途與有著綜合育發(fā)效果概念的一般育發(fā)劑截然不同。
本發(fā)明的藥物包括?；撬帷Ｔ趯⑴；撬嶙鳛橛行С煞只旌系竭m當(dāng)基劑中制成制劑時(shí)，可根據(jù)用于發(fā)揮本發(fā)明效果的具體形式適當(dāng)?shù)卮_定其混合量。通常的混合量相對(duì)于基劑總量為0.00001-20％質(zhì)量，優(yōu)選0.01-10.0％質(zhì)量。在將本發(fā)明的藥物混合到毛發(fā)相關(guān)制品中時(shí)，優(yōu)選?；撬岬暮窟_(dá)到上述含量?；旌狭坎蛔?.00001％質(zhì)量，不能充分地發(fā)揮毛發(fā)細(xì)胞活化效果；混合量超過(guò)20％質(zhì)量，則不僅不能預(yù)期與含量增加相應(yīng)的效果增大，在制劑上造成困難的傾向變得顯著，因而不優(yōu)選。
本發(fā)明的藥物特別具有基于優(yōu)良的毛囊細(xì)胞增殖活化作用或者外毛根鞘細(xì)胞增殖活化作用的毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)效果。例如，對(duì)于由毛根附近的毛囊上皮細(xì)胞增殖緩慢等而生長(zhǎng)期變短、與生長(zhǎng)期毛發(fā)相比休止期毛發(fā)的比例相對(duì)變多而引起的脫發(fā)癥特別有效。此外，通過(guò)與其它有個(gè)別效能的育發(fā)劑聯(lián)用，有可能增強(qiáng)對(duì)特定脫發(fā)癥的協(xié)同效果。
確認(rèn)本發(fā)明藥物維持或延長(zhǎng)毛周期中生長(zhǎng)期的方法并沒(méi)有特別的限定，只要其測(cè)定方法本身對(duì)于指定作用而言是適當(dāng)?shù)?。例如，可以使用體外測(cè)定方法，也可以使用體內(nèi)測(cè)定方法，但考慮到其簡(jiǎn)便性和有效性，優(yōu)選使用體外測(cè)定方法。
以下是體外測(cè)定方法之一，對(duì)特征為研究毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞增殖效果的檢測(cè)方法進(jìn)行簡(jiǎn)單說(shuō)明。所述方法是通過(guò)使試驗(yàn)物質(zhì)在無(wú)血清培養(yǎng)基中與毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞接觸，測(cè)定其細(xì)胞增殖活性的有無(wú)和強(qiáng)弱，從而鑒定所述試驗(yàn)物質(zhì)延長(zhǎng)毛周期中生長(zhǎng)期的效果的育發(fā)藥物鑒定方法。這是一種著眼于與毛發(fā)伸長(zhǎng)直接相關(guān)的毛囊上皮細(xì)胞，通過(guò)使用這種培養(yǎng)細(xì)胞，測(cè)定所需的延長(zhǎng)毛周期中生長(zhǎng)期的效果的體外育發(fā)藥物鑒定方法。
在這種育發(fā)藥物鑒定方法中，使試驗(yàn)物質(zhì)與分離動(dòng)物(包括人類)的毛囊上皮細(xì)胞得到的培養(yǎng)細(xì)胞即“毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞”接觸，測(cè)定所述細(xì)胞有無(wú)增殖以及增殖的強(qiáng)弱。毛囊上皮細(xì)胞指特別是在毛根附近的外毛根鞘細(xì)胞和基層細(xì)胞等細(xì)胞，不包括內(nèi)側(cè)的毛乳頭細(xì)胞。毛周期中的生長(zhǎng)期正好是該毛發(fā)伸長(zhǎng)的時(shí)期，亦即毛囊上皮細(xì)胞分裂增殖的時(shí)期，毛周期中的退化期和休止期是所述細(xì)胞分裂增殖減弱停止的時(shí)期?？傊贸龅慕Y(jié)論是，在毛周期中延長(zhǎng)生長(zhǎng)期的物質(zhì)是通過(guò)其給予而維持毛囊上皮細(xì)胞分裂和增殖活性、從而防止毛發(fā)進(jìn)入毛周期中的退化期和休止期的物質(zhì)，亦即持續(xù)促進(jìn)或維持毛囊上皮細(xì)胞增殖的物質(zhì)。另外，其它的體外育發(fā)藥物檢測(cè)方法有例如使試驗(yàn)物質(zhì)作用于動(dòng)物的毛乳頭細(xì)胞、確定其增殖效果的方法。
體內(nèi)測(cè)定方法有例如將試驗(yàn)物質(zhì)給予裸鼠，測(cè)定所述裸鼠體表生毛部位的狀態(tài)，檢測(cè)試驗(yàn)物質(zhì)延長(zhǎng)毛周期中生長(zhǎng)期的效果的育發(fā)藥物鑒定方法等。在原則上無(wú)毛但其生毛部位隨時(shí)間而在體表移動(dòng)的特征性生毛的裸鼠中，通過(guò)測(cè)定其生毛部位的大小和生毛部位的移動(dòng)速度，鑒定毛周期中生長(zhǎng)期的長(zhǎng)度的方法等。
本發(fā)明藥物可采用的劑型，只要可以混合到育發(fā)劑中并可適用于皮膚，則沒(méi)有特別的限定。本發(fā)明的藥物可以混合到例如生發(fā)油、發(fā)乳、摩絲(注冊(cè)商標(biāo))、香波、護(hù)發(fā)素等制品中。
本發(fā)明的藥物在不損害本發(fā)明的效果的情況下，可以與化妝品、擬藥品、藥品等中常用的各種油性或水性成分、保濕劑、增稠劑、防腐劑、抗氧化劑、香料、色素、各種藥物等混合，用常規(guī)方法配制成制劑。實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例等更具體地說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明不僅限于以下的實(shí)施例。在以下的實(shí)施例等中，以“％”表示并且顯示含量時(shí)，如無(wú)具體指明，則意指質(zhì)量百分比。
然后，將毛囊置于包被膠原(I型)的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行外殖片培養(yǎng)。另外，此時(shí)的培養(yǎng)基使用無(wú)血清培養(yǎng)基[角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(KGM)]。培養(yǎng)4-5天后，在可以確認(rèn)毛囊附著于培養(yǎng)皿并且細(xì)胞增殖時(shí)更換培養(yǎng)基，此后每隔2天更換培養(yǎng)基。
用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA于37℃處理如此增殖的細(xì)胞5分鐘，用等量的0.1％胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，離心(800×g，5分鐘)回收細(xì)胞。然后，將細(xì)胞懸浮于上述無(wú)血清培養(yǎng)基中，以5000細(xì)胞/cm2的密度接種于包被膠原(I型)的培養(yǎng)皿中，每隔2天更換培養(yǎng)基，直到細(xì)胞亞融合。再用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA于37℃處理5分鐘后，用等量的0.1％胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，離心(800×g，5分鐘)，在如此獲得的人毛囊上皮細(xì)胞中添加細(xì)胞冷凍液(セルバンカ-ダイヤトロン生產(chǎn))，調(diào)至1.0×106細(xì)胞/ml的濃度，向各冷凍管中各加入1.0×106細(xì)胞，將其凍存。另外，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算出這些管的細(xì)胞數(shù)。2.試驗(yàn)物質(zhì)的分析測(cè)定(3000倍，5個(gè)視野)通過(guò)上述程序獲得的毛囊上皮細(xì)胞中成纖維細(xì)胞的混入率(FB混入率)，最終FB混入率大于等于3％的毛囊上皮細(xì)胞不包括在分析對(duì)象中。然后，將所述毛囊上皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)燒瓶中后，將其用0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA處理，然后用0.1％胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，以1500rpm離心處理5分鐘，除去上清液，在沉淀中添加20ml KGM培養(yǎng)基，制備細(xì)胞懸浮液。
以0.2ml/孔的比率接種(1.0×104細(xì)胞/孔)于96孔板(I型膠原包被板フアルコン公司生產(chǎn))中，將細(xì)胞于室溫靜置20分鐘，直至細(xì)胞沉降至孔底。此后，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)1天，獲得所需的人毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞。B.大鼠毛囊上皮細(xì)胞1.大鼠毛囊上皮細(xì)胞的采集(1)毛囊的采集采集新生(3-4日齡)大鼠的背部皮膚，將此采集的背部皮膚每2片浸入含有1％PSF的PBS(-)中。此后，用解剖用剪刀從皮膚脂肪層除去下面的皮下脂肪、皮膜等。隨后，再將所述背部皮膚浸入含有1％PSF的PBS(-)中，再于含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)(含有0.02％EDTA。以下相同)中于4℃浸泡過(guò)夜。
在所述胰蛋白酶溶液中浸泡后，用鑷子剝下背部皮膚的真皮層和表皮層，將真皮層轉(zhuǎn)移到加入了含有0.35％膠原酶的Ham氏F12培養(yǎng)基[其組成(mg/L)1-丙氨酸(8.9)、1-精氨酸(HCl211)、1-天冬酰胺(13.2)、1-天冬氨酸(13.3)、1-半胱氨酸(HCl31.5)、1-谷氨酸(14.7)、1-谷氨酰胺(146)、甘氨酸(7.5)、1-組氨酸(HCl19)、1-異亮氨酸(3.9)、1-亮氨酸(13.1)、1-賴氨酸(HCl36.5)、1-甲硫氨酸(4.5)、1-苯丙氨酸(5.0)、脯氨酸(34.5)、1-絲氨酸(10.5)、1-蘇氨酸(11.9)、1-色氨酸(2.0)、1-酪氨酸(5.4)、1-纈氨酸(11.7)、生物素(0.0073)、膽堿(Cl14.0)、維生素B12(1.36)、葉酸(1.32)、肌醇(18.0)、煙酰胺(0.037)、泛酸(Ca0.477)、維生素B6(HCl0.062)、維生素B2(0.038)、維生素B1(HCl0.337)、CaCl2(2H2O44.0)、CuSO4·5H2O(0.0025)、FeSO4·7H2O(0.834)、KCl(224.0)、MgCl2(6H2O122)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，53，288(1965))，以下相同]的100mm培養(yǎng)皿中，用剪刀截?cái)?。含有所述截?cái)辔锏呐囵B(yǎng)基于37℃浸透(60rpm)35分鐘。浸透后，進(jìn)行吸打，直至在所述膠原酶反應(yīng)物中見(jiàn)不到塊狀物，將其轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，添加含有DNA酶(10000單位)的Ham氏F12培養(yǎng)基，放置5分鐘。
放置后，再吸打所得的懸浮液，然后用尼龍網(wǎng)(Nytex157網(wǎng))過(guò)濾，將其轉(zhuǎn)移到50ml離心管中。將懸浮液分成兩份，然后分別用PBS(-)稀釋懸浮液至30ml的體積，隨后將這種經(jīng)稀釋的懸浮液離心(4℃，400rpm，5分鐘)。離心后，除去上清液，從中除去脂肪部分。隨后，向沉淀中添加25ml PBS(-)將其懸浮，再將其離心[(4℃，400rpm，5分鐘)×3次]。通過(guò)這種離心操作獲得的沉淀是大鼠背部皮膚的毛囊。(2)毛囊上皮細(xì)胞的采集向通過(guò)上述操作獲得的毛囊中添加5ml含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，將細(xì)胞懸浮液于37℃孵育5分鐘。孵育后，加入5ml等量的胎牛血清(FBS)和Ham氏F12培養(yǎng)基，細(xì)胞懸浮液通過(guò)セルストレ-ナ-(100μm，Nalgene公司生產(chǎn))過(guò)濾，然后加入到50ml離心管中，將所述細(xì)胞懸浮液離心(4℃，1500rpm，5分鐘)。從中除去上清液，得到為沉淀的所需毛囊上皮細(xì)胞。
向此毛囊上皮細(xì)胞中加入細(xì)胞冷凍液(セルバンカ-ダイヤトロン生產(chǎn))，調(diào)至1.5×107細(xì)胞/ml的濃度，向各冷凍管中分別加入1.5×107細(xì)胞，將其凍存。另外，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算出這些管中的細(xì)胞數(shù)。2.毛囊上皮細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)為了盡可能從系統(tǒng)中除去其中混入的成纖維細(xì)胞，將通過(guò)上述程序獲得的毛囊上皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。以下說(shuō)明其步驟。用37℃的恒溫箱將通過(guò)上述程序獲得的冷凍細(xì)胞解凍。然后添加10ml FAD培養(yǎng)基[在Ham氏F12培養(yǎng)基(下述)和MEN培養(yǎng)基的3∶1混合物中含有胰島素(5.0μg/ml)、氫化可的松(0.45μg/ml)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(10.0ng/ml)、霍亂毒素(10-9M)和胎牛血清(10％)的培養(yǎng)基，以下相同]，稀釋細(xì)胞溶液，并進(jìn)行離心處理(10℃以下，1500rpm，5分鐘)。離心后，除去上清液，添加10ml FAD培養(yǎng)基，反復(fù)吸打直至見(jiàn)不到細(xì)胞塊。
用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算出所得的細(xì)胞數(shù)，用FAD培養(yǎng)基調(diào)至2.5×105細(xì)胞/ml的濃度。將細(xì)胞接種到I型膠原包被的75cm3燒瓶中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)過(guò)夜。
培養(yǎng)后，用10ml PBS(-)將其洗滌2次，加入2ml含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，于37℃、5％CO2孵育4分鐘。隨后，添加2ml胎牛血清(FBS)，輕搖一次后除去上清液，從而除去其中混入的成纖維細(xì)胞。
再向其中加入15ml KGM培養(yǎng)基[表皮角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Keratinocyto growth medium)向角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Keratinocyto basal medium){KBM培養(yǎng)基(改良的MCDB153培養(yǎng)基クロ-ネテイツクス公司生產(chǎn))}中添加牛腦垂體提取物(BPE)(0.4％體積)、胰島素(0.5μm/ml)、氫化可的松(0.5μm/ml)、h-EGF(0.1ng/ml)的培養(yǎng)基。以下相同]，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)3天。3.試驗(yàn)物質(zhì)的分析測(cè)定(3000倍，5個(gè)視野)接種有通過(guò)上述程序獲得的毛囊上皮細(xì)胞的培養(yǎng)燒瓶中成纖維細(xì)胞的混入率(FB混入率)，如果最終FB混入率大于等于3％，則從分析對(duì)象中將其除去。
用10ml PBS(-)將其洗滌2次，添加2ml含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，并于37℃孵育3分鐘。隨后，為了利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶反應(yīng)性的不同，從中除去成纖維細(xì)胞，除去胰蛋白酶，再加入2ml含有0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，于37℃以20rpm振蕩5分鐘。
然后，在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞脫落后，加入10ml含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，在50ml離心管中進(jìn)行吸打，以1500rpm離心5分鐘。除去上清液，加入20ml KGM培養(yǎng)基，吸打直至無(wú)細(xì)胞塊。
細(xì)胞懸浮液通過(guò)セルストレ-ナ-(100μm，Nalgene公司生產(chǎn))過(guò)濾，然后加入到50ml離心管中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算出懸浮液中的活細(xì)胞數(shù)，向其中加入KGM培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5.0×104細(xì)胞/ml。隨后，以0.2ml/孔的比率接種(1.0×104細(xì)胞/孔)于96孔板(I型膠原包被板フアルコン公司生產(chǎn))中，于室溫下放置約20分鐘，直至細(xì)胞沉降至孔底。此后，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)1天，得到所需的大鼠毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞。C.試驗(yàn)培養(yǎng)基的制備(1)添加試驗(yàn)物質(zhì)的培養(yǎng)基的制備稱量約1.5mg?；撬?，用KBM培養(yǎng)基配制成1％的溶液，通過(guò)0.45μm濾器過(guò)濾除菌。隨后，在KBM培養(yǎng)基中添加10000倍量的上述溶液[試驗(yàn)物質(zhì)的濃度1.0×10-5％]。(2)對(duì)照培養(yǎng)基的制備用KBM培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。作為陽(yáng)性對(duì)照，使用在陰性對(duì)照即KBM培養(yǎng)基中添加2μl胰島素(5mg/ml)、2μl氫化可的松(0.5mg/ml)的細(xì)胞增殖因子的培養(yǎng)基。D.試驗(yàn)物質(zhì)培養(yǎng)基的更換將上述A、B中配制了人毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞和大鼠毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中的KGM培養(yǎng)基更換為添加試驗(yàn)物質(zhì)的培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基(200μl孔)，更換后于37℃、5％CO2下培養(yǎng)2天。另外，如下進(jìn)行所述培養(yǎng)基的更換吸出孔內(nèi)的KGM培養(yǎng)基，小心不損傷附著于底部的細(xì)胞，隨后立即從孔的兩端加入添加了試驗(yàn)物質(zhì)的培養(yǎng)基。E.細(xì)胞增殖測(cè)定以相對(duì)于培養(yǎng)基體積為1/10的量加入alamar blue(アラマ-バイオサイエンス公司生產(chǎn))，于37℃(5％CO2)孵育6小時(shí)。孵育后，用微量培養(yǎng)板讀數(shù)儀(Bio Rad公司生產(chǎn))測(cè)定其595nm和570nm的吸光度，根據(jù)以下公式，計(jì)算出細(xì)胞增殖度。(試驗(yàn)樣品的細(xì)胞增殖度)＝(試驗(yàn)樣品的alamar blue還原率)/(陰性對(duì)照的alamar blue還原率)×100(％)再根據(jù)下述公式，確定?；撬岬拿疑掀ぜ?xì)胞增殖促進(jìn)作用。(試驗(yàn)樣品的細(xì)胞增殖促進(jìn)指標(biāo))＝((試驗(yàn)樣品的細(xì)胞增殖度)-(陰性對(duì)照的alamar blue還原率))/((陽(yáng)性對(duì)照的alamar blue還原率)-(陰性對(duì)照的alamar blue還原率))結(jié)果細(xì)胞增殖促進(jìn)作用以陰性對(duì)照為0，陽(yáng)性對(duì)照為1，則?；撬釋?duì)于來(lái)自人的毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用為0.8，對(duì)于來(lái)自大鼠的毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞而言也為0.8。根據(jù)這一結(jié)果，確實(shí)證明有毛囊上皮培養(yǎng)細(xì)胞的增殖活性。亦即明確斷定?；撬嵊忻l(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)活性。
結(jié)果，未感染病毒的外毛根鞘細(xì)胞到傳代5代左右時(shí)停止增殖。導(dǎo)入了T抗原的毛乳頭細(xì)胞在克隆后傳代7代左右時(shí)，從外表上看來(lái)好像增殖停止了，但若再繼續(xù)培養(yǎng)，從外表上看來(lái)似乎又開(kāi)始增殖了。推測(cè)大概是到傳代7代時(shí)達(dá)到了臨界，在此發(fā)生了某些變異，變?yōu)闊o(wú)限增殖化細(xì)胞?？寺r(shí)，雖然選出數(shù)個(gè)克隆，但僅得到一個(gè)克隆的越過(guò)臨界期繼續(xù)增殖的細(xì)胞株。細(xì)胞增殖評(píng)價(jià)外毛根鞘細(xì)胞用PBS(-)洗滌2次。用胰蛋白酶處理，使細(xì)胞脫落。用胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，離心，棄去上清液，回收外毛根鞘細(xì)胞。加入KGM培養(yǎng)基，制備細(xì)胞懸浮液。在包被膠原的24孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天，更換為添加了試驗(yàn)物質(zhì)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)4天后，用PBS(-)洗滌細(xì)胞，用胰蛋白酶使細(xì)胞脫落。在這種狀態(tài)下冷凍各培養(yǎng)板的細(xì)胞。試驗(yàn)物質(zhì)的制備試驗(yàn)物質(zhì)?；撬嵊媒琴|(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(KBM)配制為50mM，進(jìn)行過(guò)濾除菌。將其作為母液，用KBM培養(yǎng)基稀釋，將試驗(yàn)物質(zhì)的濃度配制為10nM、1μM、100μM、10mM。陰性對(duì)照僅用KBM培養(yǎng)基。細(xì)胞DNA的測(cè)定將細(xì)胞解凍后，向各孔中加入Hoechst33258，經(jīng)超聲處理破碎細(xì)胞。將其轉(zhuǎn)移到比色杯中，在激發(fā)波長(zhǎng)356nm、熒光波長(zhǎng)460nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度。以陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度作為100，通過(guò)計(jì)算DNA量的相對(duì)值，計(jì)算出細(xì)胞增殖程度。
結(jié)果示于

圖1。根據(jù)該結(jié)果，可知?；撬嵊袩o(wú)限增殖化外毛根鞘細(xì)胞活化作用。
隨后，測(cè)試基于毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)作用的育發(fā)效果。實(shí)施例3 液態(tài)毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑將0.8％?；撬帷?0％的70％乙醇、0.05％油酸鈉、0.49％十二烷基苯磺酸、0.5％氫化蓖麻油環(huán)氧乙烷(40摩爾)加成物和離子交換水(余量)混合攪拌，使其溶解。再加入離子交換水(10％)進(jìn)行混合，獲得液態(tài)的毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑。用這種液態(tài)育發(fā)劑配方中除牛磺酸以外的其他成分配制液體制劑，作為對(duì)照(比較例1)。實(shí)施例4 乳液狀毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑制備以下配方的乳液狀毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑。成分 混合量(質(zhì)量％)(A相)?；撬?0.05聚氧乙烯(60摩爾)加成氫化蓖麻油 2.0甘油 10.0雙丙甘醇 10.01，3-丁二醇5.0聚乙二醇1500 5.0(B相)異辛酸鯨蠟酯 10.0角鯊?fù)?5.0凡士林 2.0對(duì)羥基苯甲酸丙酯 2.0(C相)羧基乙烯基聚合物1％水溶液 30.0六偏磷酸鈉 0.03離子交換水 9.3(D相)離子交換水 4.5(E相)KOH 0.12離子交換水 5.0<制備方法>將A相和B相分別于60℃加熱溶解，混合，并用均化器進(jìn)行處理，制成凝膠。向其中緩慢加入D相，用均化器分散。隨后加入溶解的C相，最后加入溶解的E相，用均化器乳化，制備水包油型乳液型毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑。實(shí)施例5 膏狀毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑成分混合量(質(zhì)量％)(A相)液體石蠟5.0十六醇十八醇混合物 5.5一硬脂酸甘油酯 3.0EO(20摩爾)-2-辛基十二烷基醚 8.0對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.3香料0.1(B相)?；撬? 5.0甘油8.0雙丙甘醇20.0聚乙二醇40005.0十二烷基硫酸鈉 0.1六偏磷酸鈉 0.005離子交換水 39.995<制備方法>將A相和B相分別加熱溶解，混合，用均化器乳化，得到膏狀毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑。毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑的育發(fā)作用的研究為了調(diào)查通過(guò)上述方法獲得的毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑的防止脫發(fā)、生發(fā)效果等的育發(fā)作用，用下述方法對(duì)人進(jìn)行トリコグラム試驗(yàn)和實(shí)際使用試驗(yàn)。受試樣品和對(duì)照樣品是實(shí)施例3-5的本發(fā)明毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑、70％乙醇、比較例1。試驗(yàn)方法在顯微鏡下觀察在上述樣品使用前和使用后所拔取毛發(fā)的毛根，根據(jù)毛根的形態(tài)，對(duì)停止生長(zhǎng)的毛發(fā)的毛根即“休止期毛根”進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過(guò)其比率的增減，比較這些樣品的育發(fā)作用。亦即在10名男性受試者頭皮上每日2次，每次2ml連續(xù)6個(gè)月涂抹試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品，臨涂抹前和6個(gè)月涂抹一結(jié)束時(shí)，每名受試者各拔取100根頭發(fā)，在顯微鏡下觀察各個(gè)毛根。試驗(yàn)結(jié)果示于下表1中。
表1

由這一結(jié)果可以確認(rèn)本發(fā)明的毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑有基于毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)效果的育發(fā)效果。賦予毛發(fā)張力和彈性的效果以?；撬嶙鳛楸匦璩煞值谋景l(fā)明具有賦予毛發(fā)張力和彈性的效果，可以用作毛發(fā)張力、彈性改善劑。首先說(shuō)明試驗(yàn)方法。試驗(yàn)樣品毛發(fā)使用未經(jīng)過(guò)電燙發(fā)、染發(fā)、漂白等化學(xué)處理的19歲女性的頭發(fā)。約20cm的發(fā)梢部分在規(guī)定香波液中浸漬1小時(shí)后，在流水中沖洗1分鐘，在正常環(huán)境下干燥24小時(shí)以上，以此作為健康正常毛發(fā)的樣品。對(duì)上述健康正常毛發(fā)使用規(guī)定漂白劑，在室溫下漂白處理30分鐘，隨后在流水中沖洗1分鐘。重復(fù)4次漂白處理，沖洗后在正常環(huán)境下干燥，作為漂白處理的毛發(fā)(BL處理)。牛磺酸處理將1根毛發(fā)在20ml 1mol/L的?；撬崴芤褐薪n過(guò)夜，在25℃、50％相對(duì)濕度環(huán)境下干燥試驗(yàn)樣品的毛發(fā)。扭矩的測(cè)定使用カト-テツク公司生產(chǎn)的扭矩試驗(yàn)機(jī)KES-YN-1，在25℃、50％相對(duì)濕度環(huán)境下進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定在用?；撬崴芤禾幚碇斑M(jìn)行，以此作為對(duì)照。設(shè)定扭轉(zhuǎn)角為±1080°，扭轉(zhuǎn)速度為18°/秒。當(dāng)扭轉(zhuǎn)角θ＝360°～720°時(shí)，以相對(duì)于扭轉(zhuǎn)角θ的扭矩Tf的增加部分B＝tan(Tf/θ)作為扭轉(zhuǎn)剛性B值，評(píng)價(jià)用?；撬崴芤禾幚砬昂蟮腂值比。結(jié)果示于圖2。
根據(jù)所述結(jié)果，表明?；撬崽幚砗竺l(fā)扭矩增加、賦予毛發(fā)張力和彈性。
下面是混合本發(fā)明藥物的優(yōu)選制劑配方。混合有?；撬岬囊韵孪悴?、護(hù)發(fā)素是泡沫持久性、泡沫質(zhì)量?jī)?yōu)良的洗發(fā)劑，也是根據(jù)毛發(fā)生長(zhǎng)前細(xì)胞的水平來(lái)看可以預(yù)期有使毛發(fā)健康成為長(zhǎng)出后即具有張力和彈性的健康毛發(fā)的效果的育發(fā)洗發(fā)劑。配方例1 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)牛磺酸 8.0聚氧乙烯烷基銨 15.0氨基丙基二甲基乙酸 3.0椰油脂肪酸單乙醇酰胺 1.6二硬脂酸乙二醇酯 0.6二甲基硅酮(5000cs)乳膠40％乳液 1.8苯甲酸鈉 0.2陽(yáng)離子化纖維素 0.3離子交換水 69.5配方例2 護(hù)發(fā)素配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬? 0.6エキセコ-ルD-5 3.4二甲基硅酮 0.5硬脂醇 7.5硬脂酸二甲氨基丙基酰胺 2.5離子交換水 85.5配方例3 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬? 3N-椰油脂肪酸-N-甲基?；撬徕c 10椰油脂肪酸二乙醇酰胺 4椰油脂肪酸酰胺丙基甜菜堿鈉 10マ-コ-ト550(約8％水溶液) 5檸檬酸 0.5苯甲酸鈉 適量香料 適量精制水 余量配方例4 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)N-椰油脂肪酸-N-甲基牛磺酸?；撬徕c鹽12椰油脂肪酸酰胺丙基甜菜堿鈉鹽 5月桂酸丙二醇酯 1.5陽(yáng)離子化纖維素 0.3檸檬酸 0.5苯甲酸鈉 適量香料 適量精制水 余量配方例5 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬?0.3聚氧乙烯月桂基醚鈉鹽 10椰油脂肪酸酰胺丙基甜菜堿鈉鹽 5椰油脂肪酸單乙醇酰胺 2陽(yáng)離子化纖維素 0.5マ-コ-ト550(約8％水溶液) 3.0檸檬酸 0.3苯甲酸鈉 適量香料 適量精制水 余量配方例6 香波配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬?.5聚氧乙烯月桂基醚鈉鹽 8咪唑鎓甜菜堿鈉鹽 3椰油脂肪酸二乙醇酰胺 4陽(yáng)離子化纖維素0.3檸檬酸0.5ケ-ソンCG 適量香料 適量精制水余量配方例7 護(hù)發(fā)素配方成分 混合量(質(zhì)量％)牛磺酸0.1二甲基硅酮5硬脂醇2硬脂基三甲基氯化銨0.7甘油 2.0對(duì)羥基苯甲酸酯適量香料 適量精制水余量配方例8 護(hù)發(fā)素配方成分 混合量(質(zhì)量％)?；撬?.3二甲基硅酮10山萮醇1.5硬脂醇 1硬脂基三甲基氯化銨 1.0甘油5.0對(duì)羥基苯甲酸酯 適量香料適量精制水 余量配方例9 護(hù)發(fā)素配方成分混合量(質(zhì)量％)牛磺酸 0.1二甲基硅酮 5石蠟2鯨蠟醇 1.5硬脂醇 0.3山萮基三甲基氯化銨 0.5異戊二烯二醇3.0ケ-ソンCG 適量香料適量精制水 余量工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供通過(guò)使細(xì)胞增殖活化，控制毛發(fā)細(xì)胞、延長(zhǎng)毛周期中的生長(zhǎng)期、活化毛發(fā)細(xì)胞的毛囊上皮細(xì)胞和外毛根鞘細(xì)胞的增殖，從而賦予毛發(fā)張力和彈性的毛發(fā)相關(guān)藥劑。
權(quán)利要求
1.以?；撬嶙鳛橛行С煞值募?xì)胞活化劑。
2.以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)細(xì)胞控制劑。
3.以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑。
4.以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)細(xì)胞增殖活化劑。
5.以牛磺酸作為有效成分的毛囊上皮細(xì)胞增殖活化劑。
6.以?；撬嶙鳛橛行С煞值耐饷始?xì)胞增殖活化劑。
7.以?；撬嶙鳛橛行С煞值拿l(fā)張力、彈性改善劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及以?；撬嶙鳛橛行С煞值募?xì)胞活化劑、毛發(fā)細(xì)胞控制劑、毛發(fā)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)劑、毛發(fā)細(xì)胞增殖活化劑、毛囊上皮細(xì)胞增殖活化劑、外毛根鞘細(xì)胞增殖活化劑。本發(fā)明用這些藥劑作為育發(fā)劑成分，在毛發(fā)細(xì)胞活化方面發(fā)揮效果。
文檔編號(hào)A61P17/14GK1458842SQ01815800
公開(kāi)日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2001年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月19日
發(fā)明者浜田千加, 田島正裕, 中間康成, 高橋唯仁 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂