專利名稱：用非蛋白質(zhì)水解激活的凝血酶受體的激動劑刺激軟骨生長的制作方法
政府支持本發(fā)明整體或部分得到國家健康研究院/國家關(guān)節(jié)炎和粘膜骨架和皮膚疾病研究院的1 R43 AR463343-01的資金資助。政府在本發(fā)明中有一些權(quán)利。相關(guān)的申請本申請書要求了2000年7月20日遞交的美國臨時申請?zhí)?0/219,800的權(quán)益，該申請的整個內(nèi)容通過在此引證而合并于本文。
發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從關(guān)節(jié)軟骨分離的軟骨細胞是應(yīng)答非蛋白質(zhì)水解凝血酶細胞表面受體(下文中稱為“NPAR”)的化合物的。例如，軟骨細胞的每個細胞約表達233,000個凝血酶結(jié)合位點，表觀親和力約為0.1nM(3000個位點)和27nM(230,000個位點)(實施例1)。另外，化合物TP508，非蛋白質(zhì)水解凝血酶受體的激動劑在存在作為輔助有絲分裂原的凝血酶時，在培養(yǎng)物中刺激小牛軟骨細胞的增殖，并且其自身刺激在三維基質(zhì)的培養(yǎng)中培養(yǎng)的大鼠軟骨細胞的增殖(實施例3A)。這一相同的TP508化合物也刺激糖蛋白的合成，如在小牛軟骨細胞中摻入35S硫酸鹽(實施例2B)和大鼠軟骨細胞的3維培養(yǎng)(實施例3B)。這些體外實驗證明，NPAR激動劑可以刺激從關(guān)節(jié)的軟骨分離的軟骨細胞中的增殖和基質(zhì)的產(chǎn)生。其他的體內(nèi)實驗證明，將持續(xù)釋放配方的TP508遞送到大鼠滑車神經(jīng)溝軟骨缺陷處，擴展到下軟骨能夠修復軟骨缺陷，包括下軟骨的修復，正常軟骨表面的恢復和新形成的軟骨與未損傷的缺陷區(qū)的軟骨外側(cè)的整合(實施例5)。
根據(jù)前面的章節(jié)中報道的結(jié)果，本文公開了在受試者中刺激體內(nèi)軟骨細胞生長和軟骨修復的方法，和將藥物組合物遞送到關(guān)節(jié)缺陷處輔助表面的修復和防止關(guān)節(jié)退化的新遞送方法。
本發(fā)明是在需要軟骨生長，修復或再生的受試者中，在有關(guān)位點刺激軟骨生長，再生或修復的方法。該方法包括對損傷的位點給藥治療有效量的非蛋白質(zhì)水解激活凝血酶受體的激動劑的步驟。
本發(fā)明的另一個實施方案是在體外刺激軟骨細胞的增殖和擴展的方法。該方法包括在存在刺激NPAR激動劑的量時培養(yǎng)軟骨細胞。本發(fā)明的詳細說明在有骨關(guān)節(jié)炎的受試者中發(fā)現(xiàn)了需要軟骨生長，修復或再生的位點。骨關(guān)節(jié)炎或退化性關(guān)節(jié)疾病是慢發(fā)展的，不可逆的，經(jīng)常性的單關(guān)節(jié)疾病，特征是疼痛和失去功能。疼痛和虛弱的原因是軟骨退化，這是該疾病的一個主要的癥狀。透明的軟骨是靈活的組織，覆蓋在骨的末端，位于關(guān)節(jié)之間，如膝蓋中。同時，在沿著脊柱的骨之間也有發(fā)現(xiàn)。軟骨是光滑的，允許穩(wěn)定，靈活地運動，并且摩擦最小，但同時也抵抗壓力和能夠瓦解施加的負載。由于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，軟骨的表面和暴露的下面的骨變得不規(guī)則。不是光滑地摩擦，骨關(guān)節(jié)炎表面相互摩擦，導致僵硬和疼痛。損傷的軟骨的退化和這些關(guān)節(jié)位點的新的軟骨的生長將緩解疼痛并且恢復與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的功能的喪失。
軟骨損傷也可以發(fā)生在創(chuàng)傷和外科手術(shù)導致的損傷中。運動損傷是軟骨損傷的常見原因，特別是膝蓋這樣的關(guān)節(jié)中。對軟骨的損傷可以導致相同類型的功能的損傷。所以，在軟骨已經(jīng)被創(chuàng)傷或疾病損傷的受試者中的位點需要恢復或促進軟骨的生長的治療。
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，刺激或激活非蛋白質(zhì)水解激活的凝血酶受體(下文中的“NPAR”)的化合物可以刺激軟骨細胞繁殖。軟骨細胞是構(gòu)成軟骨的1％體積的細胞，它們可以替代已降解的基質(zhì)分子維持準確的體積和組織的機械特性。申請人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，刺激或激活NPAR的化合物刺激軟骨細胞中的糖蛋白的合成。糖蛋白是主要的軟骨的成分。根據(jù)這些結(jié)果，申請人遞送制備成持續(xù)釋放配方的NPAR激動劑TP508到兔子的滑車神經(jīng)溝軟骨的缺陷處，并且發(fā)現(xiàn)該肽刺激缺陷的修復，包括在正常軟骨表面的形成新軟骨。該肽同時也刺激將這一新軟骨放置和整合進鄰近的，未受損的軟骨和恢復軟骨下的骨。結(jié)論是，當對需要軟骨生長和/或修復的位點給藥時，NPAR激動劑可以誘導軟骨的生長和/或修復。
刺激或激活NPAR的化合物是NPAR激動劑。NPAR是大多數(shù)細胞的表面上存在的高親和力凝血酶受體。NPAR很大程度上負責凝血酶，蛋白質(zhì)水解激活的凝血酶和凝血酶派生的肽對細胞的高親和力結(jié)合。NPAR激動劑和激抗劑可以競爭凝血酶與細胞的親和性結(jié)合(參見例如，Glenn et al.，肽研究雜志，165(1988))。NPAR似乎是介導了不依賴蛋白質(zhì)水解活性的凝血酶啟動的許多細胞信號的。一個這樣的信號的例子是消減雜交鑒定的附加物V和其他分子的上調(diào)(參見Sower，et al.，實驗細胞研究247422(1999))。所以，NPAR的特征是，在細胞表面它與凝血酶有高的親和反應(yīng)，和它受凝血酶的蛋白質(zhì)水解失活衍生物和如下所述的凝血酶派生肽激動劑的激活。根據(jù)激動劑在加入到成纖維細胞中時，在存在亞有絲分裂原濃度的凝血酶或激活蛋白質(zhì)激酶C的分子時，刺激細胞繁殖的能力可以測試NPAR的激活，如美國專利號，5,352,664和5,500,412中公開。
NPAR有待于與其他凝血酶結(jié)合蛋白質(zhì)和凝血酶的蛋白質(zhì)水解激活受體的克隆家族包括受體PAR1，PAR2，PAR3和PAR4區(qū)別開來。PAR1占有一個特定的凝血酶裂解位點，允許凝血酶裂解，暴露一個新的氨基末端區(qū)，作為在誘導它的激活的自身回折的黏連配體起作用(參見例如，Vu，et al.，細胞，641057(1991))。PAR2具有相同的激活機制，但基本上是類似胰蛋白酶的酶激活的(參見，Zhong，et al.，生物化學雜志，26716975(1992))。PAR3也具有相同的激活機制，并且似乎是作為血小板中的第二個凝血酶受體起作用的(參見，Ishihara，et al.，自然，386502(1997))。在小鼠巨核細胞中已經(jīng)檢測了PAR4，并且研究表明，它也在人血小板中起作用(參見，Kahn，et al.，自然394690(1998))。與這些PAR受體相反，NPAR的激活需要非蛋白質(zhì)水解的裂解。
幾個證據(jù)表明，NPAR是與PAR受體不同的(1)已經(jīng)分離了表達完全功能化的PAR1受體，但由于在NPAR信號轉(zhuǎn)導途徑中有缺陷而對凝血酶不應(yīng)答的細胞的群體(參見，Kim，et al.，細胞生理學雜志，160573(1994))；(2)嗜中性粒細胞高親和力結(jié)合125I凝血酶，它們的螯合受到蛋白質(zhì)水解失活的凝血酶或NPAR激動劑的刺激(參見，Ramakrishnan and Carney，分子生物學，細胞41993(1993))，但它們?nèi)匀徊槐磉_PAR1(參見Jenkins，et al.，細胞科學雜志，1083059(1995))；(3)IIC9成纖維細胞過度表達PAR1，但沒有高親和力結(jié)合凝血酶(參見，Kim，D.Ph.D.Dissertation.德克薩斯醫(yī)科大學，Galveston分院，1995；和Low，et al.，“癌癥細胞3/生長因子和轉(zhuǎn)化”，冷泉港實驗室，紐約)；和(4)NPAR激動劑對來自PAR受體激動劑肽的那些的基因表達具有明顯的效果(參見，Sower，et al.，實驗細胞研究，247422(1999)。
NPAR激動劑的一個例子是凝血酶肽衍生物，即不超過50個氨基酸的多肽，優(yōu)選地不超過30個氨基酸，并且與對應(yīng)于前凝血酶氨基酸508-530(SEQ ID NO5)的人凝血酶的片段有足夠的同源性，使該多肽激活NPAR。本文所述的凝血酶肽衍生物優(yōu)選地具有約12和23個氨基酸，更優(yōu)選地具有約19到23個氨基酸。凝血酶肽衍生物的一個例子包括結(jié)構(gòu)式(I)的成分Asp-Ala-R (I)R是絲氨酸酯酶保守區(qū)。絲氨酸酯酶，例如，胰蛋白酶，凝血酶，胰凝乳蛋白酶等等具有一個高度保守的區(qū)域?！敖z氨酸酯酶保守區(qū)”指具有一個這樣的保守區(qū)的氨基酸序列的多肽，或與一個這樣的保守區(qū)有足夠的同源性，以致凝血酶肽衍生物保留了NPAR激活能力。
在一個實施方案中，絲氨酸酯酶保守序列具有氨基酸序列SEQ ID NO1(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽的C末端截斷的片段。但是，應(yīng)該理解，在絲氨酸酯酶保守序列中的0，1，2或3個氨基酸可以與SEQ ID NO1中的對應(yīng)的氨基酸序列區(qū)別。優(yōu)選地，與對應(yīng)的SEQ ID NO1中的氨基酸不同的絲氨酸保守序列中的氨基酸是保守取代，并且更優(yōu)選地是高度保守的取代?！癈末端截斷的片段”指從C末端除去一個氨基酸或氨基酸組后剩余的片段，所述的片段至少具有6個，更優(yōu)選地至少具有9個氨基酸。
更優(yōu)選地說，絲氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val；X1是Glu或Gln，并且X2是Phe，Met，Leu，His或Val)或其C末端截斷的片段至少具有6個氨基酸，優(yōu)選地至少9個氨基酸。
在優(yōu)選地實施方案中，凝血酶肽衍生物包括絲氨酸酯酶保守序列和具有更多特異的凝血酶氨基酸序列Arg-Glu-Asp-Ala(SEQ ID NO3)的多肽。這一類型的凝血酶肽的衍生物的一個例子包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)。X1和X2如上定義。當凝血酶肽衍生物包括SEQ ID NO4，優(yōu)選地它具有SEQ ID NO5的氨基酸序列(Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或其N末端截斷的片段，假設(shè)在凝血酶肽衍生物中的位置1-9中的0，1，2或3個氨基酸是與SEQ ID NO5的對應(yīng)位置上的氨基酸不同的。優(yōu)選地，在與SEQ ID NO5中的對應(yīng)的氨基酸不同的凝血酶肽衍生物中的氨基酸是保守取代，并且更優(yōu)選地是高度保守的取代。“N末端截斷的片段”指從N末端除去一個氨基酸或氨基酸組后剩下的片段，優(yōu)選地氨基酸組不超過6個氨基酸，更優(yōu)選地是不超過3個氨基酸的組。
TP508是凝血酶肽衍生物的例子，并且具有氨基酸序列SEQID NO5。
“保守取代”是用有同樣的靜電荷和大約同樣大小和形狀的另一個氨基酸取代。當在側(cè)鏈中的總數(shù)碳和雜合原子的區(qū)別不超過約4個，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸側(cè)鏈大約是同樣的大小。當在它們的側(cè)鏈中的支鏈的數(shù)目區(qū)別不超過一個時，它們大約具有同樣的大小。在它們的側(cè)鏈中，具有酚或取代酚基團的氨基酸考慮約具有同樣大小和形狀。下面列出的是5個氨基酸的組。在多肽中用同一組的另一個氨基酸取代產(chǎn)生了一個保守取代組I甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，和具有C1-C4脂肪族或C1-C4羥基取代脂肪族側(cè)鏈(直鏈或無分支)的非天然存在的氨基酸。
組II谷氨酸，天冬氨酸和具有羧酸取代的C1-C4脂肪族側(cè)鏈(未分支或一個分支點)的非天然存在的氨基酸。
組III賴氨酸，鳥氨酸，精氨酸和具有胺或胍取代的C1-C4脂肪族側(cè)鏈(未分支或一個分支點)的非天然存在的氨基酸。
組IV谷氨酸，天冬氨酸和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族側(cè)鏈(未分支或一個分支點)的非天然存在的氨基酸。
組V苯丙氨酸，苯甘氨酸，酪氨酸和色氨酸。
“高度保守的取代”是在側(cè)鏈中具有同樣的官能團和具有相近的大小和形狀的另一個氨基酸取代。當在側(cè)鏈中的談和雜合原子的區(qū)別不超過兩個時，具有脂肪族或取代脂肪族氨基酸側(cè)鏈的氨基酸具有近似的大小。當在側(cè)鏈中它們具有相同數(shù)目的分支時，它們具有相似的形狀。高度保守的取代的例子包括纈氨酸取代亮氨酸，蘇氨酸取代絲氨酸，天冬氨酸取代谷氨酸，苯甘氨酸取代苯丙氨酸。不高度保守的取代的例子包括丙氨酸取代纈氨酸，丙氨酸取代絲氨酸和天冬氨酸取代絲氨酸。
其他NPAR激動劑包括結(jié)合和激活NPAR的小的有機分子。這一類型的激動劑可以常規(guī)地用高流通量的篩選鑒定，例如用評估分子在存在亞有絲分裂原濃度的凝血酶或激活蛋白質(zhì)激酶C的分子時，加入到成纖維細胞中時刺激細胞增殖的能力的實驗，或利用評估這些分子與125I凝血酶競爭結(jié)合具有表面NPAR受體的細胞的能力的實驗，如Glenn et al.，出處同上，美國專利號，5,352,664和5,500,412中公開的。Glenn et al.，和美國專利號5,352,664和5,500,412的全部內(nèi)容都通過在此引證合并于本文。
術(shù)語“NPAR激動劑”也包括已知能夠激活NPAR的化合物和化合物的結(jié)合。例子公開在美國專利號5,352,664和5,500,412，并且包括凝血酶和DIP-α凝血酶。
用于本發(fā)明的方法的NPAR激動劑通常是作為藥物組合物中的一個成分給藥到需要軟骨生長，修復或再生的位點的。對需要治療的位點給藥意味著，在需要治療的位點給藥含有NPAR激動劑的藥物組合物的距離足夠近以致在該位點發(fā)生軟骨的生長或軟骨的再生(例如，在存在NPAR激動劑時比沒有它時更大量的軟骨生長或更好質(zhì)量的軟骨生長)。
在一個給藥的方法中，藥物組合物是含有NPAR激動劑和適當載體的溶液。在需要治療的位點直接施加或在附近施加該溶液。溶液的給藥可以常規(guī)地完成，例如用針筒關(guān)節(jié)內(nèi)給藥，在損傷的組織的附近用針筒給藥，或通過外科打開給藥?？梢岳脴藴实乃幬锱浞郊夹g(shù)，如在Remington藥典中，Mack出版社，Easton，PA中所述的。適當?shù)乃幬镙d體例如包括生理鹽水，無細菌鹽水(含有約0.9％mg/ml芐二醇的鹽水)，磷酸緩沖的鹽水，Hank溶液，Ringer乳酸等等。
在另一個給藥的方法中，藥物組合物包括NPAR激動劑和可植入生物兼容載體。生物兼容載體應(yīng)該是非毒性的，非炎性的，非免疫原的和在植入位點避免其他不需要的反應(yīng)的。適當?shù)妮d體提供活性成分的釋放，優(yōu)選地是慢地，在植入位點持續(xù)釋放。
許多合成的生物可降解多聚體可作為具有持續(xù)釋放特征的載體。這些多聚體的例子包括聚alpha羥酯，如聚乳酸/聚乙醇酸共聚物和聚酸酐。
聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)同聚物和共聚物是本領(lǐng)域已知的，可作為持續(xù)釋放的載體。釋放的速度可以通過技術(shù)人員改變聚乳酸與聚乙醇酸的比例和多聚物的分子量來調(diào)整(參見，Anderson，et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.285(1997)，其全部內(nèi)容都通過在此引證而合并于本文)。在多聚物混合體中摻入聚(乙二醇)允許進一步減慢活性成分的釋放過程(參見，Cleek et al.，控制釋放雜志，48259(1997)，全部內(nèi)容引入作為參考)。用作軟骨生長因子的載體的適當?shù)目芍踩隤LGA多聚物公開在美國專利號6,013,853，5,607,474和5,876,452，這些文獻的全部內(nèi)容都通過在此引證而合并于本文。
結(jié)構(gòu)式(II)中所示的聚酸酐已經(jīng)定義了降解和釋放的特征，這些特征可以通過包括改變疏水或親水單體的量如葵二酸和1，3-二(p-羧基苯氧)丙烷的量來控制(參見Leong et al.，J.Biomed.Mater.Res.19941(1985)，其全部內(nèi)容都通過在此引證而合并于本文)。為了提高機械強度，經(jīng)常用酰胺共聚酸酐形成聚酸酐-共-酰胺。適用于orthopaedic應(yīng)用的聚酸酐-共-酰胺的例子有聚(苯三亞氨-甘氨酸-共-1，6-雙(羧基苯氧)己烷和焦苯三亞氨丙氨酸1，6-雙-(p-羧基苯氧基)己烷共聚物。 這些藥物組合物可以如愿針對手術(shù)來形成，或在外科手術(shù)過程中由醫(yī)生或技術(shù)人員構(gòu)成。優(yōu)選的是，形成跨越組織缺陷處的基質(zhì)，并且采用新組織的需要形式。在大的缺陷處的軟骨修復的情況中，需要的是在各個方向上跨越缺陷處。在植入后，物質(zhì)慢慢地被身體吸收，并且被植入體的形狀或非常接近植入體的形狀的軟骨替代。
在一個方面，載體是多孔基質(zhì)，其中祖先細胞可以遷移。細胞經(jīng)?？梢愿街谶@些多孔基質(zhì)，然后可以作為組織生長的支架，從而加快骨生長的速度?？梢栽谥踩胫皩@些基質(zhì)施加軟骨細胞，進一步加快愈合。膠原或膠原凝膠是適當?shù)亩嗫谆|(zhì)的例子。
在另一方面，載體是黏性溶液或凝膠，可以在關(guān)節(jié)內(nèi)或需要治療的位點注射。透明質(zhì)酸是這一類型的載體的一個例子。透明質(zhì)酸產(chǎn)品是可以購買得到的，并且包括Anika開發(fā)的PRTHOVISC，Biomatrix開發(fā)的SYNVISC，F(xiàn)idia開發(fā)的HYALGAN，和Seikagaku開發(fā)的ARTZ。多聚凝膠是這一類型的載體的另一個例子。多聚凝膠是非毒性環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的封閉共聚物。它們展示了具有熱設(shè)定特性，允許在室溫下以黏性液體存在，擔在體溫下成凝膠?？勺⑸浣M合物可以直接施加到需要治療但不需要侵入性外科的位點。聚(環(huán)氧乙烷)和環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的共聚物也適用于作為可注射的基質(zhì)(參見Caoet al.，J.Biomater.Sci.9475(1998)和Sims et al.，Plast Reconstr.Surg.98843(196)，其全部內(nèi)容都通過在此引證而合并于本文)。
“治療有效量”是在存在NPAR激動劑時比沒有時產(chǎn)生更大的軟骨生長或修復的NPAR激動劑(軟骨細胞)的量?；蛘撸爸委熡行Я俊笔菍е聹p輕疼痛和/或缺少與軟骨損傷相關(guān)的功能的NPAR激動劑(軟骨細胞)的量。通常，給藥足夠時間的激動劑(軟骨細胞)可以獲得需要的治療或效果。給藥的量將決定于軟骨生長需要的量，健康狀況，大小，體重，年齡和性別和藥物配方的釋放特征。通常，在0.1ug/day和1毫克每天之間的激動劑(優(yōu)選地是約5ug/day-100ug/day)是通過連續(xù)釋放或直接施加到需要軟骨生長或修復的位點來給藥的。
“受試者”優(yōu)選地是人，但也可以是需要治療的動物，例如陪伴動物(例如，狗，貓等等)，農(nóng)場動物(例如，牛，豬，馬等等)和實驗室動物(例如，大鼠，小鼠，滕鼠等等)。
NPAR激動劑可以用于加快生長或維持分離的軟骨細胞的功能。在一個實施方案中，NPAR激動劑可以加入到組織培養(yǎng)基中刺激增殖和提供更快速的增殖和/或防止將初級細胞分離物放置于培養(yǎng)物中時經(jīng)常遇到的細胞程序死亡或衰老。在另一個實施方案中，因為NPAR激動劑似乎是刺激基質(zhì)生產(chǎn)的，例如NPAR激動劑可以用于維持培養(yǎng)物中的軟骨的分化功能。NPAR激動劑可以單獨在標準定義的組織培養(yǎng)基中使用或作為含有血清或其他生長因子的組織培養(yǎng)基的補充，以便對軟骨細胞的體外生長或維持提供附加的或協(xié)同的效果。在培養(yǎng)基中加入足夠量的NPAR激動劑可以提供更快速的生長，維持比沒有激動劑時更大的軟骨細胞功能，這一量即“刺激量”。通常，利用的是約0.1ug/ml和100ug/mlNPAR激動劑之間的量。
也可以通過在需要治療的位點給藥治療有效量的軟骨細胞，使用在存在NPAR激動劑時培養(yǎng)的軟骨細胞治療軟骨損傷。關(guān)于軟骨細胞，“治療有效量”也指比沒有時導致更大的軟骨生長或修復。給藥軟骨細胞治療軟骨損傷在美國專利號4,846,835中有敘述，其全部內(nèi)容都通過在此引證而合并于本文。
凝血酶肽衍生物可以通過固相肽合成(例如，BOC或FMOC)方法，液相合成，或其他適當?shù)募夹g(shù)，包括結(jié)合前面的方法來合成。BPC和FMOC方法是已確定的并且廣泛使用的，它們在Mrrifield，J.Am.Chem.Soc.882149(1963)；Meienhofer，激素蛋白質(zhì)和肽，C.H.Li，Ed.，學術(shù)出版社，1983，pp.48-267；Barany andMerrifield，肽，E.Gross and J.Meienhofer，Eds.，學術(shù)出版社，紐約，1980，3-285頁中有敘述。固相肽合成的方法在Merrifield，R.B.，科學，232341(1986)；Carpino，L.A.and Han，G.Y.，J.Org.Chem.，373404(1972)；and Gauspohl，H.et al.，合成，5315(1992))中有敘述。這6個文章的全部內(nèi)容都通過在此引證而合并于本文。
本發(fā)明是通過下面的實施例進一步說明的，但不在任何方面構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例實驗細節(jié)軟骨細胞是軟骨中發(fā)現(xiàn)的刺激細胞類型。在軟骨中，這些細胞正常時是靜止的，或非增殖的，并且具有相對低的代謝速度。在軟骨損傷后，這些細胞不容易參與修復過程。由于軟骨無血管的特性，這些細胞在推測上是不能修復過程的起始物的凝血酶。下面的實施例證明，軟骨細胞具有凝血酶受體并且激活NPAR的這些化合物刺激軟骨細胞的增殖和基質(zhì)糖蛋白的合成。
實施例1與大鼠軟骨細胞結(jié)合的凝血酶分離大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的初級培養(yǎng)物，并且制備用于體外的已確定方法的分析中(參見Kuettner，K.E.，et al.，細胞生物學雜志93743-750，1982)。簡要地說，從大鼠的肩中離解出軟骨片，在組織培養(yǎng)基(DMEM)中，37℃，攪拌，用胰蛋白酶消化片塊一小時，用膠原酶消化3小時。在燒瓶中，高密度布展細胞(50,000/cm sq.)，并且在含有抗生素抗壞血酸的DMEM中，在37℃，在5％CO2的大氣中培養(yǎng)。
利用已確定的凝血酶受體結(jié)合實驗進行與125I凝血酶與軟骨細胞的特異結(jié)合，實驗方法如美國專利5,352,664中公開的，和Carney，DH和Cunningham，DD，細胞151341-1349，1978中所述。簡要地說，將高純度的人凝血酶碘化，并且加入到有或沒有未標記的凝血酶的軟骨細胞的培養(yǎng)過程中，以糾正非特異的結(jié)合。通過用不同濃度的已標記凝血酶溫育細胞和測量凝血酶與細胞結(jié)合的量和培養(yǎng)基中的游離的凝血酶的量，估計每個細胞的受體的數(shù)目和凝血酶和結(jié)合位點的親和力是可能的。
三個分離實驗中的已標記凝血酶結(jié)合的Scatchard分析表明，大鼠軟骨細胞表達了平均3000個非常高親和力的結(jié)合位點(100pM親和力)和230,000個高親和力位點(27nM)。
實施例2ANPAR激動劑對小牛軟骨細胞的增殖的刺激利用實施例1中關(guān)于大鼠軟骨細胞所述的方法，制備小牛軟骨細胞的初級培養(yǎng)物。在24孔的塑料盤中低密度亞培養(yǎng)這些培養(yǎng)物，放置于1％的血清。在本身濃度為1.0或10ug/ml時加入NPAR激動劑TP508到這些培養(yǎng)物中，不會刺激細胞的增殖。相反，在培養(yǎng)三天后，與單獨加入凝血酶相比，加入這些濃度的TP508和小量的凝血酶共有絲分裂原導致小的，但明顯的(p＜0.05)的細胞數(shù)目的增加，這個細胞數(shù)目的增加。
實施例2BNPAR激動劑刺激小牛軟骨細胞糖蛋白合成為了確定NPAR激動劑對糖蛋白合成的效果，在96孔的平板上以每孔2×105個細胞的密度播種，并且用10％的胎牛血清在DMEM中培養(yǎng)。在確定這些多層的培養(yǎng)后，用含有已表明濃度的TP508，從1到100ug/ml的含有1％的血清的DMEM每天替代培養(yǎng)基(表1)。在每天改變有或沒有TP508的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6天后，在培養(yǎng)基中加入35S硫酸鹽，繼續(xù)溫育24小時。如表1所示，用高濃度的TP508(100ug/ml)的處理比未處理的細胞增加35S硫酸鹽的摻入有10倍以上。
表1.在小牛軟骨細胞培養(yǎng)中，NPAR激動劑TP508對35S硫酸鹽摻入的影響
實施例3A 在已培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中，NPAR激動劑刺激繁殖合成如實施例1所述，利用胰蛋白酶和膠原酶消化，從關(guān)節(jié)的肩軟骨的片中分離大鼠關(guān)節(jié)的軟骨細胞。利用如Guo et al.(Conn.Tiss.Res.19277-297，1998)所述的已確定的技術(shù)確定對軟骨細胞“3維”海藻酸膠的小珠培養(yǎng)物(Conn.Tiss.Res.19277-297，1998)。在用胰蛋白酶從組織培養(yǎng)燒瓶中除去細胞后，在海藻酸膠(1.2％w/v)中懸浮細胞，用22gauge的針，在102mMCaCl2中逐滴融合慢慢表達。當液滴接觸CaCl2時，有幾乎不間斷的海藻酸的聚合產(chǎn)生凝膠小珠。然后，在DMEM培養(yǎng)基中洗滌小珠3次，轉(zhuǎn)移到35mm的盤中，在37℃，在5％的CO2大氣壓下，通過每兩天用培養(yǎng)基飼喂維持培養(yǎng)。
通過從35mm的盤中除去小珠，用0.9％的鹽水洗滌和在37℃，加入1ml的55mM的檸檬酸鈉，0.15M NaCl溶解海藻酸鹽小珠10分鐘確定3維海藻酸鹽培養(yǎng)3天后，NPAR激動劑TP508對軟骨細胞繁殖的影響。用磷酸緩沖的鹽水(PBS)1∶10稀釋1ml溶解的小珠確定細胞數(shù)，并且用Z-系列計數(shù)器計數(shù)細胞。如表2所示，TP508本身刺激3維培養(yǎng)中的軟骨細胞的繁殖。
表2.NPAR激動劑TP508在3維培養(yǎng)中對大鼠軟骨細胞的繁殖的影響
實施例3B在培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中，NPAR激動劑刺激糖蛋白的合成為了確定NPAR激動劑TP508對糖蛋白合成的影響，如上所述制備了3維海藻酸培養(yǎng)物，并且測試了[35S]-硫酸鹽的摻入。將小珠培養(yǎng)物與標明濃度的TP508以及[35S]硫酸鹽(20uCi/ml)接觸，每天改變培養(yǎng)基，在摻入[35S]硫酸鹽后的第7天收獲。在每個時間點，移取5-10個小珠，用0.9％的鹽水洗滌3次，加入0.5ml的55mM的檸檬酸鈉，0.15M NaCl在37℃，如上所述溶解10分鐘，在液體閃爍計數(shù)器中計數(shù)。在每個樣品中，對加入的小珠的數(shù)目，將[35S]硫酸鹽的摻入歸一化。如表3所示，在300nM(約0.7ug/ml)的濃度單獨的TP508處理，刺激了[35S]硫酸鹽摻入超過對照50％。也有30uM的TP508(約70ug/ml)的大刺激，但是，在這一濃度的測量中有一個大的相對標準的偏差。
表3.NPAR激動劑TP508對[35S]硫酸鹽摻入進糖蛋白的影響
實施例4TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微球體的制備利用雙乳化技術(shù)制備含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLGA)的微球體。簡要地說，在二氯甲烷和溶解于水中的TP508中溶解基質(zhì)成分。當渦旋形成油中水(W/O)乳液時，將兩者逐步混合在一起。將聚乙烯醇(水中0.3％)加入到乳液中，進一步渦旋形成第二個乳液(O/W)，從而形成雙乳液(PLGA小滴組成的O/W乳液，在這些小滴中，第二個分散相由水中的TP508組成。在相分離的基礎(chǔ)上，PLGA小滴形成分散的微球體，含有持有TP508的腔。為了引起微球體的相分離，加入2％的異丙醇溶液。通過離心收集顆粒，并且然后凍干除去殘余的水分。改變基質(zhì)的組成，形成不同釋放動力學的微球體(表4)。
表4不同微球體配方的組成
在Coulter計數(shù)器中測量了微球體的平均直徑，在二氯甲烷中溶解稱重的微球體樣品和萃取釋放的藥物進水中后，在276nm通過光譜實驗測量藥物誘捕效率(表5)。
表5配方直徑和藥物誘捕效率
為了測量從不同的PLGA基質(zhì)釋放TP508，在1.5ml的聚丙烯微型離心管中含有的1.0mlPBS中放置20mg的微球體。在37℃溫育試管，在60rpm振搖。在各個時段，離心試管，移取含有釋放的TP508的上清液，冷凍隨后分析。在微球體中加入新鮮的PBS，連續(xù)溫育。通過在276nm處的吸光值的測量，測量上清液中的TP508。對于每個配方，進行四等分的釋放測定。配方B和D在37℃溫育28天的過程中沒有顯示可檢測的藥物釋放。其余的配方都釋放了可檢測量的TP508，雖然在所有的情況中，3-4天內(nèi)釋放的藥物的量在可檢測的限制值以下(＜1ug/mg基質(zhì)/天)。配方A和C顯示了TP508的最大釋放，在3-4天釋放了陷入藥物的60-80％。配方C顯示了最快的釋放動力學，選擇用于在實施例5中所述的大鼠軟骨缺陷模型中進行測試。
實施例5在大鼠模型中，NPAR激動劑TP508刺激軟骨的生長幼小的，雄性新西蘭兔子(2-3kg)(n＝15)麻醉后，給予雙側(cè)的，醫(yī)學縱裂副側(cè)關(guān)節(jié)術(shù)。用electrocautery切出皮膚，皮下組織和關(guān)節(jié)囊，使出血最少。通過髕骨后側(cè)的離解暴露關(guān)節(jié)表面。利用外科鉆和點不銹鋼鉆在股骨的滑車溝中做一個1-2毫米深的完全厚度的缺陷處。目的是將缺陷處擴展成軟骨下的平板，但不能刺到軟骨下的骨。
將兔子分成3組。對每個兔子，用同樣的處理來填充右邊和左邊的滑車溝缺陷處。在這一研究中，將TP508配制成如實施例4中所述制備的PLGA控制釋放微球體(配方C)。將微球體與足夠的多聚F68凝膠(5％w/v)混合，結(jié)合球體，一起成糊狀的稠性，可以容易地填充進缺陷處。對照組在兩個缺陷處接受沒有TP508的PLGA微球體。處理的組接受含有10或50mgTP508/缺陷處的微球體。在4星期時殺死來自每個組的一個兔子，在6星期時殺死每個組中的2個兔子，剩下的動物在第9個星期殺死。固定樣品，進行組織學分析。
在殺死的時候，在對照缺陷中，似乎有相當多的纖維顆粒組織，而沒有類似白色的軟骨物質(zhì)。相反，在10ug的處理組和50ug的組中的缺陷處中，缺陷有近似均一的，濃密的，白色的物質(zhì)填充。在外科手術(shù)后6個星期，在處理和對照缺陷之間，顯微鏡的差異不那么明顯。
4個星期的樣品的組織學分析表明，對照缺陷處確實填充了似乎是代表包括炎性和成纖維細胞的早期顆粒組織。相反，10和50微克的處理缺陷處似乎是具有大數(shù)目的軟骨細胞和軟骨形成的早期跡象。這一效果在6星期時更明顯。對照具有小量的結(jié)締組織，但軟骨修復的跡象很少。相反，在10ug和50ug的處理缺陷處，似乎是在缺陷處的頂部與透明的軟骨的形成有很好的整合，和大范圍的軟骨下的骨修復。
9個星期的TP508的處理缺陷處中主要占有透明的基質(zhì)，通過陽性safranin-O-染色，可見明顯的軟骨量。在大多數(shù)情況中，在修復位點和天然的組織之間，軟骨的量沒有差異。組織學結(jié)果是用分級系統(tǒng)定量評估的，這一系統(tǒng)是Freed，et al.，生物醫(yī)學物質(zhì)研究雜志，28891-899(1944)采用了O’Driscoll，et al.，骨關(guān)節(jié)外科雜志1261448-1452(2000)中的方案進行的，正常的關(guān)節(jié)軟骨的最小得分是25。實驗TP508處理的缺陷得到了明顯比對照缺陷高的平均得分(表6)。
表6-關(guān)節(jié)缺陷研究的組織學得分TP508毫克數(shù) 修復結(jié)果±SE0 9.4+1.610 18.6±1.450 19.8±1.0
修復的肽處理缺陷處具有光滑的關(guān)節(jié)表面，通常在修復和天然組織之間的連接處很好地連接。對照修復組織的質(zhì)量是特征是纖維化軟骨，和關(guān)節(jié)表面質(zhì)量不好。在修復和天然組織之間的接合處的整合通常不好。全面地說，TP508修復的軟骨的質(zhì)量比對照非處理缺陷明顯增強。提高修復組織的質(zhì)量應(yīng)該導致關(guān)節(jié)的生物機械更耐久和功能的恢復，并且減少了患有創(chuàng)傷軟骨損傷的患者中骨關(guān)節(jié)炎的癥狀。
當對本發(fā)明根據(jù)優(yōu)選的實施方案進行了表示和敘述后，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不脫離附加的權(quán)利要求書包括的本發(fā)明的范圍的情況下，可以有各種形式和細節(jié)的變化。
權(quán)利要求
1.一種在需要軟骨生長或修復的受試者中的位點刺激軟骨的生長或修復的方法，所述的方法包括對該位點給藥治療有效量的非蛋白質(zhì)水解激活凝血酶受體的激動劑的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中位點是關(guān)節(jié)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中位點正在治療軟骨損傷或缺失。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中位點正在治療由于創(chuàng)傷造成的軟骨損傷或缺失。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中激動劑是包括下面的結(jié)構(gòu)式代表的多肽的凝血酶肽衍生物Asp-Ala-R；其中R是絲氨酸酯酶保守序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有約12到23個氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中絲氨酸保守序列具有SEQID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或具有至少6個氨基酸的C末端截斷的片段，假設(shè)絲氨酸保守序列中的0，1，2或3個氨基酸與SEQ ID NO1的對應(yīng)位置不同。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中絲氨酸保守序列具有SEQID NO1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或至少具有9個氨基酸的C末端截斷的片段，假設(shè)絲氨酸保守序列中的0，1或2個氨基酸是對應(yīng)于SEQ IDNO1中的氨基酸的保守取代。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中絲氨酸保守序列具有SEQID NO2的氨基酸序列(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val，其中X1是Glu，X2是Phe，Met，Leu，His或Val)，或SEQ ID NO2的C末端截斷片段，所述的片段至少具有6個氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQ ID NO3)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中凝血酶肽衍生物包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQ ID NO4)，其中X1是Glu或Gln，X2是Phe，Met，Leu，His或Val。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO5)，或其N末端截斷的片段，假設(shè)凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1，2或3個氨基酸與SEQ ID NO5的對應(yīng)位置的氨基酸不同。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中凝血酶肽衍生物具有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-(SEQ IDNO5)，或其N末端截斷的片段，假設(shè)凝血酶肽衍生物中的位置1-9的0，1或2個氨基酸是SEQ ID NO5的對應(yīng)位置的氨基酸的保守取代。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中在藥物組合物中給藥的凝血酶肽衍生物另外包括可植入的，生物兼容的載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中載體包括聚乳酸/聚乙醇酸同多聚物或共聚物。
16.一種在需要軟骨生長或修復的受試者中的位點刺激軟骨生長或修復的方法，所述的方法包括對該位點給予治療有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ IDNO5)序列的肽的步驟。
17.一種在受試者的關(guān)節(jié)中刺激軟骨生長的方法，所述的方法包括在該位點給予治療有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO5)序列的肽的步驟。
18.一種在正在治療軟骨缺失的位點刺激受試者的軟骨生長的方法，所述的方法包括在該位點給予治療有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO5)序列的肽。
19.一種在正在治療由于創(chuàng)傷導致的軟骨缺失的位點中，刺激受試者的軟骨的生長的方法，所述的方法包括對該位點給予治療有效量的具有Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO5)序列的肽的步驟。
20.一種在體外培養(yǎng)軟骨細胞的方法，其特征在于在存在刺激量的NPAR激動劑時培養(yǎng)軟骨細胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，進一步包括對需要軟骨修復或生長的受試者的位點給予治療有效量的培養(yǎng)的軟骨細胞。
全文摘要
公開的是在需要生長，修復或再生的受試者中，在一個位點刺激軟骨生長，修復或再生的方法。該方法包括在該位點給藥治療有效量的非蛋白質(zhì)水解性激活凝血酶受體的激動劑的步驟。同時公開的是在體外刺激軟骨細胞的增殖和擴展。該方法包括在存在刺激量的NPAR激動劑時培養(yǎng)軟骨細胞。
文檔編號A61P43/00GK1458974SQ01815821
公開日2003年11月26日 申請日期2001年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月20日
發(fā)明者達芮爾·H·卡尼, 羅杰·S·庫勞澤爾, 珍妮特·斯蒂爾伯格, 約翰·伯格曼 申請人:德克薩斯系統(tǒng)大學董事會