專利名稱：用作診斷和治療靶點的sgk2和sgk3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷性檢測血清和糖皮質(zhì)激素依賴性激酶2和/或3(sgk2和/或sgk3)的物質(zhì)的用途，并且涉及作用于sgk2和/或sgk3的活性成分用于治療性處理與離子通道尤其是與鈉離子和/或鉀離子通道活性紊亂有關(guān)的疾病的用途。所涉及的sgk代表受到轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。
細(xì)胞受到多種外部信號的作用，這些外部信號引起細(xì)胞內(nèi)部的磷酸化/去磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，從而使得可快速、可逆地將所涉及的信號從質(zhì)膜及其受體向細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核傳遞。對參與這些級聯(lián)反應(yīng)的個體蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)一開始是高特異性的，且細(xì)胞的柔性使得它們可快速對胞外信號反應(yīng)。血清和糖皮質(zhì)激素依賴性激酶(sgk)最初是從大鼠的乳房癌細(xì)胞中克隆得到(Webster等人，1993a，1993b)。人的血清和糖皮質(zhì)激素依賴性激酶(hsgk)以細(xì)胞容量調(diào)節(jié)基因的形式克隆自肝細(xì)胞(Waldegger等人，1997)。據(jù)發(fā)現(xiàn)(Chen等人，1999；Naray-Fejes-Toth等人，1999)大鼠激酶刺激上皮Na+通道(ENaC)。另據(jù)顯示(Warnock，1998)高血壓伴隨著ENaC的活性升高。
hsgk也在腦中表達(dá)(Waldegger等人，1997)，其中電壓依賴性K+通道Kv1.3在神經(jīng)興奮性調(diào)節(jié)中起了決定性的作用(Pongs，1992)。Kv1.3在調(diào)控細(xì)胞增殖(Cahalan和Chandy，1997)和程序性細(xì)胞死亡(Szabo等人，1996；Lang等人，1999)也起了主要作用。Kv1.3對淋巴細(xì)胞的增殖和功能的調(diào)控也很重要(Cahalan和Chandy，1997)。兩個血清和糖皮質(zhì)激素依賴性激酶家族的其他成員sgk2和sgk3最近也被克隆(Kobayashi等人，1999)。與sgk1一樣，sgk2和sgk3也是由胰島素和IGFI經(jīng)由PI3激酶途徑激活。但是到目前為止，還沒有得知這兩種新激酶的其他特征和其功能性的用途。
因此，本發(fā)明提出了使sgk2和sgk3這兩種激酶可用于診斷性和治療性目的的問題。
在運用雙電極電壓夾的實驗中，出乎意料地發(fā)現(xiàn)hsgk2或hsgk3的共表達(dá)引起上皮Na+通道(EnaC)活性的大幅提高。上皮Na+通道在腎臟排除Na+的過程中起著決定性的作用，從而影響著血壓的變化。激酶sgk3也在大腦中表達(dá)，在運用雙電極電壓夾的實驗中，同樣顯示hsgk2或hsgk3的共表達(dá)可以大幅提高K+通道Kv1.3的活性。因為K+通道的活化引起神經(jīng)興奮性降低，獲得的這些功能性數(shù)據(jù)指示出sgk3的功能有助于降低神經(jīng)元興奮性。Sgk3的表達(dá)或功能紊亂因此可能是引起癲癇發(fā)作的原因。反過來，可穿過血腦屏障的sgk3表達(dá)或活性刺激物可成功地用于癲癇發(fā)作的結(jié)論得到證明。最后，發(fā)現(xiàn)在心臟中表達(dá)的K+通道m(xù)inK被sgk1、sgk2和sgk3激活。因此這些激酶在心臟興奮性調(diào)節(jié)上起作用。
鑒于此，本發(fā)明所提出的問題可由獨立權(quán)利要求1、2、13和17的主題解決。優(yōu)選的實施方案在從屬權(quán)利要求3-12、14-16和18-23中闡述。所有權(quán)利要求的內(nèi)容均通過引用的方式構(gòu)成說明書內(nèi)容不可分割的一部分。
根據(jù)本發(fā)明，至少有一種物質(zhì)可用于檢測sgk2或sgk3在真核細(xì)胞中的表達(dá)和/或功能，具體地講，該物質(zhì)還可以診斷那些與離子通道例如鈉通道和鉀通道活性紊亂有關(guān)的疾病。這種物質(zhì)可以是如直接抗sgk2或sgk3的抗體，并可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。在此類免疫測定中，直接抗待檢測抗原(sgk2和sgk3)的特異性抗體(或者，在抗體鑒定的情況下，為同源試驗抗原)結(jié)合至載體物質(zhì)(如纖維素或聚苯乙烯)上，孵育后，與樣本在載體物質(zhì)上形成免疫復(fù)合體形式。在下一步，這些免疫復(fù)合體與一個經(jīng)過標(biāo)記的抗體結(jié)合。向此基礎(chǔ)反應(yīng)物中加入生色底物可以使連接在這些免疫復(fù)合體上的酶—底物復(fù)合體顯色，或者通過與具有已知的酶催化活性的標(biāo)準(zhǔn)品比較，由光度測量法確定與這些免疫復(fù)合體結(jié)合的標(biāo)記物酶的濃度而確定出樣本中的抗原濃度。其它可用于診斷—檢測目的的物質(zhì)是寡核苷酸，其在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的協(xié)助下，運用分子遺傳學(xué)方法，適于定量檢測sgk2和sgk3，在這種方法下，特定DNA片斷得到選擇性的擴(kuò)增。其它用于定量檢測已知目的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
根據(jù)本發(fā)明，要求對以治療與離子通道尤其是鈉通道和/或鉀通道活性紊亂有關(guān)的疾病為目的的、用于影響尤其是抑制或激活sgk2和sgk3在真核細(xì)胞中的表達(dá)和/或功能的活性成分享有專利權(quán)。因為sgk2和sgk3是激酶，故已知的激酶抑制劑如星形孢菌素(staurosporine)、白屈菜紅堿等物質(zhì)以及其它物質(zhì)代表了活性成分的候選物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這類抑制劑，且它們中的一部分可以從Sigma或Merck等公司購買到。遺傳改變的sgk2和/或sgk3突變體可例如用作活化劑。
根據(jù)本發(fā)明，所涉及的離子通道可為ENaC亞型的鈉通道，其中sgk2和/或sgk3的抑制或活化優(yōu)選影響Na+通過該通道的轉(zhuǎn)運，這可以影響例如血壓。sgk2和/或sgk3的過度表達(dá)或過度活化會引起腎臟鈉潴留，從而引起高血壓的發(fā)生。因此血壓可由相關(guān)激酶的活化或去活化得到調(diào)節(jié)。
在優(yōu)選的實施方案中，所涉及的離子通道為Kv1.3亞型的鉀通道。具體地講，其作用涉及到sgk2和/或sgk3的抑制或活化，優(yōu)選影響K+通過Kv1.3亞型鉀通道的轉(zhuǎn)運。在其它優(yōu)選的實施方案中，所涉及的離子通道為minK亞型的鉀通道，在這此情況下，抑制或激活sgk1、sgk2和/或sgk3將影響K+通過minK亞型鉀通道的轉(zhuǎn)運。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，活性成分直接對抗sgk2和/或sgk3本身。所涉及的活性成分因此可為反義序列、稱為“激酶缺陷型突變體”的物質(zhì)或激酶抑制劑，例如星形孢菌素和/或白屈菜紅堿或其類似物。也可使用那些能夠影響sgk2和/或sgk3表達(dá)的所謂“小分子化合物”或編碼肽的多聚核苷酸。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，活性成分直接對抗sgk2和/或sgk3的激活物、抑制物、調(diào)節(jié)物和/或生物學(xué)前體。這些sgk2和/或sgk3的激活物、抑制物、調(diào)節(jié)物和/或生物學(xué)前體可為sgk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)的上游和下游成員、影響sgk2和/或sgk3表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄因子、或者至今不知道的受活性成分影響并且參與sgk2和/或sgk3的表達(dá)和/或功能的分子。
本發(fā)明允許運用已知的或至今未知的活性成分。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，活性成分為所謂的“小分子化合物”，尤其是其分子量(MW)小于1000的化合物。所涉及的“小分子化合物”可為激酶抑制劑，例如分子量為377.4的咪唑衍生物SB203580或分子量為331.3的咪唑衍生物SB202190，它們都是已知的激酶表達(dá)抑制劑并且由美國的Calbiochem.SanDiego，CA上市銷售。
本發(fā)明可用于治療與鈉通道和/或鉀通道活性紊亂有關(guān)的所有疾病。尤其值得注意的是動脈高血壓以及與Liddle綜合征相應(yīng)的癥狀，其中所述Liddle綜合征是一種罕見的、遺傳性的ENaC過度活化，并且因此為伴有血壓大幅升高的疾病。
就目前所了解的，可通過本發(fā)明的方法治療的與鉀通道活性尤其是Kv1.3和/或minK亞型的鉀通道活性紊亂有關(guān)的疾病包括癲癇癥、神經(jīng)變性、自身免疫性疾病和免疫缺陷。具體地講，mink通道紊亂可以造成心律波動。
本發(fā)明也涉及以診斷與離子通道，尤其是鈉通道和/或鉀通道紊亂有關(guān)的疾病為目的的包含至少一種適合于檢測sgk2和/或sgk3的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)的診斷試劑盒。這樣的試劑盒也可以用于診斷與sgk2和/或sgk3過量表達(dá)、低表達(dá)、功能亢進(jìn)或功能不足有關(guān)的疾病。這樣的診斷法可與診斷試劑盒結(jié)合用來檢測疾病，例如動脈高血壓、Liddle綜合征、自身免疫性疾病和免疫缺陷。在后一種情況下，疾病也是通過檢測sgk2和/或sgk3的表達(dá)和/或功能紊亂而檢測的。
本發(fā)明也包括含有至少一種影響、尤其是抑制或激活sgk2和/或sgk3表達(dá)和/或功能的活性成分的藥物組合物，并且如果需要，優(yōu)選還含有藥物載體。所涉及的活性成分可為激酶抑制劑，例如前面提到的星形孢菌素、白屈菜紅堿、SB203580、SB202190及它們的類似物之一或一些其它物質(zhì)。所涉及的活性成分也可為編碼影響、優(yōu)選抑制或激活sgk2和/或sgk3表達(dá)的肽、優(yōu)選多肽的多聚核苷酸。這種多肽例如可為所謂的“激酶缺陷型突變體”。所涉及的活性成分也可為所謂的“小分子化合物”，優(yōu)選分子量小于1000的小分子。最后，所涉及的活性成分也可為反義序列，即可以與mRNA結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)從而阻止mRNA翻譯成多肽的序列。也可使用sgk2和sgk3序列本身，以通過例如摻入含有強(qiáng)啟動子的載體來引起這些激酶的過量表達(dá)。關(guān)于該組合物的其他特征，可以參見本說明書上文的相關(guān)部分。
最后，本發(fā)明包括含有至少一種有效量的活性成分的藥物組合物，其中活性成分可以影響、尤其是抑制或激活sgk2和/或sgk3的激活物、抑制物、調(diào)控物和/或生物學(xué)前體的表達(dá)和/或功能。所述藥物組合物優(yōu)選還包含藥物載體。sgk2和/或sgk3的這些激活物、抑制物、調(diào)控物和/或生物學(xué)前體可以是諸如其它參與調(diào)控或激活sgk2和/或sgk3的激酶。轉(zhuǎn)錄因子影響著sgk2和/或sgk3以及sgk2和/或sgk3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中其它已知或仍然未知的成員的表達(dá)水平。該組合物也可含有編碼影響、尤其是抑制或激活sgk2和/或sgk3的激活物、抑制物、調(diào)控物和/或其生物學(xué)前體表達(dá)的肽的多核苷酸。也可使用所謂的“小分子化合物”，其分子量(MW)優(yōu)選小于1000并且可直接作用于sgk2和/或sgk3的激活物、抑制物、調(diào)控物和/或其生物學(xué)前體，從而抑制或激活那些激酶的表達(dá)或功能。
可以從以下對優(yōu)選實施方案的描述并結(jié)合權(quán)利要求及附圖看出本發(fā)明現(xiàn)存的特點和其它特點，其中的各單個特點可以獨立或相互組合而實現(xiàn)。
材料和方法爪蟾的解剖和以及卵母細(xì)胞的獲得和處理在以前已經(jīng)詳細(xì)描述過(Busch等人，1992)。對各卵母細(xì)胞注射1ng來自α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC、Kv1.3或minK的cRNA，同時向其中注射或不注射激酶hsgk1、hsgk2和hsgk3。在注射后2至4天內(nèi)進(jìn)行雙電極電壓夾和電流夾實驗。在10赫茲濾出Na+電流(在EnaC的情況下)和K+電流(在Kv1.3和minK的情況下)并用記錄儀記錄。實驗通常在注射cRNA后的第二天進(jìn)行。槽液含有96mM NaCl、2mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2和5mM HEPES，pH為7.5，持續(xù)電位-80毫伏。在所有實驗中，槽液的pH值用HCl或NaOH滴定確定。槽液流速設(shè)定為20毫升/秒鐘，可在10至15分鐘內(nèi)完全更換溶劑。所有數(shù)據(jù)以算術(shù)平均值±SEM的形式給出。結(jié)果為了研究hsgk1、hsgk2或hsgk3的作用，將各個激酶的mRNA分別與上皮Na+通道、α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC或電壓依賴性K+通道Kv1.3或minK通道的mRNA一起注入非洲爪蟾的卵母細(xì)胞并隨后測定阿米洛利敏感性Na+電流INa和電壓激活的K+電流IK。從下表1以及

圖1和圖2中可以看出，hsgk2和hsgk3都可刺激ENaC和Kv1.3的活性。hsgk1可刺激minK的活性(表1)。它們的刺激作用完全被蛋白激酶抑制劑星形孢菌素和白屈菜紅堿阻止。
表1
表1在卵母細(xì)胞中注入(去離子)水、注入α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC、注入Kv1.3或minK，含或不含hsgk1、hsgk2或hsgk3的Na+電流(INa)[μA]和K+電流(Ik)[μA]實驗1可以從圖1中看出，在注入來自hsgk2和hsgk3的mRNA后，由于hsgk2和hsgk3的共表達(dá)，通過Na+通道γ-ENaC的阿米洛利抑制性電流Iamil顯著增大。激酶抑制劑星形孢菌素和白屈菜紅堿可抑制Na+通道的激活(參見圖1)。由于hsgk2和hsgk3對ENaC通道的刺激作用可以被激酶抑制劑星形孢菌素和白屈菜紅堿阻止，因此，(a)診斷性檢測sgk2或sgk3的表達(dá)或功能的紊亂代表了發(fā)現(xiàn)諸如高血壓發(fā)生原因的主要測量方法，并且(b)Sgk2和sgk3的抑制劑例如星形孢菌素、白屈菜紅堿或其它的激酶抑制劑可用于上述疾病的治療。實驗2在聯(lián)合注射來自于hsgk1、hsgk2或hsgk3的mRNA與來自K+通道Kv1.3或minK的mRNA后，可以顯示通過這些通道的電流I可以升高(參見表1)。圖2代表在hsgk2和hsgk3的mRNA與來自于Kv1.3的mRNA同時注射后，第一天(d1，最左邊的條)和第五天(d5，最右邊的條)的實驗結(jié)果。由于鉀通道的活化會引起神經(jīng)興奮性的降低，因此，這些功能性的數(shù)據(jù)表明，對腦中表達(dá)的hsgk3的影響可用于降低神經(jīng)元的興奮性。sgk3的表達(dá)或功能的紊亂因此可能引起癲癇發(fā)作。反過來，可穿過血腦屏障的sgk3的表達(dá)或功能的刺激物可用于癲癇發(fā)作?；谕瑯拥目紤]，可以通過刺激或抑制激酶、尤其是hsgk1來影響心臟興奮性的紊亂。實驗3根據(jù)圖3，從人胚腎細(xì)胞(HEK-細(xì)胞)中除去胎牛血清(FCS)(Lewis等人(1984)；Phillips等人(1982))會由于細(xì)胞死亡而引起細(xì)胞總數(shù)的減少，這可以從黑色條和點狀條的比較看出，圖3描繪了24小時和48小時后的情況。這種減少可以通過加入胰島素樣生長因子(IGF1)而減弱，如圖中的白色條所示。同時用瑪格毒素(MT)抑制K+通道可以消除胰島素樣生長因子1的作用，在圖中用帶陰影線的條表示。這些數(shù)據(jù)表明，胰島素樣生長因子IGF1在K+通道受到抑制時會失去其抑制細(xì)胞死亡的作用。因此由sgk2和sgk3介導(dǎo)的Kv1.3通道的激活有抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)，并且缺乏sgk2和sgk3的作用會引起細(xì)胞死亡率的增加，就像在神經(jīng)變性時所發(fā)生的一樣。反過來，sgk2和sgk3的激活物可能用于阻止神經(jīng)變性時的程序性細(xì)胞死亡。由于Kv1.3在淋巴細(xì)胞增殖和功能的調(diào)控中也起重要作用，這些激酶的抑制劑或激活物可在患有例如自身免疫性疾病或免疫缺陷的個體中用于影響免疫系統(tǒng)。
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權(quán)利要求
1.一種用以檢測sgk2和/或sgk3在真核細(xì)胞中表達(dá)和/或功能的物質(zhì)用于診斷與離子通道活性、尤其是鈉通道和/或鉀通道活性紊亂有關(guān)之疾病的用途。
2.一種用于在真核細(xì)胞中影響、尤其是抑制或激活sgk2和/或sgk3的表達(dá)和/或功能的活性成分用于治療與離子通道活性、尤其是鈉通道和/或鉀通道活性紊亂有關(guān)之疾病的用途。
3.據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中，對sgk2和/或sgk3的影響、尤其是抑制或激活，可以影響和/或控制Na+和/或K+的清除。
4.根據(jù)以上權(quán)利要求中任意一項所述的用途，其中的離子通道是ENaC亞型的鈉通道。
5.根據(jù)以上權(quán)利要求中任意一項所述的用途，其中的離子通道是Kv1.3亞型的鉀通道。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任意一項所述的用途，其中的活性成分直接針對sgk2和/或sgk3。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任意一項所述的用途，其中的活性成分直接針對sgk2和/或sgk3的激活物、抑制物、調(diào)節(jié)物和/或生物學(xué)前體。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任意一項所述的用途，其中的活性成分是激酶抑制劑，優(yōu)選星形孢菌素和/或白屈菜紅堿或它們類似物。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-8中任意一項所述的用途，其中的活性成分是編碼肽、優(yōu)選多肽的多核苷酸，其中所述的肽可以影響、優(yōu)選抑制或激活sgk2和/或sgk3的表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-9中任意一項所述的用途，其中的活性成分是一種“小分子化合物”，優(yōu)選分子量MW小于1000的“小分子化合物”。
11.根據(jù)以上權(quán)利要求中任意一項所述的用途，其中所述的疾病、尤其是與鈉通道活性紊亂有關(guān)的疾病是動脈高血壓或與Liddle綜合征有關(guān)的癥狀。
12.根據(jù)以上權(quán)利要求中任意一項所述的用途，其中所述的疾病、尤其是與鉀通道活性紊亂有關(guān)的疾病是癲癇癥、神經(jīng)變性、自身免疫性疾病或免疫缺陷。
13.用于診斷與離子通道活性、尤其是鈉通道和/或鉀通道活性紊亂有關(guān)的疾病的、包含至少一種用于檢測sgk2和/或sgk3的表達(dá)和/或功能的物質(zhì)的診斷試劑盒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的診斷試劑盒，其用于診斷與sgk2和/或sgk3過量表達(dá)和/或低表達(dá)有關(guān)的疾病。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的診斷試劑盒，其用于診斷動脈高血壓或與Liddle綜合征有關(guān)的癥狀。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的診斷試劑盒，其用于診斷癲癇癥、神經(jīng)變性、自身免疫性疾病或免疫缺陷。
17.包含有效量的至少一種活性成分的藥物組合物，其中所述的活性成分可以影響、尤其是抑制或激活sgk2和/或sgk3的表達(dá)和/或功能，且根據(jù)需要，該藥物組合物還可包含藥物載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其中的活性成分是激酶抑制劑，優(yōu)選星形孢菌素和/或白屈菜紅堿或它們的類似物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其中的活性成分是編碼肽、優(yōu)選多肽的多核苷酸，其中所述的肽可以影響、優(yōu)選抑制或激活sgk2和/或sgk3的表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其中的活性成分是一種“小分子化合物”，優(yōu)選分子量MW小于1000的“小分子化合物”。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其包含有效量的至少一種活性成分，其中的活性成分影響、尤其是抑制或激活sgk2和/或sgk3的激活物、抑制物、調(diào)控物和/或生物學(xué)前體的表達(dá)和/或功能，且根據(jù)需要，該藥物組合物還可包含藥物載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物組合物，其中的活性成分是編碼肽、優(yōu)選多肽的多核苷酸，其中所述的肽可以影響、優(yōu)選抑制或激活sgk2和/或sgk3的激活物、抑制物、調(diào)控物和/或生物學(xué)前體的表達(dá)。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物組合物，其中的活性成分是一種“小分子化合物”，優(yōu)選分子量MW小于1000的“小分子化合物”。
全文摘要
本發(fā)明涉及可檢測sgk2和/或sgk3的物質(zhì)用于診斷與離子通道活性、尤其是鈉通道和/或鉀通道活性有關(guān)之疾病的用途。本發(fā)明還涉及活性成分用于治療上述疾病的用途，所述活性成分可以影響sgk2和/或sgk3的表達(dá)和/或功能，從而調(diào)節(jié)Na
文檔編號A61K31/4741GK1466456SQ01816335
公開日2004年1月7日 申請日期2001年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月28日
發(fā)明者P·科恩, B·弗里德里希, 弗洛里安·朗, P 科恩, 安 朗, 锏呂鏘 申請人:弗洛里安·朗, 弗洛里安 朗