專利名稱：治療肝病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療肝病的新型藥物，以及一種預(yù)防和/或治療肝病的新方法。
單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白質(zhì)-1(MCP-1)(CC趨化因子中的一種)，本身作為一種蛋白質(zhì)被首次報(bào)導(dǎo)，具體上與此同時(shí)，它的cDNA序列也被確定了(實(shí)驗(yàn)方法雜志(J.Exp.Med.)，169，1449-1459，1989；實(shí)驗(yàn)方法雜志(J.Exp.Med.)，169，1485-1490，1989；FEBSlett.，244，487-493，1989)。
識(shí)別MCP-1的受體已經(jīng)被鑒別出來，它們的cDNA也被克隆出來(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91，2752-2756，1994；生物化學(xué)·生物生理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，202，1156-1162，1994)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)九種CC趨化因子的受體，并且把MCP-1的受體稱作“CCR2”。
據(jù)Rollins等人報(bào)導(dǎo)，他們制備了多種MCP-1蛋白的氨基酸突變體，并且發(fā)現(xiàn)一些氨基酸突變體已經(jīng)失去了細(xì)胞遷移活性(生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，269，15918-15924，1994)。在這些突變體中，7ND-MCP-1是通過刪除從N端數(shù)第2至第8位氨基酸獲得的突變體，它具有連接CCR2的能力，但是卻不能引起細(xì)胞遷移。從另一方面來說，做為顯性失活劑，7ND-MCP-1與野生型的MCP-1形成二聚體從而抑制MCP-1的功能。此外，目前已知通過與趨化因子的相應(yīng)內(nèi)源單體形成雜二聚體，N端缺失的趨化因子是趨化因子-受體相互作用的有效顯性失活抑制劑，而且這些抑制劑對(duì)于治療炎癥是有效的，如后血管成形術(shù)再狹窄，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腸炎，多重硬化癥，和如肺纖維化等慢性肺炎，自身免疫疾病以及諸如此類的病癥(JP-A-11506005)。
肝纖維化是一種病態(tài)，它使正常的組織結(jié)構(gòu)的破壞，纖維原細(xì)胞的增殖和胞外基質(zhì)的積累加劇，而且纖維化后期的病癥是硬化。目前，對(duì)于這些疾病還沒有既有效又安全的治療方法。例如，各種不同癥狀的治療被應(yīng)用于硬化，但硬化卻發(fā)展為不可彌補(bǔ)性硬化，結(jié)果導(dǎo)致很差的預(yù)后改善。
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防和/或治療肝病如肝纖維化或肝硬化的新型藥物，以及一種預(yù)防和/或治療這種肝病的新方法。
具體地講，本發(fā)明提供了一種預(yù)防和/或治療肝病的藥物，其含有作為活性成分的MCP-1功能抑制劑。
本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療肝病的方法，其包括將編碼MCP-1拮抗物或者M(jìn)CP-1顯性失活劑施加給生物體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種預(yù)防和/或治療肝病的組合物，其含有MCP-1功能抑制劑和一種藥物可接受的載體。
本發(fā)明更進(jìn)一步提供了MCP-1功能抑制劑在制備預(yù)防和/或治療肝病的藥物中的用途。
例如，抗-MCP-1-抗體可以通過免疫學(xué)雜志(J.Immunology)，147，2229-2233，1991中公開的方法來獲得，而MCP-1拮抗物和MCP-1顯性失活劑已經(jīng)在JP-A-11506005等文獻(xiàn)中公開。
本發(fā)明中，引入編碼MCP-1功能抑制劑的基因與將MCP-1功能抑制劑作為蛋白質(zhì)施用于生物體相比，優(yōu)選前者，因?yàn)榍罢呖梢允够蛟谏矬w(血液)內(nèi)保留的時(shí)間更長(zhǎng)。
在本發(fā)明中，優(yōu)選MCP-1拮抗物或者M(jìn)CP-1顯性失活劑，更優(yōu)選7ND-MCP-1。進(jìn)而，優(yōu)選編碼MCP-1拮抗物或MCP-1顯性失活劑的基因，其中更優(yōu)選編碼7ND-MCP-1的基因。作為編碼7ND-MCP-1的基因，可以使用具有由序列表中SEQ ID NO1所示堿基序列的DNA。這種DNA可通過本領(lǐng)域已知的基因工程方法制備。具體地說，按照編碼野生型MCP-1的并且由序列表中SEQ ID NO2所示的DNA的堿基序列，所述DNA可以通過采用了合成引物的PCR制備。
只要能起作用，對(duì)用于在生物體內(nèi)表達(dá)基因的表達(dá)載體沒有特別的限制。具有說明性質(zhì)的是質(zhì)粒載體，如pcDNA3，pEF-BOS和pXT1；和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，如腺病毒載體和仙臺(tái)病毒載體。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，也有可能用到啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。只要在宿主(生物體)中能起作用，對(duì)于啟動(dòng)子或增強(qiáng)子沒有特別的限制。啟動(dòng)子的例子包括SV40啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子，HSV-TK，SRα和RSV。
為了使基因在宿主(生物體)中表達(dá)，還需要使用脂質(zhì)體。在這種情況下，基因存在于脂質(zhì)體內(nèi)，或者存在于構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層膜的內(nèi)部或外部。已知多種脂質(zhì)體組合物允許基因在宿主(生物體)中表達(dá)。
為了證實(shí)由所引入的7ND-MCP-1基因制備的7ND-MCP-1蛋白質(zhì)，只需要通過ELISA來確定該蛋白質(zhì)是否存在于血清中。
MCP-1功能抑制劑是一種本發(fā)明所述預(yù)防和/或治療肝病的藥物的活性成分，它可以通過口服或非腸道的方式給包括人在內(nèi)的動(dòng)物的機(jī)體用藥。如果功能抑制劑是一種蛋白質(zhì)，則需要非腸道用藥。對(duì)于非腸道用藥方式，可以采用注射?？梢灾苯釉诓∽儾课?肝部)注射，也可以在除肝以外的其它部位注射，如動(dòng)脈、靜脈、肌肉、皮膚或皮下組織。作為注射MCP-1功能抑制劑的藥物制劑(制劑形式)，可以采用注射劑。這種注射劑可以通過已知的藥物制劑生產(chǎn)技術(shù)得到。制備注射劑時(shí)可向藥物制劑中加入一種或多種添加劑。例如，等滲劑，緩沖劑，防腐劑，賦形劑和安撫劑。
每個(gè)病人使用的劑量可以根據(jù)他或她的病情，年齡，性別，體重等情況適度調(diào)整。例如2至4周內(nèi)施用一次0.1至1000毫克(蛋白質(zhì))或0.01至100毫克(基因)。
(1)7ND-MCP-1的構(gòu)建與表達(dá)以編碼MCP-1的pcDNA3載體質(zhì)粒為模板，通過PCR方法制備編碼7ND-MCP-1的質(zhì)粒載體。每個(gè)突變體都通過雙向DNA序列分析來確定。得到的編碼7ND-MCP-1的PCR產(chǎn)物被插入到pcDNA3載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后，利用“Plasmid Giga Kit(QIAGEN GmbH)”將質(zhì)粒DNA純化。
(2)7ND-MCP-1對(duì)于大鼠的由二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維癥的作用通過在雄性Wistar大鼠的腹內(nèi)注入1％的二甲基亞硝胺(100μL/100g大鼠重)，每周連續(xù)三天共四周，制備肝纖維癥的大鼠模型。在施用MCP-1突變基因(7ND-MCP-1基因)的前三天，在大鼠的右大腿部位肌內(nèi)注射0.25％的麻卡因氫氯化物(100μL/100g大鼠重)，經(jīng)過上述預(yù)處理是為了增加基因引入的效率。
在開始施用二甲基亞硝胺的當(dāng)天，將突變MCP-1基因(7ND-MCP-1基因)肌內(nèi)注射(100μg DNA[1μg/1μL]/100g大鼠重)到預(yù)處理部位。對(duì)照組中，載體DNA以同樣數(shù)量施用。在施用二甲基亞硝胺的第12天，對(duì)大鼠的左大腿肌肉再次施用上述同樣數(shù)量的突變MCP-1基因(7ND-MCP-1基因)。此外，在再次給藥的前三天(施用二甲基亞硝胺的第12天)，與上述方法一樣用麻卡因氫氯化物進(jìn)行預(yù)處理。對(duì)照組中，載體DNA也進(jìn)行類似的施用。
28天后，取出肝臟，測(cè)量它的重量，組織纖維化程度以及組織的羥脯氨酸濃度。按照Masson的毛狀體染色法對(duì)纖維化部位染色以確定纖維化程度。用HPLC測(cè)定組織的羥脯氨酸濃度。
結(jié)果，在施用了MCP-1突變基因(7ND-MCP-1基因)組中，肝重為10.42±4.01g(根據(jù)Mann-Whitney的顯著性試驗(yàn)p＜0.05)，而對(duì)照組中的肝重量為4.95±2.00g，以及纖維化程度為±，而對(duì)照組的纖維化程度為+++。從而觀察到對(duì)肝纖維化的明顯抑制效果。
在施用了MCP-1突變基因(7ND-MCP-1基因)組中，組織的羥脯氨酸濃度為28.2±9.12μmol/g大鼠肝重(根據(jù)Mann-Whitney的顯著性試驗(yàn)p＜0.05)，而對(duì)照組重為186.75±130.78μmol/g大鼠肝重。因此又可觀察到，通過施用MCP-1突變基因(7-ND-MCP-1)對(duì)肝組織中的羥脯氨酸濃度有顯著的降低作用。
工業(yè)實(shí)用性從實(shí)施例可以明顯的看出，MCP-1功能抑制劑對(duì)于預(yù)防和/或治療肝病如肝纖維化和肝硬化是有效的。
序列表序列表<110>EGASHIRA KENSUKE；DAIICHI PHARMACEUTICAL CO.，LTD<120>新的肝病治療劑<130>P04841210<150>JP 2000-310604<151>2000-10-11<160>2<210>1<211>279<212>DNA<213>人<400>1atgaaagtct ctgccgccct tctgtgcctg ctgctcatag cagccacctt cattccccaa 60gggctcgctc aggtcacctg ctgttataac ttcaccaata ggaagatctc agtgcagagg 90ctcgcgagct atagaagaat caccagcagc aagtgtccca aagaagctgt gatcttcaag 120accattgtgg ccaaggagat ctgtgctgac cccaagcaga agtgggttca ggattccatg 180gaccacctgg acaagcaaac ccaaactccg aagacttga 279<210>2<211>300<212>DNA<213>人<300><301>Yoshimura，T.，Yuhki，N.，Moore，S.K.，Appella，E.，Lerman，M.I.，Leonard，E.J.<302>人單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白質(zhì)-1(MCP-1)全長(zhǎng)DNA克隆，在受到連指手套刺激的血液?jiǎn)魏税准?xì)胞中表達(dá)，和與小鼠感受態(tài)基因JE的序列相似性。<303>FEBS Letters<304>244<305>2<306>487-493<307>1989-02<400>2atgaaagtct ctgccgccct tctgtgcctg ctgctcatag cagccacctt cattccccaa 60gggctcgctc agccagatgc aatcaatgcc ccagtcacct gctgttataa cttcaccaat 120aggaagatct cagtgcagag gctcgcgagc tatagaagaa tcaccagcag caagtgtccc 180aaagaagctg tgatcttcaa gaccattgtg gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag 240aagtgggttc aggattccat ggaccacctg gacaagcaaa cccaaactcc gaagacttga 300
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和/或治療肝病的藥物，含有作為活性成分的單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白質(zhì)-1(MCP-1)功能抑制劑。
2.一種如權(quán)利要求1所述的預(yù)防和/或治療肝病的藥物，其中所述MCP-1功能抑制劑含有一種或多種選自抗MCP-1抗體，MCP-1拮抗物，MCP-1顯性失活劑及其編碼基因的抑制劑。
3.一種如權(quán)利要求2所述的預(yù)防和/或治療肝病的藥物，其中編碼所述MCP-1顯性失活劑的基因由序列表中SEQ ID NO1來表示。
4.一種預(yù)防和/或治療肝病的方法，其包括對(duì)生物體施用編碼MCP-1顯性失活劑的基因。
5.一種如權(quán)利要求4所述的預(yù)防和/或治療肝病的方法，其中所述基因由序列表中SEQ ID NO1來表示。
6.一種如權(quán)利要求5所述的預(yù)防和/或治療肝病的方法，其中所述基因被施用于所述生物體的除肝以外的其它部位。
7.一種如權(quán)利要求6所述的預(yù)防和/或治療肝病的方法，其中所述除肝以外的其它部位是肌肉。
8.一種預(yù)防和/或治療肝病的組合物，含有一種MCP-1功能抑制劑和一種藥學(xué)可接受的載體。
9.MCP-1功能抑制劑在制備預(yù)防和/或治療肝病藥物中的用途。
全文摘要
預(yù)防和/或治療肝病的藥物，其含有作為活性成分的單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白質(zhì)－1(MCP－1)功能抑制劑。施用MCP－1功能抑制劑帶來了預(yù)防和/或治療肝病的效果。
文檔編號(hào)A61K38/19GK1469756SQ01817244
公開日2004年1月21日 申請(qǐng)日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月11日
發(fā)明者江頭健輔, 孔, 竹下彰, 小柳雅孔, 誠(chéng), 一, 中牟田誠(chéng), 西田健一 申請(qǐng)人:江頭健輔, 第一制藥株式會(huì)社