專利名稱：使用b細(xì)胞耗盡/免疫調(diào)節(jié)抗體組合治療自身免疫病的聯(lián)合療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種新的用于治療自身免疫病的聯(lián)合療法。具體地說，本發(fā)明涉及聯(lián)合使用免疫調(diào)節(jié)抗體(優(yōu)選調(diào)節(jié)T和/或B細(xì)胞分化、增殖和/或功能的抗體)和B細(xì)胞耗盡抗體(B cell depleting antibody)進(jìn)行自身免疫病治療。這些抗體可以單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
背景技術(shù)：
近來，已廣泛接受使用抗體治療疾病，包括癌癥，特別是非霍奇金淋巴瘤、白血病、病毒介導(dǎo)的疾病和自身免疫病。特別是已報道用具有細(xì)胞耗盡活性的抗-CD20或抗-CD22抗體治療癌癥，例如非霍奇金淋巴瘤和相關(guān)的B細(xì)胞淋巴瘤。還特別報道了使用對CD19和CD37特異性的B細(xì)胞耗盡抗體。
此外，已報道了使用多種免疫調(diào)節(jié)抗體，即通過調(diào)節(jié)(即增強(qiáng)或抑制)特定的免疫途徑而產(chǎn)生治療裨益的抗體。例如，這種抗體調(diào)節(jié)T或B細(xì)胞或其它參與免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞的分化、增殖、活化和/或功能。這種免疫調(diào)節(jié)抗體結(jié)合免疫細(xì)胞上的配體或受體，通常是參與調(diào)節(jié)體液或細(xì)胞免疫的B或T細(xì)胞抗原。這種配體的實例是免疫信號分子如B7.1、B7.2；T細(xì)胞調(diào)節(jié)分子如CD40-L、CD40和CD4。對這些抗原中一部分的功能和先前將其特異性抗體用于治療的討論如以下簡述。
CD40L是在活化的輔助細(xì)胞表面上表達(dá)的一種受體，并且是CD40的反受體，CD40是在B淋巴細(xì)胞以及其它抗原呈遞細(xì)胞表面上表達(dá)的一種配體。在活化的T細(xì)胞上的CD40L與在B和其它抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的CD40之間的接觸依賴性相互作用，稱為“T細(xì)胞輔助功能”，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞的活化和分化，并且有助于體液免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。該調(diào)節(jié)包括對抗體分子的特異性、分泌和同種型編碼的功能的調(diào)節(jié)。T細(xì)胞輔助B細(xì)胞進(jìn)行分化的過程已被分成兩個不同的階段誘導(dǎo)期和效應(yīng)期(Vitetta等，Adv.Immunol.451(1989)；Noelle等，Immunol.Today 11361(1990))。
現(xiàn)在已清楚地了解了通過CD40與其配體gp39(也稱為CD40L和CD154)的相互作用T細(xì)胞在體液免疫中輔助的分子基礎(chǔ)?；旧希阎罨腡輔助細(xì)胞表達(dá)淋巴因子基因和CD40L，這是一種膜蛋白，它對交互活化關(guān)連的抗原呈遞B細(xì)胞是必需的，CD40L與在B細(xì)胞上的其受體CD40的相互作用驅(qū)使進(jìn)入B細(xì)胞并誘導(dǎo)B細(xì)胞對淋巴因子的生長和分化效應(yīng)的反應(yīng)性。
此外，已知CD40L在T細(xì)胞免疫過程中起著更大的更為普遍的作用，即除了其在T細(xì)胞輔助和體液免疫的調(diào)節(jié)中的作用之外。CD40L的這一作用還不十分清楚。例如，理論上T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病包括例如多發(fā)性硬化、1型糖尿病、炎性腸病、卵巢炎和甲狀腺炎的病理學(xué)包括存在特定的表達(dá)CD40配體的T抑制細(xì)胞群，它在疾病病理學(xué)中起作用，可能是通過使T效應(yīng)細(xì)胞的作用無效。還報道了CD40和CD40L在外周和中樞對耐受的作用及其對自身免疫病所起的作用(Durie等，Res.Immunol.Vol 145(3)200-205(1994))。
已報道了使用CD40L的拮抗劑治療B細(xì)胞介導(dǎo)的和T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病。例如，EP 555,880、美國專利5,474,771和WO93/09212公開了使用CD40L拮抗劑治療體液自身免疫病。使用CD40L拮抗劑治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病公開在美國專利5833987及其相應(yīng)的PCT申請PCT/US96/09B7中。
正如所討論的，使用特異性結(jié)合B淋巴細(xì)胞上的靶抗原和耗盡B細(xì)胞的分子作為治療劑也已有報道?？赡茏畋唤邮艿挠糜谥委煹腂細(xì)胞靶是CD20抗原，鑒于FDA批準(zhǔn)了Rituxan，這是一種針對CD20抗原的嵌合單克隆抗體，用于治療非霍奇金淋巴瘤。
CD20抗原(也稱為人B淋巴細(xì)胞限制性分化抗原，-p-33)是一種疏水性跨膜蛋白，其分子量約35kD，位于前B細(xì)胞和成熟的B淋巴細(xì)胞上(Valentine等，J.Biol.Chem.264(19)11282-11287(1989)；和Einfeld等，EMBO J.7(3)711-717(1988))。該抗原還在大于90％的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤上表達(dá)(HL Anderson等，Blood 63(6)1424-1433(1984))，但未發(fā)現(xiàn)存在于造血干細(xì)胞、原B細(xì)胞、正常漿細(xì)胞或其它正常組織上(Tedder等，J.Immunol.135(2)973-979(1985))。CD20調(diào)節(jié)對細(xì)胞周期啟動和分化的活化過程中的早期步驟(Tedder等，上文)并可能作為鈣離子通道發(fā)揮作用(Tedder等，J.Cell.Biochem.14D195(1990))。
鑒于CD20在B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，該抗原可作為“瞄準(zhǔn)”這種淋巴瘤的候選物?；旧希@種瞄準(zhǔn)可概括如下將特異性針對B細(xì)胞CD20表面抗原的抗體施用于患者；這些抗CD20抗體特異性結(jié)合(表面上)正常和惡性B細(xì)胞的CD20抗原；結(jié)合CD20表面抗原的抗體導(dǎo)致對腫瘤B細(xì)胞的破壞和耗盡。此外，可以將具有破壞腫瘤潛能的化學(xué)藥劑或放射性標(biāo)記綴合至抗CD20抗體，使得所述藥劑被特異性“送遞”至腫瘤B細(xì)胞。不考慮方法，首要的目標(biāo)是破壞腫瘤；具體的方法可由所采用的特定抗CD20抗體來確定，因而可利用的瞄準(zhǔn)CD20抗原的方法可以有相當(dāng)大的差異。
CD19是另一種在B系細(xì)胞的表面上表達(dá)的抗原。類似于CD20，CD19被發(fā)現(xiàn)存在于該系整個分化過程中的細(xì)胞上，從干細(xì)胞階段直至就在最終分化成為漿細(xì)胞之前的那一點(Nadler，L.LymphocyteTyping II23-37 and Appendix，Renling等，eds.(1986)by SpringerVerlag)。與CD20不同，抗體與CD19結(jié)合引起CD19抗原的內(nèi)化。CD19抗原特別由HD237-CD19抗體(也稱為“B4”抗體)識別(Kiesel等，Leukemia Research II，121119(1987))。CD19抗原存在于4-8％的外周血單核的細(xì)胞上和大于90％的從外周血、脾、淋巴結(jié)或扁桃體分離的B細(xì)胞上。在外周血T細(xì)胞、單核細(xì)胞或粒細(xì)胞上沒有檢測到CD19。幾乎所有的非T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和B細(xì)胞淋巴瘤均表達(dá)可用抗體B4檢測的CD19(Nadler等，J.Immunol.131244(1983)；和Nadler等，Progress in Hematology Vol.XII pp.187-206.Brown，E.ed.(1981)byGrune & Stratton，Inc.)。
CD22是另一種在B系細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原。該抗原也稱為“BL-CAM”和“LyB8”。該抗原是一種膜免疫球蛋白相關(guān)蛋白，分子量為約140,000，當(dāng)膜Ig連接到其上時發(fā)生酪氨酸磷酸化(Engel等，J.R & Pmed 181(4)1521-1526(1995)；Campbell and Eur.J.Immunol.251573)。據(jù)報道該抗原是B細(xì)胞受體信號作用的負(fù)調(diào)節(jié)物(Nitschke等，Curr.Biol.7133(1997))；并促進(jìn)單核細(xì)胞紅細(xì)胞athism(Stemenkoul等，Nature 34574(1990))。一種特異性針對CD22的裸露抗體，稱為LymphocideTM，現(xiàn)正處于臨床試驗之中，用于治療惰性非霍奇金淋巴瘤，它是Immunomedics，Inc的產(chǎn)品。另外使用釔90標(biāo)記形式的該相同抗體治療惰性和侵襲性非霍奇金淋巴瘤也處于臨床試驗之中。
CD23是另一種在B細(xì)胞上表達(dá)的抗原，并且是IgE的低親和性受體，也稱為FcERII。使用結(jié)合CD23的抗體治療炎性、自身免疫性和過敏性疾病已在專利和非專利文獻(xiàn)中提出。
B7.1和B7.2是B細(xì)胞抗原的其它實例，其特異性結(jié)合并作為免疫調(diào)節(jié)劑的配體已被報道具有治療用途。尤其是已報道抗B7抗體，特別是與在B細(xì)胞表面表達(dá)的B7.1(CD80)、B7.2(CD86)或B7.3跨膜糖蛋白結(jié)合的抗體具有作為免疫抑制劑和治療多種疾病的應(yīng)用潛能。例如，于1999年2月9日授予DeBoer等并轉(zhuǎn)讓給ChironCorporation的美國專利5,869,040公開了抗B7.1抗體與另一種免疫抑制劑聯(lián)合用于治療移植排斥、移植物抗宿主疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。另外，于1999年3月23日授予Linsley等的美國專利5,885,579公開了通過施用特異性針對B7抗原例如B7.1(CD80)或B7.2(CD86)的配體而治療涉及T細(xì)胞與B7陽性細(xì)胞相互作用的免疫疾病。
此外，授予Anderson等的美國專利6,113,198公開了特異性針對B7-1抗原的抗體的用途，其與先前的抗B7抗體相比，不抑制B7.1/CTLA-4相互作用并可用于治療包括自身免疫病在內(nèi)的疾病。但是，沒有公開聯(lián)合使用這些抗體與特異性針對CD40L的抗體，也未報道該抗體與B細(xì)胞耗盡抗體連同的用途。
具體地說，Rituximab(RITUXAN)抗體是一種針對CD20抗原的基因工程嵌合小鼠/人單克隆抗體。RITUXAN適于治療復(fù)發(fā)的或難治的低分級或濾泡性CD20陽性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(美國專利No.5,736,137，于1998年4月7日授予Anderson等)。對作用機(jī)制的體外研究已證實RITUXAN結(jié)合人補體并通過補體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)而溶解淋巴樣B細(xì)胞系(Reff等，Blood 83(2)435-445(1994))。另外，它在對抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)的測定中具有顯著的活性。近來顯示RITUXAN在含氚胸苷摻入試驗中具有抗增殖效應(yīng)，并直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而其它抗-CD19和CD20抗體無這種作用(Maloney等，Blood 88(10)637a(1996))。還已在試驗中觀察到RITUXAN與化療和毒素之間的協(xié)同作用。具體地說，RITUXAN使耐藥的人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系對阿霉素、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的細(xì)胞毒性效應(yīng)敏感(Demidem等，Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3)177-186(1997))。在體外RITUXAN非常有效地從獼猴的外周血、淋巴結(jié)和骨髓耗盡B細(xì)胞，據(jù)推測是通過補體和細(xì)胞介導(dǎo)的過程(Reff等，Blood83(2)435-445(1994))。
Perrotta和Abuel Blood92，ASH 40th年會(1998年11月)摘要#3360提供了一名患有特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)的50歲女性對RITUXAN有反應(yīng)的軼事報道。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用至少一種免疫調(diào)節(jié)抗體與至少一種B細(xì)胞耗盡抗體(如以CD20、CD19、CD22、CD23或CD37為目標(biāo)的抗體)的組合治療自身免疫病，優(yōu)選B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病。當(dāng)用于治療自身免疫病時單獨或聯(lián)合施用這些類型的抗體產(chǎn)生協(xié)同效益。該結(jié)果是因為B細(xì)胞耗盡抗體作用于耗盡B細(xì)胞數(shù)目并因此減少循環(huán)IgE的量和其它涉及自身免疫病理學(xué)的抗體。然而，B細(xì)胞耗盡抗體，例如RITUXAN，傾向于優(yōu)先耗盡活化的B細(xì)胞。與此相比，免疫調(diào)節(jié)抗體，如抗-B7和抗-CD40L抗體對未活化的B細(xì)胞即未活化的抗原呈遞B細(xì)胞發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)即免疫抑制。因此，假設(shè)使用這兩種類型功能不同的抗體產(chǎn)生協(xié)同效益，在于其有助于從循環(huán)中同時去除活化的和未活化的B細(xì)胞。由此，循環(huán)自身免疫抗體水平將顯著降低，因為產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞水平將大大減少。這將提供顯著的治療效益，尤其是在其中B細(xì)胞更特別是自身抗體積極參與疾病病理學(xué)的自身免疫病中。
如以下討論的，優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)抗體包括抗-B7.1或抗-B7.2，抗-CD40，抗-CD40L和抗-CD4抗體。優(yōu)選的B細(xì)胞耗盡抗體的實例包括那些特異性針對CD20、CD19、CD21、CD37和CD22的抗體。
在其最寬的方面，本發(fā)明提供了用于治療自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE、ITP的聯(lián)合療法，通過聯(lián)合使用(i)免疫調(diào)節(jié)抗體，優(yōu)選抑制未活化B細(xì)胞的抗體；和(ii)B細(xì)胞耗盡抗體；其中這些抗體可以單獨或聯(lián)合并以任一次序施用。
在更具體的方面，本發(fā)明包括通過聯(lián)合使用(i)針對B7.1或B7.2的抗體和/或抗CD40L抗體，以及(ii)選自抗CD20、抗CD19、抗CD22和抗CD37的B細(xì)胞耗盡抗體來治療自身免疫病。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療自身免疫病的制品，其包括一個容器和其中所含的一種或多種組合物，所述組合物包含有效量的免疫調(diào)節(jié)抗體，例如抗CD40L或抗-B7.1或抗-B7.2抗體(免疫調(diào)節(jié)抗體)，和B細(xì)胞耗盡抗體或其片段，如抗CD20、抗CD19、抗CD22或抗CD37抗體(B細(xì)胞耗盡抗體)。
優(yōu)選實施方案的詳述I.定義在此“B細(xì)胞耗盡抗體”是經(jīng)施用與B細(xì)胞標(biāo)記結(jié)合的抗體或片段，導(dǎo)致可證明的B細(xì)胞耗盡。優(yōu)選這種抗體在施用后(通常在約數(shù)天之內(nèi)或更短)會導(dǎo)致B細(xì)胞數(shù)目減少約50％或更多。在優(yōu)選的實施方案中，B細(xì)胞耗盡抗體是RITUXAN(一種抗CD20嵌合抗體)或具有基本上相同或更高的細(xì)胞耗盡活性的抗體。已證實有效量的該抗體在給藥24小時之內(nèi)提供實質(zhì)上90％的B細(xì)胞耗盡作用。
“免疫調(diào)節(jié)抗體”指通過與耗盡活化B細(xì)胞不同的機(jī)制而產(chǎn)生對免疫系統(tǒng)的效應(yīng)的抗體。其實例包括抑制T細(xì)胞免疫、B細(xì)胞免疫的抗體，例如通過誘導(dǎo)耐受(抗CD40L，抗CD40)，或其它免疫抑制抗體(抗-B7.1，抗-B7.2或抗CD4)。在某些情況下，免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)抗體還可能具有促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡的能力。
在此“B細(xì)胞表面標(biāo)記”是在B細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原，與其結(jié)合的拮抗劑可以以其為目標(biāo)。示例性的B細(xì)胞表面標(biāo)記包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86(B7.2)白細(xì)胞表面標(biāo)記。特別感興趣的B細(xì)胞表面標(biāo)記較哺乳動物的其它非B細(xì)胞組織優(yōu)先在B細(xì)胞上表達(dá)，并且可能在前體B細(xì)胞和成熟的B細(xì)胞上均有表達(dá)。在一個實施方案中，所述標(biāo)記類似于CD20或CD19是在該細(xì)胞系的整個分化過程中(從干細(xì)胞階段直至就在最終分化為漿細(xì)胞之前的那一點)的B細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的一種標(biāo)記。在此優(yōu)選的B細(xì)胞表面標(biāo)記是CD19、CD20、CD23、CD80和CD86。
“CD20”抗原是一種在大于90％來自外周血或淋巴樣器官的B細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的35kDa非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá)并保持到直至分化為漿細(xì)胞。CD20存在于正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞上。在文獻(xiàn)中CD20的其它名稱包括“B淋巴細(xì)胞限制性抗原”和“Bp35”。Clark等，PNAS(USA)821766(1985)描述了CD20抗原。
“CD19”抗原指例如由HD237-CD19或B4抗體識別的一種90kDa抗原(Kiesel等，Leukemia Research II，121119(1987))。象CD20一樣，發(fā)現(xiàn)CD20存在于細(xì)胞系整個分化過程中(從干細(xì)胞階段直至就在最終分化為漿細(xì)胞之前的那一點)的細(xì)胞上。拮抗劑與CD19的結(jié)合可引起CD19抗原的內(nèi)化。
“CD22”抗原指一種在B細(xì)胞上表達(dá)的抗原，也稱為“BL-CAM”和“LybB”，其參與B細(xì)胞信號作用和粘附(參見Nitschke等，Curr.Biol.7133(1997)；Stamenkovic等，Nature 34574(1990))。該抗原是一種膜免疫球蛋白相關(guān)抗原，當(dāng)膜Ig結(jié)合時發(fā)生酪氨酸磷酸化(Engel等，J.Etyp.Med.181(4)1521，1586(1995))。已克隆了編碼該抗原的基因，并表征了其Ig結(jié)構(gòu)域。
B7抗原包括B7.1(CD80)、B7.2(CD86)和B7.3抗原，它們是在B細(xì)胞上表達(dá)的跨膜抗原。特異性結(jié)合B7抗原包括人B7.1和B7.2抗原的抗體在本領(lǐng)域中是已知的。優(yōu)選的B7抗體包括由Anderson等在美國專利No.6,113,198(轉(zhuǎn)讓給IDEC PharmaceuticalsCorporation)中公開的靈長類動物源化B7抗體，以及人和人源化B7抗體。
CD23指由B和其它細(xì)胞表達(dá)的IgE的低親和性受體。在本發(fā)明中，CD23優(yōu)選是人CD23抗原。CD23抗體在本領(lǐng)域中也是已知的。在本發(fā)明中最優(yōu)選CD23抗體是人抗人CD23抗體或包含人IgGI或IgG3恒定區(qū)的嵌合的抗人CD23抗體，并且最優(yōu)選在美國專利No.6,011,138中公開的耗盡性抗-CD23抗體。
“自身免疫病”是產(chǎn)生于并針對個體自身組織的非惡性疾病或障礙。在此非惡性自身免疫病特別除外惡性或癌性疾病或病癥，尤其是除外B細(xì)胞淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、毛細(xì)胞白血病和慢性原始粒細(xì)胞白血病。這種疾病或障礙的實例包括炎癥反應(yīng)如炎癥性皮膚疾病包括牛皮癬和皮炎(例如特應(yīng)性皮炎)；全身性硬皮病和硬化癥；與炎性腸病(如局限性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎)相關(guān)的反應(yīng)；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘迫綜合征；ARDS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；過敏性病癥如濕疹和哮喘以及其它涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的病癥；動脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘附缺陷；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)；多發(fā)性硬化；雷諾綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；斯耶格倫綜合征；青少年起病型糖尿?。灰约芭c細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答，其通常在結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和血管炎中發(fā)現(xiàn)；惡性貧血(艾迪生病)；涉及白細(xì)胞滲出的疾?。恢袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性疾?。欢嗥鞴贀p傷綜合征；溶血性貧血(包括冷球蛋白血癥)；重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；抗腎小球基底膜疾??；抗磷脂綜合征；過敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯??；蘭-伊肌無力綜合征；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內(nèi)分泌腺??；賴特?。唤┤司C合征；貝赫切特??；巨細(xì)胞動脈炎；免疫復(fù)合物腎炎；IgA腎?。籌gM多神經(jīng)?。幻庖咝匝“鍦p少性紫癜(ITP)，自身免疫性血小板減少和卵巢炎。
B細(xì)胞“拮抗劑”是這樣一種分子，其經(jīng)與B細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)合而破壞或耗盡哺乳動物的B細(xì)胞和/或干擾一種或多種B細(xì)胞功能，例如通過減少或阻止由B細(xì)胞引發(fā)的體液應(yīng)答。與此相比，B細(xì)胞耗盡抗體耗盡用其治療的哺乳動物的B細(xì)胞(即降低循環(huán)B細(xì)胞水平)。這種耗盡可通過多種機(jī)制實現(xiàn)，如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)，抑制B細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)B細(xì)胞死亡(例如通過凋亡)。在本發(fā)明范圍之內(nèi)的拮抗劑包括抗體、合成的或天然序列肽以及結(jié)合B細(xì)胞標(biāo)記的小分子拮抗劑，所述拮抗劑可選擇性地與細(xì)胞毒性劑結(jié)合或融合。
CD40L拮抗劑是特異性結(jié)合CD40L并優(yōu)選拮抗CD40L與CD40相互作用的一種分子。其實例包括特異性結(jié)合CD40L的抗體和抗體片段、可溶性CD40、可溶性CD40融合蛋白和結(jié)合CD40L的小分子。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的拮抗劑包括特異性針對CD40的抗體或抗體片段。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”和“ADCC”指一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcRs)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識別在靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細(xì)胞溶解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞—NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)總結(jié)于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)第464頁的表3。為了評價感興趣分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測定，如在美國專利No.5,500,362或5,821,337中描述的測定。對這種測定有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核的細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?？晒┻x擇地，或額外地，可以在體內(nèi)評價感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，如在Clynes等，PNAS(USA)95652-656(1998)中公開的動物模型。
“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實例包括外周血單核的細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源分離，例如在此所述從血液或PBMC。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體的Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是一種天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR與IgG抗體結(jié)合(γ受體)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括等位基因變異體和這些受體可供選擇的剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(一種“活化受體”)和FcγRIIB(一種“抑制受體”)，其具有相似的氨基酸序列，主要區(qū)別在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。活化受體FcγRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述M.Daeon，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。關(guān)于FcR的綜述見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 425-34(1994)；和deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)。其它FcR，包括那些有待在將來鑒定的，在此都被術(shù)語“FcR”所包括。該術(shù)語還包括新生兒受體FcRn，其負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移至胎兒(Guyer等，J.Immunol.117587(1976)和Kim等，J.Immunol.24249(1994))。
“補體依賴性細(xì)胞毒作用”或“CDC”指分子在補體的存在下溶解目標(biāo)靶的能力。補體活化途徑由補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)結(jié)合與相關(guān)抗原復(fù)合的分子(例如抗體)而啟動。為了評價補體活化，可以進(jìn)行CDC測定，例如在Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202163(1996)中所述。
“生長抑制性”拮抗劑阻止或減少表達(dá)拮抗劑所結(jié)合的抗原的細(xì)胞的增殖。例如，該拮抗劑可在體外和/或體內(nèi)阻止或減少B細(xì)胞的增殖。
“誘導(dǎo)凋亡”的拮抗劑誘導(dǎo)例如B細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡，如由結(jié)合膜聯(lián)蛋白V、DNA斷裂、細(xì)胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞破碎和/或形成膜囊泡(稱為凋亡小體)所確定。
在此術(shù)語“抗體”使用其最廣義并具體涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、從至少兩種完整的抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需要的生物學(xué)活性即可。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；diabodies；線狀抗體；單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體。
“天然抗體”通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接到重鏈，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之中各異。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個可變區(qū)(VH)然后是數(shù)個恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有一個可變區(qū)(VL)，在其另一端具有一個恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)并列，而輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)并列。據(jù)信特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語“可變”指這樣一個事實，即可變區(qū)的某些部分的序列在抗體之中有廣泛的差異并用于各特定抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性。但是，變異性在整個抗體可變區(qū)中并不是平均分布的。它集中在稱為高變區(qū)的3個節(jié)段(在輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)中均有)。可變區(qū)中更為高度保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包含4個FR，大部分采取β折疊構(gòu)型，由3個高變區(qū)連接，其形成連接β折疊結(jié)構(gòu)的袢，在某些情況下形成部分β-折疊結(jié)構(gòu)。在每條鏈中的高變區(qū)由FR緊緊拉到一起，并且與來自另一條鏈的高變區(qū)一起使得形成抗體的抗原結(jié)合部位(參見Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5thEd.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，如抗體參與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各有單一的抗原結(jié)合部位，和殘余的“Fc”片段，其名稱反映了其容易結(jié)晶的能力。用胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab’)2片段，其具有兩個抗原結(jié)合部位并仍能交聯(lián)抗原。
“Fv”是最小的抗體片段，其含有完整的抗原識別和抗原結(jié)合部位。該區(qū)域由緊密非共價結(jié)合的一個重鏈和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。它取這種構(gòu)型，使得各可變區(qū)的3個高變區(qū)相互作用，以在VH-VL二聚體表面上形成一個抗原結(jié)合部位。6個高變區(qū)集中起來賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，甚至是單一一個可變區(qū)(或Fv的一半，僅包含對抗原特異性的3個高變區(qū))也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管其親和力比整個結(jié)合部位要低。
Fab片段還含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CHI)。Fab’片段與Fab片段的差異在于在重鏈CHI區(qū)的羧基末端添加了幾個殘基，包括一個或多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab’-SH是此處對其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基團(tuán)的Fab’的命名。F(ab’)Z抗體片段最初是作為成對Fab’片段產(chǎn)生的，其間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。
來自任何脊椎動物種類的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”基于其恒定區(qū)的氨基酸序列，可以歸于兩個明顯不同的類型(稱為κ和λ)之一。
取決于其重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體可以歸于不同的種類。完整抗體有5個主要類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些中幾種可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGI、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應(yīng)于不同抗體類別的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。優(yōu)選重鏈恒定區(qū)將完善γ1、γ2、γ3和γ4恒定區(qū)。優(yōu)選這些恒定區(qū)還包含修飾以增強(qiáng)抗體穩(wěn)定性，如在美國專利No.6,011,138(在此全部引入作為參考)中公開的P和E修飾。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型也是熟知的。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL區(qū)，其中這些區(qū)以單一多肽鏈存在。優(yōu)選Fv多肽進(jìn)一步包含在VH和VL區(qū)之間的多肽接頭，其使scFv能形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore編著，Springer-Verlag，New York，269-315頁(1994)。
術(shù)語“diabodies”指具有兩個抗原結(jié)合部位的小抗體片段，該片段在相同多肽鏈(VH-VL)中包含重鏈可變區(qū)(VH)連接到輕鏈可變區(qū)(VL)。通過使用一個接頭(其長度不足以使得在相同鏈上的兩個區(qū)之間發(fā)生配對)，強(qiáng)制所述區(qū)與另一條鏈的互補區(qū)配對并創(chuàng)建兩個抗原結(jié)合部位。關(guān)于diabodies更完全的記載，參見例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)。
在此術(shù)語“單克隆抗體”用于指從一群實質(zhì)上同源的抗體中獲得的抗體，即構(gòu)成該群體的各抗體除了可能的天然發(fā)生的突變(其可能以較小量存在)外是完全相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相比，每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)勢在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)而合成的，未被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表明該抗體從一群實質(zhì)上同源的抗體獲得的特征，而不應(yīng)理解為需要通過特定的方法產(chǎn)生該抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可以通過首先由Kohler等，Nature，256495(1975)描述的雜交瘤方法制備，或可以通過重組DNA方法(參見例如美國專利No.4,816,567)制備?！皢慰寺】贵w”還可以使用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫分離。
在此單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相對應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與來源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相對應(yīng)序列相同或同源，以及這種抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出所需要的生物學(xué)活性即可(美國專利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。在此感興趣的嵌合抗體包括“靈長類動物源化”抗體，其包含來源于非人靈長類動物(例如Old World Monkey、猿等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。
“人源化”形式的非人(例如小鼠)抗體是含有來源于非人免疫球蛋白的最低序列的嵌合抗體。對于大部分情況，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者的高變區(qū)的殘基被來自非人物種(供體抗體)的高變區(qū)的殘基替代，所述非人物種如小鼠、大鼠、兔或具有所需要的特異性、親和性和能力的非人靈長類動物。在某些情況下，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。此外，人源化抗體可包含在受者抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。作這些修飾是為了進(jìn)一步精化抗體性能?？偟膩碚f，人源化抗體將包含基本上所有的可變區(qū)(至少一個通常兩個)，其中所有或基本上所有的高變袢對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，而所有或基本上所有的FR具有人免疫球蛋白序列。人源化抗體還可選擇性地包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分。關(guān)于更詳細(xì)的描述，參見Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
術(shù)語“高變區(qū)”當(dāng)用于本文時指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如在輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及在重鏈可變區(qū)中的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))，和/或那些來自“高變袢”的殘基(例如在輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及在重鏈可變區(qū)中的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))?！皹?gòu)架”或“FR”殘基是那些除了如在此定義的高變區(qū)殘基之外的可變區(qū)殘基。
“結(jié)合”感興趣抗原如B細(xì)胞表面標(biāo)記的拮抗劑能以足夠的親和力結(jié)合該抗原，從而該拮抗劑可用作以表達(dá)該抗原的細(xì)胞如B細(xì)胞為目標(biāo)的治療劑。
在此“抗CD20抗體”是特異性結(jié)合CD20抗原優(yōu)選人CD20的抗體，其具有可測量的B細(xì)胞耗盡活性，當(dāng)以與RITUXAN(參見美國專利No.5,736,137，全部引入本文作為參考)相同的量和條件施用時，優(yōu)選具有至少約10％的RITUXAN的B細(xì)胞耗盡活性。
在此“抗CD22抗體”是特異性結(jié)合CD22抗原優(yōu)選人CD22的抗體，其具有可測量的B細(xì)胞耗盡活性，當(dāng)以與RITUXAN(參見美國專利No.5,736,137，全部引入本文作為參考)相同的量和條件施用時，優(yōu)選具有至少約10％的RITUXAN的B細(xì)胞耗盡活性。
在此“抗CD19抗體”是特異性結(jié)合CD19抗原優(yōu)選人CD19的抗體，其具有可測量的B細(xì)胞耗盡活性，當(dāng)以與RITUXAN(參見美國專利No.5,736,137，全部引入本文作為參考)相同的量和條件施用時，優(yōu)選具有至少約10％的RITUXAN的B細(xì)胞耗盡活性。
在此“抗CD23抗體”是特異性結(jié)合CD23抗原優(yōu)選人CD23的抗體，其具有可測量的B細(xì)胞耗盡活性，當(dāng)以與RITUXAN(參見美國專利No.5,736,137，全部引入本文作為參考)相同的量和條件施用時，優(yōu)選具有至少約10％的RITUXAN的B細(xì)胞耗盡活性。
在此“抗CD37抗體”是特異性結(jié)合CD37抗原優(yōu)選人CD37的抗體，其具有可測量的B細(xì)胞耗盡活性，當(dāng)以與RITUXAN(參見美國專利No.5,736,137，全部引入本文作為參考)相同的量和條件施用時，優(yōu)選具有至少約10％的RITUXAN的B細(xì)胞耗盡活性。
在此“抗-B7抗體”是特異性結(jié)合B7.1、B7.2或B7.3最優(yōu)選人B7.1的抗體。優(yōu)選該抗體將特異性抑制B7/CD28相互作用，更優(yōu)選抑制B7.1/CD28相互作用，并且實質(zhì)上不抑制B7/CTLA-4相互作用。甚至更優(yōu)選抗B7.1抗體是在美國專利6,113,898(在此全部引入作為參考)中描述的特異性抗體之一。
“抗CD40L抗體”是特異性結(jié)合CD40L(也稱為CD154，gp39，TBAM)的抗體，優(yōu)選具有對抗活性。優(yōu)選的抗CD40L抗體具有在美國專利No.6,011,358(轉(zhuǎn)讓給IDEC Pharmaceuticals Corporation，在此全部引入作為參考)中公開的人源化抗體的特異性。
“抗CD4抗體”是特異性結(jié)合CD4優(yōu)選人CD4的抗體，更優(yōu)選是靈長類動物源化或人源化抗CD4抗體，優(yōu)選人γ4抗人CD4抗體。
“抗CD40抗體”是特異性結(jié)合CD40優(yōu)選人CD40的抗體，如在美國專利5,874,085、5,874,082、5,801,227、5,674,442和5,667,165(在此全部引作參考)中公開的那些。
優(yōu)選B細(xì)胞耗盡抗體和免疫調(diào)節(jié)抗體均含有人恒定區(qū)。合適的抗體可包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同種型。
結(jié)合CD20抗原的抗體的具體實例包括“rituximab”(“RITUXAN”)(美國專利No.5,736,137，特別在此引作參考)；釔-[90]-標(biāo)記的2B8小鼠抗體“Y2B8”(美國專利No.5,736,137，特別在此引作參考)；選擇性地用131I標(biāo)記的小鼠IgG2a“B1”抗體(BEXXARTM)(美國專利No.5,595,721，特別在此引作參考)；小鼠單克隆抗體“1F5”(Press等，Blood 69(2)584-591(1987))；和“嵌合2H7”抗體(美國專利No.5,677,180，特別在此引作參考)。
結(jié)合CD22的抗體的具體實例包括由Immunomedics報道的LymphocideTM，現(xiàn)在處于對非霍奇金淋巴瘤的臨床試驗之中。結(jié)合B7抗原的抗體的實例包括頒給Linsley等的美國專利No.5,885,577中報道的B7抗體，頒給DeBoer等并轉(zhuǎn)讓給Chiron Corporation的美國專利No.5,869,050中報道的抗B7抗體，和在Anderson等的美國專利No.6,113,198中公開的靈長類動物源化抗B7.1(CD80)抗體，以上所有文獻(xiàn)均全部引作參考。
結(jié)合CD23的抗體的優(yōu)選實例包括由Reff等在1999年7月4日頒發(fā)的美國專利No.6,011,138(共同轉(zhuǎn)讓給IDEC PharmaceuticalsCorp.和Seikakagu Corporation of Japan)中報道的特異性針對人CD23的靈長類動物源化抗體。其它抗CD23抗體和抗體片段包括由Bonnefoy等，No.96 12741；Rector等，J.Immunol.55481-488(1985)；Flores-Rumeo等，Science 2411038-1046(1993)；Sherr等，J.Immunol.，142481-489(1989)；和Pene等，PNAS，USA 856820-6824(1988)報道的那些。據(jù)報道這些抗體可用于治療過敏、自身免疫病和炎性疾病。
在此術(shù)語“rituximab”或“RITUXAN”指針對CD20抗原的基因工程嵌合小鼠/人單克隆抗體，在美國專利No.5,736,137(在此特別引作參考)中命名為“C2B8”。該抗體是一種IgG1κ免疫球蛋白，含有小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)序列以及人恒定區(qū)序列。Rituximab對CD20抗原的結(jié)合親和力大約為8.0nM。
“分離的”拮抗劑指已被鑒定并分離和/或從其天然環(huán)境的組分中回收。其天然環(huán)境的污染組分是會干擾拮抗劑的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，并可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，拮抗劑將被純化(1)至大于95wt％的拮抗劑，如Lowry法所確定，并最優(yōu)選超過99wt％，(2)其純化程度足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得N末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基，或(3)純化至使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染在還原或非還原條件下SDS-PAGE中表現(xiàn)為均一。分離的拮抗劑包括在重組細(xì)胞內(nèi)原位的拮抗劑，因為拮抗劑的天然環(huán)境的至少一種組分將不存在。但是通常分離的拮抗劑將通過至少一個純化步驟來制備。
用于治療目的的“哺乳動物”指任何分類為哺乳動物的動物，包括人、家畜和農(nóng)場動物以及動物園、運動或?qū)櫸飫游?，如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選所述哺乳動物是人。
“治療”指治療性治療和預(yù)防性措施。那些需要治療的包括已患有疾病或障礙的以及有待預(yù)防疾病或障礙的那些。因此，所述哺乳動物可能已經(jīng)被診斷為患有疾病或障礙或可能傾向于或易患該疾病。
措辭“治療有效量”指有效預(yù)防、改善或治療所關(guān)注的自身免疫病的拮抗劑量。
此處所用的術(shù)語“免疫抑制劑”(用于輔助治療)指作用于抑制或掩蔽在此接受治療的哺乳動物的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這會包括抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)或掩蔽MHC抗原的物質(zhì)。這種藥劑的實例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶類(參見美國專利No.4,665,077，其內(nèi)容在此引作參考)、硫唑嘌呤；環(huán)磷酰胺；溴隱亭；達(dá)那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美國專利No.4,120,649中所述)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環(huán)孢菌素A；類固醇如糖皮質(zhì)激素，例如強(qiáng)的松、甲基強(qiáng)的松龍和地塞米松；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑包括抗-干擾素-α、β-或δ-抗體，抗-腫瘤壞死因子-α抗體，抗-腫瘤壞死因子-β抗體，抗-白介素-2抗體和抗-IL-2受體抗體；抗-LFA-1抗體，包括抗-CD11a和抗-CD18抗體；抗-L3T4抗體；異種抗-淋巴細(xì)胞球蛋白；泛-T抗體，優(yōu)選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合域的可溶性肽(公開于7/26/90的WO90/08187)，streptolanase；TGF-β；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素；雷怕霉素；T細(xì)胞受體(Cohen等，美國專利No.5,114,721)；T細(xì)胞受體片段(Offner等，Science，251430-432(1991)；WO 90/11294；laneway，Nature，341482(1989)；和WO 91/01133)；和T細(xì)胞受體抗體(EP 340,109)如T10B9。
在此所用的術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”指抑制或阻止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)、化療劑和毒素，如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，或其片段。
“化療劑”是用于治療癌癥的化合物?；焺┑膶嵗ㄍ榛瘎┤玎缣孢吆铜h(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸鹽(酯)類如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖啶類如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替派；氮丙啶類和甲基蜜胺類包括六甲基蜜胺、曲他胺、三乙撐磷酰胺、三乙撐硫代磷酰胺和三羥甲蜜胺；氮芥類如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽固醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司??；抗生素如阿克拉霉素、放線菌素、安曲霉素、重氮乙酰絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、加利車霉素、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌羅霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝藥如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸、氨甲蝶呤、蝶酰蝶呤、三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素類如卡魯睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄氨、睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑如frolinic acid；醋葡醛內(nèi)酯；aldophosphamide glycoside；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達(dá)曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；依氟鳥氨酸；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；二胺硝吖啶；噴司他??；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替哌；紫杉烷類，例如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他奇(泰索帝，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊甙(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓；navelbine；二羥基蒽酮；替尼泊甙；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽；CPT11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；esperamicin；capecitabine；和以上任何物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。還包括在此定義之內(nèi)的是抗激素劑，其作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用，如抗雌激素類，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑類、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奧那司酮，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素類如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和任何上述物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。
術(shù)語“細(xì)胞因子”是由一個細(xì)胞群釋放的作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一個細(xì)胞的蛋白質(zhì)的總稱。這種細(xì)胞因子的實例是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括有生長激素如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)和促黃體生成激素(LH)；肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；米勒管-抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素-相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGF-13；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-g、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和試劑盒配體(KL)。在此所用的術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)以及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等同物。
本申請中所用的術(shù)語“前藥”指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，與親本藥物相比其對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，并能被酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩挠H本形式。參見例如Wilman，“Prodrugs inCancer Chemotherapy，”Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“ProdrugsAChemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed DrugDelievery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本發(fā)明的前藥包括但不限于含磷酸的前藥、含硫代磷酸的前藥、含硫酸的前藥、含肽的前藥、D-氨基酸-修飾的前藥、糖基化的前藥、含β-內(nèi)酰胺的前藥、含選擇性取代的苯氧乙酰胺的前藥或含選擇性取代的苯基乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前藥，其可轉(zhuǎn)換為更具活性的細(xì)胞毒性游離藥物。用于本發(fā)明的可衍生為前藥形式的細(xì)胞毒性藥物的實例包括但不限于以上所述的那些化療劑。
“脂質(zhì)體”是一種由多種類型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡，其可用于將藥物(如在此所公開的拮抗劑以及選擇性的化療劑)遞送至哺乳動物。脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層結(jié)構(gòu)，類似于生物膜的脂質(zhì)排列方式。
術(shù)語“包裝插入物”用來指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明書，其包含關(guān)于使用這種治療產(chǎn)品的適應(yīng)癥、用法、劑量、給藥、禁忌癥和/或警告方面的信息。
II.抗體的產(chǎn)生本發(fā)明的方法和制品使用或引入具有免疫調(diào)節(jié)活性的抗體，例如抗-B7、抗-CD40L或抗-CD40，和結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)記具有B細(xì)胞耗盡活性的抗體。相應(yīng)地，生成這種抗體的方法將在此進(jìn)行描述。
用于產(chǎn)生或篩選抗原的分子可以是例如可溶形式的抗原或其一部分，含有所需要的表位?；蛘?，或額外地，在其細(xì)胞表面表達(dá)所述抗原的細(xì)胞可用于產(chǎn)生或篩選拮抗劑。用于產(chǎn)生拮抗劑的其它形式的B細(xì)胞表面標(biāo)記對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的CD40L、CD40、CD19、CD20、CD22、CD23、CD37和B7(B7.1或B7.2)抗原的合適抗原來源是廣為人知的。
優(yōu)選CD40L抗體或抗-CD40L抗體是在美國專利6,001,358(頒布于1999年6月14日，并轉(zhuǎn)讓給IDEC Pharmaceuticals Corporation)中公開的人源化抗-CD40L抗體。
盡管優(yōu)選的CD40L拮抗劑是抗體，在此也可以想到除抗體以外的拮抗劑。例如，所述拮抗劑可以包括可溶性CD40、CD40融合蛋白或選擇性與細(xì)胞毒性劑(如在此所述的那些)融合或結(jié)合的小分子拮抗劑?？梢杂酶信d趣的B細(xì)胞表面標(biāo)記篩選小分子文庫，以鑒定與該抗原結(jié)合的小分子?？蛇M(jìn)一步篩選小分子的拮抗特性和/或?qū)⑵渑c細(xì)胞毒性劑結(jié)合。
所述拮抗劑也可以是例如通過合理設(shè)計或通過噬菌體展示產(chǎn)生的肽(WO98/35036，公開于1998年8月13日)。在一個實施方案中，所選擇的分子可以是例如基于抗體的CDR設(shè)計的“CDR模擬物”或抗體類似物。盡管所述肽可以自身即具有拮抗活性，可以選擇性地將該肽與細(xì)胞毒性劑或免疫球蛋白Fc區(qū)融合(例如，從而賦予該肽以ADCC和/或CDC活性)。
關(guān)于產(chǎn)生用于本發(fā)明的抗體拮抗劑的示例性技術(shù)如下所述。
(i)多克隆抗體優(yōu)選在動物中產(chǎn)生多克隆抗體，通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑。使用雙功能或衍生劑例如馬來酰亞氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基結(jié)合)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)，將相關(guān)抗原結(jié)合至在待免疫物種中具有免疫原性的蛋白例如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑可能是有用的。
通過聯(lián)合例如100μg或5μg的蛋白或結(jié)合物(分別對于兔或小鼠)與3體積的弗氏完全佐劑并將所述溶液在多個部位進(jìn)行皮內(nèi)注射，而使動物針對所述抗原、免疫原性結(jié)合物或衍生物免疫。一個月之后，通過在多個部位皮下注射處于弗氏完全佐劑中的1/5或1/10最初量的肽或結(jié)合物而對動物進(jìn)行強(qiáng)化免疫。7-14天之后，對動物取血并測定血清的抗體滴度。對動物進(jìn)行強(qiáng)化免疫直到滴度達(dá)到平臺。優(yōu)選用相同抗原但結(jié)合至不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)試劑得到的結(jié)合物對動物進(jìn)行強(qiáng)化。結(jié)合物也可以在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備，為蛋白融合物。此外，適當(dāng)采用聚集劑如明礬以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體是從一群本質(zhì)上均一的抗體獲得的，即構(gòu)成該群體的各抗體除了可能的天然發(fā)生的突變之外是完全相同的，所述突變可能以較小量存在。因此，修飾詞“單克隆”表示抗體不是離散抗體的混合物的特征。
例如，單克隆抗體可以使用由Kohler等，Nature，256495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或可以通過重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)制備。
在雜交瘤方法中，對小鼠或其它適宜的宿主動物如倉鼠，如以上所述進(jìn)行免疫，以得到產(chǎn)生或能產(chǎn)生將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白的抗體的淋巴細(xì)胞。或者，淋巴細(xì)胞可以在體外進(jìn)行免疫。然后使用合適的融合劑如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種并生長于合適的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常會包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，所述物質(zhì)阻止HGPRT缺乏細(xì)胞的生長。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些有效融合、支持所選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞穩(wěn)定高水平產(chǎn)生抗體的骨髓瘤細(xì)胞，并對諸如HAT培養(yǎng)基敏感。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是小鼠骨髓瘤系，如來源于可以從Salk InstituteCell Distribution Center，San Diego，California USA得到的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤，和可以從American Type Culture Collection，Manassas，Virginia，USA得到的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。還描述過人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細(xì)胞系用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.，133300 1(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(MarcelDekker，Inc.，New York，1987))。
測定雜交瘤細(xì)胞生長于其中的培養(yǎng)基針對所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生情況。優(yōu)選由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀印跡或通過體外結(jié)合測定如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來確定。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可以例如通過Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的30 Scatchard分析來確定。
在鑒定了產(chǎn)生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞之后，所述克隆可以通過有限稀釋方法進(jìn)行亞克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于此目的的合適培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPML-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可以在動物體內(nèi)作為腹水腫瘤生長。
通過常規(guī)的免疫球蛋白純化操作例如A蛋白-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養(yǎng)基、腹水或血清中適當(dāng)?shù)胤蛛x由亞克隆所分泌的單克隆抗體。
使用常規(guī)的方法易于分離編碼單克隆抗體的DNA并對其進(jìn)行測序(例如，通過使用能特異性結(jié)合編碼小鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞作為這種DNA的優(yōu)選來源。一旦被分離之后，可以將DNA置入表達(dá)載體中，然后將其轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或原本不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，從而在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。關(guān)于在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一個實施方案中，可以從使用在McCafferty等，Nature，348552-554(1990)中描述的技術(shù)生成的抗體噬菌體文庫分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)描述了使用噬菌體文庫分別分離小鼠和人抗體。隨后的出版物描述了高親和力(nM范圍)人抗體的產(chǎn)生，通過鏈改組(Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為策略構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))。由此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行備選方案。
所述DNA也可以是經(jīng)修飾的，例如，通過用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列來代替同源的小鼠序列(美國專利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價連接至免疫球蛋白編碼序列。
通常，這種非免疫球蛋白多肽被用來代替抗體的恒定區(qū)，或者它們被用來代替抗體的一個抗原結(jié)合部位的可變區(qū)，以創(chuàng)建包含一個對一種抗原具有特異性的抗原結(jié)合部位和另一個對不同抗原具有特異性的抗原結(jié)合部位的嵌合二價抗體。
(iii)人源化抗體將非人抗體人源化的方法已在現(xiàn)有技術(shù)中有所記載。優(yōu)選人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入其中的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，其通常取自于“輸入”可變區(qū)?？梢曰旧献裱韵路椒ㄟM(jìn)行人源化Winter和同事的方法(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))，通過用高變區(qū)序列代替人抗體的相應(yīng)序列。因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567)，其中實質(zhì)上小于完整的人可變區(qū)被來自非人物種的相應(yīng)序列代替。在實踐中，人源化抗體通常是人抗體，其中部分高變區(qū)殘基及可能部分FR殘基被來自嚙齒類動物抗體中類似位點的殘基所代替。
選擇用于制備人源化抗體的人可變區(qū)(輕鏈和重鏈)對降低抗原性是非常重要的。根據(jù)所謂的“最適”方法，用嚙齒類動物抗體可變區(qū)的序列篩選已知的人可變區(qū)序列的整個文庫。然后接受最接近嚙齒類動物的人序列作為人構(gòu)架區(qū)(FR)用于人源化抗體(Suns等，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法使用來源于具有特定亞型輕鏈或重鏈的所有人抗體的共有序列的特定構(gòu)架區(qū)。該相同的構(gòu)架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J.Immunol.，1512623(1993))。
另外重要的是，抗體被人源化時保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，根據(jù)優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和多種構(gòu)思的人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可以得到的并且是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。說明并展示所選擇的候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序是可以得到的。觀察這些展示可分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中可能起的作用，特別是分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。以此方式，可以從受者和輸入序列選擇并組合FR殘基，從而獲得所需要的抗體特征，如對靶抗原的親和力增加。一般來說，高變區(qū)殘基直接并最為實質(zhì)性地參與對抗原結(jié)合的影響。
(iv)人抗體作為人源化的備選方案，可以產(chǎn)生人抗體。例如，現(xiàn)在已可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，其經(jīng)免疫能產(chǎn)生人抗體的所有組成成分而不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白。例如，已描述了在嵌合和種系突變小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)PH)基因?qū)е峦耆种苾?nèi)源性抗體產(chǎn)生。在這種種系突變小鼠中轉(zhuǎn)入人種系免疫球蛋白基因陣列會導(dǎo)致在抗原攻擊時產(chǎn)生人抗體。參見例如Jakobovits等，Proc.Mad.Acad.Sci.USA，90255 1(1993)；Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in immuno.，733(1993)；和美國專利No.5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，可以使用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature348552-553(1990))，從來自非免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因所有組成成分，在體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)該技術(shù)，將抗體V區(qū)基因符合讀框地克隆入絲狀噬菌體如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒的表面上展示為功能性抗體片段。由于絲狀顆粒含有單鏈DNA拷貝的噬菌體基因組，基于抗體功能特性的選擇還導(dǎo)致選擇編碼表現(xiàn)出那些特性的抗體的基因。因此，該噬菌體模擬B細(xì)胞的某些特性。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；關(guān)于其綜述參見例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinionin Structural Biology 3564-571(1993)?？梢允褂脦追N來源的V基因片段用于噬菌體展示。Clackson等，Nature，352624-628(1991)從來源于免疫小鼠的脾的V基因小隨機(jī)組合文庫分離了一大批不同的抗噁唑酮抗體?？梢詷?gòu)建來自未免疫人供體的V基因的所有組成成分，并且可以基本上遵循以下技術(shù)分離針對一大批不同的抗原(包括自身抗原)的抗體Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)。還參見美國專利No.5,565,332和5,573,905。
還可以由體外活化的B細(xì)胞產(chǎn)生人抗體(參見美國專利No.5,567,610和5,229,275)。
(v)抗體片段已發(fā)展了多種技術(shù)用于產(chǎn)生抗體片段。傳統(tǒng)的做法是通過蛋白水解消化完整的抗體而產(chǎn)生這些片段(參見例如Morimoto等，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan等，Science，22981(1985))。然而，這些片段現(xiàn)在可以由重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生。例如，可以從上述抗體噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘?，可以從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10163-167(1992))。根據(jù)另一種方法，可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab’)2片段。用于產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)對技術(shù)人員而言是顯而易見的。在其它的實施方案中，所選的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利No.5,571,894；和美國專利No.5,587,458?？贵w片段還可以是“線狀抗體”，例如在美國專利No.5,641,870中所述。這種線狀抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體是對至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例性的雙特異性抗體可結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)記的兩種不同表位。其它的這種抗體可結(jié)合第一B細(xì)胞標(biāo)記并進(jìn)一步結(jié)合第二B細(xì)胞表面標(biāo)記?；蛘呖笲細(xì)胞標(biāo)記結(jié)合臂可與結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子的臂聯(lián)合，所述觸發(fā)分子如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受體(FcR)如FcRI(CD64)、FcRII(CD32)和FcRIII(CD16)，以將細(xì)胞防御機(jī)制集中到B細(xì)胞。雙特異性抗體還可以用于使細(xì)胞毒性劑定位于B細(xì)胞。這些抗體具有B細(xì)胞標(biāo)記結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒性劑(例如皂草素、抗干擾素α、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以制備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)上產(chǎn)生全長雙特異性抗體是基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩條鏈具有不同的特異性(Millstein等，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配組合，這些雜交瘤(quadroma)產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對正確分子的純化(通常是通過親和層析步驟完成)相當(dāng)麻煩，并且產(chǎn)物的產(chǎn)率低。類似的操作公開于WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)。
根據(jù)一種不同的方法，將具有所需要的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合部位)的抗體可變區(qū)融合至免疫球蛋白恒定區(qū)序列。所述融合優(yōu)選是與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，包括至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選在至少一種融和中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合，和如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入單獨的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染至適合的宿主生物體中。當(dāng)構(gòu)建中所用的3種多肽鏈的不等比例提供最理想的產(chǎn)率時，這為調(diào)節(jié)3種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。但是，當(dāng)至少兩種多肽鏈以相等比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)率時或當(dāng)比例無關(guān)緊要時，可將兩種或全部3種多肽鏈的編碼序列插入一個表達(dá)載體中。
在該方法的優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由在其一條臂具有第一結(jié)合特異性的雜種免疫球蛋白重鏈，和在其另一條臂的雜種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)該不對稱結(jié)構(gòu)有助于所需要的雙特異性化合物從不需要的免疫球蛋白鏈組合分離，因為僅在雙特異性分子的一半存在免疫球蛋白輕鏈為分離提供了便利的途徑。該方法公開于WO 94/04690。關(guān)于產(chǎn)生雙特異性抗體的更多細(xì)節(jié)，參見例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根據(jù)在美國專利No.5,731,168中描述的另一種方法，可以將一對抗體分子之間的界面改造成使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比達(dá)到最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3域的至少一部分。在該方法中，將來自第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈置換為較大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)。通過用較小的氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)置換大氨基酸側(cè)鏈而在第二抗體分子的界面上創(chuàng)建與大側(cè)鏈相同或相似大小的互補“空穴”。這提供了一種機(jī)制來增加異二聚體相對于其它不想要的終產(chǎn)物如同二聚體的產(chǎn)率。
雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“雜結(jié)合的”抗體。例如雜結(jié)合物中的抗體之一可以偶聯(lián)至抗生物素蛋白，而另一抗體偶聯(lián)至生物素。已提出例如用這種抗體使免疫系統(tǒng)細(xì)胞瞄準(zhǔn)不想要的細(xì)胞(美國專利No.4,676,980)，并用于治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP03089)?？梢允褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來制備雜結(jié)合抗體。合適的交聯(lián)劑以及多種交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域廣為人知的，并公開于美國專利No.4,676,980中。
用于從抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)在文獻(xiàn)中也已有記載。例如，可以使用化學(xué)鍵合制備雙特異性抗體。Brennan等，Science，22981(1985)描述了一種方法，其中將完整的抗體進(jìn)行蛋白水解切割，以生成F(ab’)2片段。將這些片段在二硫醇配位劑亞砷酸鈉的存在下還原以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫化鍵形成。然后將生成的Fab’片段轉(zhuǎn)換為硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后將Fab’-TNB衍生物之一通過用巰基乙胺進(jìn)行還原而重新轉(zhuǎn)換為Fab’-硫醇，并與等摩爾量的另一Fab’-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的物質(zhì)。
近來的研究進(jìn)展有助于從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，其可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J.Exp.Med.，175217-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab’)2分子的產(chǎn)生。各Fab’片段分別從大腸桿菌中分泌出來，并在體外進(jìn)行定向的化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能結(jié)合過量表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，以及引發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對人乳腺腫瘤靶的溶解活性。
用于直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有記載。例如，已使用亮氨酸拉鏈制備了雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合連接到兩種不同抗體的Fab’部分。將該抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后再氧化以形成抗體異二聚體。此方法還可用于產(chǎn)生抗體同二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述的“diabody”技術(shù)為制備雙特異性抗體片段提供了備選機(jī)制。所述片段包含重鏈可變區(qū)(VH)，通過接頭連接至輕鏈可變區(qū)(VL)，所述接頭的長度不足以使得相同鏈上的兩個區(qū)之間發(fā)生配對。因此，一個片段的VH和VL區(qū)被迫與另一個片段的互補VL和VH區(qū)配對，從而形成兩個抗原結(jié)合部位。通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體而制備雙特異性抗體片段的另一種策略也已有報道，參見Gruber等，J.Immunol.，1525368(1994)。
可以想到具有超過二價的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.14760(1991)。
III.拮抗劑的結(jié)合物和其它修飾在此用于所述方法中或包括在制品中的拮抗劑可選擇性地結(jié)合至細(xì)胞毒性劑。
上文已描述了用于生成這種拮抗劑-細(xì)胞毒性劑結(jié)合物的化療劑。
在此也可以想到拮抗劑與一種或多種小分子毒素(如加利車霉素、美登素(美國專利No.5,208,020)、單端孢菌毒素和CC 1065)的結(jié)合物。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，拮抗劑結(jié)合至一個或多個美登素分子(例如每個拮抗劑分子約1至約10個美登素分子)。美登素可以例如被轉(zhuǎn)換為May SS-Me，其可以被還原成May-SH3，并與經(jīng)修飾的拮抗劑反應(yīng)(Charm等，Cancer Research 52127-131(1992))以生成類美登素-拮抗劑結(jié)合物。
或者，拮抗劑可結(jié)合至一個或多個加利車霉素分子。加利車霉素家族的抗生素在皮摩爾以下濃度能產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。可以使用的加利車霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG和OI1(Hinman等，Cancer Research 533336-3342(1993)和Lode等，Cancer Research 582925-2928(1998))。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、modeccin A鏈、α八疊球菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、dianthin蛋白、垂序商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、gelonin、絲裂吉菌素、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢菌毒素。參見例如WO 93/21232(公開于1993年10月28日)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括與具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)結(jié)合的拮抗劑。
可以得到多種放射性同位素用于產(chǎn)生放射性結(jié)合的拮抗劑。實例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素。
拮抗劑與細(xì)胞毒性劑的結(jié)合物可以使用多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑制備，如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-甲酸、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如二甲基己二酰亞氨酸酯HCL)、活性酯(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、雙疊氮基化合物(如雙-(對疊氮基苯甲酰)己二胺)、雙重氮衍生物(如雙-(對重氮苯甲酰)-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氯化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如可以如Vitetta等，Science 2381098(1987)所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14標(biāo)記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一種用于將放射性核素結(jié)合到拮抗劑的示例性螯合劑。參見WO 94/11026。接頭可以是有助于在細(xì)胞內(nèi)釋放細(xì)胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可以使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感性接頭、二甲基接頭和含二硫鍵的接頭(Charm等，Cancer Research 52127-131(1992))。
或者，可以制備包含拮抗劑和細(xì)胞毒性劑的融合蛋白，例如通過重組技術(shù)或肽合成。
在另一個實施方案中，拮抗劑可以結(jié)合至“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)用于對腫瘤進(jìn)行預(yù)瞄準(zhǔn)，其中給患者施用拮抗劑-受體結(jié)合物，隨后使用清除劑從循環(huán)中去除未結(jié)合的結(jié)合物，然后施用“配體”(例如抗生物素蛋白)，所述配體與細(xì)胞毒性劑(例如放射性核素)結(jié)合。
本發(fā)明的拮抗劑還可以與前藥活化酶結(jié)合，所述酶將前藥(例如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)換為有活性的抗癌藥。參見例如WO 88/07378和美國專利No.4,975,278。
這種結(jié)合物的酶組分包括能作用于前藥從而將其轉(zhuǎn)換成其更具活性的細(xì)胞毒性形式的任何酶。
可用于本發(fā)明方法的酶包括但不限于，用于將含磷酸的前藥轉(zhuǎn)換為游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含硫酸的前藥轉(zhuǎn)換為游離藥物的芳基硫酸酶；用于將無毒性的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)換為抗癌藥氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)，其可用于將含肽的前藥轉(zhuǎn)換為游離藥物；D-丙氨酰羧肽酶，用于轉(zhuǎn)換含有D-氨基酸取代基的前藥；糖類切割酶如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶，用于將糖基化的前藥轉(zhuǎn)換為游離藥物；用于將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)換為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；和青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于將在其胺氮衍生有苯氧乙?；虮交阴；乃幬锓謩e轉(zhuǎn)換為游離藥物?；蛘?，具有酶活性的抗體，在本領(lǐng)域中也稱為“抗體酶”，可用于將本發(fā)明的前藥轉(zhuǎn)換為游離活性藥物(參見例如Massey，Nature 328457-458(1987))。可以如本文所述制備拮抗劑-抗體酶結(jié)合物用于將抗體酶遞送至腫瘤細(xì)胞群。
可以通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)將酶共價結(jié)合到拮抗劑，如使用以上所述的異雙功能交聯(lián)試劑?；蛘呖梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建融合蛋白，其包含本發(fā)明拮抗劑的至少抗原結(jié)合區(qū)，連接至本發(fā)明酶的至少功能活性部分(參見例如Neuberger等，Nature，312604-608(1984))。
在此可以預(yù)見對所述拮抗劑的其它修飾。例如，拮抗劑可以連接到多種非蛋白質(zhì)聚合物中的一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物。
在此公開的抗體還可以制成脂質(zhì)體。含有拮抗劑的脂質(zhì)體通過本領(lǐng)域已知的方法制備，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；美國專利No.4,485,045和4,544,545；和WO97/38731(公開于1997年10月23日)。循環(huán)時間增加的脂質(zhì)體公開于美國專利No.5,013,556。
特別有用的脂質(zhì)體可以如下產(chǎn)生通過反相蒸發(fā)方法，使用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物。通過確定孔徑的濾器擠出脂質(zhì)體以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可以如Martin等，J.Biol.Chem.257286-288(1982)所述通過二硫化物互換反應(yīng)而結(jié)合至脂質(zhì)體。在脂質(zhì)體中可選擇性地含有化療劑。參見Gabizon等，J.National CancerInst.81(19)1484(1989)。
可以預(yù)見在此描述的蛋白或肽拮抗劑的氨基酸序列修飾。例如，可能想要改善拮抗劑的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。拮抗劑的氨基酸序列變異體通過如下方法制備將適宜的核苷酸改變引入拮抗劑核酸，或通過肽合成。這種修飾包括，例如缺失，和/或插入，和/或置換拮抗劑氨基酸序列中的殘基。對缺失、插入和置換作任何組合以得到最終的構(gòu)建體，條件是最終的構(gòu)建體具有所需要的特征。氨基酸改變還可能改變拮抗劑的翻譯后過程，如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。
一種用于鑒定拮抗劑中作為誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有用方法被稱為“丙氨酸掃描誘變”，如Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)所述。在此，靶殘基中的一個殘基或基團(tuán)得到鑒定(例如帶電荷的殘基，如arg，asp，his，lys和glu)，并被中性或帶負(fù)性電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)置換以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或?qū)χ脫Q位點引入進(jìn)一步的或其它的變異體來精修那些證實對置換在功能上敏感的氨基酸位置。這樣，盡管預(yù)先確定引入氨基酸序列變異的位點，但突變本身的性質(zhì)并不需要預(yù)先確定。例如，為了分析在給定位點突變所表現(xiàn)出的作用，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并對所表達(dá)的拮抗劑變異體進(jìn)行所需活性的篩選。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端融合，長度從1個殘基至含有100個或更多個殘基的多肽，以及序列內(nèi)插入單個或多個氨基酸殘基。末端插入的實例包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的拮抗劑或融合至細(xì)胞毒性多肽的拮抗劑。拮抗劑分子的其它插入變異體包括酶或延長拮抗劑血清半衰期的多肽融合至拮抗劑的N-或C-末端。
另一類型的變異體是氨基酸置換變異體。對于這些變異體，拮抗劑分子中的至少一個氨基酸殘基被不同的殘基置換。對抗體拮抗劑進(jìn)行置換誘變的最有用位點包括高變區(qū)，但也可以預(yù)見FR改變。保守置換如表1所示，標(biāo)題為“優(yōu)選的置換”。如果這種置換導(dǎo)致生物學(xué)活性改變，則可以引入表1中的更為實質(zhì)性的改變(稱為“示例性置換”)或如以下參照氨基酸類別進(jìn)一步描述，并對產(chǎn)物進(jìn)行篩選。
表1
對拮抗劑的生物學(xué)特性的實質(zhì)性修飾是通過如下方法實現(xiàn)的通過選擇其對維持(a)在置換區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊或螺旋構(gòu)象，(b)分子在靶位點的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的大小的效應(yīng)顯著不同的置換。天然存在的殘基基于共同的側(cè)鏈特性分為以下幾組(1)疏水性正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水性cys，ser，thr；(3)酸性asp，glu；(4)堿性asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基gly，pro；和(6)芳香族trp，tyr，phe。
非保守置換將伴有這些類別之一的成員換成另一類別。
任何不參與維持拮抗劑適當(dāng)構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可以被置換，通常置換為絲氨酸，以提高分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常的交聯(lián)。反過來，可以將半胱氨酸(鍵)添加入拮抗劑以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)拮抗劑是抗體片段如Fv片段的情況)。
特別優(yōu)選類型的置換變異體包括置換親本抗體(如人源化或人抗體)的一個或多個高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變異體相對于產(chǎn)生其的親本抗體具有改善的生物學(xué)特性。產(chǎn)生這種置換變異體的便利方法是使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，對幾個高變區(qū)位點(例如6-7個位點)進(jìn)行突變以產(chǎn)生在每個位點所有可能的氨基酸置換。如此產(chǎn)生的抗體變異體以單價的方式由絲狀噬菌體顆粒展示，作為在每個顆粒中包裝的與M13的基因III產(chǎn)物的融合體。然后如在此所公開的，對由噬菌體展示的變異體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定進(jìn)行修飾的候選高變區(qū)位點，可以對已鑒定的對抗原結(jié)合起顯著作用的高變區(qū)殘基進(jìn)行丙氨酸掃描誘變?；蛘?，或另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體與抗原之間的接觸點可能是有益的。這種接觸殘基和鄰近的殘基可作為根據(jù)在此詳述的技術(shù)進(jìn)行置換的候選對象。一旦產(chǎn)生了這種變異體，對這些變異體如在此所述進(jìn)行篩選，可選擇在一種或多種相關(guān)測定中顯示出優(yōu)異特性的抗體作進(jìn)一步開發(fā)。
拮抗劑的另一類型氨基酸變異體改變了拮抗劑原本的糖基化模式。改變意味著去除拮抗劑中存在的一個或多個糖部分，和/或添加一個或多個拮抗劑中不存在的糖基化位點。
多肽的糖基化通常是N-連接的或O-連接的。N-連接指糖部分附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是糖部分酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，在多肽中這些三肽序列中任一個的存在創(chuàng)建潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸的附著，所述羥基氨基酸最常見為絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
通過改變氨基酸序列使得其含有一個或多個上述三肽序列而便利地實現(xiàn)向拮抗劑添加糖基化位點(對于N-連接的糖基化位點)。還可以通過向最初的拮抗劑序列添加或置換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行改變(對于O-連接的糖基化位點)。
編碼拮抗劑的氨基酸序列變異體的核酸分子可通過多種本領(lǐng)域已知的方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(對于天然存在的氨基酸序列變異體的情況)，或通過對拮抗劑的較早制備的變異體或非變異形式進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。
可能需要修飾本發(fā)明中所使用的抗體，以改善效應(yīng)功能。例如，增強(qiáng)拮抗劑的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)和/或補體依賴性細(xì)胞毒性作用(CDC)。這可以通過將一個或多個氨基酸置換引入抗體拮抗劑的Fc區(qū)來實現(xiàn)。或者或額外地，可以將半胱氨酸殘基引入Fc區(qū)，從而在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體可能內(nèi)化能力提高和/或補體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)增強(qiáng)。參見Caron等，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可以使用如Wolff等，Cancer Research 532560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)劑制備抗腫瘤活性增強(qiáng)的同二聚體抗體?；蛘呖梢愿脑炀哂须p重Fc區(qū)的抗體，從而可具有增強(qiáng)的補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
為了延長拮抗劑的血清半衰期，可以將補救受體結(jié)合表位引入拮抗劑(特別是抗體片段)，例如如美國專利5,739,277中所述。在此所用的術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)的Fc區(qū)的表位，它使得IgG分子在體內(nèi)的血清半衰期延長。
IV.藥物制劑包含本發(fā)明所使用的拮抗劑的治療制劑是這樣制備用于貯存的將具有所需純度的拮抗劑與選擇性的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑相混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980))，制成凍干制劑或水溶液的形式?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑以所采用的劑量和濃度對接受者是無毒性的，包括緩沖劑如磷酸、檸檬酸和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯己雙銨；苯扎氯銨，氯化芐乙氧銨；苯酚，丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽平衡離子如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白絡(luò)合物)；和/或非離子型表面活性劑如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
免疫調(diào)節(jié)抗體或抗體片段和B細(xì)胞耗盡抗體拮抗劑可以存在于同一制劑中或在不同制劑中。給藥可以是同時的或序貫的，并且可以以任一次序?qū)崿F(xiàn)。這種給藥可以通過重復(fù)施用兩種抗體持續(xù)一段長時間而實現(xiàn)。
示例性的抗CD20抗體制劑如WO98/56418所述(在此特別引入作為參考)。該公開文獻(xiàn)描述了一種液體多劑量制劑，包含40mg/mLrituximab，25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9％芐醇，0.02％聚山梨酯20，pH為5.0，最低架期為貯存于2-8℃兩年。另一種有用的抗CD20制劑包含10mg/mL rituximab，處于9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80及無菌注射用水中，pH6.5。
適于皮下給藥的凍干制劑如WO97/04801中所述。這種凍干制劑可以用合適的稀釋劑重新配制至高蛋白濃度，并可將重新配制的制劑對在此待治療的哺乳動物進(jìn)行皮下給藥。
在此所述制劑還可以包含超過一種對所治療的特定適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選具有互補活性彼此不產(chǎn)生不利影響的那些。例如，可能想要進(jìn)一步提供一種化療劑、細(xì)胞因子或免疫抑制劑(例如作用于T細(xì)胞的物質(zhì)，如環(huán)孢菌素，或結(jié)合T細(xì)胞的抗體，例如結(jié)合LFA-1的抗體)。這種其它物質(zhì)的有效量取決于制劑中存在的拮抗劑的量、疾病或障礙或治療的類型，以及以上討論的其它因素。這些物質(zhì)通常以相同的劑量使用，以上文所采用的給藥途徑，或迄今所采用劑量的約1-99％。
活性成分還可以包入微膠囊中，所述微膠囊是例如通過30凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，在膠態(tài)藥物遞送體系中(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳狀液、納米顆粒和納米膠囊)或處于粗滴乳狀液中。這種技術(shù)公開于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980)。
可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適例子包括含有拮抗劑的固體疏水性聚合物的半透基質(zhì)，所述基質(zhì)為成形產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物與leuprolide acetate組成的可注射微球體)，和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。通過經(jīng)無菌過濾膜濾過可以容易地實現(xiàn)這一要求。
V.用B細(xì)胞耗盡抗體和免疫調(diào)節(jié)抗體進(jìn)行治療將配制、調(diào)劑量并以符合正規(guī)醫(yī)學(xué)實踐的方式施用包含B細(xì)胞耗盡抗體和/或免疫調(diào)節(jié)抗體的一種或多種組合物。在這種情況下要考慮的因素包括所治療的特定自身免疫病或障礙、所治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床情況、疾病或障礙的病因、藥劑遞送部位、給藥方法、給藥方案和醫(yī)學(xué)從業(yè)者所知道的其它因素。待施用的拮抗劑的治療有效量將通過這些考慮因素來控制和決定。
如先前所提到的，B細(xì)胞耗盡抗體和免疫調(diào)節(jié)抗體可以存在于相同或不同的制劑中。這些抗體制劑可以分開單獨施用或同時施用，以任一次序。優(yōu)選對B細(xì)胞抗原靶例如CD20，CD19，CD22，CD23或CD37特異性的B細(xì)胞耗盡抗體將與免疫調(diào)節(jié)抗體例如抗CD40L抗體或抗CD40，抗B7.1，抗B7.2抗體分開施用。優(yōu)選CD40L抗體是在美國專利No.6,001,358中公開的人源化抗CD40L抗體。已表明該抗體在治療T和B細(xì)胞自身免疫病中均具有效力，例如多發(fā)性硬化和ITP。另外，與由Biogen報道的另一種人源化抗CD40L抗體(5c8)不同，已知該抗體不會引起不良的血液學(xué)事件。
作為一般的建議，胃腸外給藥的抗體的每劑有效量通常為大約0.1-500毫克/公斤患者體重/天，通常所用拮抗劑的初始范圍為大約2-100毫克/公斤。
優(yōu)選的B細(xì)胞耗盡抗體是RITUXAN。這種抗體的合適劑量是例如從大約20mg/m2至大約1000mg/m2。該抗體的劑量可以與現(xiàn)在推薦RITUXAN用于治療非霍奇金淋巴瘤的劑量相同或不同。例如，可以給予患者一劑或多劑實質(zhì)上小于375mg/m2的抗體，例如劑量從大約20mg/m2至大約250mg/m2，例如從大約50mg/m2至大約200mg/m2。
此外，可以施用一個或多個初始劑量的抗體，然后施用一個或多個后續(xù)劑量，其中在后續(xù)劑量中的mg/m2抗體劑量超過在初始劑量中的mg/m2抗體劑量。例如，初始劑量可以從大約20mg/m2至大約250mg/m2(例如從大約50mg/m2至大約200mg/m2)，而后續(xù)劑量可以從大約250mg/m2至大約1000mg/m2。
然而，如以上提到的，兩種免疫調(diào)節(jié)抗體的這些建議量要經(jīng)受大量的治療判斷。在選擇適宜劑量和時序安排中的關(guān)鍵因素是獲得的結(jié)果，如以上所指出的。例如，對于治療正在發(fā)生的和急性的疾病，最初可能需要相對較高的劑量。為了獲得最有效的結(jié)果，取決于該自身免疫病或障礙，拮抗劑的給予要盡可能接近所述疾病或障礙最初的征象、診斷、表現(xiàn)或發(fā)生或在所述疾病或障礙的消退期間。
可通過任何合適的方式給予抗體，包括胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)，如果需要進(jìn)行局部免疫抑制治療，可通過病損內(nèi)給藥。胃腸外輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥。另外，抗體可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^脈沖輸注給予，例如用下降劑量的抗體。優(yōu)選通過注射給藥，最優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下注射，部分地取決于給藥是短暫的還是長期的。
可以與本文的抗體一起另外施用其它化合物，如化療劑、免疫抑制劑和/或細(xì)胞因子。聯(lián)合給藥包括使用單獨分開的制劑或單一的藥物制劑共同給藥，以及以任一次序的序貫給藥，其中優(yōu)選存在一個時間段，而使兩種(或全部)活性劑同時發(fā)揮其生物學(xué)活性。
除了將抗體給予患者之外，本發(fā)明還預(yù)見通過基因療法施用抗體。這種編碼所述抗體的核酸的給藥包括在“施用治療有效量的拮抗劑”表述之中。參見例如WO96/07321(公開于1996年3月14日)，其涉及使用基因療法產(chǎn)生胞內(nèi)抗體。
有兩種主要的方法將核酸(選擇性地包含在載體之中)置入患者細(xì)胞中體內(nèi)和離體。對于體內(nèi)遞送，將核酸直接注射入患者，通常在需要拮抗劑的部位進(jìn)行注射。對于離體治療，取出患者細(xì)胞，將核酸引入這些分離的細(xì)胞中，并將經(jīng)修飾的細(xì)胞直接給予患者或例如包封入多孔膜中植入患者體內(nèi)(參見例如美國專利No.4,892,538和5,283,187)。有多種可利用的技術(shù)將核酸引入活細(xì)胞中。這些技術(shù)各異，取決于核酸是在體外轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)的細(xì)胞，還是在體內(nèi)轉(zhuǎn)移入指定宿主的細(xì)胞中。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移入哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、微注射、細(xì)胞融合、DEAF-葡聚糖、磷酸鈣沉淀方法等。用于離體遞送基因的常用載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
當(dāng)前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(如腺病毒、單純皰疹I(lǐng)病毒或腺伴隨病毒)轉(zhuǎn)染和基于脂質(zhì)的體系(脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中有用的脂質(zhì)是例如DOTMA，DOPE和DC-Chol)。在某些情況下，需要給核酸來源提供以靶細(xì)胞為目標(biāo)的物質(zhì)，如對細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞特異性的抗體，靶細(xì)胞上受體的配體等。當(dāng)采用脂質(zhì)體時，可以使用結(jié)合與胞吞作用相關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白的蛋白以定向和/或促進(jìn)攝取，例如親特定細(xì)胞類型的衣殼蛋白或其片段、針對在循環(huán)中經(jīng)歷內(nèi)化作用的蛋白的抗體，和引導(dǎo)胞內(nèi)定位并延長胞內(nèi)半衰期的蛋白。受體介導(dǎo)的胞吞技術(shù)有所記載，例如Wu等，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA873410-3414(1990)。關(guān)于目前已知的基因標(biāo)記和基因療法方案的綜述，參見Anderson等，Science 256808-813(1992)。還可參見WO93/25673及其中引用的參考文獻(xiàn)。
VI.制品在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了包含用于治療以上所述疾病或障礙的物質(zhì)的制品。
所述制品包括一個容器和容器上或容器中附帶的標(biāo)記或包裝插入物。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以從多種材料形成，如玻璃或塑料。容器中裝有或含有有效治療所選疾病或障礙的組合物，并可以具有無菌的取藥口(例如容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶，其具有可用皮下注射針頭刺破的塞子)。總體上可以有一種或幾種組合物。那些組合物之一中的至少一種活性劑是具有B細(xì)胞耗盡活性的抗體，而至少一種抗體是免疫調(diào)節(jié)抗體，如抗CD40L、抗CD40、抗CD4或抗B7抗體。標(biāo)記或包裝插入物指示所述組合物是用于治療患有或傾向于患自身免疫病的患者，如在上文所列的那些。所述制品可進(jìn)一步包括第二個容器，其包含可藥用緩沖劑，如制菌注射用水(BWFI)、磷酸緩沖鹽水、林格液和葡萄糖溶液。其還可包括從商業(yè)和用者角度所需要的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
本發(fā)明的其它細(xì)節(jié)通過以下非限定性實施例進(jìn)行說明。在本說明書中所有引用文獻(xiàn)的內(nèi)容在此特別引入作為參考。
實施例1對臨床診斷為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的患者首先用rituximab(RITUXAN)抗體治療。該患者可能還有或可能沒有B細(xì)胞耗盡抗體，即惡性病變。此外，選擇性地用任何一種或多種治療RA所采用的藥劑進(jìn)一步治療該患者，所述藥劑如水楊酸鹽；非甾體類抗炎藥如吲哚美辛、保泰松、苯基乙酸衍生物(例如布洛芬和非諾洛芬)、萘乙酸類(萘普生)、吡咯鏈烷酸(tometin)、吲哚乙酸類(舒林酸)、鹵代鄰氨基苯甲酸(甲氯芬那酸鈉)、吡羅昔康、佐美酸和二氟尼柳；抗瘧藥如氯喹；金鹽；青霉胺；或免疫抑制劑如氨甲蝶呤或皮質(zhì)類固醇，其劑量為這些藥物的已知劑量或減少的劑量。但是優(yōu)選對患者僅用RITUXAN進(jìn)行治療。
根據(jù)以下任何給藥方案對RA患者靜脈內(nèi)(IV)施用RITUXAN(A)50mg/m2IV第1天150mg/m2IV第8，15和22天(B)150mg/m2IV第1天375mg/m2IV第8，15和22天(C)375mg/m2IV第1，8，15和22天此后用美國專利No.6,001,358中公開的人源化抗CD40L抗體治療患者，根據(jù)相同的給藥方案靜脈內(nèi)給藥。
通過Paulus指數(shù)(Paulus等，Athritis Rheum.33477-484(1990))確定主反應(yīng)，即晨僵的改善、疼痛和發(fā)炎的關(guān)節(jié)數(shù)目、血沉(ESR)，以及由患者和醫(yī)師對疾病嚴(yán)重程度的5分制評價中至少提高2分。在如以上所述治療的患者中施用RITUXAN和抗CD40L抗體會減輕一種或多種RA癥狀。
實施例2用RITUXAN抗體治療被診斷為自身免疫性溶血性貧血(AIHA)例如冷球蛋白血癥或Coombs試驗陽性貧血的患者。AIHA是一種獲得性溶血性貧血，由與患者的紅細(xì)胞反應(yīng)的自身抗體引起。所治療的患者選擇性地還可能患有B細(xì)胞惡性病變。首先用含有人源化抗人CD40L抗體的組合物治療患者，給藥劑量為500mg/m2IV，該劑量每周給藥2次，共4周。
此后根據(jù)以下任何給藥方案對患者靜脈內(nèi)(IV)施用RITUXAN(A)50mg/m2IV第1天150mg/m2IV第8，15和22天(B)150mg/m2IV第1天375mg/m2IV第8，15和22天(C)375mg/m2IV第1，8，15和22天其它輔助治療(如糖皮質(zhì)激素、強(qiáng)的松、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、負(fù)載長春花的(vinca-laden)血小板或達(dá)那唑)可以與抗CD40L抗體和RITUXAN治療聯(lián)合。優(yōu)選用RITUXAN和與以上實施例中相同的抗CD40L抗體作為整個療程中唯一的其它藥劑治療患者。
總體反應(yīng)率是基于以下因素確定的血細(xì)胞計數(shù)的改善、對輸血的需要減少、血紅蛋白水平提高和/或通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)參數(shù)確定的溶血證據(jù)的減少。
在如以上所述治療的患者中施用抗CD40L抗體和RITUXAN會改善溶血性貧血的任何一種或多種癥狀。
實施例3成人免疫性血小板減少性紫癜(ITP)是一種相對罕見的血液系統(tǒng)疾病，它構(gòu)成最常見的免疫介導(dǎo)的血細(xì)胞減少癥。該疾病典型表現(xiàn)為嚴(yán)重的血小板減少，可能伴隨急性出血，而骨髓中存在正?；蛟黾拥木藓思?xì)胞。大多數(shù)ITP患者具有針對血小板膜外表面上的靶抗原的IgG抗體，導(dǎo)致脾中血小板隔離以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)加速破壞血小板(Bussell，J.B.Hematol.Oncol.Clin.North Am.(4)179(1990))。已顯示多種治療干預(yù)在治療ITP中有效。類固醇通常被認(rèn)為是一線治療，其后大多數(shù)患者可考慮接受靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)、脾切除或其它藥物治療包括長春新堿或免疫抑制/細(xì)胞毒性劑。多至80％的ITP患者最初對一個療程的類固醇有反應(yīng)，但少得多的患者能得到完全并持久的緩解。對于類固醇治療失敗的情況脾切除被推薦作為標(biāo)準(zhǔn)的二線治療，并且在接近60％的病例中實現(xiàn)長時間的緩解，但可能導(dǎo)致對感染的免疫力降低。脾切除是主要的外科方法，可能伴隨可觀的發(fā)病率(15％)和死亡率(2％)。IVIG也被用作二線藥物治療，盡管僅一小部分的成人ITP患者獲得緩解。
干預(yù)活化B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體而不伴有在用皮質(zhì)類固醇和/或脾切除治療時發(fā)生的相關(guān)死亡率，這種治療選擇對于一定比例的ITP患者將提供重要的治療方法。
對臨床診斷為ITP的患者(例如血小板計數(shù)＜75,000/uL)用rituximab(RITUXAN)抗體治療，可選擇性地聯(lián)合類固醇治療。接受治療的患者無B細(xì)胞惡性病變。
再次根據(jù)以下任何給藥方案對ITP患者靜脈內(nèi)(IV)施用RITUXAN(A)50mg/m2IV第1天150mg/m2IV第8，15和22天(B)150mg/m2IV第1天375mg/m2IV第8，15和22天(C)375mg/m2IV第1，8，15和22天與施用RITUXAN同時，用在美國專利No.6,113,898(在此全部引作參考)中公開的靈長類動物源化抗B7.1抗體中的一種治療患者。該抗B7.1抗體以單獨的制劑靜脈內(nèi)給藥，劑量為500mg/m2，每周2次，持續(xù)3周。
在輸注RITUXAN與抗B7.1抗體組合之前，預(yù)先給予患者各一劑的苯海拉明25-50mg(靜脈內(nèi))和對乙酰氨基酚650mg(口服)。使用無菌的注射器和21口徑或更大的針頭，將必需量的RITUXAN和抗B7.1抗體從小瓶中轉(zhuǎn)移入含有無菌無致熱原的0.9％氯化鈉，USP(鹽水溶液)的IV袋中。RITUXAN和B7.1抗體的終濃度大約為1mg/mL。首劑輸注速度始于最初半小時的25毫克/小時，然后以30分鐘間隔50毫克/小時的增量增加至200毫克/小時的最大速度。如果第一療程的RITUXAN和B7.1抗體得到很好耐受，則隨后療程的輸注速度從50毫克/小時開始，并以30分鐘間隔100毫克/小時的增量逐漸增加至最大速度不超過300毫克/小時。監(jiān)測生命體征(血壓、脈搏、呼吸、體溫)，每15分鐘×4或直到穩(wěn)定，然后每小時監(jiān)測一次直到輸注完成。
在四次每周一次的RITUXAN治療和施用三周B7抗體組合之后，分隔2周連續(xù)2次測定血小板計數(shù)，以此為基礎(chǔ)確定總體反應(yīng)率。用抗B7.1抗體和RITUXAN治療的患者與用安慰劑治療的患者相比將表現(xiàn)出血小板計數(shù)增加。
盡管本發(fā)明通過實施例和優(yōu)選實施方案進(jìn)行了描述，除了由前述所顯示的以外，對本發(fā)明的多種改動包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這種改動預(yù)期會落入以下權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動物自身免疫病的方法，包括給哺乳動物施用治療有效量的免疫調(diào)節(jié)抗體和治療有效量的具有B細(xì)胞耗盡活性的抗體的組合，所述免疫調(diào)節(jié)抗體選自抗CD40L、抗B7.1(CD80)、抗B7.2(CD86)、CD40抗體和抗CD4抗體，其中所述免疫調(diào)節(jié)抗體和所述B細(xì)胞耗盡抗體可以單獨或聯(lián)合并以任一順序給藥。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述B細(xì)胞耗盡抗體選自結(jié)合選自以下組的抗原的抗體CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80(B7.1)，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86(B7.2)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)抗體是抗CD40L抗體或抗B7抗體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述組合包括結(jié)合CD40L的抗體和結(jié)合CD20，CD22，CD19，CD23或CD37的抗體。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述組合包括結(jié)合B7.1或B7.2的抗體和結(jié)合CD19，CD20，CD22，CD23或CD37的抗體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中免疫調(diào)節(jié)抗體在B細(xì)胞耗盡抗體之前施用。
7.權(quán)利要求1的方法，其中B細(xì)胞耗盡抗體在免疫調(diào)節(jié)抗體之前施用。
8.權(quán)利要求1的方法，其中B細(xì)胞耗盡抗體和免疫調(diào)節(jié)抗體聯(lián)合施用。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述自身免疫病選自牛皮癬；皮炎；全身性硬皮病和硬化癥；與炎性腸病相關(guān)的反應(yīng)；局限性回腸炎；潰瘍性結(jié)腸炎；呼吸窘迫綜合征；成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；過敏性病癥；濕疹；哮喘；涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的病癥；動脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘附缺陷；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿??；多發(fā)性硬化；雷諾綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；斯耶格倫綜合征；青少年起病型糖尿?。慌c細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答；結(jié)核??；結(jié)節(jié)病；多肌炎；肉芽腫?。谎苎?；惡性貧血(艾迪生病)；涉及白細(xì)胞滲出的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性疾??；多器官損傷綜合征；溶血性貧血；重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾?。豢鼓I小球基底膜疾??；抗磷脂綜合征；過敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯?。惶m-伊肌無力綜合征；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內(nèi)分泌腺病；賴特病；僵人綜合征；貝赫切特?。痪藜?xì)胞動脈炎；免疫復(fù)合物腎炎；IgA腎?。籌gM多神經(jīng)??；特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)和自身免疫性血小板減少和卵巢炎。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物是人。
11.權(quán)利要求3的方法，其中抗體均不與細(xì)胞毒性劑結(jié)合。
12.權(quán)利要求4的方法，其中所述抗體組合包括人源化或人抗人CD40L或B7.1抗體和嵌合的人源化或人抗CD20抗體。
13.權(quán)利要求1的方法，其中B細(xì)胞耗盡抗體與細(xì)胞毒性劑結(jié)合。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述細(xì)胞毒性劑是放射性核素。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述抗體包括Y2B8或131I-B1(BEXXARTM)。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體經(jīng)靜脈內(nèi)施用。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體通過輸注施用。
18.權(quán)利要求3的方法，包括將實質(zhì)上小于375mg/m2劑量的抗體給予哺乳動物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述劑量范圍從大約20mg/m2至大約250mg/m2。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述劑量范圍從大約50mg/m2至大約200mg/m2。
21.權(quán)利要求1的方法，包括施用首劑抗體然后施用后續(xù)劑量，其中后續(xù)劑量中的mg/m2抗體劑量超過在首劑中的mg/m2抗體劑量。
22.權(quán)利要求6的方法，其中所述自身免疫病是免疫性血小板減少性紫癜(ITP)。
23.權(quán)利要求6的方法，其中所述自身免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
24.權(quán)利要求6的方法，其中所述自身免疫病是溶血性貧血。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述溶血性貧血是冷球蛋白血癥或Coombs陽性貧血。
26.權(quán)利要求6的方法，其中所述自身免疫病是血管炎。
27.權(quán)利要求1的方法，其基本上包括施用抗B7.1抗體和B細(xì)胞耗盡性抗CD20抗體。
28.一種制品，其包括一個容器和其中所含的一種或幾種組合物，其中至少一種組合物包含B細(xì)胞耗盡抗體，至少另一種組合物包含抗CD40L或抗B7.1或抗B7.2抗體，并且還包括包裝插入物指導(dǎo)使用者用所述組合物治療患有或傾向于患自身免疫病的患者。
29.權(quán)利要求25的制品，其中所述自身免疫病選自牛皮癬；皮炎；全身性硬皮病和硬化癥；與炎性腸病相關(guān)的反應(yīng)；局限性回腸炎；潰瘍性結(jié)腸炎；呼吸窘迫綜合征；成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；過敏性病癥；濕疹；哮喘；涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的病癥；動脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘附缺陷；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；糖尿病；多發(fā)性硬化；雷諾綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；過敏性腦脊髓炎；斯耶格倫綜合征；青少年起病型糖尿?。慌c細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答；結(jié)核?。唤Y(jié)節(jié)??；多肌炎；肉芽腫??；血管炎；惡性貧血(艾迪生病)；涉及白細(xì)胞滲出的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性疾??；多器官損傷綜合征；溶血性貧血；重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；抗腎小球基底膜疾病；抗磷脂綜合征；過敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯??；蘭-伊肌無力綜合征；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內(nèi)分泌腺??；賴特?。唤┤司C合征；貝赫切特?。痪藜?xì)胞動脈炎；免疫復(fù)合物腎炎；IgA腎??；IgM多神經(jīng)?。惶匕l(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，自身免疫性血小板減少和卵巢炎。
30.治療多發(fā)性硬化的方法，包括施用針對B7.1，B7.2或CD40L的抗體和具有實質(zhì)性B細(xì)胞耗盡活性的抗CD20抗體的組合，其中所述抗體單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
31.治療ITP的方法，包括施用針對B7.1，B7.2或CD40L的抗體和具有實質(zhì)性B細(xì)胞耗盡活性的抗CD20抗體的組合，其中所述抗體單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
32.治療狼瘡的方法，包括施用針對B7.1，B7.2或CD40L的抗體和具有實質(zhì)性B細(xì)胞耗盡活性的抗CD20抗體的組合，其中所述抗體單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
33.治療糖尿病的方法，包括施用針對B7.1，B7.2或CD40L的抗體和具有實質(zhì)性B細(xì)胞耗盡活性的抗CD20抗體的組合，其中所述抗體單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
34.治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括施用針對B7.1，B7.2或CD40L的抗體和具有實質(zhì)性B細(xì)胞耗盡活性的抗CD20抗體的組合，其中所述抗體單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
35.治療牛皮癬的方法，包括施用針對B7.1，B7.2或CD40L的抗體和具有實質(zhì)性B細(xì)胞耗盡活性的抗CD20抗體的組合，其中所述抗體單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
36.治療甲狀腺炎的方法，包括施用針對B7.1，B7.2或CD40L的抗體和具有實質(zhì)性B細(xì)胞耗盡活性的抗CD20抗體的組合，其中所述抗體單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
37.治療皮炎的方法，包括施用針對B7.1，B7.2或CD40L的抗體和具有實質(zhì)性B細(xì)胞耗盡活性的抗CD20抗體的組合，其中所述抗體單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
38.治療IBD的方法，包括施用針對B7.1，B7.2或CD40L的抗體和具有實質(zhì)性B細(xì)胞耗盡活性的抗CD20抗體的組合，其中所述抗體單獨或聯(lián)合并以任一順序施用。
39.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括施用合成的免疫抑制藥物。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述免疫抑制劑是環(huán)孢菌素或FK506。
41.權(quán)利要求39的方法，其進(jìn)一步包括施用針對自身抗體的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用免疫調(diào)節(jié)抗體(例如抗B7.1或抗B7.2或抗CD40L抗體)和至少一種B細(xì)胞抗體(如CD19，CD20，CD22，CD23或CD37)的組合治療自身免疫病，其中這些抗體可以單獨或聯(lián)合并以任一順序長時間施用。
文檔編號A61P21/00GK1592645SQ01817320
公開日2005年3月9日 申請日期2001年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月18日
發(fā)明者N·翰納 申請人:拜奧根Idec公司