專利名稱：抗血栓形成的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及抑制或預防凝血酶形成或活性的組合物及方法。
硫酸皮膚素(DS)，一種在實驗動物(6-9)和人體(10-13)中具有抗血栓形成活性的硫酸化糖胺聚糖，通過僅催化肝素輔因子II(HCII)而用作抗凝劑。由于凝血酶是HCII在血漿內(nèi)的專一靶體，因此DS被認為是凝血酶的選擇性抑制劑(14)。盡管結合于纖維蛋白的凝血酶能夠防護肝素-HCII復合體避免致失活作用(15)，血漿系統(tǒng)中進行的間接研究提示結合于纖維蛋白的凝血酶對DS-HCII復合體的致失活作用是敏感的(16)。然而，由于其低特異性的生物學活性以及高粘度使硫酸皮膚素的臨床應用受到限制。
商業(yè)上可獲得的低分子量肝素(無論是伊諾肝素還是替地肝素)中添加硫酸皮膚素在體外對血栓具有加和的抑制作用(17)。然而，實驗性聯(lián)合用藥沒有臨床價值，因為它對結合于纖維蛋白的凝血酶無效，并且DS效價低且溶解度小。
本發(fā)明簡述已經(jīng)證實，將從肝素獲得的寡糖級分(oligosaccharide fraction)(本文也稱之為“肝素寡糖級分”)與從硫酸皮膚素獲得的寡糖級分(本文也稱之為“硫酸皮膚素寡糖級分”)聯(lián)合使用對于流體相和結合于纖維蛋白的凝血酶都能夠產(chǎn)生良好的抑制作用。肝素寡糖級分和皮膚素寡糖級分的選擇性聯(lián)合使用產(chǎn)生超出預見的遠大于加和的抑制作用，即協(xié)同性抑制作用。本發(fā)明的新概念是在不增加出血的危險下聯(lián)合使用寡糖級分以確保肝素和硫酸皮膚素的最大的抗凝活性。
期望聯(lián)合治療中的各寡糖級分通過不同的機理抑制凝血酶。在希望不受理論上的作用機理束縛下，肝素寡糖級分可以通過激活抗凝血酶而抑制結合于纖維蛋白的凝血酶以及流體相凝血酶，并且它可通過抗凝血酶催化Xa因子失活而抑制凝血酶生成。硫酸皮膚素寡糖級分可以通過激活HCII而抑制結合于纖維蛋白的凝血酶。在其活化的構象中，HCII的氨基端結構域與外切位點I(exosite)結合。由于凝血酶通過外切位點I結合于纖維蛋白，活化的HCII與纖維蛋白競爭結合凝血酶并從纖維蛋白上置換出凝血酶。而后被置換出的凝血酶被肝素/HCII、硫酸皮膚素/HCII或肝素/抗凝血酶滅活。
通過不同機理達到抑制凝血酶最大效果的聯(lián)合治療，將改善對治療的耐受性，并且使得在單一治療時高劑量和長期使用這些藥物可引起的不利毒性作用的危險降低。因此，本發(fā)明的聯(lián)合治療能夠使所采用的各組分的劑量降低(例如，如實施例2所述至少使劑量降低5-10倍)，并降低各組分的不利的毒性作用。與各組分作為單一藥物使用的安全范圍相比，較低的劑量能夠使安全范圍擴大。此外，當向患者提供方便的單一的聯(lián)合用藥劑量單位時，它一般能夠被接受，因為便利性提高導致依從性提高，并且使患者通常與藥物的多種單位劑量形式有關的精神錯亂的可能性減少。
大致說來，本發(fā)明涉及抑制或預防患者凝血酶生成或活性的聯(lián)合治療，包括使患者服用有效劑量的(a)至少一種肝素寡糖級分；及(b)一種硫酸皮膚素寡糖級分。本發(fā)明的一個方面是提供協(xié)同活性的聯(lián)合治療。另一個方面是提供抑制或預防患者凝血酶生成或活性的方法，包括對有需要的患者聯(lián)合給予有效量(優(yōu)選產(chǎn)生協(xié)同作用的有效量)的至少一種肝素寡糖級分，以及至少一種硫酸皮膚素寡糖級分。
“聯(lián)合治療”或“聯(lián)合給予”意思是將活性成分同時給予所治療的患者。當聯(lián)合給藥時，各組分可以在同一時間或以任何順序相繼給藥、以及在不同的時間點給藥。因此，各組分可以分別給藥，但時間應充分接近以獲得所希望的作用(優(yōu)選協(xié)同作用)。
本發(fā)明還提供包括聯(lián)合使用的(a)至少一種肝素寡糖級分；和(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級分，以及任選的藥學上可接受的賦形劑、載體或媒介物的組合物。本發(fā)明還構思了在分開的容器中以及適于同時或順序給藥目的的藥用組合物，它包括肝素寡糖級分和硫酸皮膚素寡糖級分，兩者都任選與藥學上可接受的賦形劑、載體或媒介物混合在一起。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供一種藥用組合物，它包括一個單位劑量的至少一種肝素寡糖級分；以及一個單位劑量的硫酸皮膚素寡糖級分，以及任選的藥學上可接受的賦形劑、載體或媒介物。
上述組合物還包括肝素寡糖及硫酸皮膚素寡糖級分的藥學上可接受的鹽，例如鈉、鉀、銨、鎂及鈣鹽。
根據(jù)它的一個方面，所提供的藥用組合物包括在預防或抑制凝血酶生成或活性中存在有效的協(xié)同作用的(a)至少一種肝素寡糖級分；及(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級分的組合。該方法還提供藥用組合物，它包括以產(chǎn)生協(xié)同作用的有效量的至少一種肝素寡糖級分與至少一種硫酸皮膚素寡糖級分，及藥學上可接受的賦形劑、載體或媒介物的組合。
在優(yōu)選的實施方案中，該藥用組合物所包括的肝素寡糖級分及硫酸皮膚素寡糖級分的劑量至少比各自級分在預防或抑制患者凝血酶生成或活性中所需的劑量低5至10倍。
另一個方面本發(fā)明涉及包括(a)至少一種肝素寡糖級分與(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級分的組合的組合物在用于預防或抑制凝血酶生成或活性的藥物制備中的用途。另一方面本發(fā)明涉及產(chǎn)生協(xié)同作用的有效量的至少一種肝素寡糖級分，與至少一種硫酸皮膚素寡糖級分在用于抑制或預防患者凝血酶生成或活性的藥用組合物的制備中的用途。
由于本發(fā)明涉及的治療方法包括可以分別給予活性藥物的組合，因此本發(fā)明還涉及以試劑盒形式組合的分別含活性成分的組合物。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的寡糖級分，以及如本文一般描述的采用這些級分的組合物和治療方法。
本發(fā)明還構思了本發(fā)明的組合物或本發(fā)明的聯(lián)合療法在預防，和/或改善與過量的凝血酶生成或活性有關的疾病的嚴重性、疾病癥狀，和/或疾病復發(fā)周期中的用途。
本領域的技術人員應當能夠從下文附圖及詳細描述中容易地理解本發(fā)明的這些和其它方面、特征及優(yōu)點。
圖的描述參照附圖可以更好地理解本發(fā)明，其中

圖1表示可溶性纖維蛋白(Fm)對DS催化(圖A)的或肝素催化的(圖B)HCII抑制凝血酶的二級速率常數(shù)的影響。在有或無Fm存在下DS-或肝素-催化的100nM HCII對10hM凝血酶抑制的二級速率常數(shù)在準一級(pseudo first-order)條件下測定。各個點代表四次測定的平均值，而短線代表標準誤。
圖2的柱形圖表示在由肝素酶誘導的分子量遞增的肝素寡糖級分存在下4μM纖維蛋白單體對凝血酶的抗凝血酶(AT)抑制作用的影響。
圖3表示肝素和DS對凝血酶與纖維蛋白結合的影響。在濃度遞增的肝素(·)或DS(o)存在下測定凝血酶與纖維蛋白凝塊的結合。各個點代表兩次測定的平均值而條線(bars)代表標準誤。
圖4的曲線圖表示肝素或由肝素酶誘導的級分對凝血酶與纖維蛋白凝塊結合的影響。
圖5是表示在DS或標準肝素(SH)存在下HCII從纖維蛋白凝塊上置換凝血酶的曲線圖。
圖6A是表示在兔動脈血栓形成預防模型中聯(lián)合使用的肝素寡糖級分∶硫酸皮膚素寡糖級分(5∶1)與單用肝素寡糖級分對累計血管開放(patency)的影響的圖。
圖6B是表示在兔動脈血栓形成模型中聯(lián)合使用的肝素寡糖級分∶硫酸皮膚素寡糖級分(5∶1)與單用肝素寡糖級分對累計失血的影響的圖。
圖7是表示肝素、LMWH、肝素寡糖級分及水蛭素對血管開放的影響(圖A)以及對失血的影響(圖B)的比較圖。
圖8是表示肝素寡糖級分對狒狒動脈血栓形成模型中血小板沉降至血管移植物的影響的圖。
圖9是表示硫酸皮膚素寡糖級分對狒狒動脈血栓形成模型中血小板沉降至血管移植物的影響的圖。
圖10是表示肝素寡糖級分與硫酸皮膚素寡糖級分聯(lián)合使用對狒狒動脈血栓形成模型中血小板沉降至血管移植物的影響的圖。
發(fā)明詳述肝素寡糖級分“得自肝素的寡糖級分”或“肝素寡糖級分”是指以體外具有抗凝血酶和HCII相關的抗凝血活性為特征的來源于肝素的寡糖的混合物。這些級分所包含的肝素鏈太短而不能橋接凝血酶與纖維蛋白，但是其長度足以橋接抗凝血酶或HCII與凝血酶。
這些級分可包含衍生自肝素的寡糖混合物，其特征在于具有下列一、二、三、四、五、六，或七或更多項特征(a)具有體外抗凝血酶和肝素輔因子II(HCII)相關的抗凝血活性；(b)這些寡糖由于太短而不能橋接凝血酶和纖維蛋白，但是其長度足以橋接抗凝血酶或HCII與凝血酶；(c)有至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的寡糖具有一個或一個以上的五糖序列；(d)富含分子量范圍從約6000至約12000、6000至11000，或6000至10000的寡糖；(e)這些寡糖具有約7000至10000、7500至9700，或8000至9000的峰分子量；(f)至少有30％、35％、40％、45％、50％或55％的寡糖具有大于或等于6000道爾頓的分子量；(g)至少有20％、25％、30％、35％或40％，具有大于或等于8000道爾頓的分子量；(h)多分散性為1.1至1.8，優(yōu)選1.2至1.7；以及(i)具有類似抗Xa因子和抗IIa因子的活性，優(yōu)選抗Xa因子活性與抗IIa因子活性的比值從約2∶1至約1∶1。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明所采用的級分具有特征(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(d)、(c)、(h)和(i)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(e)、(h)和(i)；(b)、(e)、(f)、(h)和(i)；(b)、(e)、(g)、(h)和(i)；或(a)至(i)。
“富含寡糖”是指在所定義或限定的分子量范圍內(nèi)包含至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的寡糖的級分。
“五糖序列”是指由三個D-葡萄糖胺和兩個糖醛酸殘基組成的肝素的關鍵結構單位(見下圖結構)。中心D-葡萄糖胺殘基含有獨特的3-O-硫酸根部分。 該五糖序列代表對抗凝血酶具有高度親和性的肝素最小結構(Choay，J.等，Biochem Biophys Res Comm 1983；116492-499)。肝素通過該五糖序列結合抗凝血酶導致活性中心環(huán)的構象改變而使抗凝血酶由緩慢轉變?yōu)榭焖僖种苿?br> 肝素寡糖級分所包括的肝素序列太短而不能橋接凝血酶與纖維蛋白，但其長度足以使抗凝血酶與凝血酶橋接。因此，本發(fā)明所選用的級分能夠通過催化抗凝血酶而抑制與纖維蛋白結合的凝血酶以及流體相中凝血酶，并且通過抗凝血酶催化的Xa因子失活而抑制凝血酶生成。優(yōu)選用于本發(fā)明的級分為能夠同等抑制結合于纖維蛋白的凝血酶及流體相中的凝血酶的片段。
表1和表2列舉了可以被本發(fā)明采用的合適的肝素寡糖級分的特征。
本發(fā)明所采用的肝素寡糖級分可能具有類似的抗Xa因子和抗IIa因子的活性。在一種實施方案中，抗Xa因子活性與抗IIa因子活性的比例范圍從約2∶1至約1∶1。在優(yōu)選實施方案中，抗Xa因子活性范圍從約80IU/mg至約155IU/mg，優(yōu)選90IU/mg至約140IU/mg。在優(yōu)選實施方案中，抗IIa因子的活性范圍從約20IU/mg至約150IU/mg；更優(yōu)選從40IU/mg至約130IU/mg。
本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒可以用于改進PCT/CA98/00548(WO98/55515，1998年12月10日公布)、1999年6月30日遞交的美國專利申請序列號60/141865的，或1999年9月17日遞交的美國專利申請序列號60/154744所描述的肝素組合物，這些文獻均通過參考結合于本說明書。
應該理解，有可能制備具有更多的特殊特征的本發(fā)明所用的肝素寡糖級分，這些特征在上述(d)、(e)、(h)及(i)所確立的范圍內(nèi)。例如，這些級分所具有的分子量范圍可以從約7000至10000；7500至10000；7800至10000；7800至9800；7800至9600；7800至9000；7800至8800；7800至8600；7800至8500；或8000至8500。采用具有7800至10000；7800至9800；7800至9600；7800至9000；7800至8800；7800至8600；7800至8500；或8000至8500的峰分子量的肝素寡糖級分也是可能的。可以開發(fā)用于本發(fā)明組合物或方法的具有1.3-1.6的多分散性的級分。此外，開發(fā)用于本發(fā)明組合物或方法的級分可以具有下列一項或一項以上的特殊特征(i)抗Xa因子活性對抗IIa因子活性的比例范圍從約1.5∶1至約1∶1；(ii)從約95IU/mg至約120IU/mg或從約100至110IU/mg的抗Xa因子活性；(iii)從約80IU/mg至約100IU/mg或從約90至110IU/mg的抗IIa因子活性。
在本發(fā)明的一種實施方案中，肝素寡糖級分具有下列一項或一項以上的特征(a)富含分子量范圍從6000至10000道爾頓，且平均值約為8500的寡糖；(b)白色至黃白色的結晶固體；(c)室溫下穩(wěn)定；以及(d)約1.2至1.5，優(yōu)選1.5的多分散性。
用于本發(fā)明的肝素寡糖級分可以用制備這些肝素寡糖的常規(guī)方法從組織中獲得，或者也可以合成它。特別地，肝素寡糖級分可以由未分級分離的肝素，或者，由低分子量肝素(LMWH)制備。
舉例來說，通過首先使未分級分離的肝素解聚產(chǎn)生低分子量肝素，并且分開或分離出所需的肝素寡糖級分可由未分級分離的肝素獲得肝素寡糖級分。未分級分離的肝素既可以是藥用質(zhì)量的商業(yè)肝素制品，也可以是粗制肝素制品，例如從哺乳動物組織或器官提取活性肝素獲得。商業(yè)肝素產(chǎn)品(美國藥典肝素)可以從數(shù)種來源(例如，SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri)獲得，通常是作為堿金屬或堿土金屬鹽(最常見的是肝素鈉)。此外，未分級分離的肝素可以采用本領域技術人員所知的各種方法(參見，例如，Coyne，Erwin，Chemistry and Biology of Heparin(《肝素化學和生物學》)(Lundblad，R.L.等(主編)，9-17頁，Elsevier/North-Holland，紐約(1981))，從哺乳動物，例如，牛、豬和羊的組織或器官，特別是從小腸粘膜或肺中提取。在一種優(yōu)選實施方案中，未分級分離的肝素是豬小腸肝素。
已知有多種肝素解聚的方法，而且它們通常以化學或酶反應為基礎。舉例來說，通過芐基化繼而以強堿解聚；亞硝酸解聚；用肝素酶進行酶促解聚；過氧化解聚等，可以從標準的、未分級分離的肝素制備本發(fā)明之肝素寡糖級分。尤其是，可以采用PCT/CA98/00548(WO98/55515)所述的亞硝酸解聚法或高碘酸氧化水解法制備肝素寡糖級分。
在一種實施方案中，采用肝素酶解聚反應(例見，U.S.3766167，及U.S.4396762)而從未分級分離的肝素制備肝素寡糖級分。在優(yōu)選的實施方案中通過控制肝素酶解聚反應制備肝素寡糖級分。硫酸皮膚素寡糖級分“得自硫酸皮膚素的寡糖級分”或“硫酸皮膚素寡糖級分”是指以體外具有很少甚或沒有抗凝血酶相關活性、但具有HCII相關抗凝血活性為特征的衍生自硫酸皮膚素的寡糖混合物。硫酸皮膚素由交替的糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖殘基組成。許多葡萄糖醛酸殘基在C-5位出現(xiàn)差向異構而產(chǎn)生艾杜糖醛酸。因此，O-硫酸化可能發(fā)生在GalNAc的C-4或C-6位或IdoA的C-2位。本發(fā)明所采用的這些級分比未分級分離的天然硫酸皮膚素顯示出對HCII的更高的親和性。
選用于本發(fā)明的硫酸皮膚素寡糖級分具有下列一項或一項以上的，優(yōu)選全部的特征(a)6.0％至10.0％(w/w)的硫含量；例如從6.0％至8.0％(w/w)，優(yōu)選6.5％至8％(w/w)；(b)1.2至2.5的硫酸根/羧基比率，例如從1.2至2.0，例如從1.3至1.8，優(yōu)選從1.3-1.6；(c)20％至60％(w/w)的焦硫酸化(disulfated)二糖含量，優(yōu)選30％至60％(w/w)的單硫酸化二糖含量；(d)肝素輔因子II介導的抗凝血酶活性在20-60IU/mg范圍內(nèi)，優(yōu)選30-60IU/mg。
在本發(fā)明的一種實施方案中，被選擇的硫酸皮膚素寡糖級分所包括的硫酸皮膚素寡糖混合物中有90％或以上的分子量范圍在約1600至約20000道爾頓之間并且峰分子量從約4500至約8000道爾頓。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，硫酸皮膚素寡糖級分具有下列一項或一項以上的特征(a)富含分子量范圍從5000至8000道爾頓的寡糖；(b)白色至黃白色的結晶固體；(c)室溫下穩(wěn)定；以及(d)磺化重量大于6.2％。
硫酸皮膚素寡糖級分可以用制備這些寡糖的常規(guī)方法從組織中的未分級分離的硫酸皮膚素獲得，或者它也可以從相關的單糖從頭開始合成。優(yōu)選采用保護未分級分離的硫酸皮膚素之高電荷區(qū)并使之易于分離的解聚方法以提供用于本發(fā)明的級分，其溶解性和效價比未分級分離的硫酸皮膚素有改善。例如，可以按照下列步驟制備硫酸皮膚素寡糖級分硫酸皮膚素用高碘酸氧化反應氧化和解聚，氫硼化物還原，酸水解，以及離子交換層析。
可以用于制備這些級分的硫酸皮膚素來源包括哺乳動物組織，例如哺乳動物皮膚，包括來源于豬或牛的血管化組織和皮膚。優(yōu)選采用腸粘膜作為硫酸皮膚素來源。
本發(fā)明的組合物、方法及試劑盒優(yōu)選采用硫酸皮膚素寡糖混合物，以及制備這些混合物的方法，它描述于PCT/EP98/03007(1998年12月10日公開的WO98/55514)，它通過參考結合于本文中。
測定寡糖級分的性質(zhì)用于本發(fā)明的肝素和皮膚素寡糖級分的分子量特征可以采用本領域內(nèi)技術人員熟悉和采用的標準技術測定。這些技術包括，例如，GPC-HPLC、粘度測量、光散射、解聚過程中形成的功能基團的化學或物理化學測定等。在優(yōu)選實施方案中，寡糖級分的分子量特征通過高效分子排阻層析(high performance size exclusive chromatography)測定。
特別地，可以采用下列方法確認用于本發(fā)明的肝素或皮膚素寡糖級分的性質(zhì)和特征(a)按照Dedem，Pharmeuropa，3，202-218，1991的方法以GPS-HPLC測定分子量；(b)按照歐洲藥典，第2版，V.3.5.3.測定硫含量；(c)硫酸鹽/羧酸鹽比例按照歐洲藥典，19970828測定；(d)以國際肝素標準4(編碼號82/502)為標準在游離血漿系統(tǒng)中通過顯色分析法(Diagnostica Stago，法國)測定HCII介導的抗凝血酶活性；(e)按照歐洲藥典1997:0828測定抗Xa因子與抗IIa因子，兩種方法均采用斜率比分析的統(tǒng)計學方法校正。
組合物和方法本發(fā)明的組合物和方法在預防或治療以過量的凝血酶生成或活性和/或過強的補體激活為特征的癥狀或疾病的臨床應用中是有益的。這些癥狀在受到過創(chuàng)傷的患者，例如接受手術的患者中經(jīng)常發(fā)生。傷口或手術所致的創(chuàng)傷導致血管損傷以及繼發(fā)性的血液凝固激活。這些不良作用可發(fā)生于常規(guī)及矯形手術、婦科手術、心臟或血管手術，或其它手術過程中。凝血酶過量還可能使正常疾病的發(fā)展惡化例如動脈粥樣硬化，它可以導致心臟病發(fā)作、中風或肢端壞疽。因此，本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療、預防，或抑制多種重要的心血管并發(fā)癥，包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、腦血管意外(中風)、肺栓塞、深靜脈血栓形成、動脈血栓形成等。本發(fā)明的組合物和方法還可以用于減少或預防透析過程中的凝血及減少或預防開胸心臟手術過程中的血管內(nèi)凝血。它們還可以用于保持醫(yī)療設備如靜脈注射裝置的開放。
在本發(fā)明的一個方面，所提供的方法和組合物用于預防或抑制由于止血紊亂性醫(yī)學病情(例如，冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化，等)所致的血栓形成危險性升高的患者的凝血酶生成或活性。在另一個方面，所提供的組合物和方法用于醫(yī)學處理后的血栓形成危險性增高的患者，例如心臟手術、血管手術，或經(jīng)皮冠狀動脈介入療法。在一種實施方案中，本發(fā)明之方法和組合物用于心肺旁路。本發(fā)明方法中的組合物，或寡糖級分，可以在醫(yī)學處理之前、期間或之后給藥。
可以用標準藥學方法以細胞培養(yǎng)或以實驗動物測定療效和毒性，例如統(tǒng)計學計算ED50(在50％群體中取得治療效果的劑量)或LD50(50％群體致死的劑量)。治療指數(shù)是治療與毒性作用劑量的比值且它可以表示為ED50/LD50之比值。優(yōu)選表現(xiàn)出較大治療指數(shù)的藥用組合物。
可以接受聯(lián)合治療或給予本發(fā)明的組合物的患者包括動物，包括哺乳動物，特別是人類。動物還包括飼養(yǎng)動物，包括馬、牛、羊、家禽、魚、豬、貓、狗和動物園動物。
本發(fā)明的組合物，肝素寡糖級分，或硫酸皮膚素寡糖級分，可以通過任何使活性藥物與患者體內(nèi)的藥物作用位點產(chǎn)生接觸的途徑給藥。肝素和硫酸皮膚素寡糖級分可以同時或按任何次序相繼，或在不同的時間點給藥，以產(chǎn)生所需作用。選擇本發(fā)明的組合物及治療的最佳作用的給藥方案在熟練的醫(yī)師或獸醫(yī)的能力范圍內(nèi)。這些組合物可以用口服劑型如片劑、膠囊(每一種都包括緩釋或定時釋放制劑)、丸劑、粉劑、顆粒劑、酏劑、酊劑、混懸液、糖漿劑及乳劑給藥。它們還可以通過靜脈內(nèi)(大劑量注射或輸注)、腹腔內(nèi)、皮下或肌內(nèi)劑型給藥，所采用的所有劑型都是藥學領域內(nèi)一般技術人員所熟知的。本發(fā)明的組合物還可以采用合適的鼻內(nèi)媒介物的鼻內(nèi)劑型，或者通過透皮途徑，例如采用常規(guī)透皮貼劑以局部給藥。透皮釋藥系統(tǒng)的劑量給予是連續(xù)的而不是間歇性的全程給藥方案。
本發(fā)明包括提供協(xié)同作用或釋放協(xié)同作用有效量的硫酸皮膚素和肝素寡糖級分的聯(lián)合療法。適合用于本發(fā)明的藥用組合物包括在其中含有協(xié)同作用有效量的活性成分的組合物。而“協(xié)同作用”和“協(xié)同作用有效量”是指肝素寡糖級分和硫酸皮膚素寡糖級分以足夠的劑量存在以達到大于各級分自身所能達到的效果的所需結果，例如，在治療血栓相關性心血管病癥時增強對凝血酶的抑制，如上文所述，例如，促進結合于血塊的凝血酶失活，通過抗凝血酶催化Xa因子的滅活而增強對凝血酶生成的抑制作用等。
本發(fā)明之給藥方案將根據(jù)已知因素如特定藥物的藥效學特性及其給藥方式和途徑；患者的種屬、年齡、性別、健康狀況、醫(yī)療狀況、以及體重；癥狀的性質(zhì)和程度；并行的治療種類、治療次數(shù)、給藥途徑、患者的肝腎功能、以及所希望的療效而變化。具有常規(guī)技術的醫(yī)師或獸醫(yī)能夠容易地確定預防、對抗，或終止病情發(fā)展所需的藥物有效劑量。
本發(fā)明的組合物或治療可以包括單位劑量的至少一種肝素寡糖級分和單位劑量的至少一種硫酸皮膚素寡糖級分。“單位劑量”是指能夠?qū)颊呓o藥的單元即單次劑量，所述單位劑量可易于處理和包裝，以保持在物理和化學上的穩(wěn)定的單位劑量，它包含活性成分本身或其與固體或液體藥用賦形劑、載體或媒介物的混合物。
通常，活性藥物，即，肝素寡糖級分和硫酸皮膚素寡糖級分，可以以約每劑量2mg至每劑量1000mg的濃度范圍內(nèi)分別以藥用組合物存在(或用于本發(fā)明的治療中)，且更優(yōu)選在約每劑量5mg至每劑量500mg的濃度范圍內(nèi)。日劑量可以有較大變化，但通常以每天每劑量約20mg至每天每劑量約100mg的濃度范圍存在，更優(yōu)選在每天每劑量約40mg至每天每劑量約80mg的濃度范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的組合物或治療方法中肝素寡糖級分對硫酸皮膚素寡糖級分的比例可以是1∶1至10∶1，優(yōu)選1∶1至8∶1，更優(yōu)選2∶1至6∶1，最優(yōu)選5∶1。
本發(fā)明的組合物或其級分通常包括根據(jù)擬用的給藥劑型選擇的合適的藥用稀釋劑、賦形劑、媒介物或載體，并與常規(guī)制藥慣例一致?？刹捎眠@些載體、媒介物等以提供協(xié)同作用有效量的活性級分，以抑制或預防患者的凝血酶活性或其生成。
合適的藥用稀釋劑、賦形劑、媒介物和載體描述于標準教科書，雷明頓氏藥物科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，Mack出版社。作為口服給藥的膠囊和片劑劑型之實例，活性成分可以與口服、無毒的藥學上可接受的惰性載體如乳糖、淀粉、蔗糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、葡萄糖、硫酸鈣、磷酸鈣、甘露醇、山梨糖醇等混合。對于口服液體劑型，藥用成分可以與任何口服、無毒、藥學上可接受的隋性載體如乙醇、甘油、水等混合。合適的粘合劑(例如明膠、淀粉、玉米甜料、包括葡萄糖的天然糖；天然和合成樹膠，以及蠟質(zhì))，潤滑劑(例如油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉和氯化鈉)，崩解劑(例如淀粉、甲基纖維素、瓊脂、皂土和黃原膠)，矯味劑，及著色劑也可以與這些組合物或其成分混合。
本發(fā)明組合物的腸道外給藥制劑可以包括水溶液、糖漿劑、水或油懸液以及采用食用油如棉籽油、椰子油或花生油的乳劑?？梢杂糜谒畱乙旱臄U散或混懸劑包括合成或天然樹膠，如黃蓍膠、藻酸鹽、阿拉伯膠、右旋糖酐、羧甲基纖維素鈉、明膠、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。
腸道外給藥的組合物可包括無菌水或非水溶劑，如水、等滲生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖溶液，或其它常規(guī)用于治療活性藥物的腸道外給藥的溶劑。擬用于腸道外給藥的組合物還可以包括常規(guī)添加劑如穩(wěn)定劑、緩沖劑或防腐劑，例如抗氧化劑如甲基羥基苯甲酸酯或類似的添加劑。
本發(fā)明的組合物可以通過，例如，細菌截留過濾器過濾、在組合物中添加滅菌劑、照射組合物，或加熱組合物滅菌。此外，本發(fā)明的級分可以作為無菌固體制劑如凍干粉末來提供，它可以在臨用前容易地溶解于無菌溶劑中。
除上述制劑外，組合物還可以配制為植入制劑。這些長效制劑可以通過植入(例如，皮下或肌肉內(nèi))或通過肌肉內(nèi)注射給藥。因此，例如，這些級分可以用合適的聚合物或疏水性物質(zhì)(例如，作為可接受的油乳劑)，或離子交換樹脂來配制，或者作為微溶性衍生物，例如，微溶性的鹽。
本發(fā)明的組合物及其成分可以包括可溶性聚合物作為靶向藥物載體。
藥用組合物制備后，可以將它們放入合適的容器并標示所治療的適應癥。對于本發(fā)明的組合物的用藥，這樣的標鑒應包括用量、次數(shù)、以及用藥方法。
本發(fā)明還包括本發(fā)明的組合物與一種或一種以上的其它治療藥聯(lián)合使用的方法，它包括但不限于抗血小板藥或血小板抑制劑如阿司匹林、prioxicam、氯吡格雷、噻氯匹定，或糖蛋白IIb/IIIa受體拮抗劑，凝血酶抑制劑如boropeptide、水蛭素或阿加曲班；或溶栓藥或纖溶劑例如纖溶酶原激活物(如組織纖溶酶原激活物)，阿尼普酶，尿激酶，或鏈激酶；或它們的組合。
除用于治療上述心血管病癥的藥用組合物中外，本領域內(nèi)的技術人員容易理解其活性產(chǎn)物，可以用作體外揭示血液凝固機理的試劑。
通過特定實施例可以更加詳細地描述本發(fā)明。為說明的目的，給出下列實施例，而無意以任何方式限制本發(fā)明。本領域內(nèi)技術人員容易認識到，可以改變或調(diào)整非關鍵性參數(shù)，以達到基本相同的結果。
實施例1表2總結了本發(fā)明所采用的幾個區(qū)段(lots)的肝素寡糖級分以及其它肝素級分(來源于Sigma的UFH和來源于Rhne-Poulenc Rorer的伊諾肝素)的特征。所列特征包括平均分子量、活性、抗-IIa活性、多分散性和Kd值。多分散性為Mw/Mn(平均分子量重量除以平均分子量數(shù)目)并通過肝素樣品的凝膠過濾峰分布積分表中的數(shù)據(jù)分析確定。通過以肝素樣品滴定AT或IIa時觀察測定熒光(280nm激發(fā)，340nm發(fā)射)的增加，將對肝素濃度I/I0的滴定曲線與結合等溫方程擬合，并且解出α(最大熒光變化值)、Kd(解離常數(shù))及n(與一摩爾配基結合所需的肝素摩爾數(shù))可獲得Kd值。獲得結合配基化學計量(l/n)并轉換成每種肝素級分中含五糖鏈的比例。
與肝素不同，所選肝素寡糖級分不能穩(wěn)定凝血酶與纖維蛋白的結合。在AT和HCII都存在的情況下添加纖維蛋白單體降低未分級分離的肝素對凝血酶的滅活率的研究證明了這一點。相反，在等摩爾濃度的肝素寡糖級分存在下纖維蛋白單體對AT或HCII的凝血酶抑制率僅有極小的抑制效果。進一步的支持是在存在或不存在濃度范圍為0到7500nM的肝素寡糖級分或未分級分離的肝素下測定結合于纖維蛋白凝塊的125I標記的凝血酶的量，得出所選肝素寡糖級分不增強凝血酶與纖維蛋白的結合。
實施例2肝素級分和硫酸皮膚素寡糖級分的抗血栓形成活性采用體外循環(huán)以比較肝素寡糖級分、硫酸皮膚素寡糖級分、以及肝素及硫酸皮膚素寡糖級分聯(lián)合使用的抗血栓形成活性。1999年Writz等詳細描述了這種循環(huán)。簡單地說，將不同濃度的被檢測化合物加入到摻有125I標記的人纖維蛋白原并保持37C水浴的重新鈣化的人的全血中。蠕動泵使血液循環(huán)于40μ血液過濾器中。通過環(huán)路中的壓力計測定的濾器鄰近處的壓力而確定濾器中的血液凝塊。從環(huán)路容器中取出系列血液樣品并計算剩余放射活性作為纖維蛋白原消耗及凝塊形成的指標。此外，還測定起始激活的凝固時間。
兩項關鍵指標，開放時間及凝固過程中消耗的纖維蛋白原百分率，被用于評價該模型檢測的化合物的效價。開放期作為不能濾過的時間來測量。于90分鐘時停止該試驗，由此確定開放的最大時間。
用于研究的硫酸皮膚素級分(在實施例和表3中也稱為LMWDS)具有下列特征Mp5000Da，Mw7600Da，而多分散性為1.4。由肝素酶衍生的肝素寡糖級分通過本文所述的肝素酶解聚作用獲得，且峰分子量為8000，抗IIa活性約為100IU/mg，抗Xa活性約為134IU/mg，而多分散性約為1.5。由一氧化氮產(chǎn)生的肝素寡糖級分通過PCT/CA98/00548所述之一氧化氮解聚法獲得，且其分子量為7700Da，抗IIa活性約為84IU/mg，抗Xa活性為123IU/mg，而多分散性為1.3。由高碘酸衍生的肝素寡糖級分通過PCT/EP98/03007(1998年12月10日公開的WO98/55514)所述之高碘酸解聚法而獲得，且其峰分子量為7900Da，抗IIa活性為19IU/mg，抗Xa活性為43IU/mg，而多分散性為1.5。
由于它與包括約27個糖單位的鏈相符而選用峰分子量為約8000道爾頓的肝素級分。橋接凝血酶和抗凝血酶所需最小長度為18個糖單位。由于這些級分中幾乎所有的鏈均由18個以上的糖單位組成，因此它們具有足夠的長度以催化抗凝血酶對凝血酶的滅活作用。相反，這些級分太短而不能使凝血酶與纖維蛋白橋接，因為這種橋接反應需要包括40或40個以上的糖單位的鏈(即，12000Da或更大)。所以，平均分子量為8000的肝素級分通過其激活抗凝血酶的能力而具有良好的抑制凝血酶的活性，并且能夠滅活結合于纖維蛋白的凝血酶，因為它們不能使凝血酶橋接于纖維蛋白并使其抵抗經(jīng)肝素/抗凝血酶或肝素/HCII復合物的滅活。相反，伊諾肝素，一種平均分子量約為5000的商品化低分子量肝素(Rhone-Poulenc Rorer，Montreal，PQ)包含的糖鏈大多數(shù)太短而不能橋接凝血酶和抗凝血酶，因此解釋了為什么它對凝血酶的抑制活性低于對Xa因子的抑制活性的原因。
如先前所述(Weitz JI等，Circulation 1999；99682-689)，將不同濃度的各種級分加入到摻有125I標記的人纖維蛋白原并保持在37℃下水浴中的重新鈣化的人全血中。然后采用蠕動泵使血液通過40μ血液過濾器循環(huán)。通過(a)用環(huán)路中的壓力計測量濾器鄰近處的壓力，以及(b)從容器中取出系列血液樣品并計算剩余放射活性作為纖維蛋白原消耗的指標，來測定濾器中的血的凝固。起始的激活凝固時間也被測定。
如表3所示，在單獨使用時，需要250μg/ml濃度的硫酸皮膚素寡糖級分以保持濾器開放并且使纖維蛋白原的消耗量降低到＜10％。這是值得注目的，因為早先的研究報道了未分級分離的硫酸皮膚素在這種循環(huán)中即使在4mg/ml的濃度下也是無效的(Weitz，等，Circulation，1999)。
低分子量硫酸皮膚素與肝素酶衍生的8000Da肝素級分或伊諾肝素的聯(lián)合使用也得到評價。當與1μg/ml肝素酶衍生的8000Da肝素聯(lián)合使用時LMWDS在100μg/ml下有效，或與2μg/ml的這種肝素級分聯(lián)合使用時在50μg/ml下有效。相反，50μg/ml LMEDS在與3μg/ml的伊諾肝素聯(lián)合使用時無效，其濾器失效出現(xiàn)在80min時而纖維蛋白原消耗量為85％。這些結果表明肝素酶衍生的級分比伊諾肝素更有效。
當LMWDS和肝素酶衍生的8000Da肝素級分聯(lián)合使用時，兩種藥物在分別比所述藥物單獨使用時保持開放所需的劑量低5倍和10倍的劑量下有效(即，50比250μg/ml的LMWDS和1比10μg/ml肝素酶衍生的8000Da的級分)。
對LMWDS(50μg/ml)與肝素酶、亞硝酸及高碘酸衍生的肝素級分，以及伊諾肝素(全部為2μg/ml)的聯(lián)合使用進行了比較。LMWDS與肝素酶或亞硝酸衍生的肝素級分聯(lián)合使用有效。另兩種聯(lián)合使用無效(見表4)。
為進一步評價肝素酶衍生的級分和伊諾肝素，比較了這兩種藥物的重量分析等效劑量(表5)。即使在30μg/ml劑量下，伊諾肝素的藥效也低于10μg/ml的肝素酶衍生的級分。
實施例3纖維蛋白單體對肝素-和DS-催化的HCII抑制凝血酶的速率的比較在沒有或存在遞增濃度的DS或肝素下首先檢測可溶性纖維蛋白單體(其制備如先前所述(15))對HCII所抑制凝血酶的速率的影響。在沒有或存在3.3μM肝素或DS，或4μM SF，或兩者同時存在時在準一級條件下檢測HCII抑制凝血酶的二級速率常數(shù)(K2)。在不同濃度的肝素或DS(0至11μM)、SF(0至4μM)、10mM GPRP-NH2及15mMTris-HCl(pH7.5)存在下，使凝血酶(10nM)在室溫下在含有0.6％PEG-8000的TBS中孵育5分鐘。將反應混合物(10μl)等分量加入到96孔圓底微量滴定板中并以2秒至5分鐘范圍內(nèi)的時間間隔將等體積的HCII(其濃度至少比凝血酶高10倍)加入到每個孔中。加入含10mg/ml聚凝胺的200μl TBS中的200μM顯色底物(tGRP-pNA)終止所有反應。在405nm下采用Spectra Max 340 Microplate Reader(微量滴定板讀出儀)(Molecular Divces，Menlo Park，CA)測定吸光度5分鐘而計算剩余凝血酶活性。將數(shù)據(jù)代入等式K1·t＝1n([P]0/[P]t)中，以測定凝血酶抑制的準一級速率常數(shù)(k1)，其中[P]0為起始凝血酶活性而[P]t為時間t時的凝血酶活性。然后以HCII濃度除K1確定其二級速率常數(shù)，k2(15)。如圖1(A圖)所示，在2或4μM濃度下，可溶性纖維蛋白(Fm)僅引起DS催化的HCII對凝血酶的抑制速率稍微下降3倍。相反，F(xiàn)m引起肝素催化的HCII對凝血酶的抑制速率呈劑量依賴性降低(B圖)。在1μM肝素和4μM Fm時，觀察到速率最大下降240倍，該數(shù)值與先前的報道一致(15)。
纖維蛋白單體對肝素及肝素酶衍生的級分通過抗凝血酶滅活凝血酶的速率的影響的比較采用類似的方法，比較在肝素或肝素酶衍生的8000Da的級分存在下纖維蛋白單體對抗凝血酶使凝血酶失活的速率的影響。如圖2所示，對于肝素，在4μM纖維蛋白單體存在下凝血酶失活速率降低約45倍。相反，對于肝素酶衍生的8000Da的級分，纖維蛋白單體僅使凝血酶失活速率降低10倍。
肝素、DS或肝素酶衍生的8000Da的級分對125I-FPR-凝血酶與纖維蛋白結合的影響此前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝素促進凝血酶與纖維蛋白的結合，無論肝素具有高還是低的AT親和力，該作用都發(fā)生，但僅當肝素鏈為11200Da或更高時發(fā)生(18)。在本研究中，比較了DS和肝素對凝血酶與纖維蛋白結合的促進能力。為完成該研究，按照所述(19)方法制備活性位點被阻斷的凝血酶(FPR-凝血酶)和125I-FPR-凝血酶。在沒有或存在肝素或DS下，在含有0.6％PEG-8000和0.01％吐溫-20的TBS中研究125I-FPR-凝血酶與纖維蛋白凝塊的結合。將纖維蛋白原(7.5μM)在總體積40μl的一系列微沉淀試管(目錄號72.702，Sarstedt Inc.，St.Laurent，PQ)中與濃度遞增的肝素或DS(0至2.5μM)一起孵育。通過加入10μl含10mM氯化鈣、500nM125I-FPR-凝血酶及10μM凝血酶的貯備液A啟動凝固。室溫下孵育45分鐘后，在15000xg下離心5分鐘使纖維蛋白沉淀，并取出等份上清液樣品進行γ記數(shù)。計算結合于纖維蛋白的凝血酶比例，作為結合的125I-FPR-凝血酶的變化與沒有糖胺聚糖的對照組比較。如圖3所示，DS對125I-FPR-凝血酶與纖維蛋白凝塊的結合沒有影響，即使在高達1μM的濃度下。相反，在高達250nM的濃度時，肝素以劑量依賴性方式促進125I-FPR-凝血酶與纖維蛋白凝塊的結合。當肝素濃度高于250nM時，與凝塊結合的125I-FPR-凝血酶減少，可能反映了肝素-纖維蛋白及肝素-凝血酶數(shù)量的顯著聚集。當用低分子量(LMW)肝素(伊諾肝素)滴定凝血酶和Fm-瓊脂糖時，與用DS所觀察到的相比，所發(fā)現(xiàn)的凝血酶的量僅有少量增加。關于伊諾肝素的發(fā)現(xiàn)并不意外，因為該肝素鏈太短而不能橋接凝血酶和纖維蛋白。
也對8000Da的肝素酶衍生的級分促進凝血酶與纖維蛋白結合的能力與肝素進行了比較。如圖4所示，肝素酶衍生的級分僅少量增加凝血酶的結合，而肝素則導致非常大的增加。這些發(fā)現(xiàn)表明類似于伊諾肝素，在肝素酶衍生的級分內(nèi)的鏈也太短而不足以橋接凝血酶和纖維蛋白。
通過HCII從Fm-瓊脂糖上置換IIa由于在DS存在下HCII對凝血酶抑制的催化作用不能被纖維蛋白修復，因此DS-HCII復合體必然能夠接近凝血酶上的外切位點I甚至通過該位點凝血酶結合于纖維蛋白。此發(fā)現(xiàn)提示DS-HCII復合體應當能夠從纖維蛋白上置換凝血酶。此項檢驗是監(jiān)測在有或無DS的存在下濃度遞增的HCII從Fm-瓊脂糖上置換125I-FPR-凝血酶的量(圖5)。在最高可達生理濃度的三倍時，單用HCII從Fm-瓊脂糖上置換凝血酶的效力有限。當存在2.5μM的DS時，發(fā)現(xiàn)凝血酶被劑量依賴性地置換。生理濃度的HCII達到最大置換，其半數(shù)最大作用是在約250nM HCII下。因此，在DS存在下，HCII的氨基端能夠有效地與纖維蛋白競爭結合凝血酶外切位點I。此發(fā)現(xiàn)表明DS/HCII復合體能夠從纖維蛋白上置換凝血酶，由此使其易于失活。
實施例4功效與失血研究兔動脈血栓形成預防模型采用兔動脈血栓形成預防模型(Green等，J.Lab Clin Med.127583-587，1996；Klement等，J.Lab Clin Med.132181-185，1998；Klement等，Blood.942735-2743)檢測本發(fā)明級分和組合物的功效和安全性。在該模型中，給兔注射被檢測的抗凝劑和少量125I纖維蛋白原。對照組動物給予生理鹽水以代替抗凝劑。五分鐘后，將遠端主動脈經(jīng)氣壓式內(nèi)皮剝離器，一種用于減少血流的狹窄術(結扎狹窄)，且主動脈壁被外部16號動脈夾壓迫損傷。在沒有抗凝劑時，創(chuàng)傷性血管壁損傷以及血流減少聯(lián)合導致迅速凝血。采用放置于狹窄處之遠端的超聲流量探針可以連續(xù)測量血流量而監(jiān)測凝血程度。該實驗在注射抗凝劑后持續(xù)共90分鐘。其主要功效終點是血管在所觀察的共90分鐘的時間內(nèi)保持開放的時間百分比。各種抗血栓形成藥的安全性可以在相同動物中采用耳出血模型測定，此包括在兔耳部作5個全厚度切口并且測定在所觀察的30分鐘的時間段內(nèi)的累積失血量。這表示兩種動物模型的合并(動脈血栓形成預防模型和耳出血模型)，以使所需動物數(shù)量減少50％。所設計的研究預防動脈血栓形成的這種模型，模擬了臨床疾病如不穩(wěn)定性心絞痛或頸動脈內(nèi)皮切除術后凝血。
肝素寡糖級分在兔動脈血栓形成預防模型中比較了肝素寡糖級分(此處稱作“V21”)和未分級分離的肝素、LMWH、水蛭素，或?qū)φ丈睇}水的功效及安全性。在建立動脈狹窄和損傷之前5分鐘給予被檢測化合物。藥效是測定90分鐘內(nèi)的血流(表示為開放期％)，同時采用兔耳出血模型測定安全性。在沒有抗凝劑(SAL)以及在高劑量肝素(UFH)下觀察到迅速凝血。V21和水蛭素(HIR)在保持血管開放方面遠比LMWH更加有效。如圖7所示，V21在與最低失血量相關劑量下產(chǎn)生100％的開放(底圖)，同時證明水蛭素在其藥效所需的劑量下有更大的出血傾向。
硫酸皮膚素寡糖級分在兔動脈血栓形成預防模型和耳出血模型中檢測硫酸皮膚素寡糖級分(此處稱之為“H2403”)的功效。共20只兔被分為4個組。以表6指定的1mg/ml至10mg/ml濃度的H2403對兔給藥。
H2403使開放期呈劑量依賴性地增加。對在2.5-10mg/kg之間的所有劑量的H2403均使開放期在76-96％之間，但在1mg/kg劑量下僅為14％。H2403-123在2.5-10mg/kg劑量之間時，首次阻塞的平均時間為44-54分鐘，但在1mg/kg的劑量下僅為1分鐘。
與這些發(fā)現(xiàn)一致，H2403在2.5-10mg/kg之間的劑量時，主動脈中的累計血流量為160-288ml/hr，但在1mg/kg劑量下則少于20ml/hr。從一只兔到另一只兔，其血流量和方式差異很大，因此標準差很大。然而，H2403劑量較低時，主動脈血流量的減少趨勢可以容易地見于個體兔變化軌跡以及平均的變化軌跡。這些數(shù)據(jù)支持H2403在2.5mg/kg及更高劑量下出現(xiàn)開放的一般性結論。
當H2403劑量從5mg/kg降低至2.5mg/kg時可見栓塞血管壁放射活性少量增加(從參照值的15％至19％)，但當H2403劑量降低到1mg/kg時則可見大幅度升高(達參照值的33％)。此數(shù)據(jù)也支持在該模型中2.5mg/kg及更高劑量的H2403顯著增加功效的一般性結論。
在相同兔中采用耳出血模型測定LMWDS的安全性。H2403給藥導致劑量依賴性的失血增加，而當劑量高于2.5mg/kg時發(fā)生失血顯著增加(80μl及以上)。開放及栓塞數(shù)據(jù)都提示LMWDS在劑量高于或等于2.5mg/kg時起效。
總之，基于開放、阻塞時間、累計血流量及放射標記的纖維蛋白原沉積量，通過所有參數(shù)的測定，在兔動脈血栓形成模型中H2403在2.5mg/kg及更高的劑量下顯示其功效。然而，在大于2.5mg/kg的劑量下發(fā)生失血顯著增加。
V21和H2403-123聯(lián)合使用(矩陣研究)V2I+LMWDS制劑的安全性和功效都在兔動脈血栓形成和預防模型中檢測。將100只雄性新西蘭兔分成各有5只兔的20個處理組(見表7)，并且每組在一次靜脈注射給予一個劑量的V-21/LMWDS制劑(劑量矩陣見表8)給藥后在90分鐘實驗的剩余時間里連續(xù)滴注重復劑量。
V21和LMWDS組分的劑量反應曲線與早先研究一致，而這些研究中的劑量范圍向下延伸。
V21的功效和安全性模式優(yōu)于LMWDS，并且在實驗劑量下，V21和LMWDS均使出血的劑量反應曲線壓低。
將LMWDS加入到V21中沒有顯著增加出血。
LMWDS對V21的加和或協(xié)同作用僅在其功效，而非出血。
同時檢測V21-LMWDS劑量組合下的凝塊重量、開放時間及失血量以尋找最佳組合。發(fā)現(xiàn)下列比例的V21∶LMWDS是有用的1∶1，4∶1及5∶1。對5∶1的組合的功效和失血量進行檢測。與單獨接受相同劑量的V21的兔相比，接受5∶1比例的V21∶LMWDS組合的兔中其功效更高(圖6A)，而失血沒有增加(圖6B)。
實施例5狒狒血栓形成模型進行一項狒狒研究以檢測V21、LMWDS、以及這些藥物組合的效益與風險模式。該狒狒模型涉及測定在滌綸(Dacron)血管移植物放置于動-靜脈旁路后的60分鐘的時間內(nèi)在移植物上的急性血栓形成(Hanson等，Arteriosclerosis 5595-603，1985)。
起初，所有動物都有一個手術安放于股動脈和靜脈之間的長期外置的聚硅酮橡膠旁路。這些旁路不產(chǎn)生可檢測的血小板激活作用。為評價血栓形成，將中心鋪有滌綸移植物(2cm×4.0mm內(nèi)徑)的實驗管段插入旁路系統(tǒng)并接觸血流1小時。其旁路管段為標準聚硅酮橡膠，內(nèi)徑為4.0mm，它為固有的非血栓形成性材料。通過放置于實驗段遠端的動脈夾使血流保持在100ml/min并且采用超聲流量計連續(xù)測量。以1mCi-111-銦-8-羥基喹啉標記狒狒自身血小板。平均標記效率＞90％。采用γ閃爍相機(General Electric 400T)連續(xù)測量累積的111-In-標記的血小板。以5分鐘的間隔儲存數(shù)據(jù)并采用連接于相機的計算機輔助的圖象處理系統(tǒng)進行分析。以沉積的血小板放射活性(每分鐘的計數(shù))除以全血111-In-血小板活性(每分鐘的計數(shù)/ml)并乘以循環(huán)血小板計數(shù)(血小板數(shù)/ml)計算血小板沉積總數(shù)。
如下測定與血液接觸60分鐘后所形成的全部血栓中的纖維蛋白含量。在啟動血栓形成前10分鐘，靜脈注射5μCi的125-I-標記的同源狒狒纖維蛋白原。與血液接觸1小時后，用等滲生理鹽水徹底漂洗血栓形成性滌綸移植物。由于111-In和125-I發(fā)射譜之間相重疊，在采用γ計數(shù)器對血栓的125-I放射活性計數(shù)之前至少需要30天以使111-In衰竭(半衰期＝2.8天)。然后將各實驗中測定的沉積125-I-放射活性(每分鐘的計數(shù))除以可凝固的纖維蛋白原放射活性(每分鐘的計數(shù)/ml)并且乘以循環(huán)纖維蛋白原濃度(mg/ml)計算出累積的纖維蛋白總量。
如Hanson等，Arteriosclerosis 5595-603，(1985)所述，通過直接測量出血時間來評價安全性。
在6只未處理動物中進行平行對照研究。如上所述評定滌綸移植物上形成的血栓，并在移植物臨放前，以及移植物放置1小時后測量凝血時間(APTT、PT)、Xa因子活性(Spectrozyme assay；AmericanDiagnostica)、以及出血時間(BT)。此外，取0.5ml檸檬酸化的狒狒血漿(在各時間點)以測定凝血酶時間。
V21及LMWDS的研究首先研究V21，起始總劑量為0.5mg/kg、1mg/kg及2mg/kg(其總劑量的50％一次性大劑量(bolus)給予而余下的連續(xù)輸液65分鐘給予)。大劑量給藥5分鐘后，放入滌綸移植物并對血小板進行圖象處理另外60分鐘，其后，撤去移植物并終止研究。
以相同的方式研究LMWDS，從2mg/kg、5mg/kg及10mg/kg劑量開始。在2mg/kg的劑量下，將總劑量的50％為一次性大劑量給予而余下的連續(xù)輸液65分鐘給予。隨后調(diào)整一次性大劑量給予和輸液給予的LMWDS的相對比例以達到穩(wěn)定狀態(tài)的凝血時間。因此，在兩只狒狒中5mg/kg劑量下的一次性大劑量給藥/輸液給藥量的比例為50％/50％和33％/67％。在10mg/kg劑量下，所述比例為20-25％的一次性大劑量給藥對75-80的輸液給藥，此種輸液在60分鐘的輸液時間內(nèi)產(chǎn)生恒定的APTT值。
隨后，以0.5mg/kg V21+0.5mg/kg LMWDS、1mg/kg V21+1mg/kgLMWDS、2mg/kg V21+5mg/kg LMWDS及2mg/kg V21+10mg/kgLMWDS的劑量聯(lián)合給予V21和LMWDS(其中50％的V21和20％的LMWDS的劑量為一次性大劑量注射給予，而剩余量則連續(xù)輸液65分鐘給藥)。這種給藥方案在60分鐘的輸液過程中產(chǎn)生幾乎恒定的APTT值。血小板血栓成像、出血時間及實驗室測定也如本文所述進行。
采用Student t-檢驗(雙尾)比較接觸血液60分鐘后(或在任何較早的時間點)測量的血小板血栓形成的結果。
結果V21對滌綸移植物血栓形成的作用見圖8所示。0.5mg/kg的低劑量的V21，不能使血小板沉積量降低到低于對照值，它在接觸血液60分鐘后平均為2.96±0.85×109個血小板。1mg/kg的中等劑量在60分鐘時使血小板沉積量降低24％，而2mg/kg的高劑量使血小板沉積量降低57％(圖8)。
V21使纖維蛋白以劑量依賴方式減少。在最高劑量下，總纖維蛋白的累積量減少59％(對照組為2.54±0.37mg，而2mg/kg處理組為1.05±0.52mg)。V21在2mg/kg劑量下還以劑量依賴性方式延長APTT至＞200秒。PT的測定大多未受影響。V21沒有使出血時間顯著增加，在2mg/kg的研究組中平均僅為5.1分鐘。應當注意的是在0.5mg/kg組中記錄到一只動物的出血時間為12分鐘；然而，根據(jù)該組及其它劑量組的其它發(fā)現(xiàn)考慮，該結果被認為是假象。
LMWDS對滌綸移植物血栓形成的作用見圖9所示。在2-10mg/kg范圍內(nèi)，血小板沉積量都沒有降低。類似地，LMWDS不能減少在滌綸移植物上的纖維蛋白形成，或延長出血時間。LMWDS使APTT凝血時間延長，在10mg/kg劑量下約為兩倍(平均值60分鐘內(nèi)的59.1秒，對Pre的28.7秒)，PT凝血時間不受影響。
圖10給出了V21和LMWDS聯(lián)合使用時，在滌綸移植物處血栓形成的結果。與2mg/kg V21聯(lián)合使用時，兩只狒狒被輸入10mg/kg的LMWDS而另一只狒狒接受了5mg/kg的LMWDS。在2mg/kgV21+(5-10mg/kg)LMWDS劑量下發(fā)現(xiàn)血小板沉積量顯著減少；然而，此作用可以與相同劑量下的V21單獨使用所產(chǎn)生的作用相比較(見圖8和10)。類似地，聯(lián)合治療所見的纖維蛋白沉積減少可以與V21單獨使用所產(chǎn)生的作用相比較。大部分出血時間不受影響。同時大部分PT值不受影響(在高劑量下PT延長2秒鐘)，APTT值平均＞500秒(而2mg/kg的V21單獨使用時平均為269秒)。
這些研究中所采用的狒狒模型是一種快速血流(它促進血小板的快速轉運及利用)與提供強烈起始刺激的較強的血栓形成表面(滌綸移植物)的組合。在這些條件下，纖維蛋白形成不是廣泛的且抗凝劑(例如，標準肝素、五糖、標準硫酸皮膚素)一般無效。但是，在這種模型中V21不減少動脈血小板并且在不延長出血時間下使纖維蛋白血栓形成減少＞50％。
表1
表2肝素寡糖級分與肝素及LMWH的特征比較
表3低分子量硫酸皮膚素(LMWDS)單獨使用或與8.0Kda肝素酶級分或伊諾肝素聯(lián)合使用在體外循環(huán)中的抗血栓形成活性LMWDS 肝素酶伊諾肝素 不能濾過纖維蛋白起始ACT時間 原消耗量μg/mlμg/mlμg/ml min ％ sec250 ----＞90 9 349220 ----＞90 15336200 ---- 65 82342100 1 --＞90 9 32080 1 --＞90 1331660 1 -- 70 8127350 2 --＞90 7 30850 1 -- 45 8529625 3 -- 85 6233925 2 -- 75 7228850 --3 80 85294表4LMWDS(50μg/ml)與2μg/ml的肝素酶、亞硝酸或高碘酸產(chǎn)生的級分或與2μg/ml伊諾肝素聯(lián)合使用在體外循環(huán)中的抗血栓形成活性制劑不能濾過 纖維蛋白原 起始時間 消耗量 ACTmin ％ secLMWDS和肝素酶8450＞9011.2292LMWDS和亞硝酸7700＞9016.6299LMWDS和高碘酸1010045 85.4256LMWDS和伊諾肝素 85 80.5260
表5伊諾肝素和肝素酶衍生的級分在體外循環(huán)中的抗血栓形成活性比較藥物 劑量不能濾過纖維蛋白原時間 消耗μg/ml min ％伊諾肝素 1025 822070 6530 ＞90 33肝素酶(8450Da) 10 ＞90 11表6處理組組別 H2403 H2403 動物數(shù)一次性大劑量靜注 靜脈輸液1 10mg/kg 10mg/kg 52 5mg/kg 5mg/kg53 2.5mg/kg 2.5mg/kg 54 1mg/kg 1mg/kg5
表7處理組
表8劑量矩陣
本發(fā)明之范圍不受本說明書描述的具體實施方案的限制，因為這些實施方案的目的是僅對本發(fā)明的某一方面作單一性的描述，而且所有功能等價的實施方案均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，本領域內(nèi)技術人員能夠從前文描述及附圖中弄清在本說明書所示及所述之外的對本發(fā)明進行的各種修飾。這些修飾將被包括在所附的權利要求的范圍內(nèi)。
本說明書所參考的所有出版物、專利及專利申請均以其全文通過參考結合到本文中，如同具體和單獨指定的每件獨立的出版物、專利或?qū)＠暾埦云淙耐ㄟ^參考結合到本文中一樣。本說明書引用的任何參考文獻均不表示所述參考文獻是可作為本發(fā)明的先有技術而加以利用的。
指出在用于本說明書以及所附的權利要求時，單數(shù)形式“一(a，an)”和“該(the)”包括相關的復數(shù)，除非上下文中另有清楚說明。
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權利要求
1.一種用作藥物的組合物，它包括(a)至少一種肝素寡糖級分和(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級分的組合。
2.權利要求1所要求的組合物，其中肝素寡糖級分包括衍生自肝素的寡糖混合物，其特征在于具有下列一、二、三、四、五、六，或七項或更多項特征(a)具有與抗凝血酶及肝素輔因子II(HCII)-相關的體外抗凝血活性；(b)所述寡糖由于太短而不能將凝血酶與纖維蛋白橋接，但具有足夠的長度使抗凝血酶或HCII與凝血酶橋接；(c)具有至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的含有一個或多個五糖序列的寡糖；(d)富含具有分子量范圍約6000至約12000，6000至11000，或6000至10000的寡糖；(e)所述寡糖具有約7000至10000，7500至9700，或8000至9000的峰分子量；(f)至少30％、35％、40％、45％、50％或55％的寡糖具有大于或等于6000道爾頓的分子量；(g)至少有20％、25％、30％、35％或40％，具有大于或等于8000道爾頓的分子量；(h)多分散性為1.1-1.8；和(i)具有類似的抗Xa因子和抗IIa因子活性。
3.權利要求2所要求的組合物，其中肝素寡糖級分具有特征(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(d)、(c)、(h)和(i)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(e)、(h)和(i)；(b)、(e)、(f)、(h)和(i)；(b)、(e)、(g)、(h)和(i)；或(a)至(i)。
4.權利要求2所要求的組合物，其中肝素寡糖級分具有一項或一項以上的下列特征(a)富含具有分子量范圍為6000至10000道爾頓，而均值為約8500的寡糖；(b)白色至黃白色的結晶固體；(c)在室溫下穩(wěn)定；及(d)多分散性為約1.2至1.5。
5.權利要求2、3或4所要求的組合物，其中硫酸皮膚素寡糖級分具有一項或一項以上的下列特征(a)硫含量為6.0％至10％(w/w)，優(yōu)選6.0％至8.0％(w/w)，更優(yōu)選6.5％至8％(w/w)；(b)硫酸根/羧基比例為1.2至2.5，優(yōu)選1.2至2.0，更優(yōu)選1.3至1.8，最優(yōu)選1.3-1.6；(c)焦硫酸化二糖含量為20％至60％(w/w)，優(yōu)選單硫酸化二糖含量為30％至60％(w/w)；(d)肝素輔因子II介導的抗凝血酶活性在20-60IU/mg，優(yōu)選30-60IU/mg范圍內(nèi)。
6.權利要求2、3或4所要求的組合物，其中硫酸皮膚素寡糖級分具有一項或一項以上的下列特征(a)富含具有分子量在5000至8000道爾頓范圍內(nèi)的寡糖；(b)白色至黃白色的結晶固體；(c)在室溫下穩(wěn)定；及(d)磺化大于6.2％重量。
7.權利要求2、3或4所要求的組合物，其中硫酸皮膚素寡糖級分包含具有90％或90％以上的分子量范圍在約1600至約20000道爾頓之間且峰分子量為約4500至約8000道爾頓的皮膚素聚合鏈的混合物。
8.權利要求1至7中任何一項所要求的組合物，其中(a)和(b)的量在預防或抑制凝血酶生成或活性方面有效產(chǎn)生協(xié)同作用。
9.權利要求1至8中任何一項所要求的組合物，其中肝素寡糖級分和硫酸皮膚素寡糖級分的劑量比每種級分預防或抑制患者凝血酶生成或活性的所需劑量低至少5至10倍。
10.一種藥用組合物，它含有協(xié)同作用有效量的在藥學上可接受的載體中的至少一種肝素寡糖級分和至少一種硫酸皮膚素寡糖級分的組合。
11.權利要求10所要求的藥用組合物，其中藥學上可接受的載體適合于提供協(xié)同作用有效量的所述級分以抑制或預防患者的凝血酶生成或活性。
12.一種預防或抑制患者凝血酶生成或活性的聯(lián)合治療，它包括給予患者有效量的(a)至少一種肝素寡糖級分；和(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級分。
13.權利要求12所要求的聯(lián)合治療，其中該方法提供協(xié)同作用。
14.權利要求12或13所要求的聯(lián)合治療，其中肝素寡糖級分和硫酸皮膚素寡糖級分是同時給予或分別給予。
15.權利要求12、13或14所要求的聯(lián)合治療，其中肝素寡糖級分包括衍生自肝素的寡糖混合物，其特征在于具有下列一、二、三、四、五、六，或七項或更多項特征(a)具有與抗凝血酶及肝素輔因子II(HCII)-相關的體外抗凝血活性；(b)所述寡糖由于太短而不能將凝血酶與纖維蛋白橋接，但具有足夠的長度使抗凝血酶或HCII與凝血酶橋接；(c)具有至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的含有一個或多個五糖序列的寡糖；(d)富含具有分子量范圍約6000至約12000，6000至11000，或6000至10000的寡糖；(e)所述寡糖具有約7000至10000，7500至9700，或8000至9000的峰分子量；(f)至少30％、35％、40％、45％、50％或55％的寡糖具有大于或等于6000道爾頓的分子量；(g)至少有20％、25％、30％、35％或40％，具有大于或等于8000道爾頓的分子量；(h)多分散性為1.1-1.8；和(i)具有類似的抗Xa因子和抗IIa因子活性。
16.權利要求15所要求的聯(lián)合治療，其中肝素寡糖級分具有特征(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(e)和(f)；(a)、(b)、(e)和(g)；(a)、(b)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)；(b)、(c)、(e)和(g)；(b)、(d)、(c)、(h)和(i)；(b)、(c)、(d)和(h)；(b)、(e)、(h)和(i)；(b)、(e)、(f)、(h)和(i)；(b)、(e)、(g)、(h)和(i)；或(a)至(i)。
17.權利要求12至16之任何一項所要求的聯(lián)合治療，其中硫酸皮膚素寡糖級分具有下列一項或一項以上的特征(a)硫含量為6.0％至10％(w/w)，優(yōu)選6.0％至8.0％(w/w)，更優(yōu)選6.5％至8％(w/w)；(b)硫酸根/羧基比例為1.2至2.5，優(yōu)選1.2至2.0，更優(yōu)選1.3至1.8，最優(yōu)選1.3-1.6；(c)焦硫酸化二糖含量為20％至60％(w/w)，優(yōu)選單硫酸化二糖含量為30％至60％(w/w)；(d)抗凝血酶活性在20-60IU/mg，優(yōu)選30-60IU/mg范圍內(nèi)。
18.權利要求12至16中任何一項所要求的聯(lián)合治療，其中硫酸皮膚素寡糖級分包含具有90％或90％以上的分子量范圍在約1600至約20000道爾頓之間且峰分子量為約4500至約8000道爾頓的皮膚素聚合鏈的混合物。
19.一種在患者中抑制或預防凝血酶生成或活性的方法，它包括對有這種需要的患者聯(lián)合給予協(xié)同作用有效量的至少一種肝素寡糖級分和至少一種硫酸皮膚素寡糖級分。
20.上述權利要求中任何一項所要求的組合物或聯(lián)合治療在預防和/或緩解與過量凝血酶生成或活性有關的疾病嚴重性、疾病癥狀和/或疾病復發(fā)周期中的用途。
21.包括(a)至少一種肝素寡糖級分及(b)至少一種硫酸皮膚素寡糖級分的組合的組合物在用于預防或抑制凝血酶生成或活性的藥物制備中的用途。
22.協(xié)同作用有效量的至少一種肝素寡糖級分及至少一種硫酸皮膚素寡糖級分在用于抑制或預防患者凝血酶生成或活性的藥用組合物的制備中的用途。
23.一種藥劑盒形式的上述權利要求中任何一項所要求的組合物。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及預防或抑制凝血酶生成或活性的組合物和方法。
文檔編號A61P7/02GK1473061SQ01818447
公開日2004年2月4日 申請日期2001年9月7日 優(yōu)先權日2000年9月8日
發(fā)明者J·希爾斯, K·約翰森, J·I·維茨, J 希爾斯, 維茨, 采 申請人:漢密爾頓市醫(yī)院研究發(fā)展有限公司, 利奧藥品股份有限公司