專利名稱：犬埃里希體的同源28kD免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)基因及其用途的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明更具體涉及犬埃里希體中同源28-kDa蛋白質(zhì)基因的分子克隆和特征確定，以及編碼犬埃里希體該28kDa同源蛋白質(zhì)的多基因基因座及其用途。
相關(guān)領(lǐng)域的描述犬埃里希體病也稱作犬熱帶全血細(xì)胞減少癥，是一種犬扁虱攜帶的立克次氏體疾病，首次于1935年在非洲和1963年在美國發(fā)現(xiàn)(Donatien和Lestoquard，1935；Ewing，1963)。該疾病在越戰(zhàn)期間，美國軍犬中流行性爆發(fā)后被更好的認(rèn)識(Walker等，1970)。
犬埃里希體病的病因是犬埃里希體，一種小革蘭氏陰性專性胞內(nèi)細(xì)菌，顯示對單核吞噬細(xì)胞的嗜性(Nyindo等，1971)，并由棕色犬虱(Rhipicephalussanguineus)傳播(Groves等，1975)。犬埃里希體病的進(jìn)展有三個階段急性、亞臨床和慢性。急性階段的特征是發(fā)熱、食欲減退、抑郁、淋巴結(jié)病和中度血小板減少(Troy和Forrester，1990)。犬通常從急性期恢復(fù)，但是變成在幾個月或甚至幾年中成為該病菌的持續(xù)傳染攜帶者，而沒有臨床癥狀(Harrus等，1998)。某些犬進(jìn)入慢性階段，特征是血小板減少、高球蛋白血癥、食欲減退、消瘦和出血，特別是鼻出血，然后死亡(Troy和Forrester，1990)。
表面抗原性的調(diào)節(jié)可能是在宿主中建立這種持續(xù)感染的重要機(jī)制。雖然對該病的發(fā)病機(jī)制了解得很少，但在相關(guān)的埃里希體屬、無形體屬、考德里體屬的成員中所述的多基因家族可能涉及主要表面抗原表達(dá)的改變，從而逃脫免疫監(jiān)視。著邊無形體(Anaplasma marginale)，一種與犬埃里希體密切相關(guān)的生物，顯示了主要表面蛋白3(msp-3)基因的改變，導(dǎo)致菌株之間的抗原多態(tài)性(Alleman等，1997)。
基于16SrRNA基因的分子分類學(xué)分析，確定了犬埃里希體和恰菲埃里希體(人單核細(xì)胞埃里希體病(HME)的病因)是密切相關(guān)的(Anderson等，1991；Anderson等，1992；Dawson等，1991；Chen等，1994)。報道了犬埃里希體和恰菲埃里希體的64、47、40、30、29和23kDa抗原之間可觀的交叉反應(yīng)性(Chen等，1994；Chen等，1997；Rikihisa等，1994；Rikihisa等，1992)。用人和犬恢復(fù)期血清作免疫印跡分析免疫反應(yīng)性抗原，鑒定出許多犬埃里希體的免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)，包括30kDa蛋白(Chen等，1997)。另外，已描述犬埃里希體的30kDa蛋白質(zhì)是免疫應(yīng)答早期識別的主要免疫優(yōu)勢抗原，它與恰菲埃里希體的30kDa蛋白質(zhì)是不同的抗原(Rikihisa等，1992；Rikihisa等，1994)。犬埃里希體的其它分子量在20-30kDa之間的免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)也已被鑒定(Brouqui等，1992；Nyindo等，1991；Chen等，1994；Chen等，1997)。
已在相關(guān)生物，包括恰菲埃里希體和反芻類考德里氏體(Cowdria ruminantium)中報道了多基因家族編碼的同源28-32kDa免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)(Sulsona等，1999；Ohashi等，1998a；Reddy等，1998)。近來，描述了恰菲埃里希體中編碼23-28kDa蛋白質(zhì)的21個成員的多基因家族(Yu等，2000)。恰菲埃里希體28kDa外膜蛋白質(zhì)是表面暴露的，含有三個主要超變區(qū)(Oashi等，1998a)。重組恰菲埃里希體P28似乎在小鼠中提供了抵抗同源攻擊感染的保護(hù)，針對重組蛋白產(chǎn)生的抗血清與犬埃里希體的30kDa蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)(Ohashi等，1998a)。報道了恰菲埃里希體分離物中p28基因中的多樣性(Yu等，1999a)，用單克隆抗體的研究進(jìn)一步證明了表達(dá)的P28蛋白質(zhì)中的多樣性(Yu等，1993)。相反，報道了犬埃里希體地理學(xué)不同的分離物中p28基因完全保守，提示犬埃里希體在北美洲中可能是保守的(McBride等，1999，2000)。
現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于不能克隆和確定犬埃里希體的新的同源性28kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)基因，和含有同源28kDa蛋白質(zhì)基因的單個多基因基因座的特征。另外，現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于缺乏犬埃里希體免疫反應(yīng)性基因的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明填補(bǔ)了本領(lǐng)域這一長期存在的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一些實(shí)施例描述了犬埃里希體同源成熟28kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)基因(稱為p28-1、-2、-3、-5、-6、-7、-9)的分子克隆、測序、特征確定和表達(dá)，以及對含有9種犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因(p28-1到-9)的一個基因座的鑒定(10677bp)。p28基因中的8種位于一條DNA鏈上，一種p28基因在互補(bǔ)鏈上。9種p28基因成員中的核酸同源性是37-75％，氨基酸同源性是28-72％。
在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，提供了編碼犬埃里希體30kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的DNA序列。優(yōu)選蛋白質(zhì)具有選自SEQ ID NO2、4、6、40、42、44、46的氨基酸序列，基因具有選自SEQ ID NO1、3、5、39、41、43、45的核酸序列，是多態(tài)性多基因家族的成員。通常蛋白質(zhì)具有N-末端信號肽，它在翻譯后加工中被切下，產(chǎn)生成熟28-kDa蛋白質(zhì)。另外，編碼28kDa蛋白質(zhì)的基因優(yōu)選包含在一個多基因座中，它的大小是10,677bp，編碼9種犬埃里希體的同源28kDa蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，提供了一種表達(dá)載體，它含有編碼犬埃里希體28-kDa免疫反應(yīng)性的基因，并能在引入細(xì)胞時表達(dá)該基因。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，提供了一種重組蛋白質(zhì)，它具有選自SEQ IDNO2、4、6、40、42、44、46的氨基酸序列。優(yōu)選該氨基酸序列是由選自SEQ ID NO1、3、5、39、41、43、45的核酸序列編碼的。優(yōu)選該重組蛋白質(zhì)含有4個可變區(qū)，它們可以是暴露于表面、親水和具有抗原性。重組蛋白質(zhì)可用作抗原。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，提供了一種產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括步驟獲得一種載體，它含有一個表達(dá)區(qū)，其中含有與啟動子可操縱性連接的、編碼選自SEQ ID NO2、4、6、40、42、44、46的氨基酸序列的序列；將該載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞；在有效表達(dá)該表達(dá)區(qū)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
還在一些實(shí)施例中描述了本發(fā)明，作為在個體中抑制犬埃里希體感染的方法，包括步驟在接觸前或懷疑已接觸，或已感染犬埃里希體時鑒定個體；和以抑制犬埃里希體感染有效量施用含有犬埃里希體28kDa抗原的組合物。抑制可通過任何方式，例如刺激個體的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，或通過其它方法，例如抑制28kDa抗原的正常功能，或甚至與抗原競爭與個體體內(nèi)的一些因子相互作用發(fā)生。
可從下文為了公開而提供的本發(fā)明優(yōu)選例的描述中，更加清楚的了解本發(fā)明的其它方面、特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡述因此，將獲得并詳細(xì)理解本發(fā)明上述特征、優(yōu)點(diǎn)和目的中的內(nèi)容，以及其它將變得清楚的內(nèi)容，更具體的、對本發(fā)明上面簡述的內(nèi)容將參考某些在附圖中說明的實(shí)施例。這些圖是說明書的一部分。然而要注意的是，


了本發(fā)明的優(yōu)選例，因此不應(yīng)認(rèn)為是對其范圍的限制。
圖1顯示了p28-7基因，包括鄰近的5’和3’非編碼序列的核酸序列(SEQ IDNO1)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。ATG起始密碼子和TAA終止子用黑體標(biāo)示，23氨基酸前導(dǎo)信號序列下劃線標(biāo)示。
圖2顯示了表達(dá)的50kDa重組p28-7硫氧還蛋白融合蛋白質(zhì)(泳道1，箭頭)和16kDa硫氧還蛋白對照(泳道2，箭頭)的SDS-PAGE，和重組p28-7-硫氧還蛋白融合蛋白用恢復(fù)期犬埃里希體犬抗血清的對應(yīng)免疫印跡(泳道3)。犬埃里希體抗血清未檢測到硫氧還蛋白對照(未顯示)。
圖3顯示了p28-7蛋白質(zhì)(ECa28-1，SEQ ID NO2)、p28-5蛋白質(zhì)(ECa28SA2，部分序列，SEQ ID NO7)、p28-4蛋白質(zhì)(ECa28SA1，SEQ ID NO8)、恰菲埃里希體P28(SEQ ID NO9)、恰菲埃里希體OMP-1家族(SEQ ID NO10-14)和反芻類考德里氏體(C.ruminantium)MAP-1蛋白質(zhì)(SEQ ID NO15)的氨基酸序列的排列對比。p28-7氨基酸序列作為共有序列。未顯示的氨基酸與p28-7相同，用點(diǎn)表示。用對應(yīng)的一字母縮寫顯示分歧的氨基酸。為了氨基酸序列的最大排列引入的缺口用長劃線標(biāo)出。可變區(qū)用下劃線標(biāo)出并命名為(VR1、VR2、VR3和VR4)。箭頭表示信號肽的推測的信號肽酶切割位點(diǎn)。
圖4顯示了用非平衡樹構(gòu)建從推測的氨基酸序列得到的犬埃里希體p28-7(Eca28-1)、p28-5(ECa28SA2，部分序列)、p28-4(ECa28SA1)，恰菲埃里希體omp-1多基因家族的成員，和反芻類考德里氏體map-1蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)相關(guān)性。每對分枝的長度代表配對氨基酸序列之間的距離。比例尺測定序列之間的距離。
圖5顯示了用6種不同的限制性酶完全消化犬埃里希體基因組DNA，并與p28-7DIG標(biāo)記的探針雜交的Southern印跡分析(泳道2-7)；DIG標(biāo)記的分子量標(biāo)記(泳道1和8)。
圖6顯示了犬埃里希體p28-7的預(yù)測的蛋白質(zhì)特征(ECa28-1，Jake株)和恰菲埃里希體P28(Arkansas株)的比較。用6肽窗口，表面可能性預(yù)測了表面殘基。表面殘基是任何具有2.0nm2以上的水可接觸表面積的殘基。預(yù)測值高于1的六肽被視為表面區(qū)?？乖灾笖?shù)預(yù)測可能的抗原決定簇。指數(shù)值大于0的區(qū)域是可能的抗原決定簇。T-細(xì)胞基序用5個氨基酸的基序(殘基1-甘氨酸或極性氨基酸，殘基2-疏水氨基酸，殘基3-疏水氨基酸，殘基4-疏水氨基酸或脯氨酸，和殘基5-極性或甘氨酸)，確定了可能的T-細(xì)胞抗原決定簇的位置。比例尺表示氨基酸位置。
圖7顯示了犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因p28-5(核苷酸1-849SEQ ID NO3；氨基酸序列SEQ ID NO4)和p28-6(核苷酸1195-2031SEQ ID NO5；氨基酸序列SEQ ID NO6)，包括基因間非編碼序列(NC2，核苷酸850-1194SEQ ID NO31)的核酸序列和推測的氨基酸序列。ATG起始密碼子和TAA終止子用黑體標(biāo)示。
圖8顯示了犬埃里希體28kDa蛋白基因的基因座(5.592Kb，含有5個基因)示意圖，表明基因組的朝向和基因間非編碼區(qū)域(28NC1-4)。基因座1和2(陰影)顯示的28kDa蛋白質(zhì)已被描述過(McBride等，1999；Reddy等，1998；Ohashi等，1998)。p28-5的完整序列和新的28kDa蛋白質(zhì)基因(稱為p28-6)已測定了序列。完成了p28-5、p28-6和p28-7之間非編碼基因間區(qū)(28NC2-3)與先前未連接的基因座1和2的連接。
圖9顯示采用非平衡樹構(gòu)建法根據(jù)氨基酸序列得到的犬埃里希體p28-4(Eca28SA1)、p28-5(ECa28SA2)、p28-6(ECa28SA3)，p28-7(ECa28-1)和p28-8(ECa28-2)的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)相關(guān)性。每對分枝的長度代表配對氨基酸序列之間的距離。比例尺測定序列之間的距離。
圖10顯示了犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因基因間非編碼核酸序列(SEQ IDNO30-33)的排列對比。用點(diǎn)(.)表示的未顯示的核酸與非編碼區(qū)1(28NC1)相同。用對應(yīng)的一字母縮寫顯示分歧的氨基酸。為了氨基酸序列的最大排列對比，引入的缺口用長劃線(-)標(biāo)出。推測的轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)(-10和-35)以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)加框標(biāo)示。
圖11顯示了9種犬埃里希體基因p28基因座(10,677bp)的示意性圖，表明基因組朝向和基因間非編碼區(qū)域。實(shí)施例8中鑒定了p28基因(p28-1、2、3、9)(沒有陰影)。先前鑒定了陰影標(biāo)示的p28基因，并命名如下p28-4，p30a(Ohashi等，1998b)和ORF1(Reddy等，1998)；p28-5和p28-6(McBride等，2000)；p28-7、p28(McBride等，1999)和p30(Ohashi等，1998b)；和p28-8、p30-1(Ohashi等，1998b)。
圖12顯示了犬埃里希體P28-1到P28-9根據(jù)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。每對分枝的長度代表配對氨基酸之間的距離。比例尺測定序列之間的分歧百分?jǐn)?shù)。
圖13顯示了犬埃里希體p28-1基因的核酸序列(SEQ ID NO39)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO40)。
圖14顯示了犬埃里希體p28-2基因的核酸序列(SEQ ID NO41)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO42)。
圖1 5顯示了犬埃里希體p28-3基因的核酸序列(SEQ ID NO43)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO44)。
圖16顯示了犬埃里希體p28-9基因的核酸序列(SEQ ID NO45)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO46)。
發(fā)明詳述本發(fā)明描述了編碼犬埃里希體30-kDa蛋白質(zhì)的同源性基因的克隆、測序和表達(dá)。還進(jìn)行了7種犬埃里希體分離物和恰菲埃里希體omp-1多基因家族中的同源性基因的比較性分子分析。如下鑒定了幾種新的28-kDa蛋白質(zhì)基因p28-7(ECa28-1)具有一個834bp的開放閱讀框，編碼具有30.5kDa的預(yù)測分子量的278個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。鑒定出一個N-末端信號序列，提示蛋白質(zhì)經(jīng)過翻譯后修飾變成27.7kDa的成熟蛋白質(zhì)。
P28-6(ECa28SA3)具有840bp的開放閱讀框，編碼280氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ IDNO6)。
用PCR擴(kuò)增犬埃里希體的28kDa蛋白質(zhì)基因，得到先前未曾測序的p28-5(Eca28SA2)區(qū)域。p28-5的序列分析揭示有一個編碼283個氨基酸蛋白質(zhì)(SEQ IDNO4)的849bp的開放閱讀框。
采用對28kDa蛋白質(zhì)基因的基因間非編碼區(qū)特異性的引物作PCR擴(kuò)增，對連接先前分離的基因座的區(qū)域測序，從而鑒定了一個含有5種28kDa蛋白質(zhì)基因(p28-4、-5、-6、-7和-8)的基因座(5.592-kb)。預(yù)測該5種28kDa蛋白質(zhì)具有信號肽，可得到成熟蛋白質(zhì)，并且具有51-72％氨基酸同源性。分析了基因間區(qū)，揭示各基因的假設(shè)啟動子區(qū)，提示這些基因可獨(dú)立表達(dá)和差異性表達(dá)?；蜷g非編碼區(qū)(28NC1-4)的大小是299-355bp，具有48-71％的同源性。
另外，對串聯(lián)排列的p28基因上述5個基因的基因座的DNA上游和下游先前未知區(qū)域進(jìn)行了測序，鑒定到p28-1、-2、-3和-9。因此，本發(fā)明鑒定到了橫跨10,677bp的9基因犬埃里希體p28基因座。
本發(fā)明特別針對犬埃里希體的同源28kDa蛋白質(zhì)基因p28-1、-2、-3、-6、-7和p28-9，和先前部分測序的p28-5的完整序列。還公開了編碼犬埃里希體的9種同源28kDa外膜蛋白的多基因基因座。8種p28基因位于一條DNA鏈上，在互補(bǔ)鏈上發(fā)現(xiàn)了一個p28基因。9個p28基因成員之間的核酸同源性是37-75％，氨基酸同源性范圍是28-72％。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域能力范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的解釋，見例如Maniatis，F(xiàn)ritsch &Sambrook，＂Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)；＂DNA CloningAPractical Approach，＂卷I和II(D.N.Glover ed.1985)；＂Oligonucleotide Synthesis＂(M.J.Gait ed.1984)；＂Nucleic Acid Hybridization＂[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]；＂Transcription and Translation＂[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)]；＂Animal Cell Culture＂[R.I.Freshney，ed.(1986)]；＂Immobilized Cells And Enzymes＂[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，＂A Practical Guide To Molecular Cloning＂(1984)。
本發(fā)明包括基本純的DNA，它編碼犬埃里希體的28kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。本發(fā)明的DNA編碼的蛋白質(zhì)可以與SEQ IDNO2、4、6、40、42、44或46中列出的氨基酸具有至少80％(優(yōu)選85％，更優(yōu)選90％，和最優(yōu)選95％)的序列相同性。更優(yōu)選的，該DNA包括SEQ IDNO1、3、5、39、41、43、45的核苷酸編碼序列，或這些序列的簡并變體。
本領(lǐng)域熟知蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由編碼該蛋白質(zhì)的DNA的核苷酸序列確定的。由于遺傳密碼的簡并性(即對于大多數(shù)氨基酸而言，一種氨基酸有一種以上的核苷酸三聯(lián)體(密碼子))，不同的核苷酸序列可以編碼特定的氨基酸或多肽。因此，本發(fā)明的多核苷酸序列還包含那些編碼本發(fā)明多肽或其片段或變體的簡并序列。
本發(fā)明還包括基本純的DNA，它含有SEQ ID NO1、3、5、39、41、43或45所列出的核苷酸區(qū)域的至少15個連續(xù)核苷酸(優(yōu)選20，更優(yōu)選30，甚至更優(yōu)選50和最優(yōu)選全部)序列。
“基本純的DNA”指通過將DNA的一些或全部分子從其天然存在的微環(huán)境中分離出來，或通過改變本發(fā)明DNA的側(cè)接序列，而分離出來(部分或完全純化)的DNA。因此該術(shù)語包括例如摻入載體、自主復(fù)制質(zhì)?；虿《尽⒒蛟思?xì)胞或整合細(xì)胞的基因組DNA的重組DNA；或獨(dú)立于其它序列作為單個分子存在的DNA(例如cDNA或基因組或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA片段)。還包括重組DNA，它是編碼其它多肽序列，例如融合蛋白的雜交基因的一部分。本發(fā)明還包括重組DNA，它包括編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的SEQ ID NO1、3、5、39、41、43或45中列出的核苷酸的一部分。
DNA應(yīng)該與SEQ ID NO1、3、5、39、41、43或45中列出的核苷酸的編碼序列具有至少約70％，優(yōu)選至少75％(例如至少80％)，最優(yōu)選至少90％的序列相同性。兩條序列之間的相同性是匹配或相同位置數(shù)目的直接函數(shù)。當(dāng)兩條序列中都有的亞基位置被同一個單體亞基占據(jù)，例如如果兩條DNA分子中的給定的位置都被腺嘌呤占據(jù)，那么它們在該位置是相同的。例如，如果長10個核苷酸的序列中有7個位置與第二條10個核苷酸的序列中相應(yīng)的位置相同，呢這么兩條序列具有70％的序列相同性。比較序列長度通常至少是50個核苷酸，優(yōu)選至少60個核苷酸，更優(yōu)選至少75個核苷酸，最優(yōu)選100個核苷酸。通常用序列分析軟件(例如遺傳學(xué)計算機(jī)小組的序列分析軟件包，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，1710University Avenue，Madison，WI 53705)測定序列相同性。
本發(fā)明還包括含有編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白基因的DNA序列的載體，所述載體能在宿主中復(fù)制，含有可操縱性連接的a)復(fù)制起始點(diǎn)；b)啟動子；和c)編碼所述蛋白質(zhì)的DNA序列。優(yōu)選本發(fā)明的載體含有SEQ ID NO1、3、5、39、41、43或45所示的DNA序列的一部分。
“載體”可定義為可復(fù)制核酸構(gòu)建物，例如質(zhì)?；虿《竞怂帷］d體可以用于擴(kuò)增和/或表達(dá)編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的核酸。表達(dá)載體是一種可復(fù)制構(gòu)建物，其中編碼多肽的核酸序列與能影響多肽在細(xì)胞中的表達(dá)的合適控制序列可操縱性連接。對控制序列的需要可根據(jù)所選的細(xì)胞和所選的轉(zhuǎn)化方法而變。通常控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動子和/或增強(qiáng)子、合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)、和控制轉(zhuǎn)錄終止和翻譯的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建含有合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。見例如Sambrook等，1989，Molecular CloningALaboratory Manual(2nd Ed.)，Cold Spring Harbor Press，N.Y.中描述的技術(shù)。如果轉(zhuǎn)錄控制序列有效控制基因的轉(zhuǎn)錄，基因及其轉(zhuǎn)錄控制序列定義為“可操縱性連接”。本發(fā)明的載體包括但不限于質(zhì)粒載體和病毒載體。優(yōu)選本發(fā)明的病毒載體是衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、SV40病毒或皰疹病毒。
一般含有促進(jìn)插入的DNA片段有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的表達(dá)載體與宿主聯(lián)用。本文所用的術(shù)語“宿主”意味著不僅包括原核細(xì)胞，還包括真核細(xì)胞，例如酵母、植物和動物細(xì)胞。編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的重組DNA分子或基因可使用任何本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的技術(shù)轉(zhuǎn)化宿主。尤其優(yōu)選的是用含有編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的基因編碼序列的載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞。
原核細(xì)胞宿主可以包括大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(S.tymphimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母，例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的方法發(fā)酵并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，以實(shí)現(xiàn)最佳細(xì)胞生長。
本文所用的術(shù)語“工程改造的”或“重組”的細(xì)胞是指一種引入了編碼犬埃里希體抗原的重組基因的細(xì)胞。因此，工程改造的細(xì)胞與不含有重組引入的基因的天然存在的細(xì)胞不同。工程改造的細(xì)胞是具有人工引入的一種或多種基因的細(xì)胞。重組引入的基因可以是cDNA基因、基因組基因拷貝形式，或包含的基因鄰接一啟動子，但不是天然與該引入基因相連。另外，重組基因可以整合入宿主基因組，或可以包含在載體、或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞的細(xì)菌基因組中。
本發(fā)明還針對基本純的犬埃里希體28-30kDa免疫反應(yīng)性蛋白，它含有SEQ IDNO2、4、6、40、42、44或46列出的氨基酸序列。
“基本純的蛋白質(zhì)”意味著從與其天然相伴隨的至少一部分成分分開的蛋白質(zhì)。通常當(dāng)某蛋白質(zhì)至少60％重量沒有其它體內(nèi)天然相伴的蛋白質(zhì)和其它天然存在的有機(jī)分子時，蛋白質(zhì)是基本純的。優(yōu)選蛋白質(zhì)制品的純度至少75％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少99％重量?？赏ㄟ^例如，從天然來源提??；表達(dá)編碼犬埃里希體的28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的重組核酸；或化學(xué)合成該蛋白質(zhì)來獲得犬埃里希體的基本純的28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^任何合適的方法，例如使用對犬埃里希體的28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的特異性抗體進(jìn)行免疫親和層析等柱層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳，或HPLC分析方法測定純度。當(dāng)將蛋白質(zhì)從其天然狀態(tài)伴隨的至少一些污染物中分離出來時，該蛋白質(zhì)基本沒有天然伴隨成分。因此，化學(xué)合成的或在不同于天然起源細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，定義為基本無天然伴隨成分。因此，基本純的蛋白質(zhì)包括大腸桿菌、其它原核細(xì)胞或天然不存在的其它生物中合成的真核蛋白質(zhì)。
除了基本上全長的蛋白質(zhì)，本發(fā)明還包括犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的片段(例如抗原片段)(SEQ ID NO2、4、6、40、42、44或46)。本文所用的術(shù)語“片段”用于指一般長度至少10個殘基，更通常至少20個殘基，優(yōu)選至少30(例如50)個殘基，但比全長完整序列短的多肽。犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的片段可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生，例如通過酶消化天然存在的或重組的犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白，或通過化學(xué)合成。可通過本文所述的方法評估候選片段顯示犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的特征的能力(例如，與犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白特異性抗體結(jié)合)。
可用純化的犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白或犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的抗原性片段產(chǎn)生新的抗體，或通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測試現(xiàn)有抗體(例如作為診斷試驗(yàn)中的陽性對照)。
如本領(lǐng)域熟知的那樣，某給定的多肽其免疫原性可改變。因此常需將免疫原(例如本發(fā)明的多肽)與載體偶聯(lián)。示范性和優(yōu)選載體是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和人血清清蛋白。偶聯(lián)多肽和載體蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括戊二醛、間馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯、碳二亞胺和雙固氮二氨基聯(lián)苯胺法。還知道可通過本領(lǐng)域熟知的遺傳工程技術(shù)將肽偶聯(lián)于蛋白質(zhì)。
本領(lǐng)域還已知可使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激劑(稱為佐劑)來增強(qiáng)特定免疫原的免疫原性。示范性和優(yōu)選的佐劑包括完全BCG、Detox，(RIBI，ImmunochemResearch Inc.)ISCOMS和氫氧化鋁佐劑(Superphos，Biosector)。
本發(fā)明包括用犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白或犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的片段作為免疫原，在例如家兔中產(chǎn)生多克隆抗血清。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單克隆和多克隆抗體產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)方法?？珊Y選該方法產(chǎn)生的單克隆抗體是否具有鑒定重組犬埃里希體cDNA克隆，和將其與已知cDNA克隆區(qū)分開來的能力。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括免疫活性抗體片段，例如Fab或(Fab)2片段；工程改造產(chǎn)生的單鏈Fv分子；或嵌合分子，例如含有一種抗體(如小鼠抗體)的結(jié)合特異性，和另一種抗體(例如人抗體)的剩余部分的嵌合抗體。
在一個實(shí)施例中，抗體或其片段可以與毒素或可檢測標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記、非放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、順磁標(biāo)記、酶標(biāo)記或產(chǎn)色標(biāo)記連接。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)了解這些和其它適用于本發(fā)明的標(biāo)記。這些標(biāo)記與抗體或其片段的結(jié)合可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來完成。
還考慮了可用本發(fā)明的新穎蛋白質(zhì)制備藥物組合物。該藥物組合物含有本發(fā)明的新穎活性組合物和藥物學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員無須過多實(shí)驗(yàn)不難確定施用本發(fā)明活性成分的合適劑量和給藥途徑。
詞組“藥物學(xué)上可接受的”指當(dāng)給予個體時，不會產(chǎn)生過敏或類似不良反應(yīng)的分子或組合物。含有作為活性成分的蛋白質(zhì)的水相組合物的制備是本領(lǐng)域熟知的。通常，將這些組合物制備成可注射的溶液或懸液；也可制備成可在注射前溶解或懸浮于液體中的固態(tài)形式。還可乳化該制備物。
可將蛋白以中性或鹽形式配制在組合物中。藥物學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(由蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，和與無機(jī)酸，如鹽酸或磷酸，或乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等有機(jī)酸形成的鹽。還可與無機(jī)堿，如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物，和有機(jī)堿，如異丙基胺、三甲基胺、組氨酸、普魯卡因等衍生的游離羧基形成鹽。
配制后，以與劑量配方兼容的方式，和治療有效量施用這些溶液。不難以各種劑型，如可注射溶液施用這些制劑。
對于水溶液腸胃道外施藥，如需要可適當(dāng)緩沖該溶液，首先用足夠的鹽水或葡萄糖將稀釋液變成等滲。這些具體水溶液特別適合靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。就此而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)本文公開內(nèi)容將了解可使用無菌水溶液。例如，可將一劑量溶于1毫升等滲NaCl溶液中，或加到1000毫升作皮下灌注液或注射到預(yù)定輸液部位(見例如“Remington藥物科學(xué)”15版，1035-1038頁和1570-1580)。根據(jù)待治療個體的情況，須對劑量作某些改動。負(fù)責(zé)給藥的人員在任何情況下都將能確定各個患者的合適劑量。
在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，提供了編碼犬埃里希體30kDa免疫反應(yīng)性蛋白的DNA序列。優(yōu)選該蛋白質(zhì)具有選自SEQ ID NO2、4、6、40、42、44、46的氨基酸序列，基因具有選自SEQ ID NO1、3、5、39、41、43、45的核酸序列，是多態(tài)性多基因家族的成員。更優(yōu)選的，該蛋白質(zhì)具有N-末端信號序列，它在翻譯后加工后切斷，產(chǎn)生成熟的28kDa蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是編碼28kDa蛋白質(zhì)的DNA包含在一個多基因基因座中，它的大小是10,677bp，編碼9個犬埃里希體的同源28kDa蛋白。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，提供了一種表達(dá)載體，它含有編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的基因，當(dāng)引入細(xì)胞時該載體能表達(dá)該基因。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，提供了一種重組蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有選自SEQID NO2、4、6、40、42、44、46的氨基酸序列。優(yōu)選氨基酸序列是由選自SEQ IDNO1、3、5、39、41、3、45的核酸序列所編碼。更優(yōu)選該重組蛋白質(zhì)含有4個表面暴露的、親水和抗原性可變區(qū)。仍然優(yōu)選的是該重組蛋白是一種抗原。
本發(fā)明的另一個實(shí)施例提供了一種產(chǎn)生該重組蛋白的方法，包括以下步驟獲得含有表達(dá)區(qū)的一載體，該表達(dá)區(qū)含有選自與啟動子可操縱性連接的SEQ IDNO2、4、6、40、42、44、46的氨基酸序列的編碼序列；將載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，并在有效表達(dá)該表達(dá)區(qū)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
在一些實(shí)施例中還描述了本發(fā)明抑制個體犬埃里希體感染的方法，包括步驟鑒定懷疑已接觸或感染犬埃里希體的個體；和給予能有效抑制犬埃里希體感染劑量的含有犬埃里希體28kDa抗原的組合物。該抑制作用可以通過任何方法，例如刺激個體的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，或通過其它途徑，例如抑制28kDa抗原的正常功能，或甚至同該抗原競爭與個體體內(nèi)一些的因子相互作用而發(fā)生。
給出下列例子，用于說明本發(fā)明的各種實(shí)施例，而不意味以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1ECa28-1(p28-7)基因的未知5’和3’區(qū)域的測序埃里希體和純化Dr.Edward Breitschwerdt，(College of Veterinary Medicine，North Carolina StateUniversity，Raleigh，NC)提供了犬埃里希體(Florida株和分離物Demon，DJ，Jake，和Fuzzy)。Dr.Richard E.Corstvet(School of Veterinary Medicine，Louisiana StateUniversity，Baton Rouge，LA)提供了犬埃里希體(Louisana株)，Dr.Jacqueline Dawson(Centers for Disease Control and Prevention，Atlanta，GA)提供了犬埃里希體(Oklahoma株)。以補(bǔ)充有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)的DH82細(xì)胞中37℃進(jìn)行埃里希體的增殖。用一般的細(xì)胞染色法觀察犬埃里希體桑椹體的存在，監(jiān)測在DH82細(xì)胞中的胞內(nèi)生長。當(dāng)100％細(xì)胞被埃里希體感染時，用細(xì)胞刮棒收集DH82細(xì)胞。17,000xg離心細(xì)胞20分鐘。用Braun-Sonic2000超聲發(fā)生器以40W30秒，在冰上破碎細(xì)胞沉淀兩次。如前所述純化埃里希體(Weiss E，1975)。將細(xì)胞裂解液加到42％-36％-30％泛影葡胺的不連續(xù)梯度上，80,000xg離心60分鐘。收集重帶和輕帶中的埃里希體，并用蔗糖-磷酸-谷氨酰胺緩沖液(SPG，218mM蔗糖、3.8mM KH2PO4、7.2mM K2HPO4、4.9mM谷氨酰胺，pH7.0)洗滌，離心沉淀。
核酸制備如前所述(McBride等，1996)，將泛影葡胺純化的埃里希體重新懸浮在600微升10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)和1％十二烷基磺酸鈉(SDS，w/v)和100ng/ml蛋白酶K中，制備犬埃里希體基因組DNA。將該混合物在56℃保溫1小時，用苯酚/氯仿/異戊醇(24∶24∶1)的混合物抽提核酸兩次。用純乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗滌一次，干燥并重懸浮于10mM Tris(pH7.5)中。用高純度質(zhì)粒分離試劑盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)純化質(zhì)粒DNA，并用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)純化PCR產(chǎn)物。
ECa28-1(p28-7)基因的克隆用Universal GenomeWalker試劑盒(CLONTECH，Palo Alto，CA)根據(jù)廠商提供的方法測定p28-7基因的全長序列。用5種限制性酶(DraI，EcoRV，PvuII，ScaI，StuI)完全消化犬埃里希體(Jake分離物)基因組DNA，產(chǎn)生鈍端DNA。將試劑盒中提供的接頭(AP1)與犬埃里希體DNA的每一端連接。將該基因組文庫用作模板，采用與p28-7序列已知部分互補(bǔ)的引物，和對接頭AP1特異性的引物，通過PCR來尋找p28-7基因的未知DNA序列。用于基因組步查的p28-7特異性引物是從衍生自引物793(SEQ ID NO16)和1330(SEQ ID NO17)PCR擴(kuò)增p28-7的已知DNA序列設(shè)計的。引物394((5′-GCATTTCCACAGGATCATAGGTAA-3′；核苷酸687-710，SEQ ID NO.21)和394C(5′-TTACCTATGATCCTGT GGAAATGC-3；核苷酸710-687，SEQ ID NO.22))用于與提供的引物AP1連接，通過PCR擴(kuò)增p28-7基因的未知5′和3′區(qū)。對相應(yīng)于用引物394C和AP1擴(kuò)增的p28-7基因5′區(qū)(2000bp)的PCR產(chǎn)物用引物793C(5′-GAGTA ACCAACAGCTCCTGC-3′，SEQ ID No.23)單向測序。用同一引物雙向測序?qū)?yīng)于以引物394和AP1擴(kuò)增的p28-7基因3′區(qū)(580bp)的PCR產(chǎn)物。對鄰接開放閱讀框的5′和3′區(qū)的非編碼區(qū)進(jìn)行測序，設(shè)計與這些區(qū)域互補(bǔ)的引物EC28OM-F(5′-TCTACTTTGCACTTCC ACTATTGT-3′，SEQ ID NO.24)和EC28OM-R(5′-ATTCTTTTGCCACTATTT TTCTTT-3′，SEQ ID NO.25)以擴(kuò)增整個p28-7基因。
DNA測序用ABI Prism 377 DNA測序儀(Perkin-Elmer Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)對DNA進(jìn)行測序。用引物EC28OM-F(SEQ ID No.24)和EC28OM-R(SEQ IDNo.25)，95℃5分鐘，30輪95℃30秒，62℃1分鐘，72℃2分鐘，和72℃延伸10分鐘的熱循環(huán)方案通過PCR擴(kuò)增7種犬埃里希體分離物(來自North Carolina的4種，Oklahoma，F(xiàn)lorida和Louisiana各一種)的整個p28-7基因。得到的PCR產(chǎn)物用相同引物雙向測序。
實(shí)施例2犬埃里希體ECa28-1(p28-7)基因的PCR擴(kuò)增、克隆、測序和表達(dá)表達(dá)載體用引物-EC28OM-F和EC28OM-R PCR擴(kuò)增了整個犬埃里希體p28-7基因，并克隆入pCR2.1-TOPO TA克隆載體，獲得所需組的限制性酶切割位點(diǎn)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用BstX1從pCR2.1-TOPO上切下插入物，連接入pcDNA3.1真核表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，稱為pcDNA3.1/EC28用于后面的研究。擴(kuò)增pcDNA3.1/EC28質(zhì)粒，用KpnI-XbaI雙消化切下基因，并定向連接到pThioHis原核表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。該克隆(稱為pThioHis/EC28)在大腸桿菌BL21中產(chǎn)生了一個重組的硫氧還蛋白融合蛋白。
實(shí)施例2犬埃里希體ECa28-1(p28-7)基因的PCR擴(kuò)增、克隆、測序和表達(dá)表達(dá)載體用引物EC28OM-F和EC28OM-R PCR擴(kuò)增了全長的犬埃里希體p28-7基因，并克隆入pCR2.1-TOPO TA克隆載體，以獲得所需的限制性酶切位點(diǎn)組(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用BstX1從pCR2.1-TOPO上切下插入物，連接入pcDNA3.1真核表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，稱為pcDNA3.1/EC28，用于隨后的研究。擴(kuò)增pcDNA3.1/EC28質(zhì)粒，用KpnI-XbaI雙消化切下該基因，并定向連接入pThioHis原核表達(dá)載體中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。該克隆(稱為pThioHis/EC28)在大腸桿菌BL21中產(chǎn)生重組的硫氧還蛋白融合蛋白。離心粗純化呈不溶相的重組融合蛋白。在天然條件下用鎳-NTA旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen，Santa Clarita，CA)從溶解的細(xì)胞裂解物中，純化得到對照的硫氧還蛋白融合蛋白。
蛋白質(zhì)印跡分析在4-15％Tris-HCl梯度凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA)上對重組犬埃里希體p28-7融合蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并用半干轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad，Hercules，CA)轉(zhuǎn)移到純硝酸纖維素(Schleicher & Schuell，Keene，NH)膜上。將該膜與1∶5000稀釋的受犬埃里希體感染的恢復(fù)期犬抗血清保溫1小時，洗滌，然后與抗犬IgG(H&L)堿性磷酸酶偶聯(lián)的親和層析純化的二抗(1∶1000)保溫1小時(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)。結(jié)合的抗體用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑(BCIP/NBT)底物(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)。
Southern印跡分析為了確定與p28-7基因同源的多基因是否存在于犬埃里希體基因組中，用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989)進(jìn)行了基因組的Southem印跡分析。用各限制性酶BanII、EcoRV、HaeII、KpnI和SpeI完全消化犬埃里希體基因組DNA，它們不在p28-7基因內(nèi)切割，AseI在核酸34、43和656處切開p28-7。通過用引物EC28OM-F和EC28OM-R和地高辛(DIG)-標(biāo)記的脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)作PCR擴(kuò)增產(chǎn)生探針，并用AseI消化。用瓊脂糖凝膠電泳分離消化的探針(566-bp)，凝膠純化然后用于雜交。完全消化的基因組犬埃里希體DNA電泳并轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)上，與p28-7基因DIG-標(biāo)記的探針在DIG Easy hyb緩沖液中，根據(jù)廠商的方案(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)40℃雜交16小時。用抗-DIG堿性磷酸酶-偶聯(lián)抗體和發(fā)光底物(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)檢測結(jié)合的探針，并曝光BioMax科學(xué)顯影膠片(Eastman Kodak，Rochester，NY)。
序列分析和比較從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)獲得恰菲埃里希體p28和反芻類考德里氏體map-1 DNA序列。用LASERGENE軟件(DNASTAR，Inc.Madison，WI)進(jìn)行核苷酸和推測的氨基酸序列和蛋白質(zhì)以及系統(tǒng)發(fā)生分析。用McGeoch和von Heijine的方法，使用PSORT程序(McGeoch，1985；von Heijne，1986)進(jìn)行翻譯后加工分析，以識別信號序列。
用設(shè)計用于擴(kuò)增該全長基因的引物對7種不同犬埃里希體株的p28-7進(jìn)行序列分析。分析揭示該基因的序列在North Carolina(4種)，Louisiana，F(xiàn)lorida和Oklahoma的分離物中是保守的。
結(jié)果用Jotun-Hein算法排列對比了恰菲埃里希體p28和反芻類考德里氏體map-1的核酸序列產(chǎn)生具有高同源(＞90％)區(qū)域的共有序列。這些同源區(qū)(反芻類考德里氏體map-1核苷酸313-332和823-843；恰菲埃里希體p28的307-326和814-834)被定為PCR擴(kuò)增的引物退火位點(diǎn)的目標(biāo)。用引物793(5-GCAGGAGCTGTTGGTTACTC-3′)(SEQ ID NO.16)和1330(5′-CCTTCCTCCAAGTTCTATGCC-3′)(SEQID NO.17)完成了犬埃里希體p28-7基因的PCR擴(kuò)增，得到518bp的PCR產(chǎn)物。用引物793和1330擴(kuò)增犬埃里希體DNA，熱循環(huán)方案為95℃2分鐘，95℃30秒、62℃1分鐘、72℃2分鐘的30輪循環(huán)，然后72℃延伸10分鐘，保持在4℃。通過直接用引物793和1330對產(chǎn)物測序獲得犬埃里希體PCR產(chǎn)物的核酸序列。
序列分析揭示有一個編碼170個氨基酸的蛋白質(zhì)的開放閱讀框，犬埃里希體PCR擴(kuò)增獲得的518bp序列和恰菲埃里希體p28基因的DNA序列的排列對比，揭示70％以上的相似性，表明這些基因是同源的。
用引物394和793C進(jìn)行接頭PCR，以確定全基因序列的5′和3′區(qū)段。引物394產(chǎn)生4種PCR產(chǎn)物(3kb、2kb、1拷貝和0.8kb)，對0.8kb的產(chǎn)物用引物394和AP1進(jìn)行雙向測序。推測的序列與518bp產(chǎn)物的3′末端重疊，將開放閱讀框延伸12個bp至終止密碼子。還對p28-7基因3′末端的另一個625bp非編碼序列進(jìn)行了測序。
用引物394C和提供的引物AP1擴(kuò)增p28-7基因的5′末端。這些引物擴(kuò)增得到3種PCR產(chǎn)物(3.3、3-kb和2kb)。用引物793C對2-kb片段進(jìn)行單向測序。序列提供了p28-7基因的推測的起始密碼子，并完整了編碼278個氨基酸的蛋白質(zhì)的834bp開放閱讀框。產(chǎn)生p28-7基因5′非編碼區(qū)的其它144bp的可閱讀序列。從鄰近p28-7基因的互補(bǔ)非編碼區(qū)設(shè)計引物EC28OM-F和EC28OM-R。
用相同引物直接對用這些引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。圖1顯示了犬埃里希體p28-7基因(SEQ ID NO1)的完整DNA序列。用這些引物擴(kuò)增的p28-7 PCR片段含有整個開放閱讀框和來自5′非編碼引物區(qū)的17個其它氨基酸。將基因直接亞克隆入pThioHis表達(dá)載體，并用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。表達(dá)的p28-7硫氧還蛋白融合蛋白是不可溶的。表達(dá)的蛋白質(zhì)具有與硫氧還蛋白結(jié)合的另114個氨基酸，5個氨基酸是腸激酶識別位點(diǎn)，32個氨基酸來自多克隆位點(diǎn)和N-末端的5′非編碼引物區(qū)。來自犬埃里希體感染的犬恢復(fù)期抗血清識別表達(dá)的重組融合蛋白，但不和硫氧還蛋白對照反應(yīng)(圖2)。
實(shí)施例3犬埃里希體p28-7基因的序列同源性用Clustal法排列對比了犬埃里希體p28-7(834bp)和包括信號序列的恰菲埃里希體omp-1基因家族(p28-7、omp-1A、B、C、D、E和F)的核酸序列，以檢測這些基因之間的同源性(排列未顯示)。在犬埃里希體p28-7、恰菲埃里希體p28和omp-1F之間核酸同源性相等保守(68.9％)。恰菲埃里希體omp-1家族中的其它推定的外膜蛋白基因，omp-1D(68.2％)、omp-1E(66.7％)、omp-1C(64.1％)、反芻類考德里氏體map-1(61.8％)、犬埃里希體28kDa蛋白1基因(60％)和28kDa蛋白2基因(部分)(59.5％)也與p28-7是同源的。恰菲埃里希體omp-1B與犬埃里希體p28-7的核酸同源性(45.1％)最少。
犬埃里希體p28-7(SEQ ID NO2)和恰菲P28的預(yù)測氨基酸序列的排列對比，揭示了導(dǎo)致4個可變區(qū)(VR)的氨基酸取代。鑒定了犬埃里希體P28-7和恰菲埃里希體OMP-1家族可變區(qū)的氨基酸序列和位置中的取代或缺失(圖3)。包括信號肽的氨基酸比較揭示，犬埃里希體P28-7與恰菲埃里希體OMP-1家族的OMP-1F具有最高的同源性(68％)，然后是恰菲P28(65.5％)、OMP-1E(65.1％)、OMP-1D(62.9％)、OMP-1C(62.9％)、反芻類考德里氏體MAP-1(59.4％)、犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)1(55.6％)和28kDa蛋白質(zhì)2(部分)(53.6％)和OMP-1B(43.2％)?；诎被嵝蛄械南到y(tǒng)發(fā)生關(guān)系顯示，犬埃里希體P28-7和反芻類考德里氏體MAP-1、恰菲埃里希體OMP-1蛋白以及犬埃里希體28kDa蛋白1和2(部分)是相關(guān)的(圖4)。
實(shí)施例4犬埃里希體P28-7的預(yù)測的表面可能性和免疫反應(yīng)性用疏水和親水概況圖分析犬埃里希體P28-7，預(yù)測P28-7上的表面暴露區(qū)域(圖6)。在犬埃里希體P28-7中鑒定出8個含有3-9個氨基酸的主要表面暴露區(qū)域，與恰菲埃里希體P28上的表面暴露區(qū)域的情況相似(圖6)。犬埃里希體P28-7上較大的表面暴露區(qū)域中的5個，位于蛋白質(zhì)的N末端區(qū)域。在犬埃里希體P28-7的全部4個可變區(qū)中發(fā)現(xiàn)了表面暴露的親水區(qū)域。用Rothbard-Taylor算法(Rothbard和Taylor，1988)在P28-7中預(yù)測了10個T-細(xì)胞基序，用Jameson-Wolf抗原性算法(圖6)(Jamesor和Wolf，1988)預(yù)測了犬埃里希體P28-7的高抗原性。在犬埃里希體P28-7和恰菲埃里希體P28之間觀察到抗原性和T-細(xì)胞基序的相似性。
實(shí)施例5犬埃里希體p28-7基因同源基因組拷貝的檢測用限制性酶BanII，EcoRV，HaeII，KpnI，SpeI(在p28-7基因中沒有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))和AseI(在核苷酸34、43和656有內(nèi)部限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))分別完全消化犬埃里希體DNA，進(jìn)行基因組Southern印跡分析，揭示存在至少3種同源p28-7基因拷貝(圖5)。雖然犬埃里希體p28-7具有內(nèi)部AseI內(nèi)部限制位點(diǎn)，用于雜交實(shí)驗(yàn)的DIG-標(biāo)記的探針針對AseI消化基因產(chǎn)生的一個DNA片段內(nèi)的基因區(qū)。用AseI消化產(chǎn)生3個條帶(約566bp、850bp和3kb)，它們與p28-7DNA探針雜交，表示基因組中存在與p28-7同源的多基因。用EcoRV和SpeI消化，產(chǎn)生與p28-7基因探針雜交的兩個條帶。
實(shí)施例6犬埃里希體ECa28SA2(p28-5)、ECa28SA3(p28-6)的PCR擴(kuò)增多基因基因座的基因和鑒定為了特異性擴(kuò)增ECa28SA2(p28-5)下游的可能未知基因，用對p28-5特異性的引物46f(5′-ATATACTTCCTACCTAATGTCTCA-3′，SEQ ID No.18)和引物1330(SEQ ID NO17)進(jìn)行擴(kuò)增，1330針對p28-7基因3′末端的保守區(qū)。凝膠純化擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆入TA克隆載體(Invitrogen，Santa Clarita，CA)。對克隆進(jìn)行雙向測序，使用引物來自載體的M13反向、46f、ECa28SA2(5′-AGTGCAGAGTCTTCGGTTTC-3′，SEQ ID No.19)，ECa5.3(5′-GTTACTTGCGGAGGACAT-3′，SEQ ID No.20)。用熱循環(huán)方案95℃2分鐘，30輪的95℃30秒，48℃1分鐘，72℃1分鐘，然后72℃延伸10分鐘，維持在4℃。
用這些引物擴(kuò)增得到一含有2個開放閱讀框的2-kb PCR產(chǎn)物。第一個開放閱讀框含有p28-5基因的已知區(qū)域和該基因先前未測序的3′部分。在p28-5下游發(fā)現(xiàn)另一個不相同，但同源的28kDa蛋白基因，稱為ECa28SA3(p28-6)。
用對應(yīng)于p28-6內(nèi)區(qū)域的特異性引物，稱為ECaSA3-2(5′-CTAGGATTAGGTTATAGTATAAGTT-3′，SEQ ID No.26)和與p28-7內(nèi)某區(qū)域退火的引物793C(SEQ ID NO23)擴(kuò)增基因p28-6和-p28-7之間的基因間區(qū)。用熱循環(huán)方案95℃2分鐘，30輪的95℃30秒，48℃1分鐘，72℃1分鐘，然后72℃延伸10分鐘，維持在4℃擴(kuò)增DNA。
擴(kuò)增得到一800bp PCR產(chǎn)物，它含有p28-6的3′末端，p28-6和p28-7(28NC3)之間的基因間區(qū)，和p28-7的5′末端，與先前分離的基因座連接(圖8)。p28-5的849bp的開放閱讀框編碼283氨基酸蛋白，p28-6具有編碼280個氨基酸蛋白質(zhì)的840bp開放閱讀框。p28-6和p28-7之間的基因間非編碼區(qū)域長345bp(圖7和8)。
實(shí)施例7犬埃里希體p28-4、p28-5、p28-6、p28-7和p28-8蛋白質(zhì)的核酸和氨基酸同源性用Clustal法排列對比了全部5種犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因的核酸和氨基酸序列，以檢測這些基因之間的同源性。核酸同源性是58-75％，在犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因成員之間觀察到67-72％相似的氨基酸同源性。
轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域通過與共有的大腸桿菌啟動子區(qū)和恰菲埃里希體的啟動子比較，分析28kDa蛋白質(zhì)基因之間的基因間區(qū)的啟動子序列(Yu等，1997；McClure，1985)。在對應(yīng)于基因p28-5、p28-6、p28-7和p28-8(Eca28-2)的4個基因間序列中鑒定出推定的啟動子序列，包括RBS，-10和-35區(qū)(圖10)。p28-4(ECa28SA1)的上游非編碼區(qū)是未知的，沒有分析。
N-末端信號序列氨基酸序列分析揭示，全長犬埃里希體p28-7具有30.5kDa的推測分子量，整個p28-6具有30.7kDa的推測分子量。兩條蛋白質(zhì)具有23個氨基酸的推測N-末端信號肽(MNCKKILITTALMSLMYYAPSIS，SEQ ID No.27)，與恰菲埃里希體P28(MNYKKILITSALISLISSLPGV SFS，SEQ ID NO.28)，和OMP-1蛋白家族預(yù)測的相似(Yu等，1999a；Ohashi等，1998b)。
在p28-7的氨基酸21、22和23處發(fā)現(xiàn)信號肽酶的優(yōu)選切割位點(diǎn)(SIS；Ser-X-Ser)(Oliver，1985)。在氨基酸位置25處還存在另一個推定的切割位點(diǎn)(MNCKKILITTALISLMYSIPSISSFS，SEQ ID NO.29)，與恰菲埃里希體P28的預(yù)測切割位點(diǎn)(SFS)相同，這導(dǎo)致具有27.7kDa預(yù)測分子量的成熟p28-7。預(yù)測p28-5先前報道的部分序列的信號切割位點(diǎn)在氨基酸30。然而，信號序列分析預(yù)測p28-4具有不可切割的信號序列。
總結(jié)從包括犬埃里希體、恰菲埃里希體、反芻類考德里氏體的多個立克次氏體鑒定并克隆了具有相似分子量的蛋白質(zhì)(Reddy等，1998；Jongejan等，1993；Ohashi等，1998)。先前描述了恰菲埃里希體中具有6個同源p28基因的一個基因座，和犬埃里希體中的2個基因座，各含有一些同源28kDa蛋白質(zhì)基因。
本發(fā)明顯示了與恰菲埃里希體omp-1多基因家族以及反芻類考德里氏體map-1基因同源的犬埃里希體編碼成熟28-kDa蛋白質(zhì)的基因的克隆、表達(dá)和特征確定。鑒定出兩種新的28kDa蛋白質(zhì)基因p28-7和p28-6。在本發(fā)明中對于另一種犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因，先前部分測序(Reddy等，1998)的p28-5完全測序。還公開了含有5種犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因(p28-4、p28-5、p28-6、p28-7和p28-8)的犬埃里希體中的一個基因座的鑒定和特征確定。
犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)與恰菲埃里希體OMP-1家族以及反芻類考德里氏體MAP-1蛋白是同源的。最同源的犬埃里希體28kDa蛋白(p28-6、p28-7和p28-8)在該基因座中依次排列。這些蛋白質(zhì)的同源性是67.5-72.3％。這些28kDa蛋白質(zhì)中的趨多樣是27.3-38.6％。犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)p28-4和p28-5同源性最小，為50.9-59.4％，多樣性是53.3-69.9％?；蜷g的不同主要在于4個超變區(qū)，提示這些區(qū)域是表面暴露的，受到免疫系統(tǒng)的選擇壓力。報道了p28-7在7種犬埃里希體分離物中的保守性(McBride等，1999)，提示犬埃里希體在北美可能是純系的。相反，報道了恰菲埃里希體中p28的顯著多樣性(Yu等，1999a)。
全部犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)似乎是從30kD蛋白質(zhì)翻譯后加工成成熟28kD蛋白的。近來，在恰菲埃里希體P28上鑒定出一條信號序列(Yu等，1999a)，N-末端氨基酸測序證實(shí)，蛋白質(zhì)翻譯后加工，切下信號序列產(chǎn)生成熟蛋白(Ohashi等，1998)。OMP-1F和OMP-1E的前導(dǎo)序列已被提出是前導(dǎo)信號肽(Ohashi等，1998)。在恰菲埃里希體OMP-1F、OMP-1E和P28上鑒定的信號序列與犬埃里希體28kDa蛋白的前導(dǎo)序列是同源的。p28基因的啟動子序列未被實(shí)驗(yàn)所確定，但通過與RBS、大腸桿菌和其它埃里希體的-10和-35啟動子區(qū)的共有序列比較，鑒定了可能的啟動子區(qū)(Yu等，1997；McClure，1985)。這些啟動子區(qū)將使每個基因可能被轉(zhuǎn)錄和翻譯，提示這些基因可以在宿主中差異表達(dá)。在犬中持續(xù)感染可能與p28基因的差異表達(dá)有關(guān)，導(dǎo)致體內(nèi)抗原改變，因此使生物規(guī)避免疫應(yīng)答。
發(fā)現(xiàn)犬埃里希體28kDa蛋白基因顯示與恰菲埃里希體omp-1基因家族和反芻類考德里氏體map-1基因的核酸和氨基酸序列同源性。先前研究已證明犬埃里希體30kDa蛋白，它與針對恰菲埃里希體的恢復(fù)期抗血清反應(yīng)，但相信抗原是不同的(Rikihisa等，1994)。根據(jù)犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)4個可變區(qū)中氨基酸取代比較所得發(fā)現(xiàn)，支持該可能性。這些發(fā)現(xiàn)一起提示負(fù)責(zé)犬埃里希體和恰菲埃里希體P28之間的抗原差異的氨基酸位于這些可變區(qū)中，可輕易接觸免疫系統(tǒng)。
報道了免疫反應(yīng)性肽位于反芻類考德里氏體、恰菲埃里希體、犬埃里希體28kDa蛋白的可變區(qū)中(Reddy等，1998)。犬埃里希體和恰菲P28的分析揭示，所有可變區(qū)具有預(yù)測的表面暴露的氨基酸。在犬中的研究顯示，缺乏犬埃里希體和恰菲埃里希體的交叉保護(hù)(Dawson和Ewing，1992)。該觀察可能與這些埃里希體品種的P28可變區(qū)中以及其它免疫學(xué)重要抗原的抗原性差異有關(guān)。另一個研究發(fā)現(xiàn)，恰菲埃里希體感染的病人的恢復(fù)期人抗血清識別恰菲埃里希體的29/28kDa蛋白，也與犬埃里希體的同源蛋白質(zhì)反應(yīng)(Chen等，1997)。犬埃里希體28kDa蛋白和恰菲埃里希體P28上的同源和交叉反應(yīng)性表位似乎被免疫系統(tǒng)識別。
犬埃里希體28kDa蛋白可能是重要的免疫保護(hù)性抗原。幾個報道證明，犬埃里希體的30kDa抗原顯示強(qiáng)免疫反應(yīng)性(Rikihisa等，1994；Rikihisa等，1992)。人和犬恢復(fù)期抗血清中的抗體與恰菲埃里希體和犬埃里希體的該大小范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)反應(yīng)，提示它們可能是重要的免疫保護(hù)性抗原(Rikihisa等，1994；Chen等，1994；Chen等，1997)。另外，針對30、24和21kDa蛋白的抗體在對犬埃里希體的免疫應(yīng)答中很早產(chǎn)生(Rikihisa等，1994；Rikihisa等，1992)，提示這些蛋白質(zhì)可能在疾病急性階段的免疫應(yīng)答中尤其重要。近來，在恰菲埃里希體中鑒定出分子量為28kDa的編碼外膜蛋白的同源基因家族，用重組恰菲埃里希體P28的免疫小鼠產(chǎn)生針對同源攻擊的免疫力(Ohashi等，1998)。恰菲埃里希體P28被證明存在于外膜，免疫電子顯微鏡將P28定位在該微生物的表面，因此提示它可能作為粘附素起作用(Ohashi等，1998)?？赡茉谠撗芯恐需b定的恰菲埃里希體的28kDa蛋白具有相同的位置，可能起到相同作用。
不同犬埃里希體株p28-7的比較揭示，該基因明顯完全保守。用恰菲埃里希體的研究顯示多樣性的免疫學(xué)和分子證據(jù)。恰菲埃里希體感染的病人具有對29/28kDa蛋白質(zhì)可變化的免疫反應(yīng)性，提示其具有抗原多樣性(Chen等，1997)。近來已產(chǎn)生了分子證據(jù)，支持恰菲埃里希體p28基因中有抗原多樣性(Yu等，1999a)。5種恰菲埃里希體分離物中的比較，揭示兩種分離物(Sapulpa和St.Vincent)是100％相同的，但其它三種(Arkansas，Jax，91HE17)具有多樣性，在氨基酸水平上達(dá)13.4％。犬埃里希體p28-7的保守提示，美國發(fā)現(xiàn)的犬埃里希體株是基因相同的，因此犬埃里希體28kDa蛋白是美國犬埃里希體病的吸引人的候選疫苗。美國以外的其它犬埃里希體分離物可提供關(guān)于犬埃里希體起源和進(jìn)化的信息。28kDa蛋白的保守性使的它成為可靠血清診斷犬埃里希體病的重要的候選試劑。
現(xiàn)在還不知道多種同源性基因的作用；然而，犬中犬埃里希體的持續(xù)感染可能與由于同源28kDa蛋白基因表達(dá)變化導(dǎo)致的抗原性改變相關(guān)，因此使犬埃里希體能規(guī)避免疫監(jiān)視。msp-3基因在著邊無形體中的變化部分引起MSP-3蛋白的改變，導(dǎo)致持續(xù)感染(Alleman等，1997)。檢測急性和慢性感染犬中犬埃里希體28kDa蛋白基因表達(dá)的研究，可提供28kDa蛋白基因家族在感染持續(xù)中的作用的理解。
實(shí)施例8犬埃里希體p28-1、p28-2、p28-3和p28-9基因的鑒定通過為p28-1(ECa28-75C)和p28-5(ECa28-5-818f)設(shè)計的基因特異性引物，雙向延伸p28基因座，對上述串聯(lián)排列的p28基因的5個基因座的DNA上游和下游的未知區(qū)域進(jìn)行測序。進(jìn)行多基因步查如下獲得未知序列用引物p28-5-818f(5’-TTA AAC ATA TGC CAC TTC GGA CTA-3’，SEQ ID No.34)擴(kuò)增5個基因座1.9kp下游，并測序，產(chǎn)生900bp的擴(kuò)增子，用1191(5’-TAT GAT CGT GTA AAATTG CTG TGA GTA T-3’，SEQ ID No.35)，產(chǎn)生1kb的擴(kuò)增子。用引物ECa28-75C(5’-TAC TGG CAC GTG CTG GAC TA-3’，SEQ ID No.36)對5個基因座DNA上游的3.67kbp進(jìn)行擴(kuò)增和測序，產(chǎn)生1.6kbp擴(kuò)增子；用ECa5’-1600(5’-CAC CAA TAAATG CAG AGA CTT C-3’，SEQ ID No.37)，產(chǎn)生1.6kbp擴(kuò)增子；用3125(5’-AATCCA TCA TTT CTC ATT ACA GTG TG-3’，SEQ ID No.38)，產(chǎn)生800bp擴(kuò)增子。9個串聯(lián)排列基因的該基因座含有4個新的p28基因和上述5個p28基因，命名為p28-1到p28-9(圖11)。
用Clustal法排列對比了犬埃里希體p28基因的核酸和氨基酸序列，以檢測這些基因之間的同源性。這些蛋白質(zhì)的同源性為67.5-75％，這些P28蛋白中的多樣性為26.9-38％。犬埃里希體P28蛋白P28-1、P28-2和P28-9與其它p28基因同源性最小，為37-49％，多樣性為53-77％。9個p28基因的核酸同源性是28-72％。圖12顯示了基于犬埃里希體p28氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。
核苷酸序列和登錄號完全的9基因犬埃里希體(Jake株)p28基因座的核酸和氨基酸序列的GenBank登錄號是AF082744。該登錄號原來是給p28-7的，但已用9基因p28基因座的序列，包括p28-7更新。本研究中描述的其它犬埃里希體分離物的p28-7的核酸和氨基酸序列的GenBank登錄號是Louisiana，AF082745；Oklahoma，AF082746；Demon，AF082747；DJ，AF082748；Fuzzy，AF082749；Florida，AF082750。
用犬埃里希體感染的犬的恢復(fù)期血清的免疫印跡觀察到28kDa范圍內(nèi)的許多條帶(Rikihisa等，1994)，多個p28蛋白的表達(dá)可能是該觀察結(jié)果的解釋。Southern印跡研究提示，基因組中除了該基因座中的5個成員外，存在其它p28基因(McBride等，1999；Ohashi等，1998b)。
在該研究中，鑒定出含有編碼同源性，但非相同的p28基因的9個串聯(lián)排列的犬埃里希體p28基因的一個基因座。9個基因的基因座包括4個新p28基因(圖13-16)和上述報道的5個串聯(lián)排列的p28基因。8個p28基因位于一條DNA鏈上，一個p28基因在互補(bǔ)鏈上。9個p28基因成員中核酸同源性是37-75％，氨基酸同源性是28-72％。
發(fā)現(xiàn)犬埃里希體P28與其它物種，例如恰菲埃里希體的28kDa蛋白像其與自身一樣密切相關(guān)(McBride等，2000)。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中的區(qū)別主要在幾個主要超變區(qū)中，提示這些區(qū)域是表面暴露的，受到免疫系統(tǒng)的選擇壓力(McBride等，2000)。
報道了7種地理學(xué)上不同的分離物中犬埃里希體p28基因(p28-7)的保守性(McBride等，1999)，提示犬埃里希體在北美可能是高度保守的。類似的，犬埃里希體的120kDa糖蛋白在美國的分離物中也是保守的(Yu等，1997)。相反，恰菲埃里希體的120kDa和28kDa蛋白質(zhì)基因在分離物中是多樣的(Yu等，1999a；Chen等，1997)。恰菲埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因的多樣性似乎是由于超變區(qū)中的點(diǎn)突變所致，該突變可能是由于選擇性免疫壓力(Yu等，1999a)。這些資料提示犬埃里希體可能是較近被引入北美的，這可能是分離物中觀察到的保守的原因。犬埃里希體分離物中p28基因的保守可提供機(jī)會來開發(fā)疫苗和血清診斷性抗原，它們對于疾病預(yù)防和血清診斷將特別有效。P28的混合物可提供最可靠的血清診斷試驗(yàn)，但用一種P28血清診斷對于免疫診斷是有用的(Ohashi等，1998b；McBride等，1999)。
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本說明書提到的任何專利或出版物指出了本發(fā)明涉及的領(lǐng)域中技術(shù)人員的水平。這些專利和出版物在此引入以供參考，程度相同，如同各獨(dú)立出版物是特別和單獨(dú)表明引入以供參考的一樣。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于理解，本發(fā)明適用于實(shí)施提到的目的和獲得提到的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及與之相關(guān)的。本文描述的實(shí)施例、方法、程序、處理、分子和特定的化合物以優(yōu)選例為代表，是示范性的，而不意味著限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員對其中所作的改變和其它用途都將包括在權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍內(nèi)。序列表<110>D.H.沃克(Walker，David H.)J.W.麥克布里奇(McBride，Jere W.)于學(xué)杰(Yu，Xue-Jie)<120>犬埃里希體的同源28kD免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)基因及其用途<130>D6152CIP2/PCT<141>2001-09-12<150>09/660,587<151>2000-09-12<160>46<210>1<211>1607<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>犬埃里希體p28-7核酸序列<400>1attttattta ttaccaatct tatataatat attaaatttc tcttacaaaa 50atctctaatg ttttatacct aatatatata ttctggcttg tatctacttt 100gcacttccac tattgttaat ttattttcac tattttaggt gtaatatgaa 150ttgcaaaaaa attcttataa caactgcatt aatatcatta atgtactcta 200ttccaagcat atctttttct gatactatac aagatggtaa catgggtggt 250aacttctata ttagtggaaa gtatgtacca agtgtctcac attttggtag 300cttctcagct aaagaagaaa gcaaatcaac tgttggagtt tttggattaa 350aacatgattg ggatggaagt ccaatactta agaataaaca cgctgacttt 400actgttccaa actattcgtt cagatacgag aacaatccat ttctagggtt 450tgcaggagct atcggttact caatgggtgg cccaagaata gaattcgaaa 500tatcttatga agcattcgac gtaaaaagtc ctaatatcaa ttatcaaaat 550gacgcgcaca ggtactgcgc tctatctcat cacacatcgg cagccatgga 600agctgataaa tttgtcttct taaaaaacga agggttaatt gacatatcac 650ttgcaataaa tgcatgttat gatataataa atgacaaagt acctgtttct 700ccttatatat gcgcaggtat tggtactgat ttgatttcta tgtttgaagc 750tacaagtcct aaaatttcct accaaggaaa actgggcatt agttactcta 800ttaatccgga aacctctgtt ttcatcggtg ggcatttcca caggatcata 850ggtaatgagt ttagagatat tcctgcaata gtacctagta actcaactac 900aataagtgga ccacaatttg caacagtaac actaaatgtg tgtcactttg 950gtttagaact tggaggaaga tttaacttct aattttattg ttgccacata 1000ttaaaaatga tctaaacttg tttttawtat tgctacatac aaaaaaagaa 1050aaatagtggc aaaagaatgt agcaataaga gggggggggg ggaccaaatt 1100tatcttctat gcttcccaag ttttttcycg ctatttatga cttaaacaac 1150agaaggtaat atcctcacgg aaaacttatc ttcaaatatt ttatttatta 1200ccaatcttat ataatatatt aaatttctct tacaaaaatc actagtattt 1250tataccaaaa tatatattct gacttgcttt tcttctgcac ttctactatt 1300tttaatttat ttgtcactat taggttataa taawatgaat tgcmaaagat 1350ttttcatagc aagtgcattg atatcactaa tgtctttctt acctagcgta 1400tctttttctg aatcaataca tgaagataat ataaatggta acttttacat 1450tagtgcaaag tatatgccaa gtgcctcaca ctttggcgta ttttcagtta 1500aagaagagaa aaacacaaca actggagttt tcggattaaa acaagattgg 1550gacggagcaa cactaaagga tgcaagcwgc agccacacaw tagacccaag 1600tacaatg1607<210>2<211>278<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>犬埃里希體p28-7蛋白氨基酸序列<400>2Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Met Tyr Ser Ile Pro Ser Ile Ser Phe Ser Asp Thr Ile Gln Asp20 25 30Gly Asn Met Gly Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Val Pro35 40 45Ser Val Ser His Phe Gly Ser Phe Ser Ala Lys Glu Glu Ser Lys50 55 60Ser Thr Val Gly Val Phe Gly Leu Lys His Asp trp Asp Gly Ser65 70 75Pro Ile Leu Lys Asn Lys His Ala Asp Phe Thr Val Pro Asn Tyr80 85 90Ser Phe Arg Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Ile Glu Phe Glu Ile Ser110 115 120Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Ser Pro Asn Ile Asn Tyr Gln Asn125 130 135Asp Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His His Thr Ser Ala Ala140 145 150Met Glu Ala Asp Lys Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu Gly Leu Ile155 160 165Asp Ile Ser Leu Ala Ile Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Ile Asn Asp170 175 180Lys Val Pro Val Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Ile Gly Thr Asp185 190 195Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ile Ser Tyr Gln200 205 210Gly Lys Leu Gly Ile Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Thr Ser Val215 220 225Phe Ile Gly Gly His Phe His Arg Ile Ile Gly Asn Glu Phe Arg230 235 240Asp Ile Pro Ala Ile Val Pro Ser Asn Ser Thr Thr Ile Ser Gly245 250 255Pro Gln Phe Ala Thr Val Thr Leu Asn Val Cys His Phe Gly Leu260 265 270Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275<210>3<211>849<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><221>mat_peptide<223>p28-5的核酸序列<400>3atgaattgta aaaaagtttt cacaataagt gcattgatat catccatata 50cttcctacct aatgtctcat actctaaccc agtatatggt aacagtatgt 100atggtaattt ttacatatca ggaaagtaca tgccaagtgt tcctcatttt 150ggaatttttt cagctgaaga agagaaaaaa aagacaactg tagtatatgg 200cttaaaagaa aactgggcag gagatgcaat atctagtcaa agtccagatg 250ataattttac cattcgaaat tactcattca agtatgcaag caacaagttt 300ttagggtttg cagtagctat tggttactcg ataggcagtc caagaataga 350agttgagatg tcttatgaag catttgatgt gaaaaatcca ggtgataatt 400acaaaaacgg tgcttacagg tattgtgctt tatctcatca agatgatgcg 450gatgatgaca tgactagtgc aactgacaaa tttgtatatt taattaatga 500aggattactt aacatatcat ttatgacaaa catatgttat gaaacagcaa 550gcaaaaatat acctctctct ccttacatat gtgcaggtat tggtactgat 600ttaattcaca tgtttgaaac tacacatcct aaaatttctt atcaaggaaa 650gctagggttg gcctacttcg taagtgcaga gtcttcggtt tcttttggta 700tatattttca taaaattata aataataagt ttaaaaatgt tccagccatg 750gtacctatta actcagacga gatagtagga ccacagtttg caacagtaac 800attaaatgta tgctactttg gattagaact tggatgtagg ttcaacttc 849<210>4<211>283<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>p28-5蛋白的氨基酸序列<400>4Met Asn Cys Lys Lys Val Phe Thr Ile Ser Ala Leu Ile Ser Ser5 10 15Ile Tyr Phe Leu Pro Asn Val Ser Tyr Ser Asn Pro Val Tyr Gly20 25 30Asn Ser Met Tyr Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro35 40 45Ser Val Pro His Phe Gly Ile Phe Ser Ala Glu Glu Glu Lys Lys50 55 60Lys Thr Thr Val Val Tyr Gly Leu Lys Glu Asn Trp Ala Gly Asp65 70 75Ala Ile Ser Ser Gln Ser Pro Asp Asp Asn Phe Thr Ile Arg Asn80 85 90Tyr Ser Phe Lys Tyr Ala Ser Asn Lys Phe Leu Gly Phe Ala Val95 100 105Ala Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Ser Pro Arg Ile Glu Val Glu Met110 115 120Ser Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Asn Pro Gly Asp Asn Tyr Lys125 130 135Asn Gly Ala Tyr Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His Gln Asp Asp Ala140 145 150Asp Asp Asp Met Thr Ser Ala Thr Asp Lys Phe Val Tyr Leu Ile
155 160 165Asn Glu Gly Leu Leu Asn Ile Ser Phe Met Thr Asn Ile Cys Tyr170 175 180Glu Thr Ala Ser Lys Asn lle Pro Leu Ser Pro Tyr Ile Cys Ala185 190 195Gly Ile Gly Thr Asp Leu Ile His Met Phe Glu Thr Thr His Pro200 205 210Lys Ile Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ala Tyr Phe Val Ser215 220 225Ala Glu Ser Ser Val Ser Phe Gly Ile Tyr Phe His Lys Ile Ile230 235 240Asn Asn Lys Phe Lys Asn Val Pro Ala Met Val Pro Ile Asn Ser245 250 255Asp Glu Ile Val Gly Pro Gln Phe Ala Thr Val Thr Leu Asn Val260 265 270Cys Tyr Phe Gly Leu Glu Leu Gly Cys Arg Phe Asn Phe275 280<210>5<211>840<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><221>mat_peptide<223>p28-6的核酸序列<400>5atgaattgca aaaaaattct tataacaact gcattaatgt cattaatgta 50ctatgctcca agcatatctt tttctgatac tatacaagac gataacactg 100gtagcttcta catcagtgga aaatatgtac caagtgtttc acattttggt 150gttttctcag ctaaagaaga aagaaactca actgttggag tttttggatt 200aaaacatgat tggaatggag gtacaatatc taactcttct ccagaaaata 250tattcacagt tcaaaattat tcgtttaaat acgaaaacaa cccattctta 300gggtttgcag gagctattgg ttattcaatg ggtggcccaa gaatagaact 350tgaagttctg tacgagacat tcgatgtgaa aaatcagaac aataattata 400agaacggcgc acacagatac tgtgctttat ctcatcatag ttcagcaaca 450agcatgtcct ccgcaagtaa caaatttgtt ttcttaaaaa atgaagggtt 500aattgactta tcatttatga taaatgcatg ctatgacata ataattgaag 550gaatgccttt ttcaccttat atttgtgcag gtgttggtac tgatgttgtt 600tccatgtttg aagctataaa tcctaaaatt tcttaccaag gaaaactagg 650attaggttat agtataagtt cagaagcctc tgtttttatc ggtggacact 700ttcacagagt cataggtaat gaatttagag acatccctgc tatggttcct 750agtggatcaa atcttccaga aaaccaattt gcaatagtaa cactaaatgt 800gtgtcacttt ggcatagaac ttggaggaag atttaacttc840<210>6<211>280<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>p28-6蛋白的氨基酸序列<400>6Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Met Ser Leu5 10 15Met Tyr Tyr Ala Pro Ser Ile Ser Phe Ser Asp Thr Ile Gln Asp20 25 30Asp Asn Thr Gly Ser Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Val Pro Ser35 40 45Val Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Arg Asn Ser50 55 60Thr Val Gly Val Phe Gly Leu Lys His Asp Trp Asn Gly Gly Thr65 70 75Ile Ser Asn Ser Ser Pro Glu Asn Ile Phe Thr Val Gln Asn Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Val Leu110 115 120Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Asn Asn Asn Tyr Lys Asn125 130 135Gly Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His His Ser Ser Ala Thr140 145 150Ser Met Ser Ser Ala Ser Asn Lys Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu155 160 165Gly Leu Ile Asp Leu Ser Phe Met Ile Asn Ala Cys Tyr Asp Ile170 175 180Ile Ile Glu Gly Met Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val185 190 195Gly Thr Asp Val Val Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro Lys Ile200 205 210Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Glu215 220 225Ala Ser Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Arg Val Ile Gly Asn230 235 240Glu Phe Arg Asp Ile Pro Ala Met Val Pro Ser Gly Ser Asn Leu245 250 255Pro Glu Asn Gln Phe Ala Ile Val Thr Leu Asn Val Cys His Phe260 265 270Gly Ile Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275 280<210>7<21l>133<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>p28-5蛋白的部分氨基酸序列<400>7Met Asn Cys Lys Lys Val Phe Thr Ile Ser Ala Leu Ile Ser Ser5 10 15Ile Tyr Phe Leu Pro Asn Val Ser Tyr Ser Asn Pro Val Tyr Gly20 25 30Asn Ser Met Tyr Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro35 40 45Ser Val Pro His Phe Gly Ile Phe Ser Ala Glu Glu Glu Lys Lys50 55 60Lys Thr Thr Val Val Tyr Gly Leu Lys Glu Asn Trp Ala Gly Asp65 70 75Ala Ile Ser Ser Gln Ser Pro Asp Asp Asn Phe Thr Ile Arg Asn80 85 90Tyr Ser Phe Lys Tyr Ala Ser Asn Lys Phe Leu Gly Phe Ala Val95 100 105Ala Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Ser Pro Arg Ile Glu Val Glu Met110 115 120Ser Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn125 130<210>8<211>287<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>p28-4蛋白的氨基酸序列<400>8Met Lys Tyr Lys Lys Thr Phe Thr Val Thr Ala Leu Val Leu Leu5 10 15Thr Ser Phe Thr His Phe Ile Pro Phe Tyr Ser Pro Ala Arg Ala20 25 30Ser Thr Ile His Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro Thr35 40 45Ala Ser His Phe Gly Ile Phe Ser Ala Lys Glu Glu Gln Ser Phe50 55 60Thr Lys Val Leu Val Gly Leu Asp Gln Arg Leu Ser His Asn Ile65 70 75Ile Asn Asn Asn Asp Thr Ala Lys Ser Leu Lys Val Gln Asn Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Lys Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Asn Ser Arg Ile Glu Leu Glu Val Ser110 115 120His Glu Ile Phe Asp Thr Lys Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Leu Asn125 130 135Asp Ser His Lys Tyr Cys Ala Leu Ser His Gly Ser His Ile Cys140 145 150Ser Asp Gly Asn Ser Gly Asp Trp Tyr Thr Ala Lys Thr Asp Lys155 160 165Phe Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly Leu Leu Asp Val Ser Phe Met170 175 180Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Thr Thr Glu Lys Met Pro Phe Ser185 190 195Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Ile Gly Thr Asp Leu Ile Ser Met Phe200 205 210Glu Thr Thr Gln Asn Lys Ile Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu215 220 225Asn Tyr Thr Ile Asn Ser Arg Val Ser Val Phe Ala Gly Gly His230 235 240Phe His Lys Val Ile Gly Asn Glu Phe Lys Gly Ile Pro Thr Leu
245 250 255Leu Pro Asp Gly Ser Asn Ile Lys Val Gln Gln Ser Ala Thr Val260 265 270Thr Leu Asp Val Cys His Phe Gly Leu Glu Ile Gly Ser Arg Phe275 280 285Phe Phe<210>9<211>281<212>PRT<213>恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis)<220><223>恰菲埃里希體P28的氨基酸序列<400>9Met Asn Tyr Lys Lys Val Phe Ile Thr Ser Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Ile Ser Ser Leu Pro Gly Val Ser Phe Ser Asp Pro Ala Gly Ser20 25 30Gly Ile Asn Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro Ser35 40 45Ala Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Arg Asn Thr50 55 60Thr Val Gly Val Phe Gly Leu Lys Gln Asn Trp Asp Gly Ser Ala65 70 75Ile Ser Asn Ser Ser Pro Asn Asp Val Phe Thr Val Ser Asn Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Asp Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Val Ser110 115 120Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asn125 130 135Glu Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His Asn Ser Ala Ala Asp140 145 150Met Ser Ser Ala Ser Asn Asn Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu Gly155 160 165Leu Leu Asp Ile Ser Phe Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Val Val170 175 180Gly Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Ile Gly185 190 195Thr Asp Leu Val Ser Met Phe Glu Ala Thr Asn Pro Lys Ile Ser200 205 210Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Glu Ala215 220 225Ser Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Lys Val Ile Gly Asn Glu230 235 240Phe Arg Asp Ile Pro Thr Ile Ile Pro Thr Gly Ser Thr Leu Ala245 250 255Gly Lys Gly Asn Tyr Pro Ala Ile Val Ile Leu Asp Val Cys His260 265 270Phe Gly Ile Glu Leu Gly Gly Arg Phe Ala Phe275 280<210>10<211>283<212>PRT<213>恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis)<220><223>恰菲埃里希體OMP-1B的氨基酸序列<400>10Met Asn Tyr Lys Lys Ile Phe Val Ser Ser Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Met Ser Ile Leu Pro Tyr Gln Ser Phe Ala Asp Pro Val Thr Ser20 25 30Asn Asp Thr Gly Ile Asn Asp Ser Arg Glu Gly Phe Tyr Ile Ser35 40 45Val Lys Tyr Asn Pro Ser Ile Ser His Phe Arg Lys Phe Ser Ala50 55 60Glu Glu Ala Pro Ile Asn Gly Asn Thr Ser Ile Thr Lys Lys Val65 70 75Phe Gly Leu Lys Lys Asp Gly Asp Ile 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chaffeensis)<220><223>恰菲埃里希體OMP-1C的氨基酸序列<400>11Met Asn Cys Lys Lys Phe Phe Ile Thr Thr Ala Leu Ala Leu Pro5 10 15Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Leu Leu Ser Glu Pro Val Gln Asp20 25 30Asp Ser Val Ser Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro35 40 45Ser Ala Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Asn50 55 60Pro Thr Val Ala Leu Tyr Gly Leu Lys Gln Asp Trp Asn Gly Val65 70 75Ser Ala Ser Ser His Ala Asp Ala Asp Phe Asn Asn Lys Gly Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Ile Glu Phe Glu Val Ser110 115 120Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Gly Asn Tyr Lys Asn125 130 135Asp Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Asp Arg Lys Ala Ser Ser Thr140 145 150Asn Ala Thr Ala Ser His Tyr Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly Leu155 160 165Leu Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Val Val Ser170 175 180Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val Gly Thr185 190 195Asp Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro Lys Ile Ser Tyr200 205 210Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Ala Ser215 220 225Val Phe Val Gly Gly His Phe His Lys Val Ala Gly Asn Glu Phe230 235 240Arg Asp Ile Ser Thr Leu Lys Ala Phe Ala Thr Pro Ser Ser Ala245 250 255Ala Thr Pro Asp Leu Ala Thr Val Thr Leu Ser Val Cys His Phe260 265 270Gly Val Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275 280<210>12<211>286<212>PRT<213>恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis)<220><223>恰菲埃里希體OMP-1D的氨基酸序列<400>12Met Asn Cys Glu Lys Phe Phe Ile Thr Thr Ala Leu Thr Leu Leu5 10 15Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Ser Leu Ser Asp Pro Val Gln Asp20 25 30Asp Asn Ile Ser Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Met Pro35 40 45Ser Ala Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Glu Glu Arg Asn50 55 60Thr Thr Val Gly Val Phe Gly Ile Glu Gln Asp Trp Asp Arg Cys65 70 75Val Ile Ser Arg Thr Thr Leu Ser Asp Ile Phe Thr Val Pro Asn80 85 90Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Leu Phe Ser Gly Phe Ala Gly95 100 105Ala Ile Gly Tyr Ser Met Asp Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Val110 115 120Ser Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Asn 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Ser Gly Lys Tyr Met Pro35 40 45Ser Ala Ser His Phe Gly Met Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Asn50 55 60Pro Thr Val Ala Leu Tyr Gly Leu Lys Gln Asp Trp Glu Gly Ile65 70 75Ser Ser Ser Ser His Asn Asp Asn His Phe Asn Asn Lys Gly Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Ala95 100 105Ile Gly Tyr Ser Met Gly Gly Pro Arg Val Glu Phe Glu Val Ser110 115 120Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asn125 130 135Asp Ala His Arg Tyr Cys Ala Leu Gly Gln Gln Asp Asn Ser Gly140 145 150Ile Pro Lys Thr Ser Lys Tyr Val Leu Leu Lys Ser Glu Gly Leu155 160 165Leu Asp Ile Ser Phe Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Ile Asn170 175 180Glu Ser Ile Pro Leu Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val Gly Thr185 190 195Asp Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Thr Asn Pro Lys Ile Ser Tyr200 205 210Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Ala Ser215 220 225Val Phe Ile Gly Gly His Phe His Lys Val Ile Gly Asn Glu Phe230 235 240Arg Asp Ile Pro Thr Leu Lys Ala Phe Val Thr Ser Ser Ala Thr245 250 255Pro Asp Leu Ala Ile Val Thr Leu Ser Val Cys His Phe Gly Ile260 265 270Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275<210>14<211>280<212>PRT<213>恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis)<220><223>恰菲埃里希體OMP-1F的氨基酸序列<400>14Met Asn Cys Lys Lys Phe Phe Ile Thr Thr Thr Leu Val Ser Leu5 10 15Met Ser Phe Leu Pro Gly Ile Ser Phe Ser Asp Ala Val Gln Asn20 25 30Asp Asn Val Gly Gly Asn Phe Tyr Ile Ser Gly Lys Tyr Val Pro35 40 45Ser Val Ser His Phe Gly Val Phe Ser Ala Lys Gln Glu Arg Asn50 55 60Thr Thr Thr Gly Val Phe Gly Leu Lys Gln Asp Trp Asp Gly Ser65 70 75Thr Ile Ser Lys Asn Ser Pro Glu Asn Thr Phe Asn Val Pro Asn80 85 90Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly95 100 105Ala Val Gly Tyr Leu Met Asn Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu Met110 115 120Ser Tyr Glu Thr Phe Asp Val Lys Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Lys
125 130 135Asn Asp Ala His Lys Tyr Tyr Ala Leu Thr His Asn Ser Gly Gly140 145 150Lys Leu Ser Asn Ala Gly Asp Lys Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu155 160 165Gly Leu Leu Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Val170 175 180Ile Ser Glu Gly Ile Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Val185 190 195Gly Thr Asp Leu Ile Ser Met Phe Glu Ala Ile Asn Pro Lys Ile200 205 210Ser Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Glu215 220 225Ala Ser Val Phe Val Gly Gly His Phe His Lys Val Ile Gly Asn230 235 240Glu Phe Arg Asp Ile Pro Ala Met Ile Pro Ser Thr Ser Thr Leu245 250 255Thr Gly Asn His Phe Thr Ile Val Thr Leu Ser Val Cys His Phe260 265 270Gly Val Glu Leu Gly Gly Arg Phe Asn Phe275 280<210>15<211>284<212>PRT<213>反芻類考德里氏體(Cowdria ruminantium)<220><223>反芻類考德里氏體MAP-1的氨基酸序列<400>15Met Asn Cys Lys Lys Ile Phe Ile Thr Ser Thr Leu Ile Ser Leu5 10 15Val Ser Phe Leu Pro Gly Val Ser Phe Ser Asp Val Ile Gln Glu20 25 30Glu Asn Asn Pro Val Gly Ser Val Tyr Ile Ser Ala Lys Tyr Met35 40 45Pro Thr Ala Ser His Phe Gly Lys Met Ser Ile Lys Glu Asp Ser50 55 60Arg Asp Thr Lys Ala Val Phe Gly Leu Lys Lys Asp Trp Asp Gly65 70 75Val Lys Thr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Ser Ile Phe Thr Glu Lys80 85 90Asp Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala95 100 105Gly Ala Val Gly Tyr Ser Met Asn Gly Pro Arg Ile Glu Phe Glu110 115 120Val Ser Tyr Glu Thr Phe Asp Val Arg Asn Pro Gly Gly Asn Tyr125 130 135Lys Asn Asp Ala His Met Tyr Cys Ala Leu Asp Thr Ala Ser Ser140 145 150Ser Thr Ala Gly Ala Thr Thr Ser Val Met Val Lys Asn Glu Asn155 160 165Leu Thr Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Ala Cys Tyr Asp Ile Met170 175 180Leu Asp Gly Met Pro Val Ser Pro Tyr Val Cys Ala Gly Ile Gly185 190 195Thr Asp Leu Val Ser Val Ile Asn Ala Thr Asn Pro Lys Leu Ser200 205 210Tyr Gln Gly Lys Leu Gly Ile Ser Tyr Ser Ile Asn Pro Glu Ala215 220 225Ser Ile Phe Ile Gly Gly His Phe His Arg Val Ile Gly Asn Glu230 235 240Phe Lys Asp IIe Ala Thr Ser Lys Val Phe Thr Ser Ser Gly Asn245 250 255Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Gly Phe Ala Ser Ala Ile Leu Asp260 265 270Val Cys His Phe Gly Ile Glu Ile Gly Gly Arg Phe Val Phe275 280<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>反芻類考德里氏體MAP-1的核苷酸313-332，也是恰菲埃里希體P28的核苷酸307-326<223>PCR正向引物793<400>16gcaggagctg ttggttactc 20<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>反芻類考德里氏體MAP-1的核苷酸823-843，也是恰菲埃里希體P28的核苷酸814-834<223>PCR反向引物1330<400>17ccttcctcca agttctatgc c 21<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<223>引物46f，對p28-5基因特異性<400>18atatacttcc tacctaatgt ctca24<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<223>用于犬埃里希體28-kDa蛋白基因測序的引物<400>19agtgcagagt cttcggtttc 20<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<223>用于犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因測序的引物<400>20gttacttgcg gaggacat 18<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>犬埃里希體p28-7的核苷酸687-710<223>PCR引物394<400>21gcatttccac aggatcatag gtaa 24<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>犬埃里希體p28-7的核苷酸710-687<223>PCR引物394C<400>22ttacctatga tcctgtggaa atgc 24<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<223>與犬埃里希體p28-7的一個區(qū)域退火的引物793C，用于擴(kuò)增基因p28-6和p28-7基因間區(qū)<400>23gagtaaccaa cagctcctgc 20<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222><223>與鄰近p28-7開放閱讀框的非編碼區(qū)互補(bǔ)的引物EC280M-F<400>24tctactttgc acttccacta ttgt 24<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222><223>與鄰近p28-7的開放閱讀框互補(bǔ)的引物EC280M-R<400>25attcttttgc cactattttt cttt 24<210>26<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<223>對應(yīng)于p28-6內(nèi)區(qū)域的引物ECaSA3-2，用于擴(kuò)增基因p28-6和p28-7之間的基因間區(qū)NC3<400>26ctaggattag gttatagtat aagtt25<210>27<211>23<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><221>PEPTIDE<223>p28-7和p28-6的預(yù)測的N-末端信號肽<400>27Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Met Ser Leu5 10 15Met Tyr Tyr Ala Pro Ser Ile Ser20<210>28<211>25<212>PRT<213>恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis)<220><223>恰菲埃里希體P28的N-末端信號肽的氨基酸序列<400>28Met Asn Tyr Lys Lys Ile Leu Ile Thr Ser Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Ile Ser Ser Leu Pro Gly Val Ser Phe Ser20 25<210>29<211>26<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>p28-7的推測切割位點(diǎn)的氨基酸序列<400>29Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Met Tyr Ser Ile Pro Ser Ile Ser Ser Phe Ser20 25<210>30<211>299<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>基因間非編碼區(qū)1(28NC1)的核酸序列<400>30taatacttct attgtacatg ttaaaaatag tactagtttg cttctgtggt 50ttataaacgc aagagagaaa tagttagtaa taaattagaa agttaaatat 100tagaaaagtc atatgttttt cattgtcatt gatactcaac taaaagtagt 150ataaatgtta cttattaata attttacgta gtatattaaa tttcccttac 200aaaagccact agtattttat actaaaagct atactttggc ttgtatttaa 250tttgtatttt tactactgtt aatttacttt cactgtttct ggtgtaaat 299<210>31<211>345<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>基因間非編碼區(qū)2(28NC2)的核酸序列<400>31taatttcgtg gtacacatat cacgaagcta aaattgtttt tttatctctg 50ctgtatacaa gagaaaaaat agtagtgaaa attacctaac aatatgacag 100tacaagttta ccaagcttat tctcacaaaa cttcttgtgt cttttatctc 150tttacaatga aatgtacact tagcttcact actgtagagt gtgtttatca 200atgctttgtt tattaatact ctacataata tgttaaattt ttcttacaaa 250actcactagt aatttatact agaatatata ttctgacttg tatttgcttt 300atacttccac tattgttaat ttattttcac tattttaggt gtaat 345<210>32<211>345<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>基因間非編碼區(qū)3(28NC3)的核酸序列<400>32tgattttatt gttgccacat attaaaaatg atctaaactt gtttttatta 50ttgctacata caaaaaaaag aaaaatagtg gcaaaagaat gtagcaataa 100gagggggggg ggggactaaa tttaccttct attcttctaa tattctttac 150tatattcaaa tagcacaact caatgcttcc aggaaaatat gtttctaata 200ttttatttat taccaatcct tatataatat attaaatttc tcttacaaaa 250atctctaatg ttttatactt aatatatata ttctggcttg tatttacttt 300gcacttccac tattgttaat ttattttcac tattttaggt gtaat 345<210>33<211>355<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>基因間非編碼區(qū)4(28NC4)的核酸序列<400>33taattttatt gttgccacat attaaaaatg atctaaactt gtttttawta 50ttgctacata caaaaaaaga aaaatagtgg caaaagaatg tagcaataag 100aggggggggg gggaccaaat ttatcttcta tgcttcccaa gttttttcyc 150gctatttatg acttaaacaa cagaaggtaa tatcctcacg gaaaacttat 200cttcaaatat tttatttatt accaatctta tataatatat taaatttctc 250ttacaaaaat cactagtatt ttataccaaa atatatattc tgacttgctt 300ttcttctgca cttctactat ttttaattta tttgtcacta ttaggttata 350ataaw 355<210>34<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物p28-5-818f<400>34ttaaacatat gccacttcgg acta 24<210>35<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物1191<400>35tatgatcgtg taaaattgct gtgagtat 28<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物ECa28-75C<400>36tactggcacg tgctggacta 20<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物ECa5’-1600<400>37caccaataaa tgcagagact tc 22<210>38<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物3125<400>38aatccatcat ttctcattac agtgtg 26<210>39<211>879<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>犬埃里希體p28-1的核酸序列<400>39atgaataata aactcaaatt tactataata aacacagtat tagtatgctt 50attgtcatta cctaatatat cttcctcaaa ggccataaac aataacgcta 100aaaagtacta cggattatat atcagtggac aatataaacc cagtgtttct 150gttttcagta atttttcagt taaagaaacc aatgtcataa ctaaaaacct 200tatagcttta aaaaaagatg ttgactctat tgaaaccaag actgatgcca 250gtgtaggtat tagtaaccca tcaaatttta ctatccccta tacagctgta 300tttcaagata attctgtcaa tttcaatgga actattggtt acacctttgc 350tgaaggtaca agagttgaaa tagaaggttc ttatgaggaa tttgatgtta 400aaaaccctgg aggctataca ctaagtgatg cctatcgcta ttttgcatta 450gcacgtgaaa tgaaaggtaa tagttttaca cctaaagaaa aagtttctaa 500tagtattttt cacactgtaa tgagaaatga tggattatct ataatatctg 550ttatagtaaa tgtttgctac gatttctctt tgaacaattt gtcaatatcg 600ccttacatat gtggaggagc aggggtagat gctatagaat tcttcgatgt 650attacacatt aagtttgcat atcaaagcaa gctaggtatt gcttattctc 700taccatctaa cattagtctc tttgctagtt tatattacca taaagtaatg 750ggcaatcaat ttaaaaattt aaatgtccaa catgttgctg aacttgcaag 800tatacctaaa attacatccg cagttgctac acttaatatt ggttattttg 850gaggtgaaat tggtgcaaga ttgacattt879<210>40<211>293<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>犬埃里希體p28-1蛋白的氨基酸序列<400>40Met Asn Asn Lys Leu Lys Phe Thr Ile Ile Asn Thr Val Leu Val5 10 15Cys Leu Leu Ser Leu Pro Asn Ile Ser Ser Ser Lys Ala Ile Asn20 25 30Asn Asn Ala Lys Lys Tyr Tyr Gly Leu Tyr Ile Ser Gly Gln Tyr35 40 45Lys Pro Ser Val Ser Val Phe Ser Asn Phe Ser Val Lys Glu Thr50 55 60Asn Val Ile Thr Lys Asn Leu Ile Ala Leu Lys Lys Asp Val Asp65 70 75Ser Ile Glu Thr Lys Thr Asp Ala Ser Val Gly Ile Ser Asn Pro80 85 90Ser Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Thr Ala Val Phe Gln Asp Asn Ser95 100 105Val Asn Phe Asn Gly Thr Ile Gly Tyr Thr Phe Ala Glu Gly Thr110 115 120Arg Val Glu Ile Glu Gly Ser Tyr Glu Glu Phe Asp Val Lys Asn125 130 135Pro Gly Gly Tyr Thr Leu Ser Asp Ala Tyr Arg Tyr Phe Ala Leu140 145 150Ala Arg Glu Met Lys Gly Asn Ser Phe Thr Pro Lys Glu Lys Val155 160 165Ser Asn Ser Ile Phe His Thr Val Met Arg Asn Asp Gly Leu Ser170 175 180Ile Ile Ser Val Ile Val Asn Val Cys Tyr Asp Phe Ser Leu Asn185 190 195Asn Leu Ser Ile Ser Pro Tyr Ile Cys Gly Gly Ala Gly Val Asp200 205 210Ala Ile Glu Phe Phe Asp Val Leu His Ile Lys Phe Ala Tyr Gln
215 220 225Ser Lys Leu Gly Ile Ala Tyr Ser Leu Pro Ser Asn Ile Ser Leu230 235 240Phe Ala Ser Leu Tyr Tyr His Lys Val Met Gly Asn Gln Phe Lys245 250 255Asn Leu Asn Val Gln His Val Ala Glu Leu Ala Ser Ile Pro Lys260 265 270Ile Thr Ser Ala Val Ala Thr Leu Asn Ile Gly Tyr Phe Gly Gly275 280 285Glu Ile Gly Ala Arg Leu Thr Phe290 293<210>41<211>840<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>犬埃里希體p28-2的核酸序列<400>41atgaattata agaaaattct agtaagaagc gcgttaatct cattaatgtc 50aatcttacca tatcagtctt ttgcagatcc tgtaggttca agaactaatg 100ataacaaaga aggcttctac attagtgcaa agtacaatcc aagtatatca 150cactttagaa aattctctgc tgaagaaact cctattaatg gaacaaattc 200tctcactaaa aaagttttcg gactaaagaa agatggtgat ataacaaaaa 250aagacgattt tacaagagta gctccaggca ttgattttca aaataactta 300atatcaggat tttcaggaag tattggttac tctatggacg gaccaagaat 350agaacttgaa gctgcatatc aacaatttaa tccaaaaaac accgataaca 400atgatactga taatggtgaa tactataaac attttgcatt atctcgtaaa 450gatgcaatgg aagatcagca atatgtagta cttaaaaatg acggcataac 500ttttatgtca ttgatggtta atacttgcta tgacattaca gctgaaggag 550tatctttcgt accatatgca tgtgcaggta taggagcaga tcttatcact 600atttttaaag acctcaatct aaaatttgct taccaaggaa aaataggtat 650tagttaccct atcacaccag aagtctctgc atttattggt ggatactacc 700atggcgttat tggtaataaa tttgagaaga tacctgtaat aactcctgta 750gtattaaatg atgctcctca aaccacatct gcttcagtaa ctcttgacgt 800tggatacttt ggcggagaaa ttggaatgag gttcaccttc840<210>42<211>280<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>犬埃里希體p28-2蛋白的氨基酸序列<400>42Met Asn Tyr Lys Lys Ile Leu Val Arg Ser Ala Leu Ile Ser Leu5 10 15Met Ser Ile Leu Pro Tyr Gln Ser Phe Ala Asp Pro Val Gly Ser20 25 30Arg Thr Asn Asp Asn Lys Glu Gly Phe Tyr Ile Ser Ala Lys Tyr35 40 45Asn Pro Ser Ile Ser His Phe Arg Lys Phe Ser Ala Glu Glu Thr
50 55 60Pro Ile Asn Gly Thr Asn Ser Leu Thr Lys Lys Val Phe Gly Leu65 70 75Lys Lys Asp Gly Asp Ile Thr Lys Lys Asp Asp Phe Thr Arg Val80 85 90Ala Pro Gly Ile Asp Phe Gln Asn Asn Leu Ile Ser Gly Phe Ser95 100 105Gly Ser Ile Gly Tyr Ser Met Asp Gly Pro Arg Ile Glu Leu Glu110 115 120Ala Ala Tyr Gln Gln Phe Asn Pro Lys Asn Thr Asp Asn Asn Asp125 130 135Thr Asp Asn Gly Glu Tyr Tyr Lys His Phe Ala Leu Ser Arg Lys140 145 150Asp Ala Met Glu Asp Gln Gln Tyr Val Val Leu Lys Asn Asp Gly155 160 165Ile Thr Phe Met Ser Leu Met Val Asn Thr Cys Tyr Asp Ile Thr170 175 180Ala Glu Gly Val Ser Phe Val Pro Tyr Ala Cys Ala G1y Ile Gly185 190 195Ala Asp Leu Ile Thr Ile Phe Lys Asp Leu Asn Leu Lys Phe Ala200 205 210Tyr Gln Gly Lys Ile Gly Ile Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Glu Val215 220 225Ser Ala Phe Ile Gly Gly Tyr Tyr His Gly Val Ile Gly Asn Lys230 235 240Phe Glu Lys Ile Pro Val Ile Thr Pro Val Val Leu Asn Asp Ala245 250 255Pro Gln Thr Thr Ser Ala Ser Val Thr Leu Asp Val Gly Tyr Phe260 265 270Gly Gly Glu Ile Gly Met Arg Phe Thr Phe275 280<210>43<211>828<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>犬埃里希體p28-3的核酸序列<400>43atgaactgta aaaaaattct tataacaact acattggtat cactaacaat 50tcttttacct ggcatatctt tctccaaacc aatacatgaa aacaatacta 100caggaaactt ttacattatt ggaaaatatg taccaagtat ttcacatttt 150gggaactttt cagctaaaga agaaaaaaac acaacaactg gaatttttgg 200attaaaagaa tcatggactg gtggtatcat ccttgataaa gaacatgcag 250cttttaatat cccaaattat tcatttaaat atgaaaataa tccattttta 300ggatttgcag gggtaattgg ctattcaata ggtagtccaa gaatagaatt 350tgaagtatca tacgagacat tcgatgtaca aaatccagga gataagttta 400acaatgatgc acataagtat tgtgctttat ccaatgattc cagtaaaaca 450atgaaaagtg gtaaattcgt ttttctcaaa aatgaaggat taagtgacat 500atcactcatg ttaaatgtat gttatgatat aataaacaaa agaatgcctt 550tttcacctta catatgtgca ggcattggta ctgacttaat attcatgttt 600gacgctataa accataaagc tgcttatcaa ggaaaattag gttttaatta 650tccaataagc ccagaagcta acatttctat gggtgtgcac tttcacaaag 700taacaaacaa cgagtttaga gttcctgttc tattaactgc tggaggactc 750gctccagata atctatttgc aatagtaaag ttgagtatat gtcattttgg 800gttagaattt gggtacaggg tcagtttt 828<210>44<211>276<212>PRT<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>犬埃里希體p28-3蛋白的氨基酸序列<400>44Met Asn Cys Lys Lys Ile Leu Ile Thr Thr Thr Leu Val Ser Leu5 10 15Thr Ile Leu Leu Pro Gly Ile Ser Phe Ser Lys Pro Ile His Glu20 25 30Asn Asn Thr Thr Gly Asn Phe Tyr Ile Ile Gly Lys Tyr Val Pro35 40 45Ser Ile Ser His Phe Gly Asn Phe Ser Ala Lys Glu Glu Lys Asn50 55 60Thr Thr Thr Gly Ile Phe Gly Leu Lys Glu Ser Trp Thr Gly Gly65 70 75Ile Ile Leu Asp Lys Glu His Ala Ala Phe Asn Ile Pro Asn Tyr80 85 90Ser Phe Lys Tyr Glu Asn Asn Pro Phe Leu Gly Phe Ala Gly Val95 100 105Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Ser Pro Arg Ile Glu Phe Glu Val Ser110 115 120Tyr Glu Thr Phe Asp Val Gln Asn Pro Gly Asp Lys Phe Asn Asn125 130 135Asp Ala His Lys Tyr Cys Ala Leu Ser Asn Asp Ser Ser Lys Thr140 145 150Met Lys Ser Gly Lys Phe Val Phe Leu Lys Asn Glu Gly Leu Ser155 160 165Asp Ile Ser Leu Met Leu Asn Val Cys Tyr Asp Ile Ile Asn Lys170 175 180Arg Met Pro Phe Ser Pro Tyr Ile Cys Ala Gly Ile Gly Thr Asp185 190 195Leu Ile Phe Met Phe Asp Ala Ile Asn His Lys Ala Ala Tyr Gln200 205 210Gly Lys Leu Gly Phe Asn Tyr Pro Ile Ser Pro Glu Ala Asn Ile215 220 225Ser Met Gly Val His Phe His Lys Val Thr Asn Asn Glu Phe Arg230 235 240Val Pro Val Leu Leu Thr Ala Gly Gly Leu Ala Pro Asp Asn Leu245 250 255Phe Ala Ile Val Lys Leu Ser Ile Cys His Phe Gly Leu Glu Phe260 265 270Gly Tyr Arg Val Ser Phe275<210>45<211>813<212>DNA<213>犬埃里希體(Ehrlichia canis)<220><223>犬埃里希體p28-9的核酸序列<400>45atgaattaca aaagatttgt tgtaggtgtt acgctgagta catttgtttt 50tttcttatct gatggtgctt tttctgatgc aaatttttct gaagggagga 100gaggacttta tataggtagt cagtataaag ttggtattcc caattttagt 150aatttttcag ctgaagaaac aattcctggt attacaaaaa agatttttgc 200gttaggtctt gataagtctg agataaatac tcacagcaat tttacacgat 250catatgaccc tacttatgca agcagttttg cagggtttag tggtatcatt 300ggatattatg ttaatgactt tagggtagaa tttgaaggtt cttatgagaa 350ttttgaacct gaaagacaat ggtaccctga gaatagccaa agctacaaat 400tttttgcttt gtctcgaaat gctacaaata 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1.一種編碼犬埃里希體30kDa蛋白質(zhì)的分離的DNA序列，其特征在于，所述蛋白質(zhì)與抗犬埃里希體血清具有免疫反應(yīng)性。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID No.2，4，6，40，42，44和46的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征在于，所述蛋白質(zhì)具有N-末端信號序列。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA序列，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是經(jīng)翻譯后修飾成28kDa蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA含有選自SEQ ID No.1，3，5，39，41，43和45的序列。
6.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA包含在犬埃里希體的一個基因座中。
7.如權(quán)利要求6所述的DNA序列，其特征在于，所述基因座是長10,677bp的一個多基因基因座。
8.如權(quán)利要求7所述的DNA序列，其特征在于，所述基因座含有編碼犬埃里希體同源性28kDa蛋白質(zhì)的基因。
9.如權(quán)利要求8所述的DNA序列，其特征在于，所述犬埃里希體的同源性28kDa蛋白選自p28-1，p28-2，p28-3，p28-4，p28-5，p28-6，p28-7，p28-8和p28-9。
10.一種含有權(quán)利要求1所述的DNA序列的載體。
11.如權(quán)利要求10所述的載體，其特征在于，所述載體是一種表達(dá)載體，當(dāng)所述載體被引入細(xì)胞時，能夠表達(dá)選自SEQ ID No.1，3，5，39，41，43和45的序列編碼的肽或多肽。
12.一種重組蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID No.2，4，6，40，42，44和46的氨基酸序列。
13.如權(quán)利要求12所述的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列由含有選自SEQ ID No.1，3，5，39，41，43和45的序列的核酸區(qū)段所編碼。
14.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞含有選自SEQ ID No.1，3，5，39，41，43和45的核酸區(qū)段。
15.一種產(chǎn)生權(quán)利要求12所述的重組蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括步驟獲得含有表達(dá)區(qū)的載體，所述表達(dá)區(qū)含有與啟動子可操縱性連接的、編碼選自SEQ ID No.2，4，6，40，42，44和46的氨基酸序列的序列；將所述載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞；和在有效表達(dá)所述表達(dá)區(qū)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
16.一種抗體，其特征在于，該抗體與含有選自SEQ ID No.2，4，6，40，42，44和46的氨基酸序列的多肽具有免疫反應(yīng)性。
17.一種抑制個體內(nèi)犬埃里希體感染的方法，其特征在于，該方法包括步驟在接觸前或懷疑已接觸，或已感染犬埃里希體時鑒定個體；和以抑制犬埃里希體感染的有效量施用含有犬埃里希體28kDa抗原的組合物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述28kDa抗原是重組蛋白質(zhì)，它含有選自SEQ ID No.2，4，6，40，42，44和46的氨基酸序列。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述重組蛋白質(zhì)由含有選自SEQID No.1，3，5，39，41，43和45的序列的基因編碼。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述含有28kDa抗原的組合物分散于藥物學(xué)上可接受的載體中。
全文摘要
本發(fā)明針對犬埃里希體的一個多形性多基因家族的同源免疫反應(yīng)性28kDa蛋白質(zhì)基因，p28－1、－2、－3、－5、－6、－7、－9的克隆、測序和表達(dá)。還公開了編碼犬埃里希體所有9個同源28kDa蛋白質(zhì)基因的多基因基因座。重組犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)與犬埃里希體感染的犬的恢復(fù)期抗血清反應(yīng)，可用于開發(fā)對于疾病預(yù)防和血清診斷特別有效的疫苗和血清診斷法。
文檔編號A61K39/00GK1473166SQ01818456
公開日2004年2月4日 申請日期2001年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月12日
發(fā)明者D·H·沃克, 于學(xué)杰, J·W·麥克布里奇, D H 沃克, 麥克布里奇 申請人:研究發(fā)展基金會