專利名稱：長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白ptx3在由生長(zhǎng)因子fgf-2激活改變所致疾病的治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白(pentraxin)PTX3(PTX3)或其功能衍生物之一在生產(chǎn)可抑制生長(zhǎng)因子FGF-2生物活性的藥物中的用途，該藥物可用于預(yù)防和治療由生長(zhǎng)因子FGF-2的激活改變而引起的疾病。
具有抗血管生成活性的第一種化合物由Henry Brem和JudathFolkman于1975年在軟骨中發(fā)現(xiàn)(J.Exp.Med.1975 Feb.1；141(2)427-39)。作者認(rèn)為這一發(fā)現(xiàn)能通過(guò)利用病理性新血管生成的選擇性抑制劑用于控制病變，如腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、慢性和急性關(guān)節(jié)炎和糖尿病性視網(wǎng)膜病。
成人的血管生成通常是靜止的，但是，例如在創(chuàng)傷愈合或女性生殖周期的子宮內(nèi)膜重建中，它具有一種正常的功能。
當(dāng)血管功能減退、組織灌注不足時(shí)，生理刺激血管生成反應(yīng)。
更具體而言，可以說(shuō)，在生理?xiàng)l件下，血管生成組成了由于灌注不足或氧和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)減少引起的正反饋，例如，在動(dòng)脈堵塞、組織大量生長(zhǎng)(例如，伴隨肌肉組織形成的新血管形成)以及與氧及營(yíng)養(yǎng)需求增加相關(guān)的工作負(fù)荷增加的情況下發(fā)生。
眾所周知，腫瘤組織良好的血管形成可促進(jìn)原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)。足夠的氧及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)促進(jìn)腫瘤本身快速生長(zhǎng)。
已經(jīng)證實(shí)，血管生成的程度可能是腫瘤預(yù)后中一個(gè)非常不利的因素(van Hinsbergh VW，Collen A，Koolwijk P；Ann.Oncol.，10 Suppl.，460-3，1999；Buolamwini JK；Curr.Opin.Chem.Biol.，3(4)500-9，1999 Aug.)。
在腫瘤領(lǐng)域同樣眾所周知，腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的一個(gè)重要階段是轉(zhuǎn)移能力的獲得。
轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞能夠解除對(duì)于周圍結(jié)構(gòu)的粘附，侵入血管和淋巴管中，并且在本身能夠繼續(xù)增殖的距離外定居于其它組織。
轉(zhuǎn)移也是疾病臨床史中的一個(gè)關(guān)鍵事件，是癌癥所致死亡的主要原因。轉(zhuǎn)移與腫瘤部位或相鄰區(qū)域存在血管組織緊密相關(guān)，后者可促進(jìn)轉(zhuǎn)移。
腫瘤細(xì)胞穿過(guò)周圍結(jié)構(gòu)的遷移能使細(xì)胞到達(dá)腫瘤內(nèi)血管(無(wú)論是預(yù)先存在的還是由于新血管生成而形成的)，從而到達(dá)血流(Ray JM.，Stetler-Stevenson WG；Eur.Respir.J.，7(11)2062-72，1994；Stetler-Stevenson WG，Liotta LA，Kleiner DE Jr；FASEB J.，7(15)1434-41，1993 Dec.)。
腫瘤血管區(qū)中淋巴管與血管之間存在聯(lián)系使得腫瘤細(xì)胞能在這兩種管系統(tǒng)中移動(dòng)。
最近的研究表明，血管生成與關(guān)節(jié)炎疾病之間有直接關(guān)系(KochAE；Arthritis and Rheumatism 41951-962，1998)。特別是已經(jīng)證實(shí)，關(guān)節(jié)軟骨的新血管形成在血管翳的形成和關(guān)節(jié)炎發(fā)展中起重要作用。正常軟骨沒有血管，而關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中含有內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的血管生成刺激因子(EASF)。
該因子的存在與血管形成和軟骨降解有關(guān)。
其它疾病也與異常的血管生成有關(guān)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在糖尿病視網(wǎng)膜病[Histol Histopathol.1999 Oct；14(4)1287-94]、銀屑病[Br J Dermatol.1999 Dec；141(6)1054-60]、慢性炎癥和動(dòng)脈硬化[Planta Med 1998 Dec；64(8)686-95]中，累及組織的新血管形成是一個(gè)促進(jìn)因素。
生長(zhǎng)因子FGF-2是一種18kDa的陽(yáng)離子多肽，它能誘導(dǎo)體內(nèi)新血管生成和細(xì)胞增殖、趨化作用和培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中蛋白酶的產(chǎn)生(Basilico和Moscatelli，1992，Adv.Cancer Res.59115-65)。
FGF-2在腫瘤血管生成中的作用已知(Pathol.Biol.(Paris)1999Apr；47(4)364-7)。
J.Pathol.1999 Sept；189(1)72-8報(bào)告，間皮瘤患者FGF-2表達(dá)增強(qiáng)與這種腫瘤病患者的較強(qiáng)攻擊性和較高死亡率有關(guān)。
Oncogene 1999 Nov 18；18(48)6719-24報(bào)告，F(xiàn)GF-2使大鼠膀胱癌細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移性。
Int.J.Cancer 1999 May 5；81(3)451-8報(bào)告，F(xiàn)GF-2具有強(qiáng)烈的有絲分裂原活性，與人類腫瘤的發(fā)展和其惡性程度的提高有關(guān)。
對(duì)于腫瘤病的治療，抗血管生成治療與標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)化學(xué)治療相比具有下列優(yōu)點(diǎn)(Cancer Research 1998，58，1408-16)1.較高的特異性針對(duì)腫瘤新血管形成過(guò)程；2.較高的biodisponiblility針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞，容易到達(dá)，沒有與傳統(tǒng)化學(xué)治療方法相關(guān)的問(wèn)題(傳統(tǒng)化療直接作用于腫瘤細(xì)胞)；3.較小的化學(xué)抗性這可能是該療法的最重要的優(yōu)點(diǎn)；實(shí)際上，內(nèi)皮細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞在遺傳學(xué)上穩(wěn)定，抗藥性現(xiàn)象是不大可能發(fā)生的；4.較少的轉(zhuǎn)移新血管形成的阻斷限制了腫瘤細(xì)胞通過(guò)血流在身體其它部分增殖；5.促進(jìn)凋亡腫瘤中血管網(wǎng)的阻斷減少了腫瘤細(xì)胞對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)的獲得，這樣凋亡增加；6.全身毒性的降低抗血管生成治療未見有傳統(tǒng)化學(xué)治療的毒副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)和短期脫發(fā)。
為了確定這些作用，F(xiàn)GF-2與靶細(xì)胞表面存在的兩種不同受體類別反應(yīng)具有酪氨酸激酶活性的高親和力受體(FGFR)和以蛋白多糖硫酸乙酰肝素(HSOG)為代表的低親和力受體(Johnson和Williams，1993，Adv.Cancer Res.601-41；Moscatelli，1987，J.Cell.Physiol.131123-30)。
FGF-2是中間平滑肌細(xì)胞的一種強(qiáng)有絲分裂原，是中間平滑肌細(xì)胞在氣囊導(dǎo)管損傷后增殖所必需的(J.Biol.Chem.2000 Apr.14；275(15)11270-7)。
因此，生長(zhǎng)因子FGF-2的激活改變引起的疾病也包括在血管成形術(shù)或“冠狀擴(kuò)張”后再狹窄過(guò)程中發(fā)生的動(dòng)脈肌壁增生[J.Vasc.Surg.1997 Feb；25(2)320-5]。
依賴FGF-2的新血管形成的控制是控制和治愈與血管生成改變有關(guān)的疾病的基本條件之一，控制成纖維細(xì)胞或SMC依賴FGF-2的不受控制的增殖對(duì)于治療與過(guò)度成纖維細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)的結(jié)疤和血管成形術(shù)后的再狹窄非常重要。
獲得特異抑制FGF-2生物活性的新治療化合物是預(yù)防和治療由于該生長(zhǎng)因子激活改變所致疾病的一個(gè)最重要的目標(biāo)。這類疾病包括關(guān)節(jié)炎病、腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移、糖尿病視網(wǎng)膜病、銀屑病、慢性炎癥、動(dòng)脈硬化、與過(guò)度成纖維細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)的結(jié)疤和血管成形術(shù)后的再狹窄。
多種細(xì)胞型，特別是單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在暴露于炎性細(xì)胞因子白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)后表達(dá)PTX3(Bottazzi等人，J.Biol.Chem.1997，27232817-32823)。
迄今為止，PTX3的生物功能尚未完全了解。
PTX3具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與已知的任何分子無(wú)關(guān)的N端域，類似于短五亞基環(huán)蛋白如C反應(yīng)蛋白(CRP)的C端域(Breviario F.等人，J.Biol.Chem.26722190，1992)。
在人PTX3(hPTX3)與動(dòng)物PTX3之間已經(jīng)發(fā)現(xiàn)相當(dāng)程度的相似性。特別是，小鼠PTX3(mPTX3)與hPTX3在DNA序列和基因結(jié)構(gòu)及定位等方面極其相似。人與鼠PTX3基因之間的同一性程度為82％，如果考慮保守置換則達(dá)到90％(Introna M.等人，Blood 87(1996)1862-1872)。鼠PTX3基因位于小鼠染色體3上一個(gè)類似于人3q區(qū)的區(qū)域中(q24-28)，這與已經(jīng)證實(shí)的hPTX3在3q 25區(qū)中的位置一致(Introna M.等人，Blood 87(1996)1862-1872)。
hPTX3與mPTX3序列之間的高度相似性是進(jìn)化過(guò)程中五亞基環(huán)蛋白高度保守的一個(gè)標(biāo)志(Pepys M.B.，Baltz M.L.，Adv.Immunol.34141，1983)。
關(guān)于五亞基環(huán)蛋白的綜述見H.Gewurz等人，Current Opinion inImmunology，1995，754-64。
以本申請(qǐng)人的名字申請(qǐng)的國(guó)際申請(qǐng)WO99/32516描述了長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3在治療傳染病、炎癥或腫瘤中的用途。WO99/32516中描述的PTX3顯示的抗腫瘤活性由白細(xì)胞性(leucocitary)補(bǔ)充介導(dǎo)，即在免疫學(xué)基礎(chǔ)上介導(dǎo)。WO99/32516中沒有描述或提出PTX3作為有效藥物治療與生長(zhǎng)因子FGF-2激活改變相關(guān)的疾病的用途。
US 5767252描述了一種屬于五亞基環(huán)蛋白家族的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(參見引用的參考文獻(xiàn))。該專利涉及神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域。
FGF-2/PTX3之間的相互作用依賴于生長(zhǎng)因子的正確構(gòu)象結(jié)構(gòu)，而不只是依賴于它的基本性質(zhì)，因?yàn)镻TX3不結(jié)合細(xì)胞色素C(具有FGF-2的分子量(18kDa)和等電點(diǎn)(pH9.6)的一種蛋白質(zhì))。
而且，與PTX3同源的C反應(yīng)蛋白不能結(jié)合FGF-2。
因此，本發(fā)明的目的是長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3或其衍生物或其結(jié)構(gòu)域在生產(chǎn)一種藥物中的用途，該藥物用于預(yù)防和治療通過(guò)抑制生長(zhǎng)因子FGF-2的生物活性能夠消除的疾病。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3或PTX3的衍生物或其結(jié)構(gòu)域在生產(chǎn)一種藥物中的用途，該藥物用于預(yù)防和治療由生長(zhǎng)因子FGF-2的激活改變引起的疾病。本發(fā)明的另一個(gè)目的是長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3或其衍生物或其結(jié)構(gòu)域在生產(chǎn)一種藥物中的用途，該藥物用于預(yù)防或治療因血管生成改變引起的疾病，其中生長(zhǎng)因子FGF-2激活的改變促進(jìn)了血管生成的改變，這類疾病的例子有關(guān)節(jié)炎病、腫瘤轉(zhuǎn)移、糖尿病視網(wǎng)膜病、銀屑病、慢性炎癥、動(dòng)脈硬化或腫瘤，其中腫瘤是，例如肉瘤、癌、類癌、骨瘤或神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3或PTX3的衍生物或其結(jié)構(gòu)域在生產(chǎn)一種藥物中的用途，該藥物用于治療與成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞依賴FGF-2的不受控制的增殖有關(guān)的疾病，例如與過(guò)度成纖維細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)的結(jié)疤和血管成形術(shù)后的再狹窄。
根據(jù)本發(fā)明的化合物不僅在作為重組蛋白施用時(shí)，而且在由于其cDNA基因轉(zhuǎn)移而內(nèi)源施用時(shí)，都適用于抑制靶細(xì)胞的FGF-2活性。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是人PTX3的全長(zhǎng)cDNA或其衍生物或其結(jié)構(gòu)域在制備含有該cDNA的質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)載體中的用途，在由生長(zhǎng)因子FGF-2激活改變所致疾病的基因治療中的用途，這類疾病是，例如腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移、與過(guò)度成纖維細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)的結(jié)疤或血管成形術(shù)后的再狹窄。
“長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3”是指任何長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3，無(wú)論其來(lái)源是天然的(人或動(dòng)物)還是合成的。
衍生物是指如上所述的長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3的任何功能類似物，它至少具有一個(gè)突變，保持其選擇性抑制FGF-2的功能。
優(yōu)選的長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3是人PTX3，WO 99/32516描述了它的序列。
此處所述的長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3也能與一種或多種抗癌藥一起使用，治療腫瘤病，其中增強(qiáng)的FGF-2表達(dá)使腫瘤病具有更強(qiáng)的攻擊性或更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。
實(shí)際上，眾所周知，為了避免不希望的副作用，而保持相同的治療效果，大多數(shù)腫瘤患者不是用單種抗癌藥治療，而是用幾種抗癌藥組合治療或用抗癌藥與抗血管生成化合物的組合治療。
許多普通抗癌藥的作用機(jī)制與根據(jù)本發(fā)明的化合物的作用機(jī)制完全不同，實(shí)際上，普通的抗癌藥對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性。
具有不同作用機(jī)制的根據(jù)本發(fā)明的化合物，除了有關(guān)抗腫瘤藥的作用外，還具有治療作用(佐劑作用)。
因此，此處所述的本發(fā)明的另一個(gè)目的是長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3與一種或多種已知抗癌藥的組合。
此處所述的本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種藥用組合物，其含有長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3，和一種或多種已知抗癌藥，如烷化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗微管蛋白劑、嵌入劑、抗代謝物、天然產(chǎn)物，如長(zhǎng)春花生物堿、表鬼臼毒素、抗生素、酶、紫杉烷(taxan)，和細(xì)胞分化劑，以及一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑或載體。
此處所述的本發(fā)明的另一個(gè)目的是長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3以及一種或多種已知抗腫瘤化合物在生產(chǎn)一種腫瘤治療藥物中的用途，其中增強(qiáng)的FGF-2表達(dá)使腫瘤具有更強(qiáng)的攻擊性。
此處所述的本發(fā)明的另一個(gè)目的是長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3以及一種或多種已知抗腫瘤化合物在生產(chǎn)一種預(yù)防發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的用途，其中增強(qiáng)的FGF-2表達(dá)導(dǎo)致更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。
此處所述的本發(fā)明的另一個(gè)目的是長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3以及抗癌化合物在生產(chǎn)一種腫瘤治療藥物中的用途，其特征在于這種長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3作為該抗癌化合物的佐劑。
下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)方法100μl含有1μg FGF-2(或1μg PTX3)的PBS在體積排阻快速蛋白質(zhì)液相層析Superose 12柱(Pharmacia)上層析該柱能根據(jù)分子量分離蛋白質(zhì)。用PBS以等于1ml/min的流速洗脫該柱，收集1ml級(jí)分，用兩種蛋白質(zhì)的特異性抗體進(jìn)行斑點(diǎn)印跡分析。為了估計(jì)PTX3與FGF-2的結(jié)合，這兩種蛋白質(zhì)(分別為5g和1μg)在100μl PBS中混合，在4℃下溫育10分鐘，然后上柱。收集級(jí)分，用抗FGF-2特異性抗體進(jìn)行斑點(diǎn)印跡分析。

圖1報(bào)告的結(jié)果表明，用大約22ml的保留體積從柱上洗脫下FGF-2(18000 D)。在相同條件下，用柱的外水體積(7ml)洗脫下PTX3(450000 D)。在4℃下與PTX3預(yù)溫育10分鐘的FGF-2上柱時(shí)，觀察到層析行為的改變?cè)谠搶?shí)驗(yàn)條件下，用僅等于PTX3的保留體積從柱上洗脫下FGF-2。
實(shí)施例2生物素化PTX3結(jié)合塑料固定的FGF-2的能力100μl含有500ng FGF-2的NaHCO3pH9.6或補(bǔ)體成分C1q在96孔塑料板中4℃溫育18小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，用PBS洗孔3次，然后在室溫下與200μl含有1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的PBS一起溫育2小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，再次用PBS洗孔3次，在100μl PBS中存在含量漸增的生物素化PTX3的情況下，與30ng/ml125I-FGF-2溫育(室溫下2小時(shí))。此外，用含量漸增的FGF-2或C1q吸附孔，與溶于100μl PBS的100ng/ml生物素化PTX3一起溫育。溫育后，用PBS洗孔3次，在室溫下與100μl鏈霉親和素HRP偶聯(lián)物(1/2000)溫育1小時(shí)。加入色原微孔過(guò)氧化物酶底物系統(tǒng)ABTS(Kirkegaard &Perry Laboratories)使反應(yīng)顯色。用自動(dòng)ELISA儀在405nm下讀板。圖2報(bào)告的結(jié)果證實(shí)，固定于塑料孔上的FGF-2能以類似于生理性PTX3配體C1q的方式結(jié)合生物素化PTX3(Bottazzi B.等人，1997，J.Biol.Chem.27232817-32823)。
實(shí)施例3PTX3-FGF-2相互作用的表征在4℃下用100μl含有PTX3或C反應(yīng)蛋白(200nM)的NaHCO3pH9.6包被96孔板，或者用2μg/ml下列蛋白質(zhì)作為陰性對(duì)照牛血清白蛋白、纖連蛋白、明膠或?qū)诱尺B蛋白。溫育后，用PBS洗孔3次，在室溫下用200μl 1mg/ml BSA的PBS溶液阻斷2小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，用PBS洗孔3次，之后在室溫下與30ng125I-FGF-2溫育2小時(shí)。然后用PBS洗孔3次，每孔用200μl 2％SDS水溶液洗滌兩次，回收結(jié)合的125I-FGF-2。用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定125I-FGF-2的水平。圖3報(bào)告的結(jié)果表明，F(xiàn)GF-2結(jié)合塑料固定的PTX3，并且這種結(jié)合是特異的，因?yàn)镕GF-2極少與CRP反應(yīng)，而且不與其它固定蛋白質(zhì)反應(yīng)。
實(shí)施例4在過(guò)量預(yù)冷FGF-2存在下125I-FGF-2與塑料固定的PTX3的結(jié)合在第二組實(shí)驗(yàn)中，在過(guò)量的天然或加熱變性的預(yù)冷FGF-2(100nM)存在下，在類似的細(xì)胞色素C濃縮物存在下，或在過(guò)量的可溶性PTX3(300nM)存在下，檢測(cè)了125I-FGF-2與塑料固定的PTX3的結(jié)合。實(shí)驗(yàn)如上所述進(jìn)行圖4報(bào)告的結(jié)果證實(shí)，預(yù)冷的FGF-2和可溶性PTX3抑制125I-FGF-2與塑料固定的PTX3的相互作用。觀察到加熱滅活的FGF-2和細(xì)胞色素C(與FGF-2有相同的分子量和等電點(diǎn))不能結(jié)合PTX3，這提示與結(jié)合PTX3的能力有關(guān)的是生長(zhǎng)因子的正確構(gòu)象而不是其基本性質(zhì)。
實(shí)施例5FGF-2/PTX3相互作用的解離常數(shù)(Kd)利用該實(shí)驗(yàn)測(cè)定了FGF-2/PTX3相互作用的解離常數(shù)(Kd)。為此，將含量逐漸增加的125I-FGF-2與塑料固定的PTX3一起溫育，通過(guò)Scatchard作圖分析結(jié)合結(jié)果。圖5報(bào)告的結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)GF-2以可飽和的方式結(jié)合PTX3，親和力升高(Kd＝8-16nM)。該親和力類似于以前計(jì)算的PTX3與其生理配體C1q相互作用的親和力。
實(shí)施例6PTX3對(duì)FGF-2結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的影響轉(zhuǎn)化的胎牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞GM7373以80000細(xì)胞/cm2的濃度接種于24孔培養(yǎng)皿中含10％FCS的Eagle’s基本必需培養(yǎng)基中(Eagle’sMEM)。在37℃下24小時(shí)后，用不含F(xiàn)CS的Eagle’s MEM洗滌粘附細(xì)胞兩次，之后在Eagle’s MEM中與125I-FGF-2(10ng/ml)4℃溫育2小時(shí)，Eagle’s MEM中含有0.15％明膠和20mM HEPES pH7.5，含或不含濃度逐漸增加的PTX3。在溫育結(jié)束時(shí)，如Moscatelli，1987，J.Cell.Physiol.131123-30所述，估計(jì)與低親和力受體(HSPG)和高親和力受體(FGFR)結(jié)合的125I-FGF-2的量。簡(jiǎn)言之，用溶于20mMHEPES緩沖液(pH7.5)的2M NaCl漂洗細(xì)胞兩次，除去與低親和力結(jié)合部位結(jié)合的125I-FGF-2，用20mM乙酸鈉(pH4.0)中的2M NaCl漂洗兩次，除去與高親和力結(jié)合部位結(jié)合的125I-FGF-2。在100倍摩爾過(guò)量的未標(biāo)記FGF-2存在下測(cè)定非特異性結(jié)合，從所有數(shù)值中減除。圖6報(bào)告的結(jié)果表明，PTX3能夠以劑量依賴的方式抑制FGF-2與它在內(nèi)皮細(xì)胞上的高親和力及低親和力受體的結(jié)合。
實(shí)施例7PTX3對(duì)FGF-2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有的有絲分裂原活性的影響GM 7373細(xì)胞以75000細(xì)胞/cm2的濃度接種于48孔板中含10％FCS的Eagle’s MEM中。在37℃下24小時(shí)后，用不含F(xiàn)CS的Eagle’sMEM洗滌粘附細(xì)胞兩次，隨后在含或不含F(xiàn)GF(10ng/ml)和濃度漸增的PTX3的條件下，在含0.4％FCS的Eagle’s MEM中37℃溫育24小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)。在一組不同的實(shí)驗(yàn)中，在不同的有絲分裂原刺激物存在下，如上所述處理GM 7373細(xì)胞10％FCS；5μg/ml二酰甘油(DAG)；10ng/ml佛波醇酯(TPA)；30ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)或30ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。圖7報(bào)告的結(jié)果表明，PTX3以劑量依賴的方式抑制FGF-2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有的有絲分裂原活性，ID50等于30nM。該值類似于計(jì)算的FGF-2-PTX3相互作用的Kd。這些結(jié)果提示，PTX3對(duì)FGF-2生物活性的抑制是由于它在胞外部位中的螯合。PTX3對(duì)FGF-2的抑制活性是特異的，因?yàn)楫?dāng)用其它有絲分裂原誘導(dǎo)細(xì)胞增殖時(shí)，檢測(cè)不到這種抑制活性。
實(shí)施例8PTX3對(duì)轉(zhuǎn)化的胎牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響在該實(shí)驗(yàn)中，我們研究了PTX3對(duì)用編碼FGF-2的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系MAE3F2T增殖的影響(Gualandris等人，1996，Cell Growth Diff.7147-60)。這些細(xì)胞能夠響應(yīng)內(nèi)源FGF-2誘導(dǎo)的自分泌刺激環(huán)而增殖(Gualandris等人，1996，Cell Growth Diff.7147-60)。MAE3F2T細(xì)胞以10000/cm2的濃度接種于48孔板中添加10％FCS的Dulbecco培養(yǎng)基(DMEM)中。在37℃下24小時(shí)后，用不含F(xiàn)CS的DMEM洗滌粘附細(xì)胞兩次，在含或不含PTX3(70nM)、抗FGF-2特異性抗體或蘇拉明(50μg/ml)的條件下，在含0.4％FCS的DMEM中37℃溫育72小時(shí)。已知蘇拉明具有螯合胞外FGF-2及抑制其生物活性的能力(Rusnati等人，1996，Mol.Biol.Cell.7369-381)。在溫育結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用胰蛋白酶消化并用Burker計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。圖8報(bào)告的結(jié)果表明，PTX3能夠以類似于抗FGF-2抗體和蘇拉明的方式，阻斷FGF-2在MAE3F2T細(xì)胞中誘導(dǎo)的自分泌刺激環(huán)，抑制其依賴FGF-2的增殖。
實(shí)施例9PTX3對(duì)FGF-2體內(nèi)誘導(dǎo)的新血管形成的影響用雞胚尿囊絨膜(CAM)試驗(yàn)體內(nèi)檢測(cè)PTX3的抗血管生成能力。簡(jiǎn)言之，在3日齡雞受精卵的蛋殼上打開一個(gè)口。在第8天將明膠海綿植入CAM上，用10μl單獨(dú)的PBS或含有FGF-2(500ng/海綿)的PBS吸附，其中含或不含PTX3(5μg/海綿)(每組5-6個(gè)胚)。4天后，在Zeiss SR立體顯微鏡下體內(nèi)觀察CAM，由兩名不了解待測(cè)樣品的研究人員對(duì)血管生成反應(yīng)打分，分級(jí)為0-4+的任意標(biāo)度，0代表沒有血管生成反應(yīng)，4+代表最強(qiáng)的活性。圖9報(bào)告的結(jié)果表明，PTX3能阻斷FGF-2在體內(nèi)誘導(dǎo)的新血管形成。
實(shí)施例10利用PTX3的基因治療用克隆到商品表達(dá)載體pLXSH(Clontech)中的人PTX3全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)染過(guò)量表達(dá)FGF-2的鼠內(nèi)皮細(xì)胞，稱為FGF2MAE3F2T(Gualandris等人，1996，Cell Growth Diff.7147-60)。
對(duì)獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行體外研究，研究PTX3過(guò)量表達(dá)對(duì)FGF2MAE3F2T細(xì)胞依賴FGF-2的增殖及其對(duì)三維血纖蛋白凝膠的攻擊行為的影響。
詳細(xì)地說(shuō)，將表達(dá)不同水平PTX3的幾種FGF2MAE3F2T克隆和親代FGF2MAE3F2T細(xì)胞(不產(chǎn)生PTX3)以10000/cm2的濃度接種于48孔板中添加10％FCS的Dulbecco培養(yǎng)基(DMEM)中。在37℃下24小時(shí)后，用不含F(xiàn)CS的DMEM洗滌粘附細(xì)胞兩次，在含有0.4％FCS的DMEM中37℃溫育不同時(shí)間。在溫育結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用胰蛋白酶消化并用Burker計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。圖10報(bào)告的結(jié)果表明，PTX3的過(guò)量表達(dá)抑制FGF2MAE3F2T細(xì)胞的增殖，抑制的程度與檢測(cè)的不同克隆產(chǎn)生的PTX3的量有關(guān)。
為了評(píng)價(jià)過(guò)量表達(dá)PTX3的FGF2MAE3F2T克隆對(duì)三維血纖蛋白凝膠的攻擊行為，嚴(yán)格如述(Gualandris等人，1996，Cell Growth Diff.7147-60)在瓊脂糖包被的平板上制備細(xì)胞聚集體。將這些聚集體接種到血纖蛋白包被的48孔板上。接種后立即向每孔中加入250μl含血纖蛋白原(2.5mg/ml)和凝血酶(250mU/ml)的無(wú)鈣培養(yǎng)基，將凝膠置于37℃下5分鐘。然后向凝膠上部加上500μl培養(yǎng)基。在所有實(shí)驗(yàn)中，都向凝膠和培養(yǎng)基中加入200KIU/ml的纖維蛋白溶解抑制劑抑肽酶(trasylol)，以防止底物的分解。2天后通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析估計(jì)放射狀生長(zhǎng)的細(xì)胞胞芽的形成。
圖11報(bào)告的結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)PTX3的FGF2MAE3F2T克隆的攻擊能力顯著低于親代FGF2MAE3F2T細(xì)胞。
獲得的結(jié)果證實(shí)，當(dāng)在cDNA基因轉(zhuǎn)移后內(nèi)源產(chǎn)生時(shí)，PTX3抑制內(nèi)皮細(xì)胞的FGF-2活性。
因此，根據(jù)本發(fā)明的化合物能按照已知的方法在基因治療方案中使用(In Vivo.1998 Jan-Feb；12(1)59-67；In Vivo.1998 Jan-Feb；12(1)35-41；In Vivo.1994 Nov-Dec；8(5)771-80)，用于治療因生長(zhǎng)因子FGF-2激活改變引起的疾病。
權(quán)利要求
1.長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3或其衍生物或其結(jié)構(gòu)域在生產(chǎn)一種藥物中的用途，該藥物用于預(yù)防和治療通過(guò)抑制生長(zhǎng)因子FGF-2的生物活性能夠消除的疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中這種疾病是由生長(zhǎng)因子FGF-2的激活改變引起的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中生長(zhǎng)因子FGF-2的激活改變導(dǎo)致與成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞不受控制的增殖有關(guān)的疾病。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中這種疾病選自與過(guò)度成纖維細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)的結(jié)疤和血管成形術(shù)后的再狹窄。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中生長(zhǎng)因子FGF-2的激活改變導(dǎo)致血管生成改變。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中由血管生成改變引起的疾病選自關(guān)節(jié)炎病、腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移、糖尿病視網(wǎng)膜病、銀屑病、慢性炎癥和動(dòng)脈硬化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中腫瘤選自肉瘤、癌、類癌、骨瘤或神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
8.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3是天然存在的PTX3。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3是人PTX3。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7的用途，其中長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3是合成來(lái)源的PTX3。
11.編碼長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3或其衍生物或其結(jié)構(gòu)域的cDNA的用途，用于制備含有該cDNA的表達(dá)載體，用于由生長(zhǎng)因子FGF-2激活改變所致疾病的基因治療。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中含有編碼PTX3或其衍生物的基因的cDNA由質(zhì)?；虿《据d體攜帶。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中該疾病選自腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移、與過(guò)度成纖維細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)的結(jié)疤和血管成形術(shù)后的再狹窄。
14.長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3與一種或多種已知抗癌藥的組合。
15.含有權(quán)利要求14的組合作為活性成分以及一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑或載體的藥用組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中該抗癌藥選自烷化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗微管蛋白劑、嵌入劑、抗代謝物、天然產(chǎn)物，如長(zhǎng)春花生物堿、表鬼臼毒素、抗生素、酶、紫杉烷，和細(xì)胞分化劑。
17.長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3與一種或多種已知抗癌藥在生產(chǎn)腫瘤治療藥物中的用途，其中增強(qiáng)的FGF-2表達(dá)使腫瘤具有更強(qiáng)的攻擊性。
18.長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3與一種或多種已知抗癌藥在生產(chǎn)預(yù)防發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的用途，其中增強(qiáng)的FGF-2表達(dá)導(dǎo)致更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的用途，其特征在于長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3作為抗癌藥的佐劑。
全文摘要
描述了長(zhǎng)五亞基環(huán)蛋白PTX3或其功能衍生物之一在藥物生產(chǎn)中的用途，該藥物可抑制生長(zhǎng)因子FGF－2的生物活性，可用于預(yù)防和治療由生長(zhǎng)因子FGF－2的激活改變引起的疾病。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1473050SQ01818563
公開日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2001年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月8日
發(fā)明者A·曼托瓦尼, B·博塔茲, M·普雷斯塔, M·拉斯納蒂, A 曼托瓦尼, 姿顧, 鼓傻 申請(qǐng)人:希格馬托制藥工業(yè)公司