專利名稱：移植用組織等價(jià)物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及移植用組織等價(jià)物及其制造方法，特別地涉及在體外培養(yǎng)的，含有移植對(duì)象細(xì)胞并在培養(yǎng)后可向生物體移植的三維結(jié)構(gòu)的移植用組織等價(jià)物及其制造方法。
作為移植用組織等價(jià)物，已知在片狀或薄膜狀的載體上播種·培養(yǎng)細(xì)胞得到的二維等價(jià)物、或在立體的海綿狀(多孔體)的載體上培養(yǎng)細(xì)胞制得的三維等價(jià)物等。這種移植用組織等價(jià)物被制作成細(xì)胞的分布狀態(tài)比較均勻。即，在為了修復(fù)如軟骨損傷等立體損傷的三維組織等價(jià)物的構(gòu)筑中，與二維組織等價(jià)物的構(gòu)筑不同，播種細(xì)胞、進(jìn)行組織培養(yǎng)以便使細(xì)胞也分布在組織等價(jià)物的厚度方向。
但是，對(duì)于三維組織等價(jià)物，在使細(xì)胞比較均勻地分布的狀態(tài)下形成組織是非常困難的。特別是在構(gòu)筑具有一定厚度的大型組織等價(jià)物時(shí)，營養(yǎng)物大多不能充分?jǐn)U散至內(nèi)部。因此，制作這種細(xì)胞分布比較均勻的大型組織等價(jià)物時(shí)，需要長的培養(yǎng)期間，或以高的細(xì)胞密度播種細(xì)胞。
另一方面，由于組織等價(jià)物的硬度與細(xì)胞密度或產(chǎn)生基質(zhì)密切相關(guān)，即使在使細(xì)胞達(dá)到均勻狀態(tài)來培養(yǎng)的情況，根據(jù)移植部位，存在細(xì)胞密度過高、組織等價(jià)物過硬的情況。這種過硬的組織等價(jià)物，柔軟性差、即使移植入生物體內(nèi)與移植周圍部分的融合性也不充分、有可能脫落。反之，若細(xì)胞密度過低，由于在組織修復(fù)時(shí)消耗時(shí)間、而且向移植周圍部分的固定也消耗時(shí)間，因此在固定前的期間內(nèi)有可能脫落。
本發(fā)明鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的問題，目的在于提供一種可制造比較大型的移植用組織等價(jià)物，可迅速進(jìn)行移植后的向組織周圍部分的固定，抑制脫落的移植用組織等價(jià)物和這種移植用組織等價(jià)物的制造方法。
這樣的本發(fā)明的移植用組織等價(jià)物，由于在表面的至少一部分上具有移植對(duì)象細(xì)胞或細(xì)胞基質(zhì)豐富的細(xì)胞層，移植時(shí)該細(xì)胞層與移植面接觸，移植后向組織周邊部分的親和性升高。而且，本發(fā)明的移植用組織等價(jià)物，由于在其內(nèi)部具有比該細(xì)胞層更低的移植對(duì)象細(xì)胞或細(xì)胞基質(zhì)濃度，且主要由細(xì)胞培養(yǎng)載體構(gòu)成的載體層，因此可以賦予移植用組織等價(jià)物適當(dāng)?shù)娜彳浶裕軌虼_保與移植周圍部分的融合性。由此，可獲得在移植用組織等價(jià)物總體中未均勻地分布移植對(duì)象細(xì)胞，對(duì)生物體的親和性良好、且與移植周圍部分的融合性優(yōu)異的組織等價(jià)物。在移植用組織等價(jià)物在組織周圍部分固定后，細(xì)胞培養(yǎng)載體成為細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，在體內(nèi)(生物體內(nèi))進(jìn)行組織重建，移植部分被同種組織重建。
另外，本發(fā)明提供一種在體外培養(yǎng)的，含有移植對(duì)象細(xì)胞并且培養(yǎng)后可向生物體移植的三維結(jié)構(gòu)的移植用組織等價(jià)物的制造方法，其特征在于包括，在構(gòu)筑上述三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體上包埋移植對(duì)象細(xì)胞的包埋工序，和將可培養(yǎng)上述移植對(duì)象細(xì)胞的培養(yǎng)基供給包埋了上述移植對(duì)象細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)載體的供給工序，和在上述細(xì)胞培養(yǎng)載體的表面的上述移植對(duì)象細(xì)胞的增殖率比上述細(xì)胞載體內(nèi)部高的條件下培養(yǎng)，并在該細(xì)胞培養(yǎng)載體的至少一部分表面上，上述移植對(duì)象細(xì)胞密度比上述細(xì)胞培養(yǎng)載體的內(nèi)部更高，形成細(xì)胞密度不同的兩層的培養(yǎng)工序。
在這樣的本發(fā)明的移植用細(xì)胞等價(jià)物的制造方法中，由于在包埋了移植對(duì)象細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)載體的表面上移植對(duì)象細(xì)胞的增殖率升高的條件下培養(yǎng)、形成細(xì)胞密度不同的兩層，因此通過進(jìn)行培養(yǎng)，可以分別在細(xì)胞培養(yǎng)載體的表面上形成移植對(duì)象細(xì)胞多的層、在內(nèi)部形成移植對(duì)象細(xì)胞少的層。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種在體外培養(yǎng)的，含有移植對(duì)象細(xì)胞且培養(yǎng)后可向生物體移植的三維結(jié)構(gòu)的移植用組織等價(jià)物的制造方法，其特征在于包括，混合在培養(yǎng)基中可以維持立體結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性載體和移植對(duì)象細(xì)胞的混合工序，和將通過上述混合工序得到的混合物播種在預(yù)先被載置的三維載體的至少一部分表面上的播種工序，和在上述流動(dòng)性載體的至少一部分中、培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到實(shí)質(zhì)上移植對(duì)象細(xì)胞成為密集狀態(tài)的培養(yǎng)工序。
這樣的本發(fā)明的移植用組織等價(jià)物的制造方法，由于在細(xì)胞培養(yǎng)載體表面的至少一部分播種移植對(duì)象細(xì)胞、形成細(xì)胞密度不同的兩層，因此可以容易地在細(xì)胞培養(yǎng)載體的表面?zhèn)刃纬梢浦矊?duì)象細(xì)胞豐富的層。
這種組織等價(jià)物10具有后述的由培養(yǎng)載體構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)。組織等價(jià)物10的大小雖然根據(jù)移植場(chǎng)所的大小而有所不同，但是一般地具有1～10mm的厚度、優(yōu)選為2～5mm。
組織等價(jià)物10具備內(nèi)側(cè)的載體部分12和表面?zhèn)鹊募?xì)胞層14。
載體部分12雖然由構(gòu)建組織等價(jià)物10的三維結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)載體、和在移植組織中適合的移植細(xì)胞構(gòu)成，但是主要由培養(yǎng)載體構(gòu)成，移植細(xì)胞的分布比后述細(xì)胞層14少。
培養(yǎng)載體還具有適合移植細(xì)胞培養(yǎng)的組成，因此，在培養(yǎng)載體中可以成長·增殖移植細(xì)胞。作為這種培養(yǎng)載體，雖然可以使用具有適于在生物體內(nèi)移植的組成的載體、但是優(yōu)選為生物體吸收性材料或生物體親和性材料。特別地可以列舉，膠原、透明質(zhì)酸、多聚輪烷(polyrotaxane)、明膠、纖連蛋白、肝素、甲殼質(zhì)、殼聚糖、昆布氨酸、褐藻酸鈣、多聚輪烷水凝膠，它們可以單獨(dú)或者兩種或以上組合使用。
培養(yǎng)載體構(gòu)筑組織等價(jià)物10的三維結(jié)構(gòu)，決定組織等價(jià)物10總體的結(jié)構(gòu)。這樣的培養(yǎng)載體的三維結(jié)構(gòu)不僅提供移植細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，也提供與生物體相近的培養(yǎng)環(huán)境。因此，特別是在軟骨組織或骨組織的再生中使用的培養(yǎng)載體，雖然有必要顯示三維結(jié)構(gòu)，但是只要是可以構(gòu)筑三維結(jié)構(gòu)，可以為任何形態(tài)的載體，特別優(yōu)選為凝膠狀或海綿狀。
細(xì)胞層14連續(xù)地在載體部分12的外側(cè)，被配置在組織等價(jià)物10的大約整個(gè)周圍。細(xì)胞層14和載體部分12相同，雖然都是由培養(yǎng)載體和移植細(xì)胞或產(chǎn)生基質(zhì)構(gòu)成，但是比載體部分12含有更多的移植細(xì)胞。在細(xì)胞層14的移植細(xì)胞的細(xì)胞密度和載體部分12內(nèi)部的細(xì)胞密度相比，只要是實(shí)質(zhì)上密就可以，優(yōu)選實(shí)質(zhì)的密集狀態(tài)、即、密集相鄰的細(xì)胞之間是連續(xù)的。
若在組織等價(jià)物10的表面上形成移植細(xì)胞層，則細(xì)胞層14的厚度多厚都可以，但是優(yōu)選為20～500μm、特別優(yōu)選為100～200μm。若比20μm薄，由于不能充分發(fā)揮作為含有移植細(xì)胞的組織等價(jià)物10的功能，所以不優(yōu)選。另外，比500μm厚的細(xì)胞層，考慮到作為移植物過硬的情況、或者由于培養(yǎng)時(shí)間被延長、制作時(shí)費(fèi)時(shí)而沒有效率，所以不優(yōu)選。
可在組織等價(jià)物10的細(xì)胞層14和載體部分12兩方面都存在的移植細(xì)胞是成為移植對(duì)象的細(xì)胞，可以根據(jù)組織等價(jià)物10的移植目的地進(jìn)行適宜的選擇。在這種移植細(xì)胞中，雖然只要是可向生物體移植的細(xì)胞都可以，但是優(yōu)選通過組織等價(jià)物10的三維結(jié)構(gòu)能有效地增殖的細(xì)胞，可以列舉軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞和它們的前體細(xì)胞。這些細(xì)胞可以單獨(dú)使用，或者根據(jù)成為移植目的地的生物體部位組合2種或以上使用。
這些移植細(xì)胞，可以根據(jù)細(xì)胞的種類用對(duì)應(yīng)的公知的采集方法從生物體進(jìn)行采集。雖然可以將采集的細(xì)胞原樣使用，但是根據(jù)情況，可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)規(guī)定的時(shí)間后，包埋入培養(yǎng)載體中。
移植細(xì)胞在組織等價(jià)物10中，由于產(chǎn)生與移植適應(yīng)性細(xì)胞的增殖或移植環(huán)境的適應(yīng)性等相關(guān)的細(xì)胞基質(zhì)，所以組織等價(jià)物10除了移植細(xì)胞外、也可以含有由細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞基質(zhì)。該細(xì)胞基質(zhì)的濃度由于和移植細(xì)胞的基質(zhì)產(chǎn)生能力及細(xì)胞數(shù)相關(guān)，因此與載體部分12相比細(xì)胞層14中的濃度更高。細(xì)胞基質(zhì)可以是由密集的移植細(xì)胞產(chǎn)生的，也可以是從外部添加的細(xì)胞基質(zhì)。該移植細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)都是賦予組織等價(jià)物10向生物體的生著能力和組織等價(jià)物10的硬度的物質(zhì)。
因此，由于組織等價(jià)物10在最外層具有含有豐富的移植細(xì)胞或移植細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞層14，向生物體的生著率高，而且即使經(jīng)過很長時(shí)間也不脫落、可以原樣固定。在內(nèi)側(cè)的載體部分12中，由于細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞基質(zhì)的量都比細(xì)胞層14少，組織等價(jià)物10的柔軟性與細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞基質(zhì)的量成比例地富有，因此從生物體適應(yīng)性的觀點(diǎn)來看，可以將組織等價(jià)物10總體的硬度·柔軟性調(diào)整為良好的值。進(jìn)一步，組織等價(jià)物10由于周圍具有細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)豐富的細(xì)胞層14，在移植后迅速被固定，固定后、被移植的組織等價(jià)物10作為基礎(chǔ)在體內(nèi)(生物體內(nèi))可以良好地再生組織。
下面，對(duì)于組織等價(jià)物10的制造方法進(jìn)行說明。
組織等價(jià)物10可以通過下述工序得到，該工序包括將上述移植細(xì)胞在培養(yǎng)載體中包埋的工序，和將培養(yǎng)基供給包埋后的培養(yǎng)載體的工序，和在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的培養(yǎng)工序。
在包埋工序中，移植細(xì)胞和培養(yǎng)載體通過常規(guī)方法被混合(以下，指細(xì)胞-載體混合物)。此時(shí)，移植細(xì)胞的播種密度雖然依賴于預(yù)定的培養(yǎng)期間或培養(yǎng)載體的種類、培養(yǎng)基的組成，但是一般地，適合為1×104個(gè)/ml～1×108個(gè)/ml、優(yōu)選為約2×104個(gè)/ml～2×107個(gè)/ml、進(jìn)一步優(yōu)選為約2×105個(gè)/ml～約2×106個(gè)/ml。另外，除非另有說明，播種密度表示在培養(yǎng)載體中包埋的狀態(tài)下的密度。在此范圍外高效率地形成細(xì)胞密度或基質(zhì)密度高的細(xì)胞層14是困難的，而且，特別是若比此范圍的播種密度少，則由于增殖率不充分，到形成雙層結(jié)構(gòu)為止的時(shí)間變長，所以不優(yōu)選。
在供給工序中，可培養(yǎng)移植對(duì)象細(xì)胞的培養(yǎng)基被提供給在培養(yǎng)載體中包埋得到的細(xì)胞-載體混合物中。
在培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)選為液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)使用的中成為培養(yǎng)基基礎(chǔ)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，可使用任何在移植細(xì)胞通常的培養(yǎng)中使用的公知的培養(yǎng)基。在這種培養(yǎng)基中，可以列舉例如杜爾貝科改良的伊格爾極限必需培養(yǎng)基(DMEM)等。培養(yǎng)基的供給，在液體培養(yǎng)基的情況下，如通常一般進(jìn)行的，通過注入充分量的液體培養(yǎng)基以使具有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞-載體混合物總體成為液面下來進(jìn)行。在培養(yǎng)載體中包埋得到的細(xì)胞-載體混合物原樣被載置在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)器中后，將培養(yǎng)基供給該細(xì)胞-培養(yǎng)混合物。
培養(yǎng)工序是在包埋入載體的移植細(xì)胞的增殖率在載體的表面升高的條件下進(jìn)行的。這樣的高增殖率條件通過移植細(xì)胞的細(xì)胞種類、播種密度、培養(yǎng)基的組成、相對(duì)于載體培養(yǎng)基的浸透能等、或它們的組合來進(jìn)行選擇。
作為高增殖率條件的一例，可以列舉，對(duì)應(yīng)于移植細(xì)胞種類選擇在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加胎牛血清(FBS)等特定種類的血清、增殖因子等。例如，在兔軟骨細(xì)胞的情況下優(yōu)選胎牛血清(FBS)。另外，通過適宜選擇在可迅速轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)增殖期的播種密度、或該播種密度和對(duì)載體的浸透率高的培養(yǎng)基的組合可以實(shí)現(xiàn)高增殖率。
另外，在向作為高增殖率條件的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加的物質(zhì)中，可以列舉抗壞血酸。通過向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加抗壞血酸，可以提高細(xì)胞的基質(zhì)產(chǎn)生能力或增殖能力。其結(jié)果，與組織等價(jià)物10的內(nèi)側(cè)相比，在多數(shù)培養(yǎng)基容易浸透的表面?zhèn)?，由于通過抗壞血酸的作用能產(chǎn)生很多的基質(zhì)，因此可以形成比載體部分12的產(chǎn)生基質(zhì)量多的細(xì)胞層14。
這里使用的抗壞血酸，若是通常該領(lǐng)域中使用的L型的話，只要是未失去生理活性，可以使用鹽、水合物等任何形態(tài)?？梢粤信e例如，L-抗壞血酸-2-磷酸、L-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽、抗壞血酸-2-硫酸鈉鹽、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗壞血酸(維生素C-2-葡糖苷)等穩(wěn)定型的抗壞血酸。作為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加的抗壞血酸，在以L-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽n水合物的形態(tài)添加時(shí)，可以10～300μg/ml、優(yōu)選50～200μg/ml的量添加。
特別是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加的抗壞血酸，由于在液體中分解的性質(zhì)，優(yōu)選維持在冷凍保存的狀態(tài)下，被混合在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的狀態(tài)下冷凍保存，優(yōu)選例如被保存在-5～-20℃下的抗壞血酸。
培養(yǎng)工序可以只在至少在細(xì)胞-載體混合物中細(xì)胞增殖，在組織等價(jià)物10的表面?zhèn)群蛢?nèi)側(cè)形成細(xì)胞數(shù)不同的雙層的期間內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選到構(gòu)成細(xì)胞層14的細(xì)胞成為在表面連續(xù)的大致密集的狀態(tài)為止。由于培養(yǎng)工序在高增殖率條件下進(jìn)行，組織等價(jià)物10的細(xì)胞層14迅速形成。在組織等價(jià)物10的表面部分中，由于與培養(yǎng)基全面接觸，例如，通過選擇增殖率高的培養(yǎng)基，可以縮短培養(yǎng)期間。成為該狀態(tài)的時(shí)間根據(jù)播種密度和培養(yǎng)基的組成而不同，例如，在2×106個(gè)/ml的播種密度時(shí)，為2～3周。
組織等價(jià)物10的細(xì)胞層14配置在載體部分12的外側(cè)的幾乎全周上。為了獲得具有沿外周的細(xì)胞層14的組織等價(jià)物10，首先，在培養(yǎng)期間中，從培養(yǎng)器剝下組織等價(jià)物10。從培養(yǎng)器中剝下的組織等價(jià)物10由于飄浮在培養(yǎng)基中，因此在該狀態(tài)下通過繼續(xù)培養(yǎng)工序，沿培養(yǎng)基接觸的外周形成細(xì)胞層14。
因此，按照本發(fā)明，不考慮內(nèi)部的細(xì)胞密度，可以高效地制造對(duì)生物體的生著率和固定良好的組織等價(jià)物10，即使可以得到的細(xì)胞數(shù)量少，也可以比較容易地提供大型三維結(jié)構(gòu)的組織等價(jià)物。另外，組織等價(jià)物10中，由于不需要直到內(nèi)部為止細(xì)胞均勻地分布，與均勻分布的等價(jià)物相比，可以更迅速地制造。
這樣的組織等價(jià)物10，與移植周邊組織的融合性優(yōu)異，被比較快地固定在移植周邊組織上，可以減少脫落的可能性。
另外，在組織等價(jià)物10中，在包埋工序中，混合移植細(xì)胞和培養(yǎng)載體，雖然在載體部分12中也含有移植細(xì)胞，但若在細(xì)胞層14中存在細(xì)胞或細(xì)胞基質(zhì)的話，則在載體部分12中不存在細(xì)胞也可以。這樣的在載體部分12中不含有細(xì)胞的組織等價(jià)物可以通過預(yù)先在培養(yǎng)器中設(shè)置培養(yǎng)載體，然后在培養(yǎng)載體的表面上播種載體-細(xì)胞混合物并開始培養(yǎng)得到。
此時(shí)使用的載體，雖然可使用與上述相同的凝膠狀或海綿狀的載體，但是與移植細(xì)胞混合時(shí)具有流動(dòng)性。通過使用這種流動(dòng)性的載體，僅在預(yù)先設(shè)置在培養(yǎng)器中的載體的表面上配置或涂布就可以適度地被覆其表面。培養(yǎng)期間可以為移植細(xì)胞至少在載體的一部分密集化的時(shí)間，或從細(xì)胞到產(chǎn)生適當(dāng)量的細(xì)胞基質(zhì)為止的時(shí)間。由此，可以用比較簡(jiǎn)單的作業(yè)和短時(shí)間形成雙層結(jié)構(gòu)。因此，可以容易地制作對(duì)生物體融合性高的三維結(jié)構(gòu)的組織等價(jià)物20。
另外，在組織等價(jià)物10中，雖然沿其外周具有細(xì)胞層14，但由于只有在移植時(shí)在與生物體的接觸面上形成細(xì)胞層14，就可以在組織等價(jià)物的固定性等中發(fā)揮作用，因此也可以不沿全周存在，而在表面上的至少一部分上形成細(xì)胞層14。
圖2表示其它組織等價(jià)物20。在該組織等價(jià)物20中，在外周的一部分具有未形成細(xì)胞層14的地方。該組織等價(jià)物20由于不需要沿外周全部形成細(xì)胞層14，因此可以比沿全周形成細(xì)胞層14用更短的時(shí)間制作。
這樣的組織等價(jià)物20可以通過在培養(yǎng)器上開始培養(yǎng)后，不從培養(yǎng)器上剝下，終止培養(yǎng)工序容易地得到。
另外，圖3表示成為其它變形例的組織等價(jià)物30。在該組織等價(jià)物30中，形成細(xì)胞層14的區(qū)域變得比載體部分12露出的部分小。這樣的組織等價(jià)物30被移植時(shí)使在全周的一部分形成的細(xì)胞層14與生物體接觸。由于與生物體接觸的細(xì)胞層14對(duì)向生物體的固著有貢獻(xiàn)，所以可以得到與上述相同的結(jié)果。
這樣的組織等價(jià)物30可以通過沿厚度方向切斷上述組織等價(jià)物20容易地得到。因此，由于可使組織等價(jià)物30的形狀與移植部位的形狀相符合，提高與生物體的密著性，所以可更迅速地實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的固定和組織再生，而且可以抑制脫落。
以下，雖然列舉一實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行具體的說明，但是本發(fā)明并不僅限于此。
放置的混合液在5％CO2、37℃的條件下靜置0.5～1小時(shí)使其凝膠化，加入培養(yǎng)基，開始培養(yǎng)。培養(yǎng)基中使用調(diào)整為含有50μg/ml抗壞血酸(L-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽n水合物C6H6O9P·3/2Mg·nH2O；日光ケミカルズ株式會(huì)社制)和100μg/ml透明質(zhì)酸的10v/v％FBS(胎牛血清)-DMEM(杜爾貝科改良的伊格爾極限必需培養(yǎng)基)，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)3周。
在3周的包埋培養(yǎng)后，得到直徑約10mm、厚度約3mm的組織等價(jià)物。為了確認(rèn)該組織等價(jià)物的形態(tài)，用常規(guī)方法對(duì)作為軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)的酸性粘多糖類阿爾斯藍(lán)染色，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行Kernechtrot染色后，用顯微鏡觀察剖面時(shí)，確認(rèn)形成細(xì)胞密度不同的細(xì)胞層和載體層的雙層。
圖5A和B是經(jīng)過了3周包埋培養(yǎng)的軟骨組織剖面的阿爾斯藍(lán)染色圖像。觀察圖5，產(chǎn)生的酸性粘多糖類密集在膠原凝膠表面，在凝膠內(nèi)部只形成幾個(gè)菌叢。此時(shí)細(xì)胞層的厚度大約為100～200μm。而且，從作為軟骨的特征產(chǎn)生基質(zhì)的II型膠原的染色像(圖6A和B)也可以觀察到同樣的結(jié)果。
得到的組織等價(jià)物在表面上豐富地存在軟骨組織細(xì)胞密集的細(xì)胞基質(zhì)，與此相對(duì)，在內(nèi)部不存在細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞基質(zhì)量，因此若在厚度方向施加負(fù)荷會(huì)產(chǎn)生適度的變形，可知有適宜的硬度。
在表1中，分別用×表示幾乎看不到雙層結(jié)構(gòu)的情況，△表示可以看到一部分雙層結(jié)構(gòu)的情況，○表示可以看到雙層結(jié)構(gòu)的情況。
由該結(jié)果可知，在任何播種密度，在規(guī)定期間的培養(yǎng)后都可以提供組織等價(jià)物。另外，以2×105個(gè)/100μl載體播種的情況下從10天左右開始，以2×106個(gè)/100μl載體播種的情況下在10天以內(nèi)開始，在組織等價(jià)物表面的一部分上形成雙重結(jié)構(gòu)，表示可迅速作為移植片使用。表1

實(shí)施例7、比較例1～2除了作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用10v/v％FBS-DMEM，只添加50μg/ml抗壞血酸(L-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽n水合物)的培養(yǎng)基(實(shí)施例7)、只添加100μg/ml透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基(比較例1)、不添加添加物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(比較例2)作為培養(yǎng)用培養(yǎng)基外，與實(shí)施例1相同地進(jìn)行培養(yǎng)操作。
圖8為在實(shí)施例1、圖9為在實(shí)施例7、

圖10為在比較例1、圖11為在比較例2的條件下培養(yǎng)3周的軟骨組織剖面的阿爾斯藍(lán)染色圖像。從這些剖面染色圖像可以明確，在作為添加物加入抗壞血酸的實(shí)施例1和7(圖8和9)中，在培養(yǎng)軟骨組織的表面形成細(xì)胞層，成為雙層結(jié)構(gòu)。與此相反，在比較例1和2(圖10和11)中不形成細(xì)胞層。
表2是以實(shí)施例1制作的培養(yǎng)軟骨細(xì)胞為基準(zhǔn)來表示實(shí)施例1和7、比較例1和2的培養(yǎng)軟骨組織的雙重結(jié)構(gòu)的有無、基質(zhì)產(chǎn)生和細(xì)胞數(shù)的表。表中“基準(zhǔn)”表示實(shí)施例7，比較例1和2的基質(zhì)產(chǎn)生和細(xì)胞數(shù)與實(shí)施例1的這些方面相比時(shí)作為基礎(chǔ)。
表2

由這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在實(shí)施例1的培養(yǎng)條件下，通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加抗壞血酸，可以在培養(yǎng)軟骨組織表面上有效地形成細(xì)胞層。
培養(yǎng)操作雖然和實(shí)施例1相同地進(jìn)行，但低溫保存或冷凍保持在培養(yǎng)開始時(shí)配制的上述培養(yǎng)用培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基交換時(shí)，僅分別將必要量從保存狀態(tài)返回可使用狀態(tài)來使用，培養(yǎng)3周。另外，實(shí)施例1中每次培養(yǎng)基交換要配制新的培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)基交換。圖12為在冷凍保存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的軟骨組織剖面(實(shí)施例8)的阿爾斯藍(lán)染色圖像，圖13為在低溫保存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的軟骨組織剖面(比較例3)的阿爾斯藍(lán)染色圖像。
表3是以實(shí)施例1制作的培養(yǎng)軟骨細(xì)胞為基準(zhǔn)來表示實(shí)施例8和比較例3的培養(yǎng)軟骨組織的雙重結(jié)構(gòu)的有無、基質(zhì)產(chǎn)生和細(xì)胞數(shù)的表。表中“基準(zhǔn)”表示實(shí)施例8和比較例3的基質(zhì)產(chǎn)生和細(xì)胞數(shù)與實(shí)施例1的該方面相比時(shí)作為基礎(chǔ)。表3

由這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明確，雖然在冷凍保存培養(yǎng)基中形成了細(xì)胞層，但在低溫保存培養(yǎng)基中細(xì)胞層的形成非常少。這可推測(cè)為由于抗壞血酸在液體中具有氧化分解或加水分解的特性，如果在液體的狀態(tài)下低溫保存，其活性緩慢地降低，不形成細(xì)胞層。與此相反，認(rèn)為在冷凍保存中被保存在固體的狀態(tài)下，由于可以抑制抗壞血酸的活性降低，形成了細(xì)胞層。
由于即使是這種含抗壞血酸的培養(yǎng)基，根據(jù)保存方法其活性(效果)變化，因此有可能形成沒有細(xì)胞層的培養(yǎng)軟骨組織。由此可知，在培養(yǎng)基中抗壞血酸的活性與細(xì)胞層的形成密切相關(guān)。
圖14為測(cè)定實(shí)施例1和實(shí)施例7～8，以及比較例1～3的活細(xì)胞數(shù)的圖。在形成了細(xì)胞層的實(shí)施例1、實(shí)施例7和實(shí)施例8中，可以明確活細(xì)胞數(shù)多，細(xì)胞增殖活性升高。
發(fā)明的實(shí)用性本發(fā)明的移植用組織等價(jià)物可以容易地提供在短時(shí)間內(nèi)可移植、富具與移植周邊組織的融合性的大型移植用組織等價(jià)物。由此，在可用的細(xì)胞數(shù)量少的情況，或必須由少數(shù)細(xì)胞數(shù)迅速形成大型三維結(jié)構(gòu)的組織等價(jià)物時(shí)，特別地有用。該組織等價(jià)物10，富具與移植周邊組織的融合性，比較快地被固定在移植周邊組織中，可以減少脫落的可能性。
權(quán)利要求
1.一種在體外培養(yǎng)的，含有移植對(duì)象細(xì)胞并且培養(yǎng)后可向生物體內(nèi)移植的三維結(jié)構(gòu)的移植用組織等價(jià)物，其特征在于，具備主要以構(gòu)筑三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體構(gòu)成的載體層、和在上述移植用組織等價(jià)物表面的至少一部分上、在上述載體層上局部連續(xù)存在、上述移植對(duì)象細(xì)胞或細(xì)胞基質(zhì)比上述載體層更豐富的細(xì)胞層。
2.如權(quán)利要求1記載的移植用組織等價(jià)物，其特征在于，上述細(xì)胞層由密集的上述移植對(duì)象細(xì)胞構(gòu)成，或者進(jìn)一步含有由密集的移植對(duì)象細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞基質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1記載的移植用組織等價(jià)物，其特征在于，在上述細(xì)胞層中存在的移植對(duì)象細(xì)胞的密度相對(duì)于上述載體層內(nèi)部的細(xì)胞密度實(shí)質(zhì)的密。
4.如權(quán)利要求1記載的移植用組織等價(jià)物，其特征在于，上述細(xì)胞層的厚度為20～500μm。
5.如權(quán)利要求1記載的移植用組織等價(jià)物，其特征在于，上述細(xì)胞培養(yǎng)載體是生物體吸收性材料或生物體親和性材料。
6.如權(quán)利要求1記載的移植用組織等價(jià)物，其特征在于，上述細(xì)胞培養(yǎng)載體是膠原、透明質(zhì)酸和多聚輪烷(polyrotaxane)中的至少一種。
7.如權(quán)利要求1記載的移植用組織等價(jià)物，其特征在于，上述細(xì)胞是軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞。
8.一種在體外培養(yǎng)的，含有移植對(duì)象細(xì)胞并且培養(yǎng)后可向生物體移植的三維結(jié)構(gòu)的移植用組織等價(jià)物的制造方法，其特征在于包括，在構(gòu)筑上述三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體上包埋移植對(duì)象細(xì)胞的包埋工序，和將可培養(yǎng)上述移植對(duì)象細(xì)胞的培養(yǎng)基供給包埋了上述移植對(duì)象細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)載體的供給工序，和在上述細(xì)胞培養(yǎng)載體的表面的上述移植對(duì)象細(xì)胞的增殖率比上述細(xì)胞載體內(nèi)部高的條件下培養(yǎng)，并在該細(xì)胞培養(yǎng)載體的至少一部分表面上，上述移植對(duì)象細(xì)胞密度比上述細(xì)胞培養(yǎng)載體的內(nèi)部更高、形成細(xì)胞密度不同的兩層的培養(yǎng)工序。
9.如權(quán)利要求8記載的移植用組織等價(jià)物的制造方法，其特征在于，上述培養(yǎng)基含有抗壞血酸。
10.如權(quán)利要求9記載的移植用組織等價(jià)物的制造方法，其特征在于，含有上述抗壞血酸的培養(yǎng)基是被冷凍保存的培養(yǎng)基。
11.如權(quán)利要求8記載的移植用組織等價(jià)物的制造方法，其特征在于，以1×104～1×108個(gè)/ml的播種密度在上述細(xì)胞培養(yǎng)載體中包埋上述移植對(duì)象細(xì)胞。
12.一種在體外培養(yǎng)的，含有移植對(duì)象細(xì)胞并且培養(yǎng)后可向生物體移植的三維結(jié)構(gòu)的移植用組織等價(jià)物的制造方法，其特征在于包括，混合在培養(yǎng)基中可以維持立體結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性載體和移植對(duì)象細(xì)胞的混合工序，和將通過上述混合工序得到的混合物播種在預(yù)先被載置的三維載體的至少一部分表面上的播種工序，和在上述流動(dòng)性載體的至少一部分中，培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到實(shí)質(zhì)上移植對(duì)象細(xì)胞成為密集狀態(tài)的培養(yǎng)工序。
全文摘要
本發(fā)明的移植用組織等價(jià)物，是在體外培養(yǎng)的含有移植對(duì)象細(xì)胞并且培養(yǎng)后可向生物體內(nèi)移植的三維結(jié)構(gòu)的移植用組織等價(jià)物，其特征在于具備主要以構(gòu)筑三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體構(gòu)成的載體層，和在上述移植用組織等價(jià)物表面的至少一部分上、在上述載體層上局部連續(xù)存在、上述移植對(duì)象細(xì)胞或細(xì)胞基質(zhì)比上述載體層更豐富的細(xì)胞層。本移植用組織等價(jià)物適合成為比較大型的移植用組織等價(jià)物。本移植用組織等價(jià)物，可以實(shí)現(xiàn)移植后向組織周邊部分的早期固定和抑制脫落。
文檔編號(hào)A61L27/38GK1477979SQ01819903
公開日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2001年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月6日
發(fā)明者越智光夫, 內(nèi)尾祐司, 河崎賢三, 加藤雅一, 山本剛之, 福島里佳, 久留島豐一, 一, 三, 豐一, 之, 佳, 司 申請(qǐng)人:越智光夫, 株式會(huì)社日本組織工程, 科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團(tuán)