專利名稱：通過(guò)控制胸腺的再生改善移植物的接受度的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物的細(xì)胞、組織和器官移植領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明屬于通過(guò)刺激胸腺產(chǎn)生移植耐受，特別是對(duì)同種異體抗原和異種抗原的耐受。
與本發(fā)明相關(guān)的背景技術(shù)免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)的主要功能是把“外源性”抗原與“自體”抗原區(qū)分開并且做出相應(yīng)的應(yīng)答以保護(hù)機(jī)體免受感染。在正常的免疫應(yīng)答中，事件的序列包括專用的抗原呈遞細(xì)胞(APC)捕獲外源性抗原并把它處理成小的肽鏈片段，然后在APC表面呈現(xiàn)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子的裂片。MHC分子可以為表達(dá)在所有有核細(xì)胞上的I類分子(被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Tc)識(shí)別)，或者主要表達(dá)在免疫系統(tǒng)細(xì)胞上的II類分子(被輔助T淋巴細(xì)胞(Th)識(shí)別)。這些細(xì)胞識(shí)別APC上的MHCII/肽復(fù)合物并且發(fā)生應(yīng)答；然后，這些細(xì)胞釋放因子，促進(jìn)對(duì)特定的抗原有特異性的Tc細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞活化。事實(shí)上所有的免疫應(yīng)答中Th細(xì)胞的重要性在HIV/AIDS中具有最好的體現(xiàn)，由于病毒的破壞造成它們的缺乏，引起嚴(yán)重免疫缺陷，最終導(dǎo)致死亡。Th不適常的發(fā)育(在較小程度上的Tc)能導(dǎo)致多種其它疾病，例如過(guò)敏癥、癌癥和自身免疫病。
抗原識(shí)別能力有賴于T和B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜受體。這些受體是由許多可能的基因通過(guò)一系列復(fù)雜的重排隨機(jī)生成的，以致每個(gè)T或B細(xì)胞都有獨(dú)特的抗原受體。這種巨大的潛在的多樣性意味著對(duì)于機(jī)體可能遇到的任何一種抗原，都會(huì)有多種淋巴細(xì)胞能夠通過(guò)不同程度的結(jié)合強(qiáng)度(親和力)識(shí)別它并且做出不同程度的應(yīng)答。由于抗原受體的特異性隨機(jī)地出現(xiàn)，因此出現(xiàn)了關(guān)于機(jī)體為什么通過(guò)淋巴細(xì)胞反抗自身抗原不會(huì)“自毀”的問(wèn)題。幸好，有幾種防止T和B細(xì)胞這樣做的機(jī)制，它們共同創(chuàng)造一種免疫系統(tǒng)對(duì)自身耐受的情況。
自身耐受最有效的形式是把任何具有潛在自身反應(yīng)性的淋巴細(xì)胞在它們生成的部位清除(殺死)(對(duì)于T細(xì)胞是胸腺，對(duì)于B細(xì)胞是骨髓)。這就是所謂的中樞耐受。另一種重要的耐受方法是通過(guò)調(diào)節(jié)Th細(xì)胞直接抑制自身反應(yīng)性細(xì)胞或更可能是通過(guò)細(xì)胞因子抑制自身反應(yīng)性細(xì)胞。假定事實(shí)上所有的免疫應(yīng)答都需要通過(guò)輔助性T細(xì)胞啟動(dòng)和調(diào)節(jié)，任何誘導(dǎo)耐受的方法的主要目標(biāo)都將是這些細(xì)胞。同樣地，由于Tc是非常重要的效應(yīng)細(xì)胞，它們的產(chǎn)生是諸如抗癌和抗病毒之類治療的主要靶點(diǎn)。
胸腺胸腺經(jīng)證實(shí)是免疫系統(tǒng)的主要器官，因?yàn)樗钱a(chǎn)生T淋巴細(xì)胞的主要部位。它的作用是吸引血液中適當(dāng)?shù)脑从诠撬璧那绑w細(xì)胞并且誘導(dǎo)它們對(duì)T細(xì)胞譜系的支持，包括生成T細(xì)胞抗原受體(TCR)所必須的基因重排。與之對(duì)應(yīng)的是程度明顯細(xì)胞分裂，從而T細(xì)胞數(shù)量增加，由此導(dǎo)致每種外源性抗原均能被識(shí)別和清除的可能性增加。然而，T細(xì)胞抗原識(shí)別的一個(gè)特性在于不同于B細(xì)胞，TCR僅僅識(shí)別與MHC分子相結(jié)合的肽鏈片段；在正常情況下這是自體MHC，并且這種能力是在胸腺中進(jìn)行選擇的。此過(guò)程稱為陽(yáng)性選擇，并且是皮質(zhì)上皮細(xì)胞的特性。如果TCR不能與自身MHC/肽復(fù)合物結(jié)合，T細(xì)胞則由于“疏忽”死亡，它的繼續(xù)成熟需要通過(guò)TCR傳遞的某種程度的信號(hào)。
盡管胸腺對(duì)于功能性免疫系統(tǒng)是必需的，每天將其T細(xì)胞含量的約1％釋放到血流中，但是哺乳動(dòng)物存在一種明顯異常，即此器官由于性類固醇的生成而嚴(yán)重萎縮。這種現(xiàn)象甚至可能在兒童期開始，但從青春期開始加重。對(duì)于正常的健康個(gè)體，失去生成和釋放新的T細(xì)胞的能力并非總會(huì)產(chǎn)生臨床后果(雖然隨著年齡的增長(zhǎng)，免疫失調(diào)在發(fā)病率和嚴(yán)重性方面會(huì)增加)。在T細(xì)胞有大量損失的時(shí)候，例如，在接受化療或放療之后，愛滋病患者由于免疫抑制而非常容易患病。
然而許多T細(xì)胞將發(fā)育為能夠通過(guò)高親和力偶然識(shí)別自體MHC/肽復(fù)合物。這種T細(xì)胞有潛在的自身反應(yīng)性，并可能引起嚴(yán)重的自身免疫疾病，例如，多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。幸好，如果TCR對(duì)自身MHC/肽復(fù)合物的親和力在胸腺中太高，發(fā)育中的胸腺細(xì)胞將被誘導(dǎo)自殺激活和通過(guò)細(xì)胞凋亡而死亡，此過(guò)程稱為陰性選擇。這是所謂的中樞耐受。這樣的T細(xì)胞將死亡而不是發(fā)生應(yīng)答，因?yàn)樵谛叵僦兴鼈內(nèi)匀皇遣怀墒斓?。在胸腺中最有力的陰性選擇誘導(dǎo)物是被稱為樹突狀細(xì)胞(DC)的抗原呈遞細(xì)胞(APC)。作為APC，它們向T細(xì)胞傳遞最強(qiáng)的信號(hào)；從而在胸腺中導(dǎo)致清除，在T細(xì)胞更為成熟的外周淋巴器官中引起DC活化。
胸腺萎縮胸腺在很大程度上受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的雙向聯(lián)系的影響(Kendall，1988)。尤其是垂體、腎上腺和性腺之間涉及胸腺功能的相互作用，包括營(yíng)養(yǎng)的(促甲狀腺素或TSH和生長(zhǎng)激素或GH)和萎縮的影響(促黃體激素或LH、促卵泡刺激素或FSH，和促腎上腺皮質(zhì)激素或ACTH)兩種作用(Kendall，1988；Homo-Delarche，1991)。事實(shí)上胸腺的一個(gè)生理學(xué)特征為在青春期隨著循環(huán)中的性類固醇激素生成的逐漸增加胸腺在結(jié)構(gòu)和功能方面進(jìn)行性衰亡(Hirokawa和Makinodan，1975；Tosi等，1982和Hirokawa等，1994)。激素的準(zhǔn)確靶點(diǎn)及其誘導(dǎo)胸腺萎縮的機(jī)制仍不確定。由于胸腺是產(chǎn)生和維持外周T細(xì)胞庫(kù)的主要部位，所以這種萎縮已被廣泛地假定為在老年人中免疫失調(diào)的發(fā)病率增加的主要原因。特別地，一些由于T細(xì)胞依賴的免疫功能(如溶細(xì)胞T-細(xì)胞活性和促有絲分裂反應(yīng))下降導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)缺陷可致晚年免疫缺陷、自身免疫病和腫瘤的發(fā)病率增加(Hirokawa，1998)。
胸腺萎縮的影響反映在外周，由于胸腺對(duì)T細(xì)胞庫(kù)的輸入減少導(dǎo)致外周T細(xì)胞受體(TCR)全部組成部分的多樣性降低。另外，還可觀察到細(xì)胞因子分布圖的改變(Hobbs等，1993；Kurashima等，1995)，CD4+和CD8+亞群的變化以及傾向于生成記憶T細(xì)胞而非幼稚T細(xì)胞(Mackall等，1995)。此外，胸腺生成(thymopoiesis)的效率隨著年齡降低，以致免疫系統(tǒng)最終失去在T-細(xì)胞損耗之后再生正常T-細(xì)胞的能力(Mackall等人，1995)。然而，Douek等人(1998)最近的工作表明胸腺的輸出甚至在老年人體內(nèi)也可能發(fā)生。TCR基因重排時(shí)切除的DNA產(chǎn)物被用來(lái)證明在老年患者感染HIV之后循環(huán)中重新產(chǎn)生幼稚T細(xì)胞。這種輸出速率和隨后的外周T細(xì)胞庫(kù)再生的速率需要進(jìn)一步進(jìn)行研究，因?yàn)榻?jīng)過(guò)化療的患者表明與青春期前的患者相比，青春期后的患者T細(xì)胞庫(kù)(尤其是CD4+T細(xì)胞)的再生速率大大降低(Mackall等，1995)。這在Timm和Thoman最近的工作(1999)中被進(jìn)一步說(shuō)明，他們已經(jīng)證明雖然老年小鼠在骨髓移植(BMT)后CD4+T細(xì)胞可以再生，但是由于老年外周微環(huán)境，它們似乎更傾向于向記憶細(xì)胞分化，同時(shí)胸腺生成幼稚T細(xì)胞的能力低。
胸腺主要由散布在各種基質(zhì)細(xì)胞(以上皮細(xì)胞亞群為主)間的發(fā)育中的胸腺細(xì)胞組成，這些基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成微環(huán)境并且提供對(duì)于T細(xì)胞的最佳發(fā)育必不可少的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞間相互作用。在胸腺細(xì)胞和上皮細(xì)胞亞群之間控制它們的分化和成熟的共生發(fā)育關(guān)系意味著性-類固醇抑制可能發(fā)生在任一種可以影響其他細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞類型水平上(Boyd等，1993)。胸腺細(xì)胞自身有內(nèi)在缺陷的可能性較小，因?yàn)橄惹袄梅派湫郧逗象w的研究已表明骨髓(BM)干細(xì)胞不受年齡影響(Hirokawa，1998；Mackall和Gress，1997)并且有與年輕BM細(xì)胞類似的胸腺種群再生潛力。此外，胸腺細(xì)胞在老年的動(dòng)物中至少在一定程度上保留了其分化能力(Mackall和Gress，1997；George和Ritter，1996；Hirokawa等，1994)。然而，Aspinall最近的工作(1997)已經(jīng)證明在前體CD3-CD4-CD8-三陰性(TN)群體內(nèi)有發(fā)生在TCRγ鏈基因重排階段的缺陷。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明披露了有關(guān)改變宿主T-細(xì)胞群對(duì)來(lái)自非同一或配型不合供體的移植物應(yīng)答性的方法。在優(yōu)選的實(shí)施例中，老年患者(青春期后的)的萎縮的胸腺被重新激活。重新激活的胸腺能夠從血液中吸收造血前體細(xì)胞并且在胸腺中把它們轉(zhuǎn)化成新的T細(xì)胞和DC細(xì)胞。然后，后者的DC誘導(dǎo)后來(lái)的T細(xì)胞對(duì)與前體細(xì)胞供體有相同的組織相容性的移植物的耐受。這大大改善了同種移植的接受度。
這些方法以破壞傳向所述胸腺的的性類固醇介導(dǎo)的信號(hào)為基礎(chǔ)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，閹割被用來(lái)破壞性類固醇介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。在優(yōu)選的實(shí)施例中，使用化學(xué)閹割。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，使用外科手術(shù)閹割。閹割使胸腺的狀態(tài)逆轉(zhuǎn)到青春期前的狀態(tài)，從而將它重新激活。
在一個(gè)特定的實(shí)施例中，用LHRH的激動(dòng)劑或拮抗劑、抗雌激素抗體、抗雄激素抗體、被動(dòng)的(抗體)或主動(dòng)的(抗原)抗LHRH的疫苗接種或?qū)追N方法結(jié)合起來(lái)(“阻斷劑”)阻斷傳向胸腺的性激素介導(dǎo)的信號(hào)。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，阻斷劑是用肽緩釋劑配方給藥的。肽緩釋劑配方的例子是在WO 98/08533中提供的，其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此作為參考。
在本發(fā)明中，來(lái)自供體的造血或淋巴干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞被移植到受體體內(nèi)，從而形成對(duì)來(lái)自供體的移植物的耐受。在一個(gè)實(shí)施例中，這恰好發(fā)生在胸腺重新激活之前、之時(shí)或之后不久。在另一個(gè)實(shí)施例中，這發(fā)生在T細(xì)胞清除開始之時(shí)或期間。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，細(xì)胞是CD34+前體細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)要描述

圖1A和B閹割前后胸腺細(xì)胞數(shù)量的變化。胸腺萎縮導(dǎo)致胸腺細(xì)胞數(shù)隨年齡顯著減少。閹割后兩周，細(xì)胞數(shù)已增加到年輕成體的水平。閹割后三周，細(xì)胞數(shù)從年輕成體水平顯著地增加并在閹割后4周達(dá)到穩(wěn)定。***＝與年輕成體(2月)的胸腺有顯著性差異，p＜0.001圖2A-C(A)脾細(xì)胞數(shù)隨年齡和閹割后保持不變。在外周B∶T細(xì)胞比也保持不變(B)，但CD4∶CD8的比值隨著年齡顯著降低(p＜0.001)并在閹割后4周恢復(fù)到正常年輕的水平。
圖3隨著年齡和閹割后CD4對(duì)CD8胸腺細(xì)胞群體的熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)的分布圖。每個(gè)象限的百分?jǐn)?shù)在每張圖的上方給出。胸腺細(xì)胞的亞群隨年齡保持恒定，而閹割后存在胸腺細(xì)胞的同步增殖。
圖4通過(guò)結(jié)合BrdU脈沖檢測(cè)胸腺細(xì)胞的增殖。增殖的胸腺細(xì)胞的比例不因年齡和閹割改變。
圖5A-D年齡和閹割對(duì)胸腺細(xì)胞亞群的增殖的影響。(A)組成總增殖群體的每個(gè)亞群的比例——CD8+T細(xì)胞在增殖群體內(nèi)的比例顯著地增加。(B)每個(gè)亞群中增殖細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)——TN和CD8亞群在兩年時(shí)比兩個(gè)月時(shí)增殖顯著減少。閹割后兩周，TN已恢復(fù)到正常年輕的增殖水平，而CD8群的增殖有顯著的增加。在閹割后4周其增殖水平與正常的年輕相當(dāng)。(C)總的TN增殖隨年齡和閹割后保持不變。然而，(D)隨著年齡增長(zhǎng)TN1亞群的增殖顯著降低，在閹割后4周仍未回到正常水平。***＝高度顯著性，p＜0.001，**＝顯著，p＜0.01圖6小鼠胸腺內(nèi)注射FITC。24小時(shí)后計(jì)數(shù)外周FITC+細(xì)胞的數(shù)目。雖然新近的胸腺遷移細(xì)胞(RTE)比例隨著年齡始終保持在大約胸腺細(xì)胞數(shù)的1％，但在閹割后兩周顯著減少，在RTE細(xì)胞數(shù)方面隨著年齡顯著(p＜0.01)減少。閹割后，雖然這些數(shù)值逐漸增加，但閹割2周后仍然顯著低于年輕小鼠。在CD4+對(duì)CD8+的RTE比率方面已看到隨著年齡顯著增加，而且這是在閹割后一周恢復(fù)正常的。
圖7A-C用環(huán)磷酰胺(一種化療藥)處理后胸腺(A)、脾(B)和淋巴結(jié)(C)細(xì)胞數(shù)的變化。請(qǐng)注意在處理后一周和兩周與未閹割(只有環(huán)磷酰胺)組對(duì)比閹割動(dòng)物胸腺的迅速增殖。此外，閹割組脾和淋巴結(jié)的細(xì)胞數(shù)目與單獨(dú)用環(huán)磷酰胺組相比有很大增加。到4周時(shí)，細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到正常(n＝每個(gè)處理組和時(shí)間點(diǎn)3-4)。
圖8A-C在外科手術(shù)閹割一周后放射處理(625拉德)，胸腺(A)、脾(B)和淋巴結(jié)(C)的細(xì)胞數(shù)目的變化。請(qǐng)注意在處理后一周和兩周與未閹割(只有放射處理)組相比閹割動(dòng)物胸腺的迅速增殖。(n＝每個(gè)處理組和時(shí)間點(diǎn)3-4)。
圖9A-C在同一天進(jìn)行放射處理和閹割后，胸腺(A)、脾(B)和淋巴結(jié)(C)的細(xì)胞數(shù)目的變化。請(qǐng)注意在處理后兩周與未閹割組相比閹割動(dòng)物胸腺的迅速增殖。然而，觀察到的差異不如小鼠在處理前一周被閹割時(shí)(圖7)那樣明顯。(n＝每個(gè)處理組和時(shí)間點(diǎn)3-4)。
圖10在同一天用環(huán)磷酰胺(一種化療藥)處理，外科手術(shù)或化學(xué)閹割之后，胸腺(A)、脾(B)和淋巴結(jié)(C)的細(xì)胞數(shù)目的變化。請(qǐng)注意在處理后一周和兩周與未閹割(只有環(huán)磷酰胺)組相比閹割動(dòng)物胸腺的迅速增殖。此外，閹割組脾和淋巴結(jié)的細(xì)胞數(shù)目與單獨(dú)用環(huán)磷酰胺組相比有很大增加。(n＝每個(gè)處理組和時(shí)間點(diǎn)3-4)。在用環(huán)磷酰胺處理后，化學(xué)閹割與外科手術(shù)閹割在免疫系統(tǒng)再生方面作用相當(dāng)。
圖11用單純性皰疹病毒-1(HSV-1)進(jìn)行足底免疫后淋巴結(jié)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。請(qǐng)注意與未閹割的老年組相比閹割的老年組細(xì)胞數(shù)量增加。底部的圖說(shuō)明在CD25細(xì)胞對(duì)CD8細(xì)胞上用FACS進(jìn)行門控時(shí)激活細(xì)胞總數(shù)。
圖12A-CHSV-1接種后，在激活的LN(淋巴結(jié))中CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)Vβ10的表達(dá)。請(qǐng)注意在老年小鼠中克隆應(yīng)答的減弱和閹割后預(yù)期反應(yīng)的恢復(fù)。
圖13A-C閹割恢復(fù)對(duì)HSV-1免疫的應(yīng)答性。(a)與年輕的和閹割小鼠相比老年小鼠感染后總淋巴結(jié)細(xì)胞構(gòu)成顯著減少。(b)HSV-1感染小鼠的LN中活化(CD8+CD25+)細(xì)胞的代表性FACS分布圖。未發(fā)現(xiàn)活化CTL的比例隨年齡或閹割出現(xiàn)差異。(c)老年小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞構(gòu)成減少是通過(guò)活化CTL的數(shù)目顯著減少反映的。老年小鼠閹割后可以恢復(fù)對(duì)HSV-1的免疫反應(yīng)，其CTL數(shù)目與年輕小鼠相等。結(jié)果表示為8-12只小鼠的均數(shù)±1SD。**＝p≤0.01，與年輕(2個(gè)月)小鼠比較；^＝p≤0.01，與老年(未閹割)小鼠比較。
圖14將HSV-1免疫后培養(yǎng)3天的小鼠的腘窩淋巴結(jié)摘除。用未免疫的小鼠作為對(duì)照來(lái)消除背景因素(用51Cr-釋放方法確定)測(cè)定CTL。結(jié)果表示為8只小鼠的均數(shù)±1SD。老年小鼠在E∶T值為10∶1和3∶1時(shí)CTL活性顯著(p≤0.01，*)降低，表明在淋巴結(jié)內(nèi)特定的CTL的百分?jǐn)?shù)減少。老年小鼠閹割后可使CTL應(yīng)答恢復(fù)到年輕成體水平。
圖15A和B分析HSV-1感染后CD4+T輔助細(xì)胞和VβTCR的應(yīng)答。在感染HSV-1后第5天將腘窩淋巴結(jié)摘除并在體外測(cè)定(a)CD25、CD8和特異性TCRVβ標(biāo)記和(b)CD4/CD8T細(xì)胞的表達(dá)。(a)表達(dá)Vβ10或Vβ8.1的活化(CD25+)CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)表示為每組8只小鼠的均數(shù)±1SD。沒(méi)有觀察到因年齡或閹割造成的差異。(b)在靜息LN群體中可見CD4/CD8比值隨年齡減小。閹割后可恢復(fù)。結(jié)果表示為每組8只小鼠的均數(shù)±1SD。***＝p≤0.001與年輕的和閹割小鼠相比。
圖16A-DLy5同系小鼠的骨髓移植之后，胸腺(A)、脾(B)、淋巴結(jié)(C)和骨髓(D)的細(xì)胞數(shù)目的變化。請(qǐng)注意在處理后所有時(shí)間點(diǎn)與未閹割組比較，閹割動(dòng)物中胸腺的迅速增殖。此外，與單獨(dú)用環(huán)磷酰胺處理組比較，閹割組的脾和淋巴結(jié)細(xì)胞數(shù)目有很大增加。(n＝每個(gè)處理組和時(shí)間點(diǎn)3-4)。與未閹割動(dòng)物相比閹割小鼠同系(Ly5.2)細(xì)胞有顯著增加(數(shù)據(jù)未示出)。
圖17A和B胎兒肝重建后閹割的和未閹割的小鼠中胸腺細(xì)胞數(shù)的變化。(n＝每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3-4)(A)兩周時(shí)閹割小鼠的胸腺細(xì)胞數(shù)處于正常水平并且顯著高于未閹割小鼠(*p≤0.05)。四周后觀察到閹割小鼠的胸腺肥大。未閹割組細(xì)胞數(shù)目低于對(duì)照水平。(B)CD45.2+細(xì)胞-CD45.2+作為供體來(lái)源的標(biāo)記。重建后兩周，在閹割的和未閹割的兩種小鼠中均出現(xiàn)供體來(lái)源的細(xì)胞。處理后四個(gè)周，在閹割組的胸腺中大約85％的細(xì)胞是供體來(lái)源的。在未閹割組的胸腺中沒(méi)有供體來(lái)源的細(xì)胞。
圖18在致死劑量輔照輻照和胎兒肝重建后再外科手術(shù)閹割，供體來(lái)源的胸腺細(xì)胞群體中CD4對(duì)CD8的FACS分布圖。每個(gè)象限的百分?jǐn)?shù)在每張圖的右側(cè)給出。年齡匹配的對(duì)照分布圖來(lái)自于八個(gè)月的Ly5.1同系小鼠的胸腺。閹割的和未閹割的小鼠的胸腺是在CD45.2+細(xì)胞上進(jìn)行門控的，只顯示供體來(lái)源的細(xì)胞。重建后兩周，胸腺細(xì)胞的亞群在閹割組和未閹割組小鼠之間沒(méi)有區(qū)別。
圖19A和B在致死劑量輻照、胎兒肝重建和閹割后骨髓和淋巴樣樹突狀細(xì)胞(DC)的數(shù)目。(n＝每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3-4只小鼠)。在下面圖中對(duì)照(其上劃斜線)柱是基于未經(jīng)處理的年齡匹配的小鼠中的正常的樹突狀細(xì)胞的數(shù)目。(A)供體來(lái)源的骨髓性樹突狀細(xì)胞-重建后兩周，未閹割小鼠中DC水平正常。在同一時(shí)間點(diǎn)閹割小鼠中有顯著地更多的DC。(*p≤0.05)。四周時(shí)，閹割組小鼠DC數(shù)目仍高于對(duì)照水平。(B)供體來(lái)源的淋巴樹突狀細(xì)胞-重建后兩周，閹割小鼠DC數(shù)目是未閹割的小鼠的兩倍。處理后四周，DC數(shù)目仍高于對(duì)照水平。
圖20A和B胎兒肝重建后閹割的和未閹割的小鼠中總的和CD45.2+的骨髓細(xì)胞數(shù)目的變化。n＝每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3-4只小鼠。(A)總細(xì)胞數(shù)-重建后兩周，骨髓細(xì)胞數(shù)目已正常而且閹割的和未閹割的小鼠之間細(xì)胞數(shù)沒(méi)有顯著差異。重建后四周，閹割的和未閹割的小鼠之間細(xì)胞數(shù)有顯著差異(*p≤0.05)。(B)CD45.2+細(xì)胞數(shù)。移植后兩周閹割的和未閹割的小鼠的骨髓中CD45.2+細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著差異。四周時(shí)，閹割小鼠CD45.2+的細(xì)胞數(shù)保持高水平。在同一時(shí)間點(diǎn)未閹割的小鼠中沒(méi)有供體來(lái)源的細(xì)胞。
圖21A-C胎兒肝重建后閹割和未閹割的小鼠骨髓中T細(xì)胞和骨髓和淋巴衍生的樹突細(xì)胞(DC)的變化。(n＝每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3-4只小鼠)。下圖中對(duì)照(其上劃斜線)柱基于未經(jīng)處理的年齡匹配的小鼠的T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的正常數(shù)目。(A)T細(xì)胞數(shù)目-重建后兩周和四周在閹割和未閹割的小鼠中數(shù)目都減少。(B)供體來(lái)源的骨髓樹突狀細(xì)胞-重建后兩周，DC細(xì)胞數(shù)目在閹割的和未閹割的小鼠中都正常。這個(gè)時(shí)間點(diǎn)閹割的和未閹割的小鼠細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著性差異。(C)供體來(lái)源的淋巴樣樹突狀細(xì)胞-重建后兩周和四周，細(xì)胞數(shù)均在正常水平。兩周時(shí)閹割的和未閹割的小鼠細(xì)胞數(shù)之間沒(méi)有顯著性差異。
圖22A和B胎兒肝重建后閹割的和未閹割的小鼠中總的和供體(CD45.2+)脾細(xì)胞數(shù)目的變化。(n＝每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3-4只小鼠)。(A)總細(xì)胞數(shù)目-重建后兩周，細(xì)胞數(shù)目減少，閹割的和未閹割的小鼠細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著性差異。重建后四周，閹割小鼠的細(xì)胞數(shù)目接近正常水平。(B)CD45.2+細(xì)胞數(shù)目-重建后兩周閹割的和未閹割的小鼠的脾臟CD45.2+細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著差異。四周時(shí)閹割小鼠CD45.2+細(xì)胞數(shù)目保持高水平。在同一時(shí)間點(diǎn)未閹割的小鼠中沒(méi)有供體來(lái)源的細(xì)胞。
圖23A-C胎兒肝重建后脾臟T細(xì)胞和骨髓和淋巴衍生的樹突狀細(xì)胞(DC)。(n＝每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3-4只小鼠)。下圖中對(duì)照(其上劃斜線)柱基于未經(jīng)處理的年齡匹配的小鼠的T細(xì)胞和樹突細(xì)胞的正常數(shù)目。(A)T細(xì)胞數(shù)目-移植后兩周和四周閹割的和未閹割的小鼠細(xì)胞數(shù)目均減少。(B)供體來(lái)源的(CD45.2+)骨髓樹突狀細(xì)胞-重建后兩周和四周閹割的和未閹割的小鼠DC數(shù)目均正常。兩周時(shí)，閹割的和未閹割的小鼠細(xì)胞數(shù)目之間沒(méi)有顯著差異。(C)供體來(lái)源的(CD45.2+)淋巴樹突狀細(xì)胞-重建后兩周和四周，細(xì)胞數(shù)目都在正常水平。兩周時(shí)，閹割的和未閹割的小鼠細(xì)胞數(shù)目之間沒(méi)有顯著差異。
圖24A和B胎兒肝重建后閹割的和未閹割的小鼠總的和供體(CD45.2+)淋巴結(jié)細(xì)胞數(shù)目的變化。(n＝每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3-4)。(A)總細(xì)胞數(shù)-重建后兩周，細(xì)胞數(shù)目處于正常水平而且閹割的和未閹割的小鼠之間沒(méi)有顯著差異。重建后四周，閹割的小鼠細(xì)胞數(shù)目處于正常水平。(B)CD45.2+細(xì)胞數(shù)-重建后兩周閹割的和未閹割的小鼠淋巴結(jié)中供體CD45.2+細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著差異。四周時(shí)閹割的小鼠中CD45.2細(xì)胞數(shù)目維持高水平。在同-時(shí)間點(diǎn)未閹割的小鼠中沒(méi)有供體來(lái)源的細(xì)胞。
圖25A-C胎兒肝重建后閹割的和未閹割的小鼠的腸系膜淋巴結(jié)中T細(xì)胞和來(lái)源于骨髓及淋巴的樹突狀細(xì)胞(DC)的變化。(n＝每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3-4只小鼠)。對(duì)照(其上劃斜線)柱是未經(jīng)處理的年齡匹配的小鼠的T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的數(shù)目。(A)重建后兩周和四周，閹割的和未閹割的小鼠T細(xì)胞數(shù)目均減少。(B)閹割的和未閹割的小鼠供體來(lái)源的骨髓樹突狀細(xì)胞都是正常的。四周時(shí)均減少。兩周時(shí)閹割的和未閹割的小鼠細(xì)胞數(shù)目之間無(wú)顯著差異。(C)供體來(lái)源的淋巴樹突狀細(xì)胞-重建后兩周和四周細(xì)胞數(shù)目處于正常水平。兩周時(shí)閹割的和未閹割的小鼠細(xì)胞數(shù)目之間無(wú)顯著差異。
圖26經(jīng)LHRH激動(dòng)劑治療的前列腺癌患者(全部＞60歲)，對(duì)其外周血淋巴細(xì)胞的表型組成進(jìn)行分析。分析治療前和LHRH激動(dòng)劑治療后4個(gè)月的患者樣品。治療前全部患者的每毫升血液中淋巴細(xì)胞總數(shù)都處于對(duì)照值的下限。治療后，6/9的患者總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)大幅度增加(某些病例細(xì)胞總數(shù)加倍)。與此相關(guān)的是6/9的患者T細(xì)胞總數(shù)增加。CD4+亞群中，8/9的患者增加甚至更顯著，說(shuō)明CD4T細(xì)胞的增加。CD8+亞群增加的趨勢(shì)不太明顯，4/9的患者表現(xiàn)出水平增加，但通常增加的幅度低于CD4+T細(xì)胞。
圖27對(duì)用LHRH激動(dòng)劑治療前后患者血液分析說(shuō)明T細(xì)胞、CD4或CD8T細(xì)胞的總的比例沒(méi)有明顯改變，而治療后CD4∶CD8比值有不同的改變。這表明盡管治療后T細(xì)胞總數(shù)有大幅度增加，然而治療對(duì)T細(xì)胞亞群的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡維持的影響是最小的。所用的值與對(duì)照值相比較。
圖28對(duì)經(jīng)LHRH激動(dòng)劑治療的患者的外周血的B細(xì)胞和骨髓性細(xì)胞(NK、NKT、和巨噬細(xì)胞)的比例進(jìn)行分析證明各亞群有不同程度的變化。盡管治療后NK、NKT、和巨噬細(xì)胞的比例保持相對(duì)穩(wěn)定，但4/9的患者中B細(xì)胞的比例下降。
圖29對(duì)治療后的患者的外周血內(nèi)B細(xì)胞和骨髓性細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)的分析表明治療后NK(5/9的患者)、NKT(4/9的患者)和巨噬細(xì)胞(3/9的患者)的細(xì)胞數(shù)目明顯增加。B細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯的變化趨勢(shì)，2/9的患者細(xì)胞數(shù)目增加；4/9的患者沒(méi)有變化，和3/9的患者細(xì)胞數(shù)目減少。
圖30A和BLHRH激動(dòng)劑治療后所見到的主要變化是在外周血的T細(xì)胞群體內(nèi)。特別是幼稚(CD45RA+)CD4+細(xì)胞的比例選擇性增加，在CD4+T細(xì)胞亞群中，在6/9的患者中幼稚T細(xì)胞(CD45RA+)與記憶T細(xì)胞(CD45RO+)的比例增加。
圖31采用各種激光脈沖能量減少皮膚的阻抗。用擬合曲線來(lái)內(nèi)推數(shù)據(jù)，可以看到用10毫焦耳(mJ)的能量輻照時(shí)，皮膚阻抗減少。
圖32藥物對(duì)皮膚的滲透。用胰島素作為樣本藥物，激光輻照后，皮膚的通透性大幅度增加。
圖33在對(duì)皮膚施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和單一的短暫脈沖后一段時(shí)間皮膚熒光的變化。強(qiáng)度的峰值出現(xiàn)在640nm附近，在治療后210分鐘(虛線)最高。
圖34在對(duì)皮膚施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)而不進(jìn)行短暫脈沖后一段時(shí)間皮膚熒光的變化。在不同的時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)度幾乎無(wú)變化。
圖35在不同的峰值壓力下對(duì)皮膚施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和單一的短暫脈沖后皮膚熒光變化的比較。角質(zhì)層通透性的程度取決于峰值應(yīng)力。
發(fā)明詳述本發(fā)明披露了一種在受體體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)配型不合的器官、組織和/或細(xì)胞的耐受的方法。使用本發(fā)明所述方法能夠重新激活受體的胸腺，原來(lái)的“外源性”物質(zhì)將被患者的免疫系統(tǒng)識(shí)別為“自身的”。通過(guò)阻斷傳向性類固醇介導(dǎo)的信號(hào)來(lái)重新激活受體的胸腺。這種阻斷逆轉(zhuǎn)受體的激素狀態(tài)。阻斷的優(yōu)選方法是閹割。閹割的方法包括(但不限于)化學(xué)閹割和外科手術(shù)閹割。在閹割期間或之后，來(lái)自供體的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞、或上皮干細(xì)胞被移植給受體。胸腺會(huì)認(rèn)為這些細(xì)胞屬于受體并且成為胸腺產(chǎn)生的新的T細(xì)胞和DC的一部分。由此產(chǎn)生的T細(xì)胞群體把受體和供體兩者都識(shí)別為自體的，由此形成對(duì)來(lái)自供體的移植物的耐受。
使胸腺重新激活的優(yōu)選方法是通過(guò)阻斷LHRH對(duì)垂體的直接和/或間接的刺激作用從而導(dǎo)致促性腺激素FSH和LH的減少。正常情況下促性腺激素可以作用于性腺，使其釋放性激素，具體地說(shuō)，在女性是雌激素，男性是睪酮；這種釋放由于FSH和LH的損失而被阻斷。它的直接后果是血漿中性類固醇的水平下降，并由此導(dǎo)致向胸腺發(fā)放抑制信號(hào)。胸腺再生的程度和動(dòng)力學(xué)可通過(guò)注射CD34+造血細(xì)胞(理想情況下是自體的)得到增強(qiáng)。
本發(fā)明可以用于任何由性類固醇促進(jìn)成熟和免疫系統(tǒng)的動(dòng)物種屬(包括人類)，例如哺乳動(dòng)物和有袋類動(dòng)物，優(yōu)選的是大型哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的是人類。
“再生”、“重新激活”、和“重建”這些術(shù)語(yǔ)和它們的派生詞在本文中可以互換，都是指萎縮的胸腺恢復(fù)到它的激活狀態(tài)。
“受體”、“患者”、和“宿主”在本文中可以互換，均指接受移植的主體?！肮w”指移植物的來(lái)源，可能是同基因的、同種異基因的或異種的。同種異基因移植物是優(yōu)選的。同種異基因移植物來(lái)出現(xiàn)在同一種屬的不匹配的成員之間，而異種移植物的供體和受體是不同的種屬。配型相同的動(dòng)物的同基因移植物是最優(yōu)選的。術(shù)語(yǔ)移植物、“匹配的”、“配型不合的”、“錯(cuò)配的”、和“不相同的”均指供體和受體的MHC和/或次要的組織相容性標(biāo)記是(匹配的)或不是(不匹配的、錯(cuò)配的和不相同的)相同的。
本文中使用的“閹割”意味著體內(nèi)的性類固醇的產(chǎn)生和分布顯著減少或徹底清除。當(dāng)胸腺功能完全恢復(fù)的時(shí)候即可有效地使患者回到青春期前的狀態(tài)。手術(shù)閹割切除患者的性腺。
持續(xù)時(shí)間較短的閹割方案是在一段時(shí)間內(nèi)給予化學(xué)藥品，文中稱之為“化學(xué)閹割”。多種化學(xué)藥品均能以這種方式起作用。給藥期間和隨后的一段時(shí)間里，患者的激素停止產(chǎn)生。優(yōu)選地，停止給藥后閹割可以逆轉(zhuǎn)。
阻斷傳向胸腺的性類固醇介導(dǎo)的信號(hào)不難理解，傳向胸腺的性類固醇介導(dǎo)的信號(hào)能以各種熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的人們所周知的方式被阻斷，其中的一些將在此予以描述。例如，抑制性類固醇的產(chǎn)生或阻斷胸腺內(nèi)一種或多種性類固醇的受體均可達(dá)到預(yù)期的阻斷效果，如給予性激素激動(dòng)劑和/或拮抗劑、或給予主動(dòng)的(抗原)或被動(dòng)的(抗體)抗性類固醇疫苗。給予一種或多種性類固醇類似物也可抑制性類固醇的產(chǎn)生。在一些臨床病例中，借助物理閹割永久地去除性腺可能是適當(dāng)?shù)摹?br> 在優(yōu)選具體實(shí)施例中，通過(guò)給予性類固醇的類似物，特別是促黃體激素釋放激素(LHRH)的類似物，以阻斷傳向胸腺的性類固醇介導(dǎo)的信號(hào)導(dǎo)。性類固醇類似物及其在治療和化學(xué)閹割中的應(yīng)用是眾所周知的。這樣的類似物包括(但不限于)下面的LHRH受體(LHRH-R)激動(dòng)劑布舍瑞林(煙酸己可堿)、Cystorelin(煙酸己可堿)、達(dá)必佳(Decapeptyl)(商品名Debiopharm；Ipsen/Beaufour)、地洛瑞林(平衡藥物)、戈那瑞林(Ayerst)、戈舍瑞林(商品名Zoladex；澤尼卡)、組氨瑞林(Ortho)、亮丙立德(商品名Lupron；雅培/TAP)、亮丙瑞林(Plosker等)、黃體瑞林(Wyeth)、美替瑞林(WO9118016)、那法瑞林(興泰克)、和曲普瑞林(美國(guó)專利第4,010,125號(hào))。LHRH的類似物還包括(但不限于)下面的LHRH-R的拮抗劑阿巴瑞克(Abarelix)(商品名Plenaxis；Praecis)、和西曲瑞利克斯(商品名；Zentaris)。激動(dòng)劑的組合、拮抗劑的組合以及激動(dòng)劑和拮抗劑的組合也被包括在內(nèi)。以上每份參考文獻(xiàn)披露的內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。當(dāng)前優(yōu)選的類似物是地洛瑞林(在美國(guó)第4,218,439號(hào)專利中描述)。更多的目錄參閱Vickery等，1984。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，先給予患者LHRH-R拮抗劑，再給LHRH-R激動(dòng)劑。這個(gè)治療方案可以消除或限制在性類固醇產(chǎn)生減少之前可能由于給予激動(dòng)劑而導(dǎo)致的任何性類固醇產(chǎn)生的高峰。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，使用極少引起或不引起性類固醇產(chǎn)生高峰的LHRH-R激動(dòng)劑，在此之前給予或不給予LHRH-R拮抗劑。
雖然胸腺重新激活的刺激基本上來(lái)自于抑制性類固醇的作用和/或LHRH類似物的直接作用，但使用一些能增強(qiáng)胸腺功能的附加物質(zhì)也可能是有用的。這樣的化合物包括(但不限于)白細(xì)胞介素2(IL2)、白細(xì)胞介素7(IL7)、白細(xì)胞介素15(IL15)、上皮和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員、干細(xì)胞因子、粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)?？梢韵胂筮@些附加化合物只在最初應(yīng)用LHRH類似物時(shí)使用一次。然而，可以在任何時(shí)候再給予這些物質(zhì)的任何一種或多種的組合的附加劑量，以進(jìn)一步刺激胸腺。此外，可以開發(fā)并使用以胸腺為特異性靶點(diǎn)的類固醇受體調(diào)節(jié)劑。
藥物組成在本發(fā)明中使用的化合物可以混于任何在制藥學(xué)上可接受的載體中或不使用載體。例如使用生理上相容的包膜、溶劑和稀釋劑。對(duì)于腸胃道外、皮下、靜脈、和肌肉給藥，藥物成分可以用膠囊之類的方法得到保護(hù)?？商鎿Q地，用可以保護(hù)活性成分的載體攜帶藥物，同時(shí)使那些成分緩慢釋放。許多本技術(shù)領(lǐng)域熟知的聚合物和共聚物可用于制備緩釋劑型，例如各種乳酸/羥基乙酸共聚物。例如，例子參閱美國(guó)專利第5,410,016號(hào)，它使用聚乙二醇(PEG)改性聚合物作為可生物降解的包膜。
可口服的配方可以制成液體、膠囊、片劑等。例如，這些組合物可以包括賦形劑、稀釋劑、和/或防止活性成分分解的包膜。這樣的配方是眾所周知的。
在任何配方中，還可以包括其他對(duì)LHRH類似物的活性沒(méi)有負(fù)作用的化合物。例如本文中描述的各種生長(zhǎng)因子和其它細(xì)胞因子。
劑量LHRH類似物可以一次給藥，藥效可以持續(xù)一段時(shí)間。優(yōu)選地，該配方的藥效可以持續(xù)一至兩個(gè)月。隨著所用的類似物的種類不同，其標(biāo)準(zhǔn)劑量也有變化。通常，劑量介于大約0.01微克/千克和大約10毫克/千克之間，優(yōu)選的是介于大約0.01毫克/千克和大約5毫克/千克之間。根據(jù)所用的LHRH類似物或疫苗的種類不同，其劑量也不同。在優(yōu)選實(shí)施例中，使用的劑量持續(xù)的時(shí)間要與流行周期一致。例如，“流感季節(jié)”通常發(fā)生在冬季的幾個(gè)月。如同在此描述的那樣，要制備和使用LHRH類似物，使其能夠在從流感季節(jié)開始時(shí)起的兩個(gè)或多個(gè)月里保護(hù)患者免受感染，每?jī)蓚€(gè)或多個(gè)月補(bǔ)充劑量直到感染的危險(xiǎn)減少或消失為止。
該配方可以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能。可選擇地，該配方可以在增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能的同時(shí)專門防止流感病毒的感染。后一種配方包括可對(duì)流感病毒產(chǎn)生抵抗力的GM細(xì)胞(見下文)。該GM細(xì)胞可以在空間上和/或時(shí)間上與LHRH類似物配方一起或分開給藥。如同非GM細(xì)胞那樣，可在一段時(shí)間內(nèi)多次給藥，以便在整個(gè)流感季節(jié)形成保護(hù)，并且防止流感病毒的感染。
用于化學(xué)閹割的藥物的給藥對(duì)于熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的人，本發(fā)明的化合物可以通過(guò)多種方法給藥。一種使用化學(xué)抑制劑以抑制傳向胸腺的性激素介導(dǎo)的信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)程序是使用藥效可持續(xù)三個(gè)月的單一劑量的LHRH激動(dòng)劑。為此，簡(jiǎn)單的一次靜脈或肌肉注射是不夠的，因?yàn)樵谌齻€(gè)月結(jié)束之前激動(dòng)劑將被從患者體內(nèi)清除掉?？梢允褂觅A存注射或植入，或任何其它允許抑制劑緩慢釋放的方法給予抑制劑。同樣地，可以采用延長(zhǎng)抑制劑在體內(nèi)的半衰期的方法，例如通過(guò)化學(xué)修飾，使其保持本文中所需要的功能。
更有效的給藥機(jī)制包括(但不限于)激光輻照皮膚和在皮膚上產(chǎn)生高壓短暫脈沖(也叫應(yīng)力波或短暫脈沖)，每種方法均伴隨或跟隨有在同一部位放置有或沒(méi)有載體的化合物。優(yōu)選的放置方法是加在治療期間放置和維持在皮膚上的膏藥之中。
一種給藥方法利用適當(dāng)波長(zhǎng)的并且被聚焦的激光束在患者的皮膚上形成小的打孔或蝕變。參閱美國(guó)專利第4,775,361號(hào)、美國(guó)專利第5,643,252號(hào)、美國(guó)專利第5,839,446號(hào)、和美國(guó)專利第6,056,738號(hào)，所有結(jié)合于此供參考。在優(yōu)選的實(shí)施例中，激光束的波長(zhǎng)介于0.2微米和10微米之間。更優(yōu)選的波長(zhǎng)介于大約1.5微米和3.0微米之間。最優(yōu)選的波長(zhǎng)為大約2.94微米。在一個(gè)實(shí)施例中，用透鏡將激光束聚焦以在皮膚上產(chǎn)生穿透表皮的輻照斑點(diǎn)。在補(bǔ)充實(shí)施例中，將激光束聚焦使之形成僅穿透皮膚角質(zhì)層的輻照斑點(diǎn)。
這里所說(shuō)的“消融”和“打孔”是指在皮膚上形成孔。這樣的孔在深度方面可以不同；例如，它可以僅穿透角質(zhì)層，它可以一直深入到皮膚的毛細(xì)血管層，或它可以終止在其間的任何地方。這里所說(shuō)的“蝕變”是指皮膚結(jié)構(gòu)的改變，但不形成孔，這樣可以增加皮膚的通透性。與打孔的情形一樣，皮膚能夠被蝕變到任何深度。
在定義激光束時(shí)應(yīng)考慮幾個(gè)因素，包括波長(zhǎng)、能注量、脈沖時(shí)間寬度和輻照斑點(diǎn)尺寸。在較好的實(shí)施例中，能注量在0.03至100,000焦耳/平方厘米的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，能注量在0.03-9.6焦耳/平方厘米的范圍內(nèi)。激光束波長(zhǎng)部分地取決于激光材料，例如鉺:釔鋁石榴石(Er:YAG)。脈沖時(shí)間寬度是由電容器組、閃光燈和激光棒材料之類提供的脈沖寬度決定的。脈沖寬度最好介于1fs(毫微微秒)和1,000微秒之間。
依照這種方法，激光所產(chǎn)生的打孔或蝕變不需要用激光器的單一脈沖產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施例中，穿過(guò)角質(zhì)層的打孔或蝕變是用多個(gè)激光脈沖產(chǎn)生的，其中每個(gè)激光脈沖僅僅打穿或蝕變目標(biāo)組織厚度的一小部分。
所以，人們可以將單一脈沖的能量除以預(yù)期的脈沖數(shù)粗略地估計(jì)用多重脈沖打穿或蝕變角質(zhì)層所需的能量。例如，如果特定大小的點(diǎn)需要1焦耳的能量來(lái)打穿或蝕變整個(gè)角質(zhì)層，那么人們可以用十個(gè)脈沖(每個(gè)脈沖為1/10的能量)產(chǎn)生在定性上相似的打孔或蝕變。因?yàn)橐蠡颊咴谳椪掌陂g不移動(dòng)靶組織(人的反應(yīng)時(shí)間大約在100ms左右的數(shù)量級(jí)上)，且每個(gè)脈沖期間所產(chǎn)生的熱量沒(méi)有明顯的擴(kuò)散，所以在優(yōu)選的實(shí)施例中來(lái)自激光器的脈沖重復(fù)率應(yīng)能使整個(gè)打孔在不足100ms的時(shí)間里完成?？商鎿Q地，靶組織和激光的定位可以機(jī)械固定，使在較長(zhǎng)的輻照時(shí)間內(nèi)靶位置不發(fā)生變化。
為了穿透皮膚而極少或沒(méi)有出血，可以打穿或蝕變皮膚的外表面(例如角質(zhì)層)，但是不深入到毛細(xì)血管層。激光束精確聚焦在皮膚上，在皮膚上形成直徑大約0.5微米到5.0厘米的光束。斑點(diǎn)也可以為寬度大約0.05-0.5毫米、和長(zhǎng)度不超過(guò)2.5毫米的狹縫。寬度可以是任意尺寸的，由受輻照區(qū)域的解剖和所需的有待被移除的流體或所用的藥物的滲透率控制。聚焦透鏡的焦距可以是任意長(zhǎng)度的，但是在一個(gè)實(shí)施例中是30毫米。
通過(guò)改變波長(zhǎng)、脈沖長(zhǎng)度、能注量(它是激光能量輸出(焦耳)和激光束在焦點(diǎn)的大小(平方厘米)的函數(shù))、和輻照斑點(diǎn)的尺寸，可以改變對(duì)角質(zhì)層的作用是消融(打孔)或非消融的修飾(蝕變)。角質(zhì)層的消融和非消融性改變均可導(dǎo)致后面應(yīng)用藥物時(shí)增強(qiáng)其通透性。
例如，保持其它變量恒定，通過(guò)減少脈沖能量，可以在消融和非消融的組織效應(yīng)之間改變。使用脈沖長(zhǎng)度大約300微秒的鉺:釔鋁石榴石(Er:YAG)激光，在單一脈沖或輻射能量在皮膚上輻照2毫米斑點(diǎn)的情況下，大約100毫焦耳以上的脈沖能量引起部分或完全的消融，而在大約100毫焦耳以下的脈沖能量引起對(duì)角質(zhì)層的部分消融或非消融性改變?？蛇x地，使用多重脈沖，增強(qiáng)體液滲透性或給藥所必需的脈沖能量閾值減少的系數(shù)近似等于脈沖數(shù)增加的數(shù)目。
可選地，保持其它變量恒定，減小斑點(diǎn)尺寸，也可以在消融和非消融的組織效應(yīng)之間改變。例如，斑點(diǎn)面積減半將導(dǎo)致產(chǎn)生同樣效果所必需的能量減半。例如，通過(guò)將激光器的輻射輸出與顯微鏡物鏡的多個(gè)物鏡相耦合，能夠獲得0.5微米以下的輻照。(例如Nikon，Inc.，Melville，紐約)。在這種情況下，可以將激光束聚焦到數(shù)量級(jí)在顯微鏡的分辨率極限的斑點(diǎn)上，可能在大約0.5微米的數(shù)量級(jí)上。事實(shí)上，如果光束分布是高斯分布，受影響的輻照面積的尺寸可以小于實(shí)測(cè)的光束尺寸而超過(guò)顯微鏡的成像分辨率。在這種情況下如需非消融性地改變組織，宜使用3.2焦耳/平方厘米的能注量，它對(duì)于半微米大小的斑點(diǎn)需要大約5納焦耳(nJ)的脈沖能量。這樣低的脈沖能量很容易通過(guò)二極管激光器獲得，也可以通過(guò)用玻璃之類的吸收濾光器衰減鉺:釔鋁石榴石(Er:YAG)激光器的光束能量而獲得。
保持其它變量恒定而改變輻射能量的波長(zhǎng)，也可以在燒蝕和非燒蝕的組織效應(yīng)之間改變。例如，用Ho:YAG(鈥:YAG；2.127微米)代替Er:YAG激光(鉺:YAG；2.94微米)可以使組織吸收較少的能量，從而形成較弱的打孔或蝕變。
激光器產(chǎn)生的微微秒和毫微微秒的脈沖也可以被用來(lái)在皮膚上產(chǎn)生蝕變或消融。這可以用調(diào)制二極管或相關(guān)的微芯片激光器完成，它能夠提供時(shí)間寬度為1毫微微秒到1毫秒范圍內(nèi)的單一脈沖。(參閱D.Stern等人的《在532納米和625納米下用毫微秒、微微秒和毫微微秒的激光器消融角膜)》(“Corneal Ablation by Nanosecond，Picosecond，and Femtosecond Lasers at 532 and 625nm”)，《角膜激光消融)》(Corneal Laser Ablation)，第107卷，587-592頁(yè)，(1989年)，其結(jié)合于此作為參考，此文披露了短于1毫微微秒的脈沖長(zhǎng)度的激光的使用。)另一種給藥方法是在皮膚上使用高壓短暫脈沖來(lái)產(chǎn)生通透性。參閱美國(guó)專利第5,614,502號(hào)和美國(guó)專利第5,658,892號(hào)，兩者結(jié)合于此作為參考。有特定的上升時(shí)間和峰值應(yīng)力(或壓力)的高壓短暫脈沖例如，應(yīng)力波(例如，用激光器生成的激光應(yīng)力波(LSW))，能安全有效地影響化合物(例如本發(fā)明中所披露的那些化合物)通過(guò)各層上皮組織層(例如角質(zhì)層和粘膜)的運(yùn)輸。分子大小范圍很廣的化合物均可用這些方法來(lái)給藥，而不受其凈電荷的影響。此外，在本發(fā)明方法中使用的短暫脈沖可避免組織損傷。
在暴露于短暫脈沖以前，上皮組織層(例如，角質(zhì)層)對(duì)于外來(lái)的化合物可能是不能通透的；這妨礙該化合物擴(kuò)散到上皮層下面的細(xì)胞中。上皮層暴露于短暫脈沖后使化合物能夠擴(kuò)散通過(guò)上皮層。擴(kuò)散速率通常是受短暫脈沖的性質(zhì)和所給的化合物的大小控制的。
通過(guò)特定的上皮組織層(例如皮膚的角質(zhì)層)的滲透速率還取決于其它幾個(gè)因素，包括pH值、皮膚基質(zhì)組織的新陳代謝、角質(zhì)層外部的區(qū)域和角質(zhì)層內(nèi)部的區(qū)域之間的壓力差、以及皮膚的解剖部位和物理?xiàng)l件。皮膚的物理?xiàng)l件本身又取決于健康狀況、年齡、性別、種族、皮膚保健情況、和接觸史。例如，以前曾與有機(jī)溶劑或表面活性劑接觸可影響皮膚的物理?xiàng)l件。
通過(guò)上皮組織層的化合物的量還取決于上皮層保持通透狀態(tài)的時(shí)間長(zhǎng)短和變得可通透的上皮層表面積的大小。
短暫脈沖的性質(zhì)和特征受產(chǎn)生脈沖的能源控制。參閱WO98/23325，結(jié)合于此作為參考。然而，它們的特征被其傳播時(shí)通過(guò)的偶聯(lián)介質(zhì)的線性和非線性性質(zhì)而改變。偶聯(lián)介質(zhì)引起的線性衰減主要削弱短暫脈沖的高頻成分。這引起帶寬隨著短暫脈沖的上升時(shí)間的增加而相應(yīng)的減少。另一方面，偶聯(lián)介質(zhì)的非線性性質(zhì)引起上升時(shí)間縮短。上升時(shí)間的縮減是聲音和粒子速度對(duì)應(yīng)力(壓力)的依賴性的結(jié)果。隨著應(yīng)力增加，聲音和粒子速度也增加。這使短暫脈沖的前緣變得更加陡峭。線性衰減的相對(duì)強(qiáng)度、非線性的系數(shù)和峰值應(yīng)力決定波必須傳播多久才能實(shí)現(xiàn)在上升時(shí)間的陡度方面的增加。
選擇短暫脈沖的上升時(shí)間、幅度和持續(xù)時(shí)間以產(chǎn)生非破壞性的(即，非沖擊波)短暫脈沖，而暫時(shí)性地增大上皮組織層的通透性。通常上升時(shí)間至少為1納秒，優(yōu)選的是大約10納秒。
短暫脈沖的峰值應(yīng)力或壓力對(duì)于不同的上皮組織或細(xì)胞層是不同的。例如，為了通過(guò)角質(zhì)層轉(zhuǎn)運(yùn)化合物，短暫脈沖的峰值應(yīng)力或壓力應(yīng)該被設(shè)定為至少400巴；更優(yōu)選至少1,000巴，但是不超過(guò)大約2,000巴。對(duì)于上皮粘膜層，峰值壓力應(yīng)設(shè)定在300巴和800巴之間，優(yōu)選在300巴和600巴之間。較好的短暫脈沖的持續(xù)時(shí)間應(yīng)在幾十納秒數(shù)量級(jí)，這樣它僅在很短的時(shí)間內(nèi)與上皮組織發(fā)生相互作用。與短暫脈沖相互作用之后，上皮組織并非永久損傷，但是其通透性可維持大約3分鐘。
此外，這些方法還包括對(duì)患者施加少數(shù)離散的大振幅脈沖。給予患者的短暫脈沖的次數(shù)通常應(yīng)少于100，更優(yōu)選的是少于50，最優(yōu)選的少于10。當(dāng)需用多重光學(xué)脈沖來(lái)產(chǎn)生短暫脈沖的時(shí)候，連續(xù)的脈沖之間的時(shí)間間隔是10到120秒，這足以防止對(duì)上皮組織的永久性損傷。
短暫脈沖的性質(zhì)可以使用本技術(shù)領(lǐng)域上的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。例如，峰值應(yīng)力或壓力和上升時(shí)間可以使用Doukas等人在《超生醫(yī)學(xué)生物學(xué)》(Ultrasound Med.Biol.)，21961(1995)中描述的聚偏氟乙烯(PVDF)換能器法測(cè)定。
短暫脈沖可以用各種能源產(chǎn)生。產(chǎn)生短暫脈沖的物理現(xiàn)象通常有三種不同的機(jī)理(1)熱彈性產(chǎn)生；(2)光學(xué)擊穿；或(3)消融。
例如，短暫脈沖可以通過(guò)用高能激光源消融靶材料產(chǎn)生，然后短暫脈沖借助偶聯(lián)介質(zhì)與上皮組織或細(xì)胞層耦合。該偶聯(lián)介質(zhì)可以是諸如液體或凝膠之類的東西，只要它是非線性的。因此，水、蓖麻油之類的油、磷酸鹽緩沖液(PBS)之類的等滲介質(zhì)、或膠原之類的凝膠都可以用作偶聯(lián)介質(zhì)。
此外，偶聯(lián)介質(zhì)可以包括表面活性劑，它可以在短暫脈沖產(chǎn)生通透性后，通過(guò)延長(zhǎng)角質(zhì)層對(duì)化合物的可通透狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間來(lái)增強(qiáng)其轉(zhuǎn)運(yùn)。表面活性劑可以是離子型去污劑或非離子型去污劑，因此可以包括，例如，十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、和月桂基二甲基氨基氧化物。
吸收性靶材料作為光學(xué)觸發(fā)換能器。靶材料在吸收光線之后發(fā)生快速熱擴(kuò)張，或者被消融，從而啟動(dòng)短暫脈沖。通常，金屬和聚合物膜在可見光和紫外線光譜區(qū)域有高吸收系數(shù)。
多種類型的材料可以作為靶材料與激光束一起使用，只要它們能在所用的激光波長(zhǎng)下充分吸收光。靶材料可以是鋁或銅之類的金屬、聚苯乙烯(例如，黑色聚苯乙烯)之類的塑料、陶瓷、或高度濃縮的染料溶液。靶材料必須比所用的激光能量的橫截面積大。此外，靶材料必須比光學(xué)貫穿深度厚，以致沒(méi)有光線到達(dá)皮膚表面。靶材料還必須足夠厚，以便提供機(jī)械支撐。當(dāng)靶材料是金屬時(shí)，常用的厚度是1/32英寸(0.79375mm)到1/16英寸(1.5875mm)。塑料的靶材料，厚度是1/16英寸(1.5875mm)到1/8英寸(3.175mm)。
用受限制的消融可以增強(qiáng)短暫脈沖。在受限制的消融中，石英光學(xué)窗之類對(duì)激光束透明的材料緊貼靶材料放置。通過(guò)使用透明材料消融靶材料所形成的等離子體限制可以把耦合系數(shù)增加一個(gè)數(shù)量級(jí)(Fabro等，《應(yīng)用物理學(xué)雜志》(J.Appl.Phys.)，68775，1990)。透明材料可以是石英、玻璃、或透明塑料。
由于靶材料和透明的限制材料之間的空隙允許等離子體擴(kuò)張并因此減少傳給靶向物的動(dòng)量，所以優(yōu)選用最初呈液態(tài)的粘合劑(例如含碳的環(huán)氧樹脂)將透明材料粘到靶材料上，以防止產(chǎn)生空隙。
激光束可以用本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)調(diào)制技術(shù)產(chǎn)生，例如通過(guò)使用諸如電-或聲-光學(xué)器件之類的裝置的Q-開關(guān)或鎖模激光器。能以脈動(dòng)模式在紅外線、可見光、和/或紅外光譜區(qū)中操作的標(biāo)準(zhǔn)商品化激光器包括釹:釔鋁石榴石(Nd:YAG)激光器、釹:YLF激光器、CO2激光器、受激準(zhǔn)分子激光器、染料激光器、Ti藍(lán)寶石激光器、二極管激光器、鈥(和其它稀土材料)激光器和金屬-蒸汽激光器。這些光源的脈沖寬度是可調(diào)的，可以從幾十皮秒(ps)到幾百微秒。本發(fā)明中使用的光學(xué)脈沖寬度可以從100ps變化到大約200ns，優(yōu)選的是在大約500ps和40ns之間。
也可以用體外碎石機(jī)產(chǎn)生短暫脈沖(如Coleman等在《超聲醫(yī)藥生物學(xué))》(Ultrasound Med.Biol.)，15213-227，1989中所述)。這些短暫脈沖的上升時(shí)間為30到450ns，比激光產(chǎn)生的短暫脈沖長(zhǎng)。如用體外碎石機(jī)形成上升時(shí)間適于新方法的短暫脈沖，則短暫脈沖在非線性的偶聯(lián)介質(zhì)(例如，水)中傳播的距離用上面的式(1)確定。例如，使用碎石機(jī)形成上升時(shí)間為100ns、峰值壓力為500巴的短暫脈沖時(shí)，短暫脈沖在接觸上皮細(xì)胞層之前應(yīng)在偶聯(lián)介質(zhì)中傳播大約5毫米。
用碎石機(jī)產(chǎn)生短暫脈沖的方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是由于通過(guò)非線性的偶聯(lián)介質(zhì)傳播，波的拉伸分量將被增寬和衰減。傳播距離應(yīng)該調(diào)整到使短暫脈沖的拉伸分量的壓力僅為波的壓縮分量的峰值壓力的大約5％到10％。這樣，經(jīng)過(guò)調(diào)整的短暫脈沖將不會(huì)損傷組織。
所用碎石機(jī)的類型并無(wú)嚴(yán)格限制。電動(dòng)液壓型、電磁型、或壓電型碎石機(jī)均可使用。
短暫脈沖也可以用換能器(例如壓電換能器)產(chǎn)生。換能器最好直接接觸偶聯(lián)介質(zhì)并且在用光、熱或電場(chǎng)產(chǎn)生短暫脈沖之后發(fā)生快速位移。例如，可以使用電擊穿，它通常是由高壓火花或壓電換能器誘導(dǎo)的(類似于在某些體外碎石機(jī)中使用的方法，Coleman等，《超聲波生物醫(yī)學(xué)》(Ultrasound Med.Biol.)，15213-227，1989)。在采用壓電換能器的情況下，換能器在施加電場(chǎng)之后發(fā)生快速膨脹，在偶聯(lián)介質(zhì)中引起快速位移。
此外，短暫脈沖還可以用光學(xué)纖維輔助產(chǎn)生。光學(xué)纖維遞送系統(tǒng)特別容易操作，并且可以在難以達(dá)到的部位輻照置于上皮組織層附近的靶材料以產(chǎn)生短暫脈沖。此類遞送系統(tǒng)在與激光器光學(xué)耦合后是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兡鼙徽系綄?dǎo)管和相應(yīng)柔性裝置中，可用于輻照人體的大多數(shù)器官。此外，為了產(chǎn)生具有預(yù)期的上升時(shí)間和峰值應(yīng)力的短暫脈沖，光源的波長(zhǎng)能輕易地得到調(diào)整，以便在特定的靶材料中產(chǎn)生適當(dāng)?shù)奈铡?br> 高能材料能對(duì)引爆脈沖發(fā)生響應(yīng)而產(chǎn)生短暫脈沖。引爆劑能通過(guò)引起放電或火花引爆高能材料。
流體靜壓可與短暫脈沖結(jié)合使用，以增強(qiáng)化合物通過(guò)上皮組織層的轉(zhuǎn)運(yùn)。由于短暫脈沖誘導(dǎo)的作用可持續(xù)幾分鐘，所以藥物順著它的濃度梯度通過(guò)上皮細(xì)胞層被動(dòng)擴(kuò)散的速率可以通過(guò)短暫脈沖后在上皮組織層的表面(例如，皮膚的角質(zhì)層)施加流體靜壓而增加。
耐受的誘導(dǎo)個(gè)體的T細(xì)胞群能通過(guò)本發(fā)明的方法改變。尤其地，可以誘導(dǎo)改變而形成對(duì)異體移植物的耐受。如果將來(lái)源于供體的樹突狀細(xì)胞摻入到胸腺中，則可建立對(duì)外源性抗原，尤其是臨床移植情況下的非自身供體抗原的耐受。通過(guò)使用抑制性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞可以使這種形式的耐受變得更有效。然而，后者產(chǎn)生的機(jī)制還不太了解，但是仍然可能涉及樹突狀細(xì)胞。
假設(shè)防止T細(xì)胞對(duì)自身抗原發(fā)生反應(yīng)的主要機(jī)制是由于胸腺樹突狀細(xì)胞對(duì)這樣的細(xì)胞進(jìn)行的陰性選擇(通過(guò)克隆清除)，那么生成含有來(lái)源于潛在的器官或組織供體的樹突狀細(xì)胞的胸腺的能力在防止移植物排斥方面有重要意義。這是因?yàn)閷?duì)移植物可能有潛在的排斥作用的T細(xì)胞將在胸腺中遇到供體的樹突狀細(xì)胞并在它們進(jìn)入血流之前就已經(jīng)被清除。生成樹突狀細(xì)胞的血液前體細(xì)胞與生成T細(xì)胞自身的血液前體細(xì)胞是一樣的。
本發(fā)明的披露提供了將外源性樹突狀細(xì)胞摻入患者胸腺的方法。這是通過(guò)將供體細(xì)胞注入受體體內(nèi)而在受體體內(nèi)形成耐受完成的。供體細(xì)胞可以是造血干細(xì)胞(HSC)、上皮干細(xì)胞、或造血祖細(xì)胞。優(yōu)選的供體細(xì)胞是CD34+HSC、淋巴樣祖細(xì)胞、或骨髓性祖細(xì)胞。最優(yōu)選的供體細(xì)胞是CD34+HSC。供體細(xì)胞被注入受體體內(nèi)并通過(guò)外周血液循環(huán)遷移到胸腺。在缺乏性類固醇的情況下，攝入胸腺的造血前體細(xì)胞大大增加。這些細(xì)胞整合到胸腺中并以與受體細(xì)胞相同的方式產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞。其結(jié)果是受體外周血循環(huán)中出現(xiàn)T細(xì)胞的嵌合體以及被受體的免疫系統(tǒng)識(shí)別為自身的細(xì)胞群、組織和器官相應(yīng)增加。
小動(dòng)物的研究材料和方法動(dòng)物CBA/CAH和C57B16/J雄性小鼠是從Central Animal Service，Monash大學(xué)動(dòng)物服務(wù)中心獲得的，并在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。年齡在4-6周到26個(gè)月之間，并且在相關(guān)處標(biāo)明。
閹割向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(鹽酸賽拉嗪；BayerAustralia公司，Botany NSW，澳大利亞)和1.5mg鹽酸氯胺酮(氯胺酮制劑(Ketalar)；Parke-Davis，Caringbah，NSW，澳大利亞)的生理鹽水進(jìn)行麻醉。外科手術(shù)閹割首先切開陰囊，暴露睪丸，用縫合線系住睪丸，然后連同周圍脂肪組織一起取出睪丸。
5-溴脫氧尿苷(BrdU)摻入小鼠接受兩次腹腔內(nèi)注射BrdU(Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，密蘇里州)(100mg/公斤體重，溶于100微升PBS中)，間隔4小時(shí)。對(duì)照小鼠只注射賦形劑。第二次注射后一小時(shí)，切除胸腺，制成細(xì)胞懸液以進(jìn)行FACS分析或立即包埋在Tissue Tek(O.C.T.化合物，Miles公司，印第安納州)中，在液氮中快速冷凍并在使用前置于-70℃保存。
流式細(xì)胞儀分析小鼠用CO2窒息殺死，取出胸腺、脾和腸系膜淋巴結(jié)。這些器官在冷的PBS/1％FCS/0.02％疊氮化物中被輕輕地推過(guò)200微米濾網(wǎng)，離心(650克，5分鐘，4℃)，重懸在任何一種PBS/FCS/疊氮化物中。脾細(xì)胞在紅細(xì)胞裂解緩沖液(8.9克/升氯化銨)中4℃孵育10分鐘，漂洗，用PBS/FCS/疊氮化物重懸。細(xì)胞濃度和存活度是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和溴乙錠/吖啶橙重復(fù)測(cè)定兩次確定的，并在熒光顯微鏡(Axioskop；Carl Zeiss，Oberkochen，德國(guó))下觀察。
對(duì)于3-色免疫熒光檢驗(yàn)法，用抗αβTCR-FITC或抗γδTCR-FITC、抗CD4-PE和抗CD8-APC(購(gòu)于Pharmingen，圣地亞哥，加利福尼亞)標(biāo)記胸腺細(xì)胞，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。脾和淋巴結(jié)懸浮液用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或含CD4-PE和CD8-APC的B220-B(Sigma)進(jìn)行標(biāo)記。B220-B購(gòu)于Caltag實(shí)驗(yàn)室公司，Burlingame，加利福尼亞，用抗生蛋白鏈菌素三色共軛物顯色。
對(duì)于進(jìn)行BrdU檢測(cè)，細(xì)胞用CD4-PE和CD8-APC進(jìn)行表面標(biāo)記，然后用前述方法進(jìn)行固定和通透性處理(Carayon和Bord，1989)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，染色細(xì)胞在4℃下用1％PFA/0.01％吐溫-20固定O/N。洗滌過(guò)的細(xì)胞在37℃下在500微升DNase中孵育30分鐘(100孔尼茲(Kunitz)單位，Boehringer Mannheim，西德)以使DNA變性。最后，用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)孵育細(xì)胞。
對(duì)于4-色免疫熒光檢驗(yàn)法，胸腺細(xì)胞標(biāo)記有CD3、CD4、CD8、B220和Mac-1，可以用抗小鼠免疫球蛋白-Cy5(Amersham，U.K.)集體檢測(cè)，門化的陰性細(xì)胞(TN)用于分析。然后用前述方法(Godfrey和Zlotnik，1993)用CD25-PE(Pharmingen)和CD44-B(Pharmingen)進(jìn)一步染色，再用抗生蛋白鏈菌素三色共軛物(Caltag，加利福尼亞)顯色。然后，按前述方法進(jìn)行BrdU的檢測(cè)。
用FacsCalibur(Becton-Dickinson)分析樣品。根據(jù)0和90光散射分布圖門化活的淋巴細(xì)胞，并且用細(xì)胞搜尋軟件(Cell questsoftware)(Becton-Dickinson)分析數(shù)據(jù)。
免疫組化冰凍胸腺切片(4微米)用低溫箱(Leica)切片，并立刻用100％丙酮固定。
對(duì)于雙色免疫熒光檢驗(yàn)法，切片用本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的一系列單克隆抗體MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35和44(Godfrey等，1990；表1)進(jìn)行雙標(biāo)，并用多價(jià)兔抗細(xì)胞角蛋白抗體(Dako，Carpinteria，加利福尼亞)檢測(cè)上皮細(xì)胞決定簇的共表達(dá)。結(jié)合的單克隆抗體用FITC-共軛綿羊抗大鼠免疫球蛋白 (西勒諾斯驗(yàn)室(Silenus Laboratories))顯色，而抗細(xì)胞角蛋白用TRITC-共軛的山羊抗兔免疫球蛋白(西勒諾斯實(shí)驗(yàn)室(Silenus Laboratories))顯示。
對(duì)于BrdU檢測(cè)，切片或者是先用抗細(xì)胞角蛋白隨后再用抗兔-TRITC染色，或者是用特異的mAb染色，然后用抗大鼠免疫球蛋白-Cγ3(Amersham)顯示。然后，用前述方法檢測(cè)BrdU(Penit等，1996)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，切片用70％乙醇固定30分鐘。半干的切片在4MHCl中孵育，用硼酸鹽緩沖液(Sigma)沖洗中和，再用PBS洗兩次。用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)檢測(cè)BrdU。
對(duì)于三色免疫熒光檢驗(yàn)法，標(biāo)記切片的特異性MTSmAb和抗細(xì)胞角蛋白一起標(biāo)記。然后用上述方法檢測(cè)BrdU。
用萊卡(Leica)熒光顯微鏡和尼康(Nikon)共聚焦顯微鏡分析切片。
遷移研究向動(dòng)物腹腔內(nèi)注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(鹽酸賽拉嗪；BayerAustralia公司，Botany NSW，澳大利亞)和1.5mg鹽酸氯胺酮(氯胺酮針劑；Parke-Davis，Caringbah，NSW，澳大利亞)的生理鹽水進(jìn)行麻醉。
FITC標(biāo)記胸腺細(xì)胞的技術(shù)細(xì)節(jié)類似于在其它地方(Scollay等，1980；Berzins等，1998)描述的那樣。簡(jiǎn)單地說(shuō)，暴露胸腺小葉，每個(gè)小葉注射350μg/ml FITC大約10μm(μl)(溶于PBS中)。用外科手術(shù)針縫合創(chuàng)口，將小鼠保溫直到從麻醉中完全恢復(fù)。注射后大約24小時(shí)將小鼠用CO2窒息殺死，取出淋巴器官并分析。
細(xì)胞計(jì)數(shù)后，樣品用抗CD4-PE和抗CD8-APC染色，然后用流式細(xì)胞儀分析。遷移細(xì)胞被識(shí)別為表達(dá)CD4或CD8的活的門化的FITC+細(xì)胞(以排除自身熒光細(xì)胞和雙聯(lián)體)。加上FITC+CD4和CD8細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)以得到淋巴結(jié)和脾各自的總遷移百分?jǐn)?shù)。用Berzins等(1998)所述方法計(jì)算每日輸出率。
用不配對(duì)的t檢驗(yàn)或非參數(shù)的曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，以確定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組結(jié)果之間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而這些實(shí)驗(yàn)至少要重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)值顯著區(qū)別于對(duì)照值表示如下*p≤0.05，**p≤0.01、和***p≤0.001。
結(jié)果年齡對(duì)胸腺細(xì)胞群體的影響(i)胸腺重量和胸腺細(xì)胞數(shù)目隨著年齡增長(zhǎng)，胸腺重量(圖1A)和胸腺細(xì)胞總數(shù)(圖1B)均顯著(p≤0.0001)減少。年輕成體的相對(duì)胸腺重量(毫克胸腺/克體重)的平均值為3.34，18-24個(gè)月時(shí)減少到0.66(脂肪的沉積限制了精確的計(jì)算)。胸腺重量的減少是由于胸腺細(xì)胞總數(shù)的減少1-2個(gè)月胸腺含有～6.7×107個(gè)胸腺細(xì)胞，24個(gè)月時(shí)減少到～4.5×106個(gè)細(xì)胞。通過(guò)閹割去除性類固醇對(duì)胸腺的影響，胸腺再生，在閹割后4周，胸腺重量和細(xì)胞構(gòu)成(圖1A和1B)均相當(dāng)于年輕成體水平。有趣的是閹割后2周胸腺細(xì)胞數(shù)目顯著(p≤0.001)增加(～1.2×108)，閹割后4周恢復(fù)到正常的年輕時(shí)的水平(圖1B)。
胸腺產(chǎn)生的T細(xì)胞數(shù)目減少在外周沒(méi)有反映，脾細(xì)胞數(shù)目隨年齡增長(zhǎng)保持恒定(圖2A)。外周組織有明顯的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定機(jī)制，因?yàn)樵谄⒑土馨徒Y(jié)中B細(xì)胞與T細(xì)胞的比例不受年齡和到達(dá)外周的T細(xì)胞數(shù)目減少的影響(圖2B)。然而，CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例隨年齡顯著減少(p≤0.001)，該比例從2個(gè)月時(shí)的2∶1降至2歲時(shí)的1∶1(圖2C)。繼閹割和到達(dá)外周的T細(xì)胞數(shù)目上升之后，沒(méi)有觀察到外周T細(xì)胞數(shù)目的變化；脾臟T細(xì)胞數(shù)目和脾和淋巴結(jié)的B∶T細(xì)胞的比例在閹割后未發(fā)生改變(圖2A和B)。外周CD4∶CD8比例隨著年齡減少在閹割后2周仍很明顯，但在閹割后4周則完全逆轉(zhuǎn)(圖2C)。
(ii)αβTCR、γδTCR、CD4和CD8表達(dá)為了確定胸腺細(xì)胞數(shù)目隨著年齡逐漸減少是否是特定的細(xì)胞群體缺失的結(jié)果，胸腺細(xì)胞用特定的標(biāo)記物標(biāo)記，以便分析各個(gè)亞群。此外，這樣還允許分析閹割后胸腺種群再生的動(dòng)力學(xué)。主要的胸腺細(xì)胞亞群的比例與正常的年輕的胸腺相比(圖3)，隨著年齡保持不變。此外，用αβTCR和γδTCR的表達(dá)進(jìn)一步細(xì)分胸腺細(xì)胞揭示出這些群體的比例隨著年齡沒(méi)有改變(數(shù)據(jù)未示出)。在閹割后2周和4周，各胸腺細(xì)胞亞群的比例保持不變，由于閹割后胸腺細(xì)胞數(shù)目增加了100倍，所以這表明全部胸腺細(xì)胞亞群同步擴(kuò)增，而不是進(jìn)化式的逐步擴(kuò)增。
因此，老年動(dòng)物胸腺細(xì)胞數(shù)目的減少似乎是所有細(xì)胞表型均衡減少的結(jié)果，在T細(xì)胞群體中未檢測(cè)到顯著變化。胸腺再生以同步方式發(fā)生，所有的T細(xì)胞亞群是同時(shí)而不是依次補(bǔ)充。
胸腺細(xì)胞的增殖如圖4所示，15-20％的胸腺細(xì)胞在4-6周時(shí)增殖。這些細(xì)胞中的大部分(～80％)是雙陽(yáng)性的，三陰性亞群組成了第二大群體，約占～6％(圖5A)。因此，大部分分裂可以通過(guò)免疫組化在被膜下和皮質(zhì)中看到(數(shù)據(jù)未給出)。一些細(xì)胞分裂可以用FACS分析方法在髓質(zhì)區(qū)域中看到，為單陽(yáng)性細(xì)胞的分裂(9％的CD4 T細(xì)胞和25％的CD8 T細(xì)胞)(圖5B)。
雖然在老年胸腺細(xì)胞數(shù)目顯著減少，但是胸腺細(xì)胞的增殖保持恒定，在2歲時(shí)減少到12-15％(圖4)，增殖群體的表型類似于2個(gè)月的胸腺(圖5A)。免疫組化揭示在1歲時(shí)的細(xì)胞分裂反映年輕成體中所看到的分裂；在2歲時(shí)，增殖主要發(fā)生在外層皮質(zhì)和維管結(jié)構(gòu)周圍(數(shù)據(jù)未給出)。閹割后2周，雖然胸腺細(xì)胞數(shù)目顯著增加，但是增殖的胸腺細(xì)胞的比例沒(méi)有變化，從而再一次證明細(xì)胞的同步增殖(圖4)。免疫組化顯示閹割后2周胸腺細(xì)胞增殖的部位和細(xì)胞分裂的程度類似于2個(gè)月胸腺的情況(數(shù)據(jù)未給出)。分析每個(gè)代表增殖群體的亞群的比例，增殖群體內(nèi)的CD8 T細(xì)胞的百分比顯著(p＜0.001)增加(2個(gè)月和2歲為1％，閹割后2周增加到～6％)(圖5A)。
圖5B顯示年輕、老年和閹割小鼠中每個(gè)亞群的增殖程度。在雙陰性亞群內(nèi)增殖顯著(p≤0.001)衰減(2個(gè)月時(shí)35％，2歲時(shí)4％)。CD8+T細(xì)胞的增殖也顯著(p≤0.001)減少，從而反映出免疫組化的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)，即老年胸腺髓質(zhì)中沒(méi)有明顯的分裂。閹割后4周，雙陰性亞群增殖的減少仍未回到正常的年輕水平。然而，閹割后2周，CD8+T細(xì)胞亞群的增殖顯著(p≤0.001)增加并且在閹割后4周恢復(fù)到正常的年輕水平。
用CD44和CD25標(biāo)記物進(jìn)一步分析雙陰性亞群內(nèi)增殖的減少。除了胸腺前體細(xì)胞之外，雙陰性亞群還包括αβTCR+CD4-CD8-胸腺細(xì)胞，這些細(xì)胞被認(rèn)為在向單陽(yáng)性細(xì)胞過(guò)渡時(shí)共表達(dá)受體下調(diào)(Godfrey&Zlotnik，1993)。通過(guò)在這些成熟的細(xì)胞上的門化，可以分析真正的三陰性區(qū)室(CD3-CD4-CD8-)，結(jié)果表明隨著年齡或在閹割后其增殖速率沒(méi)有差異(圖5C)。然而，表達(dá)CD44和CD25的亞群的分析表明三陰性1(TN1)亞群(CD44+CD25-)的增殖顯著(p＜0.001)減少，從正常的年輕時(shí)的20％減少到18個(gè)月時(shí)的大約6％(圖5D)，這在閹割后4周時(shí)恢復(fù)。三陰性1(TN1)亞群增殖的減少被三陰性2(TN2)亞群(CD44+CD25+)增殖的顯著(p≤0.001)增加所補(bǔ)償，后者在閹割后2周恢復(fù)到正常年輕水平(圖5D)。
年齡對(duì)胸腺微環(huán)境的影響使用來(lái)自MTS系列的單克隆抗體(Mabs)的延伸板，用多克隆抗細(xì)胞角蛋白抗體進(jìn)行雙標(biāo)記，用免疫熒光法，來(lái)檢測(cè)胸腺微環(huán)境隨年齡的變化。
被單克隆抗體識(shí)別的抗原可以分為三組胸腺上皮亞群，血管相關(guān)抗原、和那些在基質(zhì)細(xì)胞和胸腺細(xì)胞上均存在的抗原。
(i)上皮細(xì)胞抗原2歲小鼠胸腺的抗角蛋白染色(泛上皮)顯示普通胸腺結(jié)構(gòu)的喪失，伴隨嚴(yán)重的上皮細(xì)胞無(wú)序化和明顯的皮質(zhì)-髓質(zhì)連接的喪失。用單克隆抗體MTS10(髓質(zhì))和MTS44(皮層)進(jìn)一步分析，表明隨著年齡皮質(zhì)明顯減小，而髓質(zhì)上皮細(xì)胞減少不明顯(數(shù)據(jù)未給出)。在老年胸腺中，沒(méi)有上皮細(xì)胞的區(qū)域，或角蛋白陰性區(qū)域(KNA’s，van Ewijk等，1980；Godfrey等，1990；Bruijntjes等，1993)更明顯而且面積增加，如同用抗細(xì)胞角蛋白標(biāo)記那樣。在老年胸腺中還出現(xiàn)胸腺上皮的“囊樣”結(jié)構(gòu)，在髓質(zhì)區(qū)域中更顯著(數(shù)據(jù)未給出)。用抗細(xì)胞角蛋白染色可顯示脂肪的沉積，胸腺體積的嚴(yán)重減小和皮質(zhì)-髓質(zhì)連接的完整性的減退(數(shù)據(jù)未給出)。胸腺在閹割后2周開始再生。這在胸腺葉的大小、用MTS 44顯示的皮質(zhì)上皮細(xì)胞的增加和髓質(zhì)上皮細(xì)胞的定位方面均是明顯的。髓質(zhì)上皮細(xì)胞是在2周時(shí)用MTS 10檢測(cè)到的，用MTS 10染色仍然有上皮細(xì)胞的副囊(subpockets)分散在整個(gè)皮質(zhì)中。閹割后4周，有明顯的髓質(zhì)和皮層并且可分辨出皮質(zhì)-髓質(zhì)的連接處(數(shù)據(jù)未給出)。
MTS 20和24標(biāo)記物可檢測(cè)原生上皮細(xì)胞(Godfrey等，1990)，能夠進(jìn)一步說(shuō)明老年胸腺的退化。在胚胎14天(E14)時(shí)原生上皮細(xì)胞大量存在，在4-6周時(shí)在分散的髓質(zhì)上皮細(xì)胞簇中可檢測(cè)到，在老年胸腺中強(qiáng)度再次增加(數(shù)據(jù)未給出)。閹割后，用MTS 20和MTS 24檢測(cè)，所有這些抗原的表達(dá)均與年輕成體胸腺的水平相當(dāng)(數(shù)據(jù)未給出)，恢復(fù)到位于皮質(zhì)-髓質(zhì)連接處的上皮細(xì)胞的離散副囊(subpockets)中。
(ii)血管相關(guān)抗原血-胸腺屏障被認(rèn)為負(fù)責(zé)T細(xì)胞前體細(xì)胞向胸腺的遷移，和成熟T細(xì)胞從胸腺向外周的遷移。
單克隆抗體MTS 15對(duì)于胸腺血管內(nèi)皮有特異性，呈顆粒狀、彌散的染色圖像(Godfrey等，1990)。在老年胸腺中，MTS 15的表達(dá)顯著增加，反映血管和血管周圍間隙的增加和體積增大(數(shù)據(jù)未給出)。
含有一些重要結(jié)構(gòu)和諸如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖維蛋白原等細(xì)胞粘連分子的胸腺細(xì)胞外基質(zhì)可以用單克隆抗體MTS16檢測(cè)。MTS 16散布在正常的年輕胸腺中，在老年胸腺中MTS 16的表達(dá)更為擴(kuò)散且互相連接。閹割后2周MTS 16的表達(dá)進(jìn)一步增加，閹割后4周，這種表達(dá)類似于2個(gè)月的胸腺的情況(數(shù)據(jù)未給出)。
(iii)共享的抗原用MAbMTS 6檢測(cè)到的在正常年輕胸腺中MHC II的表達(dá)在皮質(zhì)上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性(顆粒狀)(Godfrey等，1990)而在髓質(zhì)上皮細(xì)胞中染色較弱。老年胸腺M(fèi)HC II表達(dá)減少，閹割后2周表達(dá)明顯增加。閹割后4周，表達(dá)再次減少，并類似于2個(gè)月時(shí)的胸腺(數(shù)據(jù)未給出)。
胸腺細(xì)胞遷移在年輕小鼠每天大約有1％的T細(xì)胞從胸腺遷出(Scollay等，1980)。我們發(fā)現(xiàn)在14個(gè)月的正常年輕小鼠和甚至2歲的小鼠遷移比例相當(dāng)(圖5)，雖然數(shù)量顯著減少(p≤0.0001)。在最近的胸腺遷出細(xì)胞中CD4∶CD8的比例從2個(gè)月時(shí)的～3∶1增加到26個(gè)月時(shí)的～7∶1。閹割后一周，遷移到外周的細(xì)胞數(shù)明顯增加，而總的遷移率保持恒定在1-1.5％。
實(shí)施例下面的實(shí)施例提供本發(fā)明方法的特定實(shí)施例，但是并不會(huì)構(gòu)成對(duì)本發(fā)明內(nèi)容的限制。實(shí)施例1T細(xì)胞清除為了防止可能的移植物受體體內(nèi)現(xiàn)有的T細(xì)胞影響移植物，患者需經(jīng)歷T細(xì)胞清除。這個(gè)步驟的標(biāo)準(zhǔn)程序如下?；颊呙刻熳⑸淇筎細(xì)胞抗體Atgam 15mg/kg(異種抗T細(xì)胞球蛋白，Pharmacia Upiohn)，連續(xù)10天，同時(shí)持續(xù)靜脈輸注T細(xì)胞活性抑制劑環(huán)孢菌素A，3mg/kg，持續(xù)3至4周，隨后按每天9mg/kg服用片劑。這種處理不影響患者胸腺中T細(xì)胞的早期發(fā)育，因?yàn)橛捎谌说男叵俚拇笮『徒Y(jié)構(gòu)限制，不能給予能產(chǎn)生這種作用的必需的抗體數(shù)量。該處理維持大約4-6周，以允許后面胸腺重建時(shí)性類固醇的缺乏。對(duì)T細(xì)胞的反應(yīng)性的抑制也可以與諸如白細(xì)胞介素或細(xì)胞粘附分子之類二級(jí)信號(hào)的抑制劑聯(lián)合使用以增強(qiáng)T細(xì)胞的消融。
外周T細(xì)胞的清除將移植物排斥的風(fēng)險(xiǎn)降低到最小，因?yàn)樗宄怂蟹翘禺愋訲細(xì)胞，包括那些對(duì)外來(lái)供體有潛在反應(yīng)的T細(xì)胞。但是，同時(shí)，因?yàn)槿狈細(xì)胞，該程序會(huì)導(dǎo)致廣泛的免疫缺陷狀態(tài)，這意味著患者非常容易感染，尤其是病毒感染。在缺乏T細(xì)胞輔助的情況下，即使B細(xì)胞的應(yīng)答也不能正常進(jìn)行。實(shí)施例2性類固醇消融治療給予患者LHRH激動(dòng)劑以進(jìn)行性類固醇清除治療。用Leucrin(貯存注射；22.5mg)或醋酸性瑞林(植入；10.8mg)，單一劑量持續(xù)3個(gè)月有效。這可以將性類固醇激素水平降低到足以重新激活胸腺的水平。在某些情況下，還有必要給一些抑制腎上腺產(chǎn)生性類固醇的抑制劑，如Cosudex(5毫克/天)，在性類固醇消融治療期間每天一片。腎上腺產(chǎn)生的性類固醇約占人體類固醇的10-15％。
將血液中的性類固醇減少到最小值約需1-3周；與此一致的是胸腺的重新激活。在某些情況下，有必要把此治療時(shí)間延長(zhǎng)，進(jìn)行第二個(gè)3個(gè)月的注射/植入療程。實(shí)施例3其它給藥方法可以用其它方法代替LHRH激動(dòng)劑的3個(gè)月貯存注射或植入給藥。在一個(gè)實(shí)施例中，患者的皮膚被諸如Er:YAG激光器之類的激器光輻照，消融或蝕變皮膚，以減少角質(zhì)層的阻礙效應(yīng)。
A.激光消融或蝕變用Er:YAG固態(tài)脈沖激光器產(chǎn)生紅外激光輻射脈沖。該激光器包括兩塊平面共振反射鏡、一塊作為活性介質(zhì)的Er:YAG晶體、電源、和激光束聚焦裝置。激光束的波長(zhǎng)是2.94微米。使用的是單一脈沖。
操作參數(shù)如下每個(gè)脈沖的能量是40、80、或120毫焦耳，在焦點(diǎn)光束尺寸是2毫米，能注量為1.27、2.55、或3.82焦耳/平方厘米。脈沖時(shí)間寬度為300微秒，能注量率為0.42、0.85、或1.27×104瓦/厘米2。
隨后，將一定量LHRH激動(dòng)劑加到皮膚上，并且涂在輻照部位。LHRH激動(dòng)劑可以為軟膏，這樣它就能保留在輻照部位上。可選地在激動(dòng)劑周圍放一個(gè)封閉貼片，以使它保持在輻照部位。
可選地，用光束分離器來(lái)分裂激光束以形成多個(gè)消融或蝕變點(diǎn)。這可以使LHRH激動(dòng)劑更快地通過(guò)皮膚進(jìn)入血流。部位的數(shù)目可以預(yù)先確定，以使激動(dòng)劑在患者系統(tǒng)內(nèi)維持必不可少的大約30天。
B.壓力波一定劑量LHRH激動(dòng)劑放在諸如柔軟的塑膠墊圈(直徑大約1英寸(25.4mm)，厚約1/16英寸(1.5875mm))之類的合適的容器中，放在要產(chǎn)生壓力波的皮膚處。然后，用諸如大約1毫米厚的黑色聚苯乙烯片之類的靶材料覆蓋該部位。用Q-開關(guān)固態(tài)紅寶石激光器(20納秒的脈沖持續(xù)時(shí)間，每個(gè)脈沖能夠產(chǎn)生2焦耳能量)生成激光束以輻照靶材料并且產(chǎn)生單一的短暫脈沖。黑色聚苯乙烯靶材料完全吸收激光輻射，這樣皮膚僅僅暴露于短暫脈沖下，而不暴露于激光輻射之中。該過(guò)程不產(chǎn)生疼痛。該過(guò)程可以每天或者在需要時(shí)重復(fù)，以維持激動(dòng)劑的血液循環(huán)水平。實(shí)施例4給予供體細(xì)胞以形成耐受實(shí)際應(yīng)用中，在采集細(xì)胞之前給供體注射10微克/千克的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)2-5天以提高供體血液中造血干細(xì)胞(HSC)的水平。優(yōu)選使用流式細(xì)胞儀或免疫磁珠從供體血液或骨髓中純化CD34+供體細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀證明供體來(lái)源的HSC為CD34+?？蛇x地，在體外用干細(xì)胞因子擴(kuò)增這些HSC。給予LHRH激動(dòng)劑后大約1-3周，正好在胸腺開始再生之前或之時(shí)，給患者注射供體的HSC，最好為大約2-4×106細(xì)胞/千克的劑量?？蛇x地，給受體注射G-CSF以輔助HSC擴(kuò)增。
重新激活的胸腺吸收純化的HSC并將它們轉(zhuǎn)變成供體型T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，同時(shí)將受體的HSC轉(zhuǎn)變成受體型T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。通過(guò)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)清除，或通過(guò)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞誘導(dǎo)耐受，供體樹突狀細(xì)胞將耐受任何可能與受體反應(yīng)的T細(xì)胞。實(shí)施例5移植物的移植當(dāng)受體仍然在接受持續(xù)的T細(xì)胞清除免疫抑制治療的時(shí)候，即可將至少部分清除供體T細(xì)胞的器官、組織、或細(xì)胞群從供體移植到受體。
在LHRH治療的大約3-4周內(nèi)，最早的新T細(xì)胞將存在于受體的血流中。然而，為了形成移植受體和供體的造血細(xì)胞的穩(wěn)定的嵌合體，免疫抑制治療應(yīng)維持大約3-4個(gè)月。由于在重新激活的胸腺中存在供體和受體兩者的DC，它們將清除新產(chǎn)生的T細(xì)胞中可能對(duì)供體和移植受體發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞。經(jīng)過(guò)移植受體的胸腺上皮細(xì)胞的正面選擇，T細(xì)胞將能夠識(shí)別受體外周血中移植受體的APC呈遞的肽，從而保持對(duì)正常感染發(fā)生反應(yīng)的能力。將供體樹突狀細(xì)胞摻入到受體的淋巴器官中可以形成與移植受體獨(dú)自的免疫系統(tǒng)完全一樣的免疫系統(tǒng)狀態(tài)，而不是對(duì)供體細(xì)胞、組織、和器官的耐受。因此，正常的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制仍然存在。實(shí)施例6替代方案如果可用于供體的細(xì)胞、組織、或器官移植的時(shí)間被縮短，則應(yīng)修改在實(shí)施例1-5中使用的時(shí)間線。T細(xì)胞消融和性類固醇消融可以同時(shí)開始。T細(xì)胞消融維持大約10天，而性類固醇消融維持大約3個(gè)月。移植物的移植優(yōu)選在聯(lián)合治療后大約10-12天胸腺開始重新激活時(shí)進(jìn)行。
對(duì)于更短的時(shí)間表，兩種類型的消融和移植物的移植可以同時(shí)開始。在這種情況下，優(yōu)選T細(xì)胞消融維持3-12個(gè)月，更優(yōu)選3-4個(gè)月。實(shí)施例7免疫抑制的終止當(dāng)胸腺嵌合體已經(jīng)建立，成熟T細(xì)胞的新群體已開始從胸腺排出的時(shí)候，從患者身上取血并在體外用標(biāo)準(zhǔn)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢查T細(xì)胞對(duì)供體細(xì)胞的免疫應(yīng)答缺乏性。如果沒(méi)有應(yīng)答，則可逐漸減少免疫抑制治療，以能夠防御感染。如果沒(méi)有排斥的癥狀，可部分地通過(guò)血液中出現(xiàn)激活的T細(xì)胞表現(xiàn)，則可最終完全停止免疫抑制治療。由于HSC有很強(qiáng)的自我更新能力，這樣形成的造血細(xì)胞嵌合體在理論上對(duì)于患者將終生穩(wěn)定(如同正常的、非耐受的、和未接受移植的人一樣)。實(shí)施例8使用LHRH激動(dòng)劑來(lái)重新激活人類胸腺為了說(shuō)明人的胸腺能用本發(fā)明的方法重新激活，這些方法被用于接受化療的前列腺癌患者。在性類固醇消融治療前和治療后4個(gè)月對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果總結(jié)于圖23-27中?？偲饋?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)證明在許多患者中T細(xì)胞的狀態(tài)得到了定性的和定量的改善。
LHRH療法對(duì)淋巴細(xì)胞總數(shù)及T細(xì)胞亞群的影響分析正在接受LHRH激動(dòng)劑治療的前列腺癌患者(全部＞60歲)的外周血淋巴細(xì)胞的表型組成(圖23)。在治療前和開始LHRH激動(dòng)劑治療后4個(gè)月分析患者的樣本。治療前在所有的患者中，每毫升血中淋巴細(xì)胞總數(shù)都在對(duì)照值的低限。治療后，6/9的患者顯示總的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加(在某些病例可觀察到細(xì)胞總數(shù)加倍)。與此相關(guān)的是在6/9的患者中T細(xì)胞總數(shù)增加。在CD4+亞群內(nèi)，這種增加甚至更顯著，8/9的患者顯示CD4+T細(xì)胞的水平增加。在CD8+亞群內(nèi)這種趨勢(shì)較不明顯，4/9的患者的水平增加，但是通常增加的程度比CD4+T細(xì)胞小。
LHRH療法對(duì)T細(xì)胞亞群的比例的影響對(duì)LHRH激動(dòng)劑治療前和治療后患者的血液分析證明，T細(xì)胞、CD4+或CD8+T細(xì)胞的總比例沒(méi)有明顯改變，而在治療后CD4+CD8+細(xì)胞的比例有不同的改變(圖24)。這表明雖然治療后T細(xì)胞總數(shù)有明顯增加，但治療對(duì)T細(xì)胞亞群的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的維持影響很小。全部數(shù)值都與對(duì)照值進(jìn)行比較。
LHRH療法對(duì)B細(xì)胞和骨髓性細(xì)胞的比例的影響對(duì)正在接受LHRH激動(dòng)劑治療的患者的外周血內(nèi)B細(xì)胞和骨髓性細(xì)胞(NK、NKT、和巨噬細(xì)胞)的比例的分析證明各個(gè)亞群有不同程度的改變(圖25)。雖然治療后NK、NKT、和巨噬細(xì)胞的比例保持相對(duì)恒定，但B細(xì)胞的比例在4/9的患者中降低。
LHRH激動(dòng)劑療法對(duì)B細(xì)胞和骨髓性細(xì)胞總數(shù)的影響對(duì)治療后外周血內(nèi)B細(xì)胞和骨髓性細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)的分析清楚地表明治療后NK(5/9的患者)、NKT(4/9的患者)、和巨噬細(xì)胞(3/9的患者)的細(xì)胞數(shù)明顯增加(圖26)。B細(xì)胞的數(shù)目的改變無(wú)明顯趨勢(shì)，2/9的患者細(xì)胞數(shù)目增加；4/9的患者沒(méi)有變化；而3/9的患者細(xì)胞數(shù)目減少。
LHRH治療對(duì)相對(duì)于記憶細(xì)胞的幼稚細(xì)胞水平的影響
LHRH激動(dòng)劑治療后的主要變化是在外周血的T細(xì)胞群體之內(nèi)。特別是，幼稚(CD45RA+)CD4+細(xì)胞的比例選擇性增加，在CD4+T細(xì)胞亞群中幼稚(CD45RA+)與記憶(CD45RO+)細(xì)胞的比例在6/9的患者中增加(圖27)。
結(jié)論因此，人們能夠得出結(jié)論LHRH激動(dòng)劑治療在胸腺萎縮的動(dòng)物如人類能夠誘導(dǎo)胸腺的重新激活。在接受性類固醇消融治療的前列腺癌患者血液中T淋巴細(xì)胞的狀態(tài)有普遍改善。盡管很難準(zhǔn)確地確定這些細(xì)胞是否僅僅來(lái)源于胸腺，但是這將是非常合乎邏輯的結(jié)論，因?yàn)檫€沒(méi)有其他來(lái)源的主流(CD8αβ鏈)T細(xì)胞的描述。胃腸道T細(xì)胞主要是TCRγδ或CD8αα鏈。
參考文獻(xiàn)Aspinall，R.，1997，″Age-associated thymic atrophy in the mouse is due to adeficiencyaffecting rearrangement ofthe TCR during intrathymic T cell development，″J.Immunol.
1583037.
Bahnson,，A.B.，et al.，1997，“Method for Retrovirus-Mediated Gene Transfer to CD34+-Enriched Cells，”in GENE THERAPY PROTOCOLS(P.D.Robbins，ed.)，Humana Press，pp.249-263.
Bauer，G.，et al.，1997，“Inhibition of Human Immunodeficiency Virus-1(HIV-1)ReplicationAfter Transduction of Granulocyte Colony-Stimulating Factor-Mobilized CD34+Cells FromHIV-1-Infected Donors Using Retroviral Vectors Containing Anti-HIV-1 Genes，”Blood892259-2267.
Belmont，J.W.and R.Jurecic，1997，“Methods for Efficient Retrovirus-Mediated GeneTransfer to Mouse Hematopoietic Stem Cells，”in GENE THERAPY PROTOCOLS(P.D.Robbins，ed.)，Humana Press，pp.223-240.
Berzins，S.P.，Boyd，R.L.and Miller，J.F.A.P.，1998，″The role of the thymus and recentthymic migrants in the maintenance of the adult peripheral lymphocyte pool，″JExp.Med.
1871839.
Bonyhadi，M.L.，et al.，1997，“RevM10-Expressing T Cells Derived In Vivo FromTransduced Human Hematopoietic Stem-Progenitor Cells Inhibit Human ImmunodeficiencyVirus Replication，”J.Virology 714707-4716.
Boyd，R.L.，Tucek，C.L.，Godfrey，DI.，Wilson，T.J，Davidson，N.J.，Bean，A.G.D.，Ladyman，H.M.，Ritter，M.A.and Hugo，P.，1993，″The thymic microenvironment，″Immunology Today14445.
Bruijntjes，J.P.，Kuper，C.J.，Robinson，J.E.and Schutirman，H.J.，1993，″Epithelium-free areain the thymic cortex of rats，″Dev.Immunol.3113.Capecchi，M.R.，1980，“High Efficiency Transformation by Direct Microinjection of DNAInto Cultured Mammalian Cells，”Cell 22479-488.Carayon，P.，and Bord，A.，1992，″Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets usinga new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA，″J.Imm.Methods147225.Douek，D.C.，McFarland，R.D.，Keiser，P.H.，Gage，E.A.，Massey，J.M.，Haynes，B.F.，Polis，M.A.，Haase，A.T.，F(xiàn)einberg，M.B.，Sullivan，J.L.，Jamieson，B.D.，Zack，J.A.，Picker，L.J.and Koup，R.A.，1998，″Changes in thymic function with age and during the treatment of HIVinfection，″Nature 396690.Fredrickson，G.G.and Basch，R.S.，1994，″Early thymic regeneration after irradiation，″Development and Comparative Immunology 18251.George，A.J.and Ritter，M.A.，1996，″Thymic involution with ageingobsolescence or goodhousekeeping？，″Immunol.Today 17267.Godfrey，D.I，Izon，D.J.，Tucek，C.L.，Wilson，T.J.and Boyd，R.L.，1990，″Thephenotypicheterogeneyity of mouse thymic stromal cells，″Immunol.7066.Godfrey，D.I，and zlotnik，A.，1993，″Control points in early T-cell development，″Immunol.Today 14547.Graham，F(xiàn).L.and Van Der Eb，A.J.，1973，“A New Technique for the Assay of Infectivity ofHuman Adenovirus 5 DNA，”Virology 52456-457.Hirokawa，K.，1998，″Immunity and Ageing，″in PRINCIPLES AND PRACTICE OF GERIATRICMEDICINE，(M.Pathy，ed.)John Wiley and Sons Ltd.Hirokawa，K.and Makinodan，T.，1975，″Thymic involutionthe efiect on T celldifferentiation，″ J.Immunol.1141659.Hirokawa，K.，Utsuyama M.，Kasai，M.，Kurashima，C.，Ishijima，S.and Zeng，Y.-X.，1994，″Understanding the mechanism ofthe age-change ofthymic function to promote T celldifferentiation，″Immunology Letters 40269.Hobbs，M.V.，Weige，W.O.，Noonan，D.J.，Torbett，B.E.，McEvilly，R.J.，Koch，R.J.，Cardenas，G.J.and Ernst，D.N.，1993，″Patterns of cytokine gene expression by CD4+T cellsfrom young and old mice，″J.Immunol.1503602.Homo-Delarche，R.and Dardenne，M.，1991，″The neuroendocrine-immune axis，″Seminarsin Immunopathology.Huiskamp，R.，Davids，J.A.G.and Vos，O.，1983，″Short-and long-term effects of wholebody irradiation with fission neutrons or x-rays on the thymus in CBA mice，″RadiationResearch 95370.Kendall，M.D.，1988，″Anatomical and physiological factors influencing the thymicmicroenvironment，″in THYMUS UPDATE I，Vol..1.(M.D.Kendall，and M.A.Ritter，eds.)Harwood Academic Publishers，p.27.Kohn，D.B.，et al.，1999，“A Clinical Trial of Retroviral-Mediated Transfer of a rev-Responsive Element Decoy Gene Into CD34+Cells From the Bone Marrow of HumanImmunodericiency Virus-1 Infected Children，”Blood 94368-371.Kurashima，C，Utsuyama，M.，Kasai，M.，Ishijima，S.A.，Konno，A.and Hirokawa，A.，1995，″The role of thymus in the aging of Th cell subpopulations and age-associated alteration ofcytokine production by these cells，″Int.Immunol.797.Mackall，C.L.et.al.，1995，″Age，thymopoiesis and CD4+T-lymphocyte regeneration afterintensive chemotherapy，″New England J.Med.332143.Mackall，C.L.and Gress，R.E.，1997，″Thymic aging and T-cell regeneration，″Immunol.Rev.16091.Nabel，E.G.，et al，1992，“Gene Transfer In Vivo With DNA-Liposome ComplexesLack ofAutoimmunity and Gonadal Localization，”Hum.Gene Ther.3649-656.Panoskaltsis，N，and C.N.Abboud，1999，“Human Immunodeficiency Virus and theHematopoietic RepertoireImplications For Gene Therapy，”Frontiers in Bioscience 4457.Penit，C.and Ezine，S.，1989，″Cell proliferation and thymocyte subset reconstitution insublethally irradiated micecompared kinetics of endogenous and intrathymically transferredprogenitors，″Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.865547.Penit，C.，Lucas，B.，Vasseur，F(xiàn).，Rieker，T.and Boyd，R.L.，1996，″Thymic medulla epithelialcells acquire specific markers by post-mitotic maturation，″Dev.Immunol.525.Plosker，G.L.and Brogden，R.N.，1994，″Leuprorelin.A review of its pharmacology andtherapeutic use in prostatic cancer，endometriosis and other sex hormone-related disorders，″Drugs 48930.Potter，H.，Weir，L.，and Leder，P.，1984，“Enhancer-dependent expression of Human KappaImmunoglobulin Genes Introduced Into Mouse pre-B Lymphocytes by Electroporation，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817161-7165.Randle-Barrett，E.S.and Boyd，R.L.，1994，″Thymic microenvironment and lymphoidresponses to sublethal irradiation，″Dev.Immunol.41.Scollay，R.G.，Butcher，E.C.and Weissman，I.L.，1980，″Thymus cell migration.Quantitativeaspeets of cellular traffic from the thymus to the periphery in mice，″Eur.J.Immunol 10210.Shortman，K.，Egerton，M.，Spangmde，G.J.and Scollay，R.，1990，″The generation and fateof thymocytes，″Seminars in Immuno.23.Starzl，T.E.，Demetris，A.J.，Murase，N.，Ricardi，C.and Truce，M.，1992，″Cell migration，chimerism，and graft acceptance，″Lancet3391579.Suda，T.，and Zlotnik，A.，1991，″IL-7 maintains the T cell precursor potential of CD3-CD4-CD8-thymocytes，″J.Immunol.463068.Timm，J.A.and Thoman，M.L.，1999，″Maturation of CD4+lymphocytes in the agedmicroenviroment results in a memory-enriched population，″J.Immunol.162711.Thomson，A.W.and Lu，L.，1999，″Are dendritic cells the key to liver transplant？，″Immunology Today 2020.Tosi，R.，Kraft，R.，Luzi，P.，Cintorino，M.，F(xiàn)ankhause，G.，Hess，M.W.and Cottier，H.，1982，″Involution pattern of the human thymus.1.Size of the cortical area.as a function of age，″Clin.Exp.Immunol.47497.van Ewijk，W.，Rouse，R.V.and Weissman，I.L.，1980，″Distribution of H-2microenvironments in the mouse thymus，″J.Histochem.Cytochem.281089.Vickery，B.H.，et al.，eds.，1984，LHRH AND ITS ANALOGSCONTRACEPTIVE&THERAPEUTICAPPLICATIONS，MTP Press Ltd.，Lancaster，PAvon Freeden-Jeffry，U.，Vieira，P.，Lucian，L.A.，McNeil，T.，Burdach，E.G.and Murray，R.，1995，″Lymphopenia in interlenkin(IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as anonredundant cytokine，″J.Exp.Med.1811519.Wiles，M.V.，Ruiz，P.and Imhof，B.A.，1992，″Interleukin-7 expression during mouse thymusdevelopment，″Eur.J.Immunol.221037.Yang，N.-S.and P.Ziegelhoffer，1994，“The Particle Bombardment System for MammalianGene Transfer，”In PARTICLE BOMBARDMENT TECHNOLOGY FOR GENETRANSFER(Yang，N.-S.and Christou，P.，eds.)，Oxford University Press，New York，pp.117-141.Zlotnik，A.and Moore，T.A.，1995，″Cytokine production and requirements during T-celldevelopment，″Curr.Opin.Immunol.7206.
權(quán)利要求
1.用來(lái)在患者體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)配型不合移植物耐受的方法，包括如下步驟T細(xì)胞消融、胸腺的重新激活、以及將選自由造血干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、祖細(xì)胞及其混合物的細(xì)胞組成的組從移植物供體轉(zhuǎn)移到患者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者的胸腺至少已部分失活。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述患者是青春期后的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述患者患有或曾經(jīng)患有疾病或得到疾病治療，其至少部分使所述患者胸腺失活。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述疾病的治療方法是化療。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述供體的造血干細(xì)胞為CD34+。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述造血干細(xì)胞是在胸腺開始再生或其后不久供給的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述造血干細(xì)胞是在傳向所述胸腺的所述性類固醇介導(dǎo)的信號(hào)開始被阻斷時(shí)供給的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中阻斷傳向所述胸腺的所述性類固醇介導(dǎo)的信號(hào)的所述方法是通過(guò)外科手術(shù)閹割去除所述患者的性腺。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中阻斷傳向所述胸腺的所述性類固醇介導(dǎo)的信號(hào)的所述方法通過(guò)給予一種或多種藥物實(shí)現(xiàn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述藥物選自由LHRH激動(dòng)劑、LHRH拮抗劑、抗LHRH疫苗及其組合組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中LHRH激動(dòng)劑選自由氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、組氨瑞林、那法瑞林、黃體瑞林、亮丙瑞林和地洛瑞林組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述LHRH拮抗劑是Abarelix。
14.用于改善移植物在患者體內(nèi)接受度的試劑盒包括LHRH類似物、一組來(lái)自移植物供體的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中所述LHRH類似物選自由一種或多種LHRH激動(dòng)劑、一種或多種LHRH拮抗劑及其組合組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中所述干細(xì)胞或祖細(xì)胞選自由造血干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞及其組合組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒還含有細(xì)胞因子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中細(xì)胞因子選自由白細(xì)胞介素7、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素15、粒細(xì)胞集落刺激因子、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其組合組成的組。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在受體體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)配型不合的移植器官、組織和/或細(xì)胞耐受的方法。通過(guò)接受受體的胸腺和提供供體的造血干細(xì)胞，原先的“外源性”物質(zhì)在受體體內(nèi)被認(rèn)為是“自身的”，從而不被排斥，患者的T細(xì)胞群體被清除。在優(yōu)選實(shí)施例中造血干細(xì)胞為CD3文檔編號(hào)A61K35/14GK1479638SQ01820136
公開日2004年3月3日 申請(qǐng)日期2001年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月13日
發(fā)明者理查德·博伊德, 理查德 博伊德 申請(qǐng)人:莫納什大學(xué)