專利名稱：造血干細胞基因治療方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于基因治療領域。更特別地，本發(fā)明涉及通過刺激患者的胸腺并對造血干細胞(HSC)或骨髓進行基因治療來對患者的免疫系統(tǒng)進行改造。
與本發(fā)明相關的背景技術(shù)免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)的主要功能是區(qū)別“外來”和“自身”抗原并相應地進行應答，以保護機體不受感染。在正常的免疫應答中，事件的序列涉及專一性抗原呈遞細胞(APC，antigen presenting cells)捕獲外來抗原并將它處理成小的肽片段，這些肽片段在APC表面呈現(xiàn)為主要組織相容性復合物(MHC)的裂片(clefts)。該MHC分子可為I型(在所有有核細胞上表達，被細胞毒性T細胞(Tc)識別)或II型(主要經(jīng)免疫系統(tǒng)細胞進行表達，被輔助T細胞(Th)識別)。Th細胞識別APC上的MHCII/肽復合物并進行應答；然后這些細胞釋放的因子可提高Tc細胞或產(chǎn)生B細胞的抗體(這些B細胞對特定抗原具有特異性)的活性。Th細胞在事實上所有免疫應答中的重要性在HIV/AIDS中有最好的體現(xiàn)，其中HIV/AIDS就是因為病毒破壞Th細胞導致Th細胞缺乏，從而引起嚴重免疫缺陷并最終導致死亡。Th細胞的不正常發(fā)育(和Tc，但程度較輕)能導致多種其他疾病如過敏癥、癌癥、和自身免疫病。
T淋巴細胞和B淋巴細胞的細胞膜受體具有識別抗原的能力。這些受體由許多可能基因的復雜重排序列隨機產(chǎn)生，因此每一個獨立的T或B細胞具有獨一無二的抗原受體。這種巨大的潛在多樣性意味著對機體可能遇到的任何單個抗原，多種淋巴細胞都能以不同的結(jié)合強度(親和力)對它進行識別，并且產(chǎn)生不同程度的應答。既然抗原受體的特異性隨機產(chǎn)生，因而產(chǎn)生了如下問題為什么身體中的淋巴細胞不會和自身抗原反應產(chǎn)生“自我摧毀”。幸運的是有許多機制阻止T和B細胞這樣做—它們共同形成免疫系統(tǒng)對自身耐受的環(huán)境。
自身耐受最有效的方式是將所有具有潛在反應性的淋巴細胞從它們產(chǎn)生的部位(T細胞在胸腺，B細胞在骨髓)除去(殺死)。所述方式稱為中心耐受(central tolerance)。另一種重要的附加耐受方式是通過調(diào)節(jié)Th細胞，其可直接地或更有可能地通過細胞因子來抑制自身反應性細胞。鑒于事實上所有免疫應答的引發(fā)和調(diào)節(jié)都需要通過Th細胞，因此任何耐受誘導療法的主要靶向均是這類細胞。同樣地，既然Tc細胞是非常重要的效應細胞，因此對例如抗癌和抗病毒療法而言，產(chǎn)生此類細胞是這些治療策略的主要目標。
胸腺胸腺經(jīng)證實是免疫系統(tǒng)中的主要器官，因為它是T淋巴細胞產(chǎn)生的主要部位。它的作用是從血液中吸引適當?shù)脑从诠撬璧那绑w細胞，并且誘導他們對T細胞譜系的支持(commitment)，其中包括產(chǎn)生抗原的T細胞受體(TCR)所必需的基因重組。與此相聯(lián)系的是程度明顯的細胞分裂，從而增加T細胞數(shù)量，由此增加每個外來抗原被識別和消除的可能性。然而，和B細胞不同的是，T細胞識別抗原的很奇怪的特征是TCR只識別與MHC分子物理上相連的肽片段；一般這是自身MHC并且在胸腺中獲取這種能力。此過程稱為正選擇并且是皮質(zhì)上皮細胞獨有的特性。如果TCR未能和自身MHC/肽復合物結(jié)合，該T細胞將會被“忽略”而死亡—它的繼續(xù)成熟需要一定程度的TCR介導信號。
雖然胸腺是功能免疫系統(tǒng)的基礎，每天釋放約1％的T細胞進入血液，哺乳動物的明顯異常之一是，由于性類固醇的產(chǎn)生，該器官會嚴重萎縮。該萎縮甚至在兒童階段就開始發(fā)生并在青春期更加明顯。對正常的健康個體而言，這種新的T細胞的產(chǎn)生和釋放的損失并不總是產(chǎn)生臨床效果(盡管隨年齡增長，免疫有關的疾病的發(fā)病率和嚴重程度也隨之增加)。當大量喪失T細胞時，如患有AIDS并接受化療或放療時，患者對疾病高度敏感，因為免疫受到抑制。
許多T細胞會繼續(xù)發(fā)育，然而，其可偶然地(具有較高的親和力)識別自身MHC/肽復合物。這種T細胞因而具有潛在的自身反應性并能引發(fā)嚴重的自身免疫病，例如多發(fā)性硬化癥、關節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺炎、和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。幸運的是，如果在胸腺中TCR對自身MHC/肽復合物的親和力太高，正在發(fā)育的胸腺細胞就會經(jīng)誘導產(chǎn)生自殺活性并且通過細胞凋亡而死亡，此過程稱為負選擇。這稱為中心耐受。這種T細胞死亡而不發(fā)生應答，因為在胸腺中它們?nèi)晕闯墒臁Ｐ叵僦羞@種負選擇的最有力誘導物是稱為樹突狀細胞(DC)的APC。作為APC，它們給T細胞傳送最強信號；在胸腺中這過程會導致消除，在T細胞更為成熟的外周淋巴器官中，DC起到激活的作用。
胸腺萎縮胸腺在很大程度上受到與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)雙相交流的影響(Kendall，1998)。垂體、腎上腺、和性腺之間的相互作用對胸腺功能的影響尤其重要，包括營養(yǎng)(促甲狀腺激素或TSH，和生長激素或GH)和萎縮的影響(促黃體激素或LH，促卵泡激素或FSH，和促腎上腺皮質(zhì)激素或ACTH)(Kendall，1988；Homo-Delarche，1991)。事實上胸腺生理學的一個重要特征是其結(jié)構(gòu)和功能的進行性退化，其與在青春期循環(huán)血中性類固醇產(chǎn)生的增加成比例(Hirokawa and Makinodan，1975；Tosi et al.，1982 and Hirokawa，etal.，1994)。誘導胸腺萎縮的激素靶點和機制還有待確定。因為胸腺是產(chǎn)生和維持外周T細胞庫的基本生產(chǎn)和維持位點，所以普遍認為這種萎縮是老年人中免疫紊亂發(fā)病率增加的主要原因。特別地，由T細胞依賴的免疫功能(比如溶細胞T細胞的活力和促有絲分裂反應)的下降而說明的免疫系統(tǒng)缺陷，可以從老年時期免疫缺陷、自身免疫以及腫瘤(tumor load)的發(fā)病升高得到反映(Hirokawa，1998)。
胸腺萎縮的影響可反映在外周中，隨著胸腺對T細胞庫的輸入減少致使T細胞受體(TCR)免疫細胞庫的多樣性減少。還觀察到細胞因子改變(Hobbs等，1993；Kurashima等，1995)、CD4+和CD8+亞群的變化、和傾向于記憶細胞(與純真T細胞相對)(Mackall等，1995)。進一步而言，胸腺生成(thymopoiesis)的效率隨著年齡下降，以致在T細胞耗竭后免疫系統(tǒng)重新生成正常數(shù)量T細胞的能力最終喪失(Mackall等，1995)。然而，最近的研究表明(Douek等，1998)，即使在老年人中胸腺輸出仍然存在。TCR基因重組后的DNA酶切產(chǎn)物顯示在HIV感染的老年患者中存在新生的循環(huán)純真T細胞。因為接受化療的青春期后的患者與青春期前的患者相比T細胞庫(尤其是CD4+T細胞)的再生速率明顯降低，所以這種輸出和其后的外周T細胞庫再生的速率有待進一步研究(Mackall等，1995)。Timm和Thoman的最近研究進一步證明了這一點(1999)，研究表明，對老年小鼠進行骨髓移植(BMT)后，盡管CD4+T細胞得到再生，但由于外周微環(huán)境的老化，它們似乎對記憶細胞表現(xiàn)出偏離(bias)，這與胸腺貧乏產(chǎn)生純真T細胞相關。
胸腺基本上由分散在多樣化的基質(zhì)細胞(主要是上皮細胞亞群)中的正在發(fā)育的胸腺細胞組成，這些基質(zhì)細胞構(gòu)成微環(huán)境并提供T細胞的最佳發(fā)育所必要的生長因子和細胞相互作用。胸腺細胞和上皮細胞亞群之間的共生發(fā)育關系(其控制它們的分化和成熟)(Boyd等，1993)，意味著在任何細胞類型的水平都會出現(xiàn)性類固醇抑制，一種類型細胞會影響另一種類型細胞的狀態(tài)。胸腺細胞自身有內(nèi)在缺陷的可能性比較小，因為以往的利用輻射嵌合體進行的研究表明骨髓(BM)干細胞不受年齡的影響(Hirokawa，1998；Mackall and Gress，1997)并且老年骨髓細胞胸腺再生能力與新生骨髓細胞相似。進一步而言，老年動物中的胸腺細胞保持一定的分化能力(Mackall and Gress，1997；George and Ritter，1996；Hirokawa etal.，1994)。然而，Aspinall最近研究(1997)發(fā)現(xiàn)，在前體CD3-CD4-CD8-三陰性(TN)群體中的缺陷發(fā)生于TCRγ鏈基因重組時期。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及利用遺傳修飾的HSC、淋巴或骨髓性祖細胞、上皮干細胞、或其組合(該組和其中每個成員在本文稱為“GM細胞”)，其給予正激活的胸腺，從而進行基因治療的方法。在優(yōu)選的具體實施例中，年齡較大(青春期后)患者的萎縮胸腺被激活。經(jīng)激活后的胸腺能夠從血液中吸收HSC和骨髓細胞(優(yōu)選為經(jīng)遺傳修飾和/或外源的細胞)并在胸腺中將它們轉(zhuǎn)化成新的T細胞和DC。
本發(fā)明的一個方面提供治療患者T細胞紊亂的方法，該方法包括對患者體內(nèi)傳向胸腺的性類固醇介導的信號進行阻斷并對患者進行骨髓或HSC移植。
在一個具體實施例中，T細胞紊亂具有已定義的基因基礎。
在優(yōu)選的具體實施例中，T細胞紊亂是選自由病毒感染(如由人免疫缺陷病毒(HIV)所感染)、T細胞功能紊亂、和任何其他直接或間接減低T細胞數(shù)量或功能的疾病或情況組成的組。
在優(yōu)選的具體實施例中，HSC經(jīng)遺傳修飾，從而在胸腺激活期間和以后形成的T細胞中對HIV產(chǎn)生抗性。例如，HSC經(jīng)修飾以包括其產(chǎn)物能在T細胞中干擾HIV感染、功能、和/或復制的基因。
在另一個方面，本發(fā)明提供了防止感染物質(zhì)如HIV進行感染的方法。在胸腺激活的同時，給患者注射GM，其中GM已經(jīng)過遺傳修飾從而抵抗或防止感染物的感染、活性、復制等、和其組合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了通過阻斷性類固醇介導的信號來實現(xiàn)胸腺的再激活。在一個具體實施例中，用閹割的方法來阻斷性類固醇介導的信號。在優(yōu)選的具體實施例中，采用化學閹割。在另一個具體實施例中，采用手術(shù)閹割。閹割使胸腺的狀態(tài)恢復到青春期前，由此使胸腺重新激活。
在特定的具體實施例中，對傳向胸腺的性類固醇介導的信號的阻斷是通過給予LHRH的激動劑或拮抗劑、抗雌激素抗體、抗雄激素抗體、或被動的(抗體)或主動的(抗原)抗LHRH接種疫苗、或其組合(“阻滯劑”)。
在優(yōu)選的具體實施例中，阻滯劑以肽緩釋劑型施用。在WO98/08533中提供了肽緩釋劑型的例子，其內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實施例中，經(jīng)遺傳修飾的HSC在胸腺重新激活前、同時或隨后移植到患者體內(nèi)，產(chǎn)生新的遺傳修飾的T細胞群。
附圖簡要描述

圖1A和B閹割前后淋巴細胞數(shù)量的變化。胸腺萎縮導致隨年齡增長淋巴細胞數(shù)量顯著下降。到閹割后2周時，細胞數(shù)量已達到年輕成體的水平。在閹割后3周，淋巴細胞的數(shù)量又有所上升并在閹割后第4周穩(wěn)定下來。***＝與年輕成年(2個月)的胸腺顯著不同，p＜0.001。
圖2A-C(A)脾細胞數(shù)量不受年齡和閹割的影響。B∶T細胞比率在外周中也保持恒定(B)，然而，CD4∶CD8比率隨年齡增長而顯著下降(p＜0.001)，并在閹割后4周恢復到正常年輕時的水平。
圖3利用熒光激活細胞分類器(FACS)測定年齡和閹割后對CD4與CD8淋巴細胞群的影響的結(jié)果。每個象限的百分數(shù)在圖上給出。淋巴細胞亞群不隨年齡發(fā)生變化并且在閹割后淋巴細胞同步擴充。
圖4胸腺細胞的增殖，如通過結(jié)合BrdU脈沖所探測的。正在增殖的淋巴細胞比率不隨年齡和閹割發(fā)生變化。
圖5A-D年齡和閹割對淋巴細胞亞群增殖的影響。(A)每個亞群在整個增殖細胞群中的比率—在增殖細胞群中CD8+T細胞比率明顯增加。(B)每個正在增殖亞群的百分比-TN和CD8亞群在2年時與2個月時相比增殖顯著減弱。在閹割后兩周，TN群恢復到正常年輕細胞的增殖水平而CD8群的增殖表現(xiàn)出明顯的增加。該水平與閹割后4周的正常年輕時的水平相似。(C)TN的總增殖不隨年齡和閹割變化。然而(D)TN1亞群隨年齡增長增殖顯著下降，并且在閹割后4周都不能恢復到正常水平。***＝很顯著，p＜0.001，**＝顯著，p＜0.01。
圖6小鼠胸腺內(nèi)注射異硫氰酸熒光素(FITC)。在24h后對外周中的FITC+細胞數(shù)目進行計數(shù)。盡管胸腺新轉(zhuǎn)移細胞(RTE)的比率保持在胸腺細胞數(shù)量的1％左右，但是在閹割后兩周明顯減少，RTE細胞數(shù)量隨年齡明顯降低(p＜0.01)。在閹割后，這些值雖然有所上升但在閹割后兩周仍顯著低于年輕小鼠。隨年齡增長，CD4+與CD8+RTE比率顯著增長，在閹割后一周恢復正常。
圖7A-C用化療藥物環(huán)磷酰胺治療后胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(jié)(C)細胞數(shù)量的變化。結(jié)果表明在治療后1周和2周，閹割組動物與未閹割組動物(僅采用環(huán)磷酰胺治療)相比胸腺發(fā)生快速擴充。此外，與僅采用環(huán)磷酰胺治療組相比，閹割組脾細胞和淋巴結(jié)細胞數(shù)目增長較快。到4周時，細胞數(shù)量達到正常。(n＝3-4每個治療組和時間點)。
圖8A-C手術(shù)閹割后及經(jīng)一周放射治療(625拉德)后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(jié)(C)細胞數(shù)量的變化。注意在治療后1周和2周，閹割組動物與未閹割組動物(僅采用放射治療)相比胸腺發(fā)生快速擴充。(n＝3-4每個治療組和時間點)。
圖9A-C在同一天進行閹割和放射治療后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(jié)(C)細胞數(shù)量的變化。結(jié)果表明在治療后2周，閹割組動物與未閹割組動物相比胸腺發(fā)生快速擴充。然而，所觀察到的差異不如在治療前1周對小鼠進行閹割效果明顯(圖7)。(n＝3-4每個治療組和時間點)。
圖10在同一天進行手術(shù)或化學閹割和化療藥物環(huán)磷酰胺治療后胸腺(A)、脾(B)、和淋巴結(jié)(C)細胞數(shù)量的變化。結(jié)果表明在治療后1周和2周，閹割組動物與未閹割組動物(僅采用環(huán)磷酰胺治療)相比胸腺發(fā)生快速擴充。此外，與僅采用環(huán)磷酰胺治療組相比，閹割組脾細胞和淋巴結(jié)細胞數(shù)量增長較快。(n＝3-4每個治療組和時間點)?；瘜W閹割對環(huán)磷酰胺治療后的免疫系統(tǒng)再生效果與手術(shù)閹割相當。
圖11用I型單純性皰疹病毒(HSV-I)足跖免疫(foot-padimmunization)后的淋巴結(jié)細胞數(shù)量(cellularity)。注意老年閹割組與老年未閹割組相比細胞數(shù)量上升。下圖說明通過FACS就CD25對CD8細胞進行門化的總的激活的細胞數(shù)。
圖12A-C接種HSV-1后，在激活的淋巴結(jié)(LN)中，Vβ10在細胞毒T淋巴細胞(CTL)上的表達。顯示年老小鼠中克隆應答的減少和閹割后所期待應答的復原。
圖13A-C閹割恢復對HSV-1免疫接種的應答。(a)與年輕小鼠和閹割后小鼠相比較老年小鼠在感染后淋巴結(jié)總細胞數(shù)量明顯減少。(b)HSV-1感染小鼠的LN中活化的(CD8+CD25+)細胞的典型FACS圖。活化CTL的比例不隨年齡或閹割發(fā)生明顯變化。(c)老年小鼠淋巴結(jié)中細胞數(shù)量的減少反映在活化CTL數(shù)量的顯著減少上。老年小鼠閹割后對HSV-1的免疫應答恢復正常并且CTL數(shù)量與年輕小鼠相當。結(jié)果用8-12只小鼠的均值±1標準偏差表示。**＝與年輕小鼠(2個月)相比p≤0.01；^＝與年老的(非閹割)小鼠相比p≤0.01。
圖14腘淋巴結(jié)取自經(jīng)HSV-1免疫的小鼠，并培養(yǎng)3天。用未經(jīng)免疫的小鼠作為對照來消除背景因素(通過51Cr的釋放來判定)，進行CTL檢測。結(jié)果用8只小鼠的平均值表示，重復三次，±1標準偏差。在10∶1和3∶1的E∶T比值下年老的小鼠均表現(xiàn)出CTL活性的明顯降低(p≤0.01，*)，這顯示淋巴結(jié)中存在的特異性CTL的百分數(shù)的降低。閹割后老年小鼠的CTL反應性恢復到年輕成體水平。
圖15A和BCD4+T輔助細胞(Tcell help)和對HSV-1感染的VβTCR應答分析結(jié)果。在HSV-1感染后5天摘除腘淋巴結(jié)并在體外分析(a)CD25、CD8和特定的VβTCR標記和(b)CD4/CD8T細胞的表達。(a)活化的(CD25+)CD8+T細胞表達Vβ10或Vβ8.1的百分率用每組8只小鼠的平均值±1標準偏差表示。沒有觀察到隨年齡和閹割后的變化。(b)靜止(resting)LN群中CD4/CD8比率隨年齡下降。該現(xiàn)象在閹割后復原。結(jié)果用每組8只小鼠的平均值±1標準偏差表示。***＝與年輕和閹割小鼠相比p≤0.001。
圖16A-D在Ly5同類(congenic)小鼠骨髓移植后，胸腺(A)、脾(B)、淋巴結(jié)(C)、和骨髓(D)細胞數(shù)量的變化。注意在治療后所有時間點閹割后的動物與非閹割組相比較胸腺快速擴充。此外，閹割組脾和淋巴結(jié)數(shù)量與僅用環(huán)磷酰胺組相比較明顯增加。(每個治療組和時間點的n＝3-4)。與非閹割動物相比，閹割小鼠具有顯著增加的同類(Ly5.2)細胞(數(shù)據(jù)沒有列出)。
圖17A和B在胎兒肝臟重建之后閹割和非閹割小鼠中胸腺細胞數(shù)量的變化。(每個測試組的n＝3-4)。(A)在兩周時，閹割小鼠的胸腺細胞數(shù)量處于正常水平并且明顯高于非閹割小鼠(*p≤0.05)。閹割小鼠4周后觀察發(fā)現(xiàn)胸腺肥大。非閹割的細胞數(shù)量保持在對照水平以下。(B)CD45.2+細胞-CD45.2+是供體來源的標記。在重組后兩周，供體來源細胞在閹割和非閹割小鼠中均存在。在治療后4周閹割胸腺中約85％的細胞是供體來源的。在非閹割胸腺中沒有任何供體來源細胞。
圖18在致死輻照和胎兒肝臟重建、以及其后的手術(shù)閹割后，來源于供體的淋巴細胞群的CD4對CD8的FACS圖。每個象限的百分比在圖的右邊給出。年齡匹配的對照圖是8個月大的Ly5.1同類小鼠胸腺。閹割和非閹割小鼠的圖是在CD45.2+細胞上進行門化，只顯示供體來源的細胞。在重建后兩周胸腺細胞亞群在閹割小鼠和非閹割小鼠間沒有不同。
圖19A和B致死輻照、胎兒肝臟重建、和閹割后，骨髓性和淋巴樹突狀細胞(DC)的數(shù)量。(n＝3-4，每個測試組)。下面圖中的對照(其上標斜線)條圖是基于未治療的年齡匹配的小鼠中發(fā)現(xiàn)的DC的正常數(shù)量。(A)供體來源的骨髓性樹突狀細胞-重建兩周后在非閹割小鼠中DC細胞處于正常水平。同一時間點閹割小鼠中DC明顯更多(*p≤0.05)。在4周時閹割小鼠中DC數(shù)量維持在對照水平之上。(B)供體來源的淋巴樣樹突狀細胞-重建后兩周在閹割小鼠中的DC數(shù)量是非閹割小鼠的兩倍。治療后4周DC數(shù)量保持在對照水平之上。
圖20A和B在胎兒肝臟重建后，閹割和非閹割小鼠中總骨髓細胞數(shù)量和CD45.2+骨髓細胞數(shù)量的變化。n＝3-4，每個測試組。(A)總細胞數(shù)量-重建后兩周骨髓細胞數(shù)量恢復正常并且在閹割和非閹割小鼠之間的細胞數(shù)量沒有明顯差異。重建后4周閹割和非閹割小鼠之間的細胞數(shù)量明顯不同(*p≤0.05)。(B)CD45.2+細胞數(shù)量。重建后兩周，相對于骨髓中的CD45.2+細胞數(shù)在閹割和非閹割小鼠之間沒有任何顯著差異。在四周時，閹割小鼠中的CD45.2+細胞數(shù)量仍然較高。同一時間點，在非閹割小鼠體內(nèi)沒有任何供體來源的細胞。
圖21A-C胎兒肝臟重建后，閹割和非閹割小鼠骨髓中T細胞、骨髓和淋巴來源的樹突狀細胞(DC)的變化。(n＝3-4小鼠，每個測試組)。下圖中的對照(其上標斜線)條圖是基于在未治療的年齡匹配的小鼠中發(fā)現(xiàn)的T細胞和DC的正常數(shù)量。(A)T細胞數(shù)量-重建后兩周和四周，在閹割和非閹割小鼠中的細胞數(shù)量均減少。(B)供體來源的骨髓性樹突狀細胞—重建后兩周，在閹割和非閹割小鼠中DC細胞數(shù)量均正常。在此時間點，閹割和非閹割小鼠的細胞數(shù)量之間沒有任何明顯差異。(C)供體來源的淋巴樣樹突狀細胞-重建后兩周和四周細胞數(shù)量處于正常水平。兩周時，閹割和非閹割小鼠的細胞數(shù)量之間沒有任何明顯差異。
圖22A和B在胎兒肝臟重建后，在閹割和非閹割小鼠中總的和供體(CD45.2+)脾細胞數(shù)量的變化。(n＝3-4小鼠，每個測試組)。(A)總細胞數(shù)-重建后兩周細胞數(shù)量下降并且在閹割和非閹割小鼠的細胞數(shù)量之間沒有任何明顯差異。重建四周后，閹割小鼠中的細胞數(shù)接近正常水平。(B)CD45.2+細胞數(shù)量—重建后兩周，閹割和非閹割小鼠脾中CD45.2+細胞數(shù)量沒有明顯區(qū)別。在4周時閹割小鼠中的CD45.2+細胞數(shù)量仍保持高水平。在同一時間點，非閹割小鼠體內(nèi)沒有任何供體來源的細胞。
圖23A-C胎兒肝臟重建后的脾T細胞以及來源于髓骨和淋巴的樹突狀細胞(DC)。(n＝3-4小鼠，每個測試組)。下圖中的對照(在其上標斜線)條圖是基于在未治療的年齡匹配的小鼠中發(fā)現(xiàn)的T細胞和樹突狀細胞的正常數(shù)量。(A)T細胞數(shù)量-重建后兩周和四周，在閹割和非閹割小鼠中的細胞數(shù)量均減少。(B)供體來源的(CD45.2+)的骨髓性樹突狀細胞—重建后兩周和四周，在閹割和非閹割小鼠中的DC數(shù)量均正常。在兩周時，在閹割和非閹割小鼠的細胞數(shù)之間沒有任何顯著差異。(C)供體來源的(CD45.2+)淋巴樣樹突狀細胞-重建后兩周和四周細胞數(shù)量處于正常水平。兩周時，在閹割和非閹割小鼠的細胞數(shù)之間沒有任何顯著差異。
圖24A和B胎兒肝臟重建后，閹割和非閹割小鼠中總的和供體(CD45.2+)淋巴結(jié)細胞數(shù)量的變化。(n＝3-4，每個測試組)。(A)總細胞數(shù)-重建后兩周，細胞數(shù)量處于正常水平并且在閹割和非閹割小鼠的細胞數(shù)之間沒有任何顯著差異。重建后4周，閹割小鼠中細胞數(shù)量處于正常水平。(B)CD45.2+細胞數(shù)量-重建后兩周，閹割和非閹割小鼠淋巴結(jié)中供體CD45.2+細胞數(shù)量沒有明顯區(qū)別。在4周時閹割小鼠中的CD45.2細胞數(shù)量仍保持高水平。在同一時間點，非閹割小鼠體內(nèi)沒有任何供體來源的細胞。
圖25A-C胎兒肝臟重建后，在閹割和非閹割小鼠腸系膜淋巴結(jié)中，T細胞、來源于骨髓以及淋巴的樹突狀細胞(DC)的變化。(n＝3-4小鼠，每個測試組)。對照(在其上標斜線)條圖是在未治療的年齡匹配的小鼠中發(fā)現(xiàn)的T細胞和樹突狀細胞的數(shù)量。(A)重建后兩周和四周，在閹割和非閹割小鼠中的T細胞數(shù)量均減少。(B)在閹割和非閹割小鼠中，供體來源的骨髓性樹突狀細胞數(shù)量均正常。4周時，它們都減少。兩周時，在閹割和非閹割小鼠的細胞數(shù)之間沒有任何顯著差異。(C)供體來源的淋巴樣樹突狀細胞-重建后兩周和四周細胞數(shù)量處于正常水平。兩周時，在閹割和非閹割小鼠的細胞數(shù)之間沒有任何顯著差異。
圖26經(jīng)LHRH激動劑治療前列腺癌后，對患者(所有患者大于60歲)外周血淋巴細胞的表型組成進行了分析。治療前和開始LHRH激動劑治療4個月后，分析了患者樣品。治療前，所有患者的每毫升血液的總淋巴細胞數(shù)量是在對照值的較低端。在治療之后，6/9的患者體內(nèi)總淋巴細胞計數(shù)顯著上升(在某些情況下總細胞數(shù)加倍)。與此相關的是6/9的患者的總T細胞數(shù)增加。在CD4+亞群中，這種增加更加明顯，8/9的患者的CD4+T細胞水平增加。而在CD8+亞群中，趨勢不是很明顯，有4/9的患者的水平升高，雖然一般來說升高的程度也小于CD4+T細胞。
圖27LHRH激動劑治療前后患者血分析顯示T細胞、CD4或CD8T細胞的總比例沒有任何明顯變化，但CD4∶CD8比率在治療后有不定的變化。這說明對T細胞亞群的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持具有最小的治療作用，雖然治療后總T細胞數(shù)顯著升高。所有的值與對照值相比較。
圖28經(jīng)LHRH激動劑治療后，患者外周血內(nèi)的B細胞和骨髓性細胞(NK、NKT、和巨噬細胞)的比例分析顯示在亞群中具有不同程度的變化。雖然治療后NK、NKT、和巨噬細胞的比例相對不變，但在4/9的患者中B細胞比例下降。
圖29治療后，患者外周血內(nèi)的B細胞和骨髓性細胞的總細胞數(shù)分析清楚表明，治療后5/9的患者NK水平、4/9的患者NKT、和3/9的患者巨噬細胞明顯增加。B細胞的數(shù)量變化沒有明顯趨勢2/9的患者水平增加、4/9的患者沒有變化、和3/9的患者水平下降。
圖30A和BLHRH激動劑治療后所見到的主要變化是在外周血的T細胞群內(nèi)。尤其是純真(CD45RA+)CD4+細胞的比例選擇性升高，同時在6/9的患者中，CD4+T細胞亞群中純真(CD45RA+)∶記憶(CD45RO+)的比例升高。
圖31用各種激光脈沖能量降低皮膚的阻礙作用。用低至10mJ的能量輻照皮膚就能降低皮膚的阻礙作用，利用擬合曲線來內(nèi)推數(shù)值。
圖32藥物通過皮膚的滲透。通過激光輻照，以胰島素為例，皮膚滲透性大大增加。
圖33給皮膚施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和單個短暫脈沖后，皮膚熒光隨時間的變化。強度的峰值出現(xiàn)在大約640nm并且在治療后210min最高(虛線)。
圖34不加短暫脈沖，只施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)后，皮膚熒光隨時間的變化。不同時間點的強度幾乎沒有變化。
圖35給皮膚施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和在不同峰值應力(peak stress)下的單次短暫脈沖后，皮膚熒光變化的比較。角質(zhì)層的滲透程度取決于峰值應力。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括利用遺傳修飾的造血干細胞、淋巴祖細胞、骨髓性祖細胞、上皮干細胞、或其組合(GM細胞)進行基因治療的方法。以前其他人用這類細胞進行基因治療所做的嘗試并沒有成功，得到的修飾細胞的水平很低，幾乎可以忽略。本發(fā)明提供傳送這些細胞的新方法，該方法可以提高細胞的吸收和分化成所需的T細胞。經(jīng)修飾的細胞注射到正用本發(fā)明的方法進行胸腺重新激活的患者體內(nèi)。經(jīng)修飾的干細胞和祖細胞由胸腺吸收并轉(zhuǎn)化成為T細胞、樹突狀細胞、和其它在胸腺中產(chǎn)生的細胞。所有的這些新細胞中均含有母體干/祖細胞的遺傳修飾。
可以通過阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號來激活受者的胸腺。這種阻斷逆轉(zhuǎn)受者的激素狀態(tài)。產(chǎn)生阻斷的優(yōu)選方法是通過閹割。閹割的方法包括但不限于化學閹割和手術(shù)閹割。在閹割期間或之后，GM細胞移植到患者體內(nèi)。這些細胞經(jīng)胸腺吸收進入患者體內(nèi)并成為胸腺產(chǎn)生的新T細胞和DC的一部分。獲得的T細胞群含有遺傳修飾，其已插入干/祖細胞中。
重新激活胸腺的優(yōu)選方法是通過阻斷LHRH對垂體的直接和/或間接的刺激作用，所述阻斷導致促性腺激素FSH和LH的水平降低。這些促性腺激素通常作用于性腺從而釋放性類固醇，特別是在女性和男性中分別為雌激素和睪酮；FSH和LH水平的降低阻斷所述釋放。其直接結(jié)果是血漿中性類固醇水平立即降低，從而導致對胸腺不斷釋放抑制信號。注射CD34+造血細胞(最好是自體的)可以增強胸腺再生的程度和動力學。
本發(fā)明適用于任何由性類固醇驅(qū)動成熟并具有免疫系統(tǒng)的動物(包括人類)，如哺乳動物和有袋類動物、更好為大型哺乳動物、優(yōu)選為人類。
術(shù)語“再生”、“重新激活”、和“重建”及它們的衍生詞在本文可以相互替換使用，并且都是指使萎縮胸腺恢復到活性狀態(tài)。
如本文所使用的，“閹割”是指性類固醇在體內(nèi)的產(chǎn)生和分布明顯減少或消除。當胸腺的功能完全恢復時，就可以有效地使患者恢復到青春期前的狀態(tài)。手術(shù)閹割去除患者的性腺。
一種持續(xù)時間不長的閹割方式，是在一段時間內(nèi)施用某種化合物，這里稱為“化學閹割”。多種化學藥物能夠以這種方式起作用。在施用化學藥物期間，以及其后的一段時間內(nèi)，患者的激素產(chǎn)生停止。優(yōu)選地，在施藥停止后，患者恢復到正常狀態(tài)。
在優(yōu)選的具體實施例中，患者用HIV感染。治療該患者的優(yōu)選過程包括下述步驟，其將在下面進行詳細描述1)用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)治療以降低病毒濃度，該治療在整個治療過程中持續(xù)以防止或減少新T細胞的感染；2)T細胞消融(免疫抑制)；3)阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號，優(yōu)選通過給予LHRH類似物；4)在胸腺開始重新激活時，施用經(jīng)修飾含有能表達蛋白的基因的GM細胞，其能防止HIV感染、阻止HIV復制、使HIV病毒喪失活性，或其它能防止HIV感染T細胞的作用；5)如果GM細胞不是自體同源的，在胸腺重新激活的同時施用供體細胞可以使免疫系統(tǒng)準備好(prime)以將供體細胞識別為自身細胞；以及6)當胸腺嵌合體已經(jīng)建立并且新的成熟T細胞群開始從胸腺中排出時，降低并最終消除免疫抑制。
阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號很易理解，傳向胸腺的性類固醇介導的信號能用本領域技術(shù)人員所熟知的多種方法進行阻斷，其中一些方法在本文進行描述。例如，抑制性類固醇的產(chǎn)生或阻斷胸腺中一個或多個性類固醇受體就可以達到阻斷的目的，如施用性類固醇激動劑或拮抗劑、或主動的(抗原)或被動的(抗體)抗性類固醇接種疫苗就可以完成所希望的切斷。也可以通過施用一種或多種性類固醇類似物來抑制性類固醇產(chǎn)生。在一些臨床實例中，通過物理閹割永久切除性腺可能是適合的。
在優(yōu)選具體實施例中，傳向胸腺的性類固醇介導的信號是通過給予性類固醇同源物、優(yōu)選為促黃體激素釋放激素(LHRH)的類似物加以切斷。性類固醇類似物以及在治療和化學閹割中的應用已為大家熟知。此類類似物包括但不限于下面的LHRH受體(LHRH-R)的激動劑布舍瑞林(Hoechst公司)、Cystorelin(Hoechst公司)、達必佳(Decapetyl)(商品名Debiopharm；Ipsen/Beaufour公司)、地洛瑞林(Balance Pharmaceuticals公司)、戈那瑞林(Ayerst公司)、戈舍瑞林(商品名Zoladex；Zeneca公司)、組氨瑞林(Ortho公司)、亮丙立德(商品名Lupron；Abbott/TAP公司)、亮丙瑞林(Plosker等公司)、黃體瑞林(Wyeth公司)、美替瑞林(Meterelin)(WO 9118016)、那法瑞林(Syntex公司)、和曲普瑞林(美國專利第4,010,125號)。LHRH類似物還包括但不限于下面的LHRH-R的拮抗劑阿巴瑞克(Abarelix)(商品名Plenaxis；Praecis公司)和西曲瑞克(商品名；Zentaris公司)。激動劑的組合、拮抗劑的組合、以及激動劑和拮抗劑的組合也包括在內(nèi)。上述參考文獻所披露的內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。目前優(yōu)選的類似物為地洛瑞林(Deslorelin)(描述于美國專利第4,218,439號)。更多的目錄可參見Vickery等，1984。
在優(yōu)選具體實施例中，先對患者施用LHRH-R受體(LHRH-R)拮抗劑，然后施用LHRH-R激動劑。這種方法可以在性類固醇產(chǎn)量降低之前，阻止或限制任何由于施用激動劑而可能誘導的性類固醇產(chǎn)生高峰。在另一個具體實施例中，采用只引起很少或不引起性類固醇生產(chǎn)高峰的LHRH-R激動劑，之前可給予或不給予LHRH-R拮抗劑。
雖然刺激胸腺重新激活主要基于對性類固醇的效應和/或LHRH同源物的直接效果的抑制，但包括其它一些增強胸腺功能的物質(zhì)也是有用的。這類化合物包括但不限于白介素2(IL2)、白介素7(IL7)、白介素15(IL15)、上皮和成纖維細胞生長因子家族成員、干細胞因子、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、和角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)?？梢韵胂筮@些附加的化合物只能在LHRH同源物初次應用時使用一次。然而，這些物質(zhì)中的一種或其組合可以在任何時侯增加使用，來進一步刺激胸腺。此外，可開發(fā)和應用基于類固醇受體的調(diào)節(jié)劑，其可以是靶向于胸腺特異性的。
藥物組合物本發(fā)明所用的化合物可載于任何藥用載體或不使用載體。具體例子包括生理性兼容的膠囊、溶劑、和稀釋劑。用于胃腸道外、皮下、靜脈、和肌肉注射等途徑的藥物應被保護起來，比如采用膠囊?？商鎿Q地，這些藥物組合物可采用能保護有效成分的載體形式給予，同時允許這些成分的緩慢釋放。本技術(shù)領域內(nèi)已知有多種多聚體和共聚物可用于制備定時釋放制劑，比如多種形式的乳酸/羥乙酸共聚物。例見美國專利第5,410,016號，其利用聚乙二醇(PEG)的改性多聚體作為生物可降解的膠囊。
口服劑型可以制備成液體制劑、膠囊、片劑等。這些組合物可以包括，例如，賦形劑、稀釋劑、和/或保護活性成分不被分解的包被物(coverings)。這些劑型為大家所熟知。
在任何劑型中，可以包括不對LHRH類似物活性產(chǎn)生負面影響的其它化合物。具體例子是本文所描述的各種生長因子和其它細胞因子。
劑量LHRH類似物可一次性給予，其效果會持續(xù)一段時間。優(yōu)選地，該劑型在1-2個月內(nèi)有效。標準劑量隨使用的不同類似物發(fā)生變化。一般來說，劑量是在約0.01μg/kg和約10mg/kg之間，優(yōu)選在大約0.01mg/kg和大約5mg/kg之間。劑量隨所用LHRH類似物或疫苗發(fā)生變化。優(yōu)選具體實施例中，一次劑量可維持一個流行病的周期。例如，“流感季節(jié)”一般發(fā)生在冬季的幾個月?？芍苽銵HRH類似物劑型并用本文所描述的方法施用，以便能在流感季節(jié)開始后的兩個或更多月內(nèi)保護患者不受感染，每兩個或更多月追加劑量直到感染的危險降低或消失。
可以用該劑型來增強免疫系統(tǒng)?？商鎿Q地，該制劑可制備成在特別地防止流感病毒感染的同時增強免疫系統(tǒng)。后一種劑型可包括經(jīng)基因改造并能對病毒產(chǎn)生抗性(參見下面內(nèi)容)的GM細胞。該GM細胞可與LHRH類似物劑型一起施用或分別施用(包括空間上和/或時間上)。正如非GM細胞的情況一樣，根據(jù)流感季的長短，可向患者給予多次劑量，以產(chǎn)生保護并避免流感病毒的感染。
化學閹割劑的施用可采用許多本領域技術(shù)人員所熟知的方法施用本發(fā)明的化合物。一種施用化學抑制劑來抑制傳向胸腺的性類固醇介導的信號的標準方法是利用單劑三個月有效的LHRH激動劑。對此，簡單的一次性靜脈注射或肌肉注射是不夠的，因為這種激動劑在三個月結(jié)束之前就會從患者體內(nèi)清除掉。作為替代，可以采用長效制劑注射或移植物，或其他任何能夠緩慢釋放抑制劑的施藥方法。同樣地，可采用延長抑制劑在體內(nèi)的半衰期的方法，例如通過對化合物進行修飾而同時保持此處所需的功能。
更有用的施藥機制實例包括但不限于皮膚的激光輻照、和在皮膚上產(chǎn)生高壓短暫脈沖(也稱為應力波或短暫脈沖)，在每種方法實施的同時或在其實施之后，在同樣的皮膚區(qū)域放置帶有或不帶有載體的化合物。優(yōu)選的放置方法是采用貼劑并在治療過程中一直貼于皮膚上。
給藥的一種方式是采用激光束(特殊地聚焦的并在合適的波長產(chǎn)生激光)，以在患者的皮膚上產(chǎn)生小的穿孔或蝕變(alteration)。參見美國專利第4,775,361號、美國專利第5,643,252號、美國專利第5,839,446號、和美國專利第6,056,738號，所有這些結(jié)合于此作為參考文獻。在優(yōu)選的具體實施例中，激光束的波長是在0.2-10微米之間。更好地，波長是在大約1.5-3.0微米之間。最好地，波長是大約2.94微米。在一個具體實施例中，激光束是用透鏡進行聚焦，以通過皮膚表皮在皮膚上產(chǎn)生輻照斑。在另一個具體實施例中，對激光束進行聚焦，從而只通過皮膚的角質(zhì)層產(chǎn)生輻照斑。
如本文所使用的，“消融”或“打孔”是指在皮膚上產(chǎn)生的孔。這樣的孔可具有不同的深度；例如它可以只穿透角質(zhì)層，也可以一直穿透到皮膚的毛細血管層，或可以終止于這兩層之間的任何地方。如本文所使用的，“蝕變”指在不產(chǎn)生孔的情況下皮膚結(jié)構(gòu)的改變，其使得皮膚的滲透性增加。用打孔的方法可以改變皮膚蝕變到任意厚度。
在規(guī)定激光束的時候可考慮幾種因素，包括波長、能注量、脈沖時間(pulse temporal width)、和輻照斑的大小。在優(yōu)選的具體實施例中，能注量的范圍是0.03-100,000J/cm2。更優(yōu)選地，能注量的范圍是0.03-9.6J/cm2。激光束波長部分取決于激光材料，如鉺釔鋁石榴石。脈沖時域是脈沖寬度的結(jié)果，該脈沖寬度由例如一系列電容器、閃光燈、和激光棒材料(laser rod material)所產(chǎn)生。脈沖寬度最優(yōu)是在1fs(塵秒)和1000μs之間。
根據(jù)此方法，由激光產(chǎn)生的穿孔或蝕變不必由來自激光的單脈沖實現(xiàn)。在優(yōu)選的具體實施例中，透過角質(zhì)層的打孔或使皮膚發(fā)生改變是利用多個激光脈沖所產(chǎn)生，每個脈沖只打孔或蝕變靶組織深度的一部分。
如此，用單脈沖的能量除以所希望的脈沖數(shù)，就能粗略估計用多個脈沖在角質(zhì)層上形成打孔或蝕變所需要的能量。例如，如果特定大小的斑需要1J的能量來產(chǎn)生穿過整個角質(zhì)層的穿孔或蝕變，那么可用10個脈沖來產(chǎn)生定性上相似的穿孔或蝕變，每個脈沖的能量為1/10。因為期望在輻照過程中患者不移動靶組織(人的反應時間在100ms左右)，并且希望每個脈沖產(chǎn)生的熱量不發(fā)生明顯擴散，所以，在優(yōu)選的具體實施例中，來自激光的脈沖重復率應該能使整個打孔過程在不到100ms內(nèi)完成?？商鎿Q地，靶組織和激光的定位可機械地固定，從而在更長的輻照時間內(nèi)，不會發(fā)生靶位置的改變。
為了在穿透皮膚的過程的少出血或不流血，可通過外表面對皮膚進行打孔或蝕變，如角質(zhì)層，但不能達到毛細血管層。激光束在皮膚上精確聚焦，在皮膚上產(chǎn)生直徑為約0.5μm-5.0cm的光束?？蛇x地，光斑可以是狹縫形狀，寬度大約為0.05-0.5mm，長可達到2.5mm。寬度可為任意大小，決定于輻照區(qū)域的解剖特點和所需要的有待被移除液體或?qū)⒁┯璧乃幬锏臐B透速率。聚焦透鏡的焦距可為任意長度，但在一個具體實施例中為30mm。
通過改變波長、脈沖寬度、能注量(其是激光輸出能量(J)和焦點光束大小(cm2)的函數(shù))、和輻照斑大小，可以將對角質(zhì)層的影響控制在消融(穿孔)和非消融改變(蝕變)之間。角質(zhì)層的消融和非消融蝕變都可提高隨后施用藥物的滲透性。
例如，通過減少脈沖能量而保持其他參數(shù)不變，可以使對皮膚的改變處于消融和非消融組織效應之間。利用脈沖寬度在300μs左右的鉺釔鋁石榴石激光器，采用單脈沖或輻射能并在皮膚上輻照2mm大的斑點，超過大約100mJ的脈沖能量引起角質(zhì)層的部分或全部消融，而約100mJ以下的任何脈沖能量則引起角質(zhì)層的部分消融或非消融改變?？蛇x地，通過采用多脈沖方式，增強體液或所給藥物的滲透性所需的閾脈沖能量則下降，下降的系數(shù)大約等于脈沖數(shù)目。
可替換地，保持其他參數(shù)不變的情況下，通過減少光斑尺寸，也可以使對皮膚的改變處于消融和非消融組織效應之間。例如，減半光斑面積將導致產(chǎn)生同樣效應所需的能量減半?？色@得小至0.5微米的輻照，例如，通過將激光器的輻射輸出(radiant output)耦合于顯微鏡物鏡的多個物鏡中(例如，可購自Nikon公司，Melville，紐約)。在這種情況下，激光束聚焦形成的光斑可能會小至顯微鏡的分辨率限制的數(shù)量級，后者大約為0.5微米的數(shù)量級。實際上，如果激光束呈高斯分布，受輻照影響的區(qū)域尺寸可以小于測量的激光束的尺寸并且可超過顯微鏡的成像分辨率。在這種情況下，為非消融性地蝕變組織，采用3.2J/cm2的能注量可能比較合適，其對于半微米大的光斑將需要大約5nJ的脈沖能量。這么低的脈沖能量可容易地由二極管激光器獲得，也可以，例如，將鉺釔鋁石榴石激光器產(chǎn)生的激光束經(jīng)吸收濾光器(如玻璃)衰減后獲得。
可選地，保持其他參數(shù)不變，通過改變輻射能的波長，就可以使對皮膚的改變處于消融和非消融性組織效應之間。例如，用鈥∶釔鋁石榴石(Ho∶YAG；2.127微米)代替鉺釔鋁石榴石(Er∶YAG；2.94微米)激光器，可以減少組織對能量的吸收，產(chǎn)生較輕的消融或蝕變。
激光器產(chǎn)生的皮秒和塵秒脈沖也可以用于產(chǎn)生皮膚的消融或蝕變。這可用調(diào)制的二極管或相關的微片激光器來完成，其輸出時間寬度(temporal widths)在1塵秒至1ms之間的單脈沖。(參見D.Stern等，“用在532和625nm處的納秒、皮秒、和塵秒激光進行角膜消融”，(“Corneal Ablation by Nanosecond，Picosecond，andFemtosecond Lasers at 532 and 625nm，”)《角膜激光消融》(CornealLaser Ablation)，第107卷，587-592頁，(1989)，其結(jié)合于此作為參考文獻，該參考文獻披露了低至1塵秒的脈沖寬度的應用)。
另一種遞藥方法采用高壓脈沖瞬變在皮膚上產(chǎn)生通透性。參見美國專利第5,614,502號和美國專利第5,658,892號，兩者結(jié)合于此作為參考文獻。高壓短暫脈沖，例如具有特定上升時間和峰值應力(或壓力)的應力波(例如，激光器產(chǎn)生的激光應力波(LSW))，能夠安全和有效地影響化合物(比如本發(fā)明中所披露的那些化合物)通過上皮組織層(例如角質(zhì)層和黏膜)的轉(zhuǎn)運。這些方法可以用于很大尺寸范圍的化合物的給藥，與其凈電荷無關。此外，本方法中所用短暫脈沖可避免組織損傷。
在暴露于短暫脈沖之前，上皮組織層，例如，角質(zhì)層，對外來化合物可能是不通透的；這阻止該化合物向上皮層下面的細胞擴散。將上皮層暴露于短暫脈沖可以使化合物通過上皮層進行擴散。擴散的速率通常取決于短暫脈沖的特性和被施予的化合物的大小。
通過特定上皮組織層(例如皮膚的角質(zhì)層)的穿透速率，還取決于其他因素，包括pH值、皮膚基質(zhì)組織(cutaneous substrate tissue)的代謝、角質(zhì)層內(nèi)外區(qū)域的壓力差、以及皮膚的結(jié)構(gòu)部位和生理條件。皮膚物理條件又依賴于健康狀況、年齡、性別、種族、皮膚保健、和接觸史。例如，之前接觸過有機溶劑或表面活性劑就會影響皮膚的物理條件。
通過上皮組織層給予的化合物的數(shù)量也取決于上皮層保持通透的時間長短、以及變得可通透的上皮層表面積的大小。
脈沖的性質(zhì)和特征可用產(chǎn)生它們的能源來控制。參見WO98/23325，其結(jié)合于此作為參考文獻。然而，它們的特點因其傳播所經(jīng)過的偶聯(lián)介質(zhì)的線性和非線性性質(zhì)而改變。偶聯(lián)介質(zhì)引起的線性衰減主要衰減短暫脈沖的高頻成分。這使得短暫脈沖的帶寬變窄，并且上升時間延長。另一方面，偶聯(lián)介質(zhì)的非線性性質(zhì)使上升時間縮短。上升時間的縮短是聲速和質(zhì)點速度依賴于應力(壓力)的結(jié)果。當應力增加時，聲速和質(zhì)點速度也增加。這使得短暫脈沖的前沿變得更陡。線性衰減的相對強度、非線性系數(shù)、和峰值應力，決定了該波必須傳播多長才使上升時間陡度的增加變得顯著。
對短暫脈沖的上升時間、幅度、和持續(xù)時間進行選擇，從而產(chǎn)生非破壞性的(即，非沖擊波)短暫脈沖，其可以暫時增加上皮組織層的通透性。一般上升時間至少為1ns，優(yōu)選為大約10ns。
短暫脈沖的峰值應力或壓力隨不同的上皮組織或細胞層發(fā)生變化。例如，為通過角質(zhì)層轉(zhuǎn)運化合物，短暫脈沖的峰值應力或壓力應設為至少400巴，優(yōu)選至少為1,000巴，但不超過約2,000巴。對上皮粘膜層而言，峰值壓力應設在300巴和800巴之間，優(yōu)選在300巴和600巴之間。短暫脈沖優(yōu)選為持續(xù)幾十ns，這樣與上皮組織的作用時間很短。與短暫脈沖相互作用后，上皮組織并未受到永久破壞，但保持通透性最長達約3分鐘。
此外，這些方法涉及對患者應用很少的離散的高振幅脈沖。對患者施用的短暫脈沖數(shù)量一般小于100，更好小于50，最好小于10。當應用多次光脈沖來產(chǎn)生短暫脈沖時，連續(xù)脈沖間的間隔為10-120秒，這對避免上皮組織的永久損傷是足夠長的。
短暫脈沖的性質(zhì)可以用本領域中的標準方法進行測量。例如，峰值應力或壓力、和上升時間可以用聚偏氟乙烯(PVDF)傳感器的方法進行測量，該方法描述于Doukas等，《超聲醫(yī)學生物學》(Ultrasound Med.Biol.)，21961(1995)。
短暫脈沖可由多種能源產(chǎn)生。能發(fā)射短暫脈沖的物理現(xiàn)象一般有如下三種機理(1)熱彈性產(chǎn)生；(2)光學擊穿；或(3)消融。
例如，短暫脈沖可用高能激光源消融靶材料進行引發(fā)，然后短暫脈沖通過偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)于上皮組織或細胞層。該偶聯(lián)介質(zhì)可以為，例如，液體或膠體，只要是非線性的。因此，水、油如蓖麻油、等滲介質(zhì)例如磷酸緩沖鹽水(PBS)、或膠體如膠原凝膠，都可以用作偶聯(lián)介質(zhì)。
此外，偶聯(lián)介質(zhì)可包括能增強轉(zhuǎn)運的表面活性劑，例如，在短暫脈沖發(fā)生之后，通過延長角質(zhì)層對化合物保持通透的時間。該表面活性劑可為，例如，離子型去污劑或非離子型去污劑，因而可包括，如月桂基硫酸鈉(十二烷基磺酸鈉)、十六烷基三甲基溴化銨、和N，N-二甲基-N-十二烷胺氧化物。
吸收靶材料的作用相當于光學引發(fā)換能器。在吸收光以后，靶材料快速熱膨脹或發(fā)生消融，從而發(fā)射短暫脈沖。通常，金屬和聚合物膜在可見光和紫外光譜區(qū)具有較高的吸收系數(shù)。
許多類型的材料可作為靶材料與激光束一起使用，它們在所用激光器的波長能充分吸收光。靶材料的成分可以是金屬(如鋁或銅)、塑料(如聚苯乙烯，例如黑色聚苯乙烯)、陶瓷、或高濃度染料溶液。靶材料的尺寸必須大于所施加的激光能量的橫截面積。此外，靶材料必須比激光的光穿透深度要厚，以免光直接作用于皮膚表面。靶材料還必須足夠厚，以提供機械支撐。當靶材料由金屬制成時，典型厚度是1/32英寸(0.79375mm)-1/16英寸(1.5875mm)。對塑料靶材料，厚度是1/16英寸(1.5875mm)-1/8英寸(3.175mm)。
短暫脈沖也可用限制性消融來加強。在限制性消融中，將激光束透明材料，如石英光學窗，與靶材料緊貼放置。等離子體的限制(通過采用該透明材料來消融靶材料而產(chǎn)生)在數(shù)量級上提高了偶連系數(shù)(Fabro等，《應用物理學雜志》(J.Appl.Phys.)，68775，1990)。該透明材料可以是石英、玻璃、或透明塑料。
由于靶材料和限制性透明材料間的空隙允許使等離子體進行膨脹，并因此降低傳給靶向物的動量(momentum)，所以透明材料最好用起初為液態(tài)的粘合劑(例如含碳的環(huán)氧樹脂)和靶材料粘在一起，以免產(chǎn)生這類空隙。
激光束可用本領域所熟知的標準光調(diào)制技術(shù)(如應用Q開關或鎖模激光器，利用如電光裝置或聲光裝置)產(chǎn)生。標準的商業(yè)上可購的能夠在紅外線、可見光、和/或紅外線光譜區(qū)采用脈沖形式的激光器包括，Nd:YAG激光器、Nd:YLF激光器、CO2激光器、激基分子激光器、染料激光器、Ti:蘭寶石激光器、二極管激光器、鈥(及其它稀土材料)激光器、和金屬蒸氣激光器。這些光源的脈沖寬度可調(diào)，并且可以從幾十ps到幾百微秒。對在本發(fā)明中的應用而言，光脈沖寬度范圍可為100ps至約200ns，優(yōu)選為約500ps至40ns。
也可以用體外碎石器產(chǎn)生短暫脈沖(一個實例描述于Coleman等，《超聲醫(yī)學生物學》(Ultrasound Med.Biol.)，15213-227，1989)。這些短暫脈沖的上升時間為30-450ns，其長于激光產(chǎn)生的短暫脈沖。為了采用體外碎石器產(chǎn)生具有合適上升時間的短暫脈沖，短暫脈沖可在非線性偶聯(lián)介質(zhì)中(例如水)傳播一段距離，該距離由前述的方程(1)決定。例如，當用碎石器產(chǎn)生上升時間為100ns和峰值壓力為500巴的短暫脈沖，短暫脈沖在接觸上皮細胞層之前在偶聯(lián)基質(zhì)中應穿行的距離約為5mm。
對由碎石器產(chǎn)生的短暫脈沖進行修整(shaping)的方法的另一個好處是，作為在非線性偶聯(lián)介質(zhì)中傳播的結(jié)果，波的拉伸分量(tensile component)將變寬并衰減。這個傳播距離應該進行調(diào)整來產(chǎn)生這樣的短暫脈沖，其拉伸分量的壓力僅為波的壓縮分量的峰值壓力的5％至10％左右。這樣，修整過的短暫脈沖就不會損傷組織。
所用碎石器的類型沒有嚴格要求。電動液壓、電磁、或壓電碎石器都可以使用。
短暫脈沖也可以用換能器產(chǎn)生，例如壓電換能器。優(yōu)選地，該換能器與偶聯(lián)介質(zhì)直接接觸，并在應用光場、熱場、或電場之后發(fā)生迅速的移位從而產(chǎn)生短暫脈沖。例如，可利用電介質(zhì)擊穿，該擊穿通常采用高壓火花或壓電換能器誘導產(chǎn)生(與某些體外碎石器中使用的一樣，Coleman等，《超聲醫(yī)學生物學》(Ultrasound Med.Biol.)，15213-227，1989)。在采用壓電換能器的情況下，在應用電場后換能器迅速膨脹并在偶聯(lián)介質(zhì)中引發(fā)快速移位。
此外，短暫脈沖可在纖維光學的幫助下產(chǎn)生。光纖傳導系統(tǒng)容易操作并且可以用來輻照與上皮組織層相鄰的靶材料從而在難以達到的區(qū)域產(chǎn)生短暫脈沖。這些類型的傳送系統(tǒng)(當可選地與激光器偶聯(lián)時)是優(yōu)選的，因為它們可結(jié)合于導管及相應的柔軟裝置中，并用于輻照人體內(nèi)大部分器官。此外，為了發(fā)射具有所需上升時間和峰值應力的短暫脈沖，光源波長可以容易調(diào)節(jié)，從而在特定的靶材料中產(chǎn)生合適的吸收。
可選擇地，響應爆炸脈沖(detonating impulse)，高能材料可產(chǎn)生短暫脈沖。引爆物通過引起放電或電火花可以引爆高能材料。
流體靜壓力可與短暫脈沖聯(lián)合用于增強化合物通過上皮組織層的轉(zhuǎn)運。因為由短暫脈沖產(chǎn)生的效果能維持幾分鐘，應用短暫脈沖之后，在上皮組織層(例如皮膚角質(zhì)層)的表面施加流體靜壓力就可以加快藥物順濃度梯度被動擴散進入上皮細胞層的轉(zhuǎn)運速度。
干細胞或祖細胞的遺傳修飾基因本發(fā)明有用的基因和基因片段(多核苷酸)包括對以基因為基礎的疾病和T細胞條件能發(fā)揮作用的基因。這類疾病和條件包括但不限于HIV感染/AIDS、T細胞白血病病毒感染、和其他淋巴組織增生疾病。就HIV/AIDS而言，許多基因和基因片段都可以使用，包括但不限于船形盆轉(zhuǎn)錄因子(nef transcription factor)；編碼特異性剪切HIV基因的核酶的基因，例如tat和rev(Bauer G.等，1997)；HIV-1 rev基因的反顯性突變株，RevM10，其抑制HIV復制(Bonyhadi等，1997)；HIV-1 rev應答元件(RRE)的過表達結(jié)構(gòu)(construct)(Kohn等，1999)；編碼RNA或蛋白的任何基因，其表達能抑制細胞HIV感染或復制；和其片段和組合。
這些基因或基因片段以穩(wěn)定表達的形式應用。如在本文所使用的，術(shù)語“穩(wěn)定表達形式”是指，將基因或基因片段轉(zhuǎn)入細胞后，基因或基因片段(功能片段)的表達產(chǎn)物(RNA和/或蛋白)至少能夠在宿主細胞中半持久表達，在分裂和/或分化后也能在細胞后代中表達。這需要基因或基因片段(不管是否有載體)具有適當?shù)膶NA轉(zhuǎn)錄成RNA的信號序列。此外，當基因或基因片段編碼的蛋白是影響患者狀態(tài)的活性分子時，該DNA也將編碼翻譯信號。
大多數(shù)情況下基因或基因片段包含在載體中。本領域的一般技術(shù)人員熟知可用于表達所需RNA或蛋白的表達載體。表達載體是能夠引導轉(zhuǎn)錄其中所含DNA序列并能引導翻譯目標RNA(resultingRNA)的載體。表達載體能夠在基因重組的細胞中進行復制，并包括質(zhì)粒、噬菌體、病毒、和微小染色體。可替換地，該基因或基因片段可以成為細胞染色體DNA的整合部分。重組載體和方法學為大家所熟知。
本發(fā)明中用來表達蛋白的有用的表達載體含有復制起點。適當構(gòu)建的表達載體含有能在細胞中自主復制的復制起點，或能夠整合到宿主細胞染色體中。這類載體還可包含選擇性標記、有限數(shù)目的有用的限制性內(nèi)酶切位點、高拷貝數(shù)、和強啟動子。啟動子是DNA序列，其引導RNA聚合酶結(jié)合到DNA并引發(fā)RNA合成的；強啟動子可以高頻引發(fā)這種合成。本發(fā)明的表達載體是可操作連接于編碼RNA或蛋白(用于本發(fā)明)的DNA，即，該載體能引導附著DNA分子的復制，又能引導DNA分子編碼的RNA或蛋白的表達。于是，對蛋白而言，該表達載體必須有附著DNA分子的適當?shù)霓D(zhuǎn)錄起始信號上游片段，保持正確的閱讀框架，從而允許在調(diào)控序列的調(diào)控下表達DNA分子以及產(chǎn)生所預期的由DNA分子編碼的蛋白。表達載體可包括但不限于克隆載體、修飾克隆載體、和特定設計的質(zhì)粒或病毒。優(yōu)選地，使用誘導啟動子，從而可以控制插入基因或多核苷酸表達的數(shù)量和時間。
細胞遺傳修飾的優(yōu)選細胞是造血干細胞。這些細胞可來源于骨髓、外周血、或臍帶、或任何其他造血干細胞來源，并且可以是自體的或非自體的。淋巴和骨髓性祖細胞和上皮干細胞也是有用的，并且也可以是自體的或非自體的。
使用非自體(供體)細胞時，在胸腺激活步驟中要產(chǎn)生對這些細胞的耐受性。在阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號的起始過程中或之后，將有關的遺傳修飾的供體細胞移植入受體體內(nèi)。這些細胞經(jīng)胸腺識別認為是自體細胞并成為胸腺產(chǎn)生的新T細胞和DC的一部分。產(chǎn)生的T細胞群將受體和供體細胞都識別為自體細胞，由此對供體的移植產(chǎn)生耐受性。參見共同提出的未決專利申請U.S.S.N.09/________，其結(jié)合于此作為參考文獻。
遺傳修飾的方法用于基因治療的細胞可用標準重組方法進行遺傳修飾。例如，培養(yǎng)HSC的反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導是一種成功的方法(Belmont andJurecic，1997，Bahnson，A.B.等，1997)。其他載體包括但不限于腺病毒衍生或慢病毒衍生的載體和莫洛尼鼠白血病病毒衍生的載體。
同樣可用的有如下方法顆粒介導(particle-mediated)的基因轉(zhuǎn)移如用基因槍(Yang and Ziegelhoffer，1994)、脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移(Nabel等，1992)、磷酸鈣和遺傳修飾載體的共沉淀(Grahamand Van Der Eb，1973)、電打孔(Potter等，1984)、和微注射(Capecchi，1980)、以及任何其他能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)移基因或寡核苷酸(優(yōu)選在載體中)進入HSC內(nèi)以致基因至少在部分時間內(nèi)表達的方法。
基因治療本發(fā)明提供通過患者胸腺的重新激活來進行基因治療的方法。這是通過對受體施用GM細胞來完成。遺傳修飾細胞可以是HSC、上皮干細胞、或骨髓性或淋巴樣祖細胞。較好地，該遺傳修飾細胞是CD34+HSC、淋巴樣祖細胞、或骨髓性祖細胞。更好地，該遺傳修飾細胞是CD34+HSC。對患者施用遺傳修飾細胞并且這些細胞通過外周血系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到胸腺。在缺少性類固醇的情況下，胸腺對這些造血前體細胞的吸收顯著增加。這些細胞整合到胸腺中并且產(chǎn)生樹突狀細胞和T細胞，其攜帶有來自已改變細胞的遺傳修飾。其結(jié)果是含有所需基因改變的T細胞群在受體外周血中循環(huán)，并且伴隨由患者胸腺重新激活引起的細胞群、組織、和器官的增加。
小動物研究材料和方法動物CBA/CAH和C57B16/J雄性小鼠是獲自Monash大學動物服務中心(Central Animal Service)，并在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。小鼠年齡從4-6周到26個月，并在相關處標明。
閹割向動物腹膜內(nèi)注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(鹽酸賽拉嗪；BayerAustralia公司，Botany NSW，澳大利亞)和1.5mg鹽酸氯胺酮(氯胺酮針劑，Parke-Davis公司，Caringbah，NSW，澳大利亞)的生理鹽水進行麻醉。手術(shù)閹割是將陰囊切開，露出睪丸，接著將睪丸用縫合線打結(jié)并沿脂肪組織除去。
5-溴脫氧尿苷(BrdU)引入小鼠以4h的間隔兩次腹膜內(nèi)注射BrdU(Sigma Chemical公司，St.Louis，密蘇里州)(以100mg/每kg體重的劑量，在100μL PBS中)。對照組小鼠只注射賦形劑。在第二次注射1小時后，對胸腺進行解剖，并且制成懸液供FACS分析或立即在Tissue Tek(O.C.T.化合物，Miles INC公司，印第安納州)中進行包埋，在液氮中速凍并在-70℃下保存直至使用。
流式細胞分析用CO2窒息處死小鼠并將胸腺、脾和腸系膜淋巴結(jié)摘除。器官在冷的PBS/1％FCS/0.02％疊氮化物的溶液中輕柔地通過孔徑200μm的篩子，離心(650g，5min，4℃)，并重新懸浮在任何一種PBS/FCS/疊氮化物中。脾細胞在紅細胞裂解緩沖液(氯化銨為8.9g/L)中4℃培養(yǎng)10min，洗滌并重新懸浮在PBS/FCS/疊氮化物中。細胞的濃度和生活力可用血細胞計數(shù)器和溴乙錠/吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下觀察確定(雙份)(Axioskop公司；Carl Zeiss，Oberkochen，德國)。
為進行三色免疫熒光檢測，胸腺細胞例行用抗αβTCR-FITC或抗γδTCR-FITC、抗CD4-PE、和抗CD8-APC(均獲自Pharmingen公司，圣地亞哥，加利福尼亞)進行標記，然后進行流式細胞分析。脾和淋巴結(jié)懸液用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或B220-B(Sigma公司)連同CD4-PE和CD8-APC進行標記。B220-B用抗生蛋白鏈菌素-三-色結(jié)合物(購自Caltag實驗室公司，伯林蓋姆，加利福尼亞)顯色。
對BrdU檢測而言，細胞用CD4-PE和CD8-APC進行表面標記，接著進行固定和滲透化，如先前所描述的(Carayon and Bord，1989)。簡而言之，染色后細胞4℃下在1％PFA/0.01％吐溫-20中進行O/N固定。洗滌過的細胞在37℃下置于500μl DNA酶(100孔尼茲單位，Boehringer Mannheim公司，西德)中孵育30分鐘，以使DNA變性。最后，細胞用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson公司)進行孵育。
為進行四色免疫熒光檢測，胸腺細胞用CD3、CD4、CD8、B220、和Mac-1標記，用抗鼠Cy5免疫球蛋白(Ig-Cy5)(Amersham公司，英國)集中檢測，門化的負細胞(TN)進行分析。它們進一步用CD25-PE(Pharmingen公司)和CD44-B(Pharmingen公司)染色并接著用抗生蛋白鏈菌素-三-色(Caltag公司，加利福尼亞)顯色，如先前所描述的(Godfrey and Zlotnik，1993)。然后，如上述進行BrdU檢測。
樣品在FacsCalibur(Becton-Dickinson公司)上進行分析?；畹牧馨图毎鶕?jù)0°和90°光散射圖進行門化，并且用細胞探索軟件(Cell quest software)(Becton-Dickinson公司)進行數(shù)據(jù)分析。
免疫組化用低溫保持器(Leica公司)將冷凍的胸腺切片(4μm)并立即放在100％的丙酮中固定。
對二色免疫熒光而言，胸腺切片用如下單克隆抗體的平板進行雙標記，這些單抗有產(chǎn)生于本實驗室的MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35、和44(Godfrey等，1990；表1)，然后用多價兔抗細胞角蛋白抗體(Dako公司，Carpinteria，加利福尼亞)對上皮細胞決定蔟共同表達進行評價。用FITC結(jié)合的綿羊抗鼠Ig(Silenus實驗室)對結(jié)合的單克隆抗體(mAb)進行顯色，并且用異硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)結(jié)合的山羊抗兔Ig(Silenus實驗室)對抗細胞角蛋白進行顯色。
為進行BrdU檢測，切片用抗細胞角蛋白并接著用抗兔TRITC、或用特定的單克隆抗體染色，然后用抗鼠Ig-Cγ3(Amersham公司)顯色。然后用如前所述的方法(Penit等，1996)進行BrdU檢測。簡而言之，切片在70％的乙醇中固定30min。半干后在4M鹽酸中孵育，接著用硼酸鹽緩沖液(Sigma公司)洗至中性，然后用PBS洗兩次。采用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson公司)檢測BrdU。
對三色免疫熒光而言，切片用特定的多腫瘤抑制基因(MTS)單克隆抗體和抗細胞角蛋白一起標記。然后用如前所述的方法檢測BrdU。
切片用Leica熒光顯微鏡和Nikon共焦顯微鏡進行分析。
遷移研究向動物腹膜內(nèi)注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(鹽酸賽拉嗪；BayerAustralia公司，Botany NSW，澳大利亞)和1.5mg鹽酸氯胺酮(氯胺酮針劑；Parke-Davis公司，Caringbah，NSW，澳大利亞)于生理鹽水進行麻醉。
用FITC標記胸腺細胞的技術(shù)與其他文獻中所描述的一樣(Scollay等，1980；Berzins等，1998)。簡而言之，先暴露胸腺葉并且每葉注射約10μm(μl)的350μg/ml FITC(在PBS中)。傷口用手術(shù)U形針縫合并且給小鼠取暖使其從麻醉狀態(tài)中完全恢復。小鼠在注射后大約24h用CO2窒息處死并將淋巴器官取出進行分析。
在細胞計數(shù)之后，樣品用抗CD4-PE和抗CD8-APC染色，接著用流式細胞儀分析。遷移細胞被確定為活的門化的(live-gated)FITC+細胞，其表達CD4或CD8(忽略自身熒光細胞和雙聯(lián)體)。FITC+CD4和CD8細胞的百分比加起來分別得到淋巴結(jié)和脾的總遷移百分比。用Berzins等(1998)描述的方法計算每天的輸出速率。
數(shù)據(jù)采用非配對的t檢驗或非參數(shù)的曼-惠特尼檢驗進行分析，并用來對至少重復三次的試驗結(jié)果進行分析，以確定對照組和測試組結(jié)果之間的統(tǒng)計顯著性。試驗數(shù)據(jù)同對照數(shù)據(jù)相比的顯著性差異用下列方式表示*p≤0.05、**p≤0.01以及***p≤0.001。
結(jié)果年齡對胸腺細胞群的影響(i)胸腺重量和胸腺細胞數(shù)量隨年齡的增長，胸腺重量(圖1A)和總胸腺細胞數(shù)量(圖1B)均明顯下降(p≤0.0001)。在年輕成體中的相對胸腺重量(mg胸腺/g體重)的平均值為3.34，在18-24個月大的時候相對胸腺重量降至0.66(脂肪沉積限制了計算的準確性)。胸腺重量的降低可歸因于淋巴細胞總數(shù)的降低1-2個月時胸腺含有約6.7×107個胸腺細胞，在24個月時降低至約4.5×106個細胞。通過閹割消除性類固醇對胸腺的影響，胸腺發(fā)生再生，并且在閹割后4周，胸腺與年輕成體的胸腺重量和細胞結(jié)構(gòu)(cellularity)相當(圖1A和1B)。有趣的是，在閹割后兩周胸腺細胞數(shù)量有顯著上升(p≤0.001)(約1.2×108)，在閹割后4周恢復到正常年輕成體的水平(圖1B)。
隨年齡變化胸腺產(chǎn)生的T細胞數(shù)量減少并不反映在外周中，并且脾細胞數(shù)量保持不變(圖2A)。外周的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(homeostatic)機制非常明顯，因為在脾和淋巴結(jié)中的B細胞和T細胞數(shù)的比率不隨年齡和隨后進入外周中的T細胞數(shù)量減少而發(fā)生變化(圖2B)。然而，CD4+和CD8+T細胞數(shù)的比率隨年齡顯著降低(p≤0.001)，從2月時的2∶1降至2歲時的1∶1(圖2C)。在閹割和隨之發(fā)生的進入外周的T細胞數(shù)量上升之后，外周中的T細胞數(shù)量沒有變化脾T細胞數(shù)和在脾和淋巴結(jié)中的B∶T細胞比率在閹割后沒有改變(圖2A和2B)。外周中隨年齡變化CD4∶CD8比率降低在閹割后兩周仍然很明顯，但在閹割后4周完全逆轉(zhuǎn)(圖2C)。
(ii)αβTCR、γδTCR、CD4和CD8的表達為了確定胸腺細胞數(shù)量隨年齡增長而降低是否是特定的細胞群耗盡所致，我們對胸腺細胞進行特定標記，以便對各個亞群進行分析。此外，還可以分析閹割后胸腺再生的動力學。將主要胸腺細胞亞群的比例與正常年輕個體的胸腺相比較(圖3)，結(jié)果表明不隨年齡變化。此外，通過αβTCR和γδTCR的表達對胸腺細胞的進一步細分顯示這些細胞群的比例不隨年齡發(fā)生變化(數(shù)據(jù)沒有列出)。在閹割后2和4周，胸腺細胞亞群保持相同比例，并且因為胸腺細胞數(shù)量在閹割后增加至100倍，這表明所有胸腺細胞亞群同時擴充，不是進行式的逐步擴增(developmental progression ofexpansion)。
因而在年老動物胸腺中細胞數(shù)量的減少是所有細胞表型的平衡減少的結(jié)果，T細胞群沒有發(fā)生明顯的變化。胸腺以同步的方式再生，同時補足所有的T細胞亞群而不是依次補足。
胸腺細胞的增殖如圖4所示，15-20％的胸腺細胞在4-6周時進行增殖。這些胸腺細胞的大部分(約80％)是DP，TN亞群次之(～6％)(圖5A)。因此，利用免疫組化，可以看到大部分分裂(division)是在被膜下(subcapsule)和皮質(zhì)(數(shù)據(jù)沒有列出)。在髓質(zhì)區(qū)域也可以看到一些分裂，用FACS分析顯示正在分裂的SP細胞的比例(9％的CD4T細胞和25％的CD8 T細胞)(圖5B)。
盡管細胞數(shù)量在老年胸腺中顯著降低，但胸腺細胞的增殖保持恒定，在2年時降至12-15％(圖4)，而增殖細胞群的表型與兩個月大的胸腺類似(圖5A)。免疫組織學研究顯示在1年時的分裂與年輕成體中所見相同；然而，在兩年時，觀察到的增殖主要發(fā)生在外皮質(zhì)和維管結(jié)構(gòu)(vasculature)周圍(數(shù)據(jù)沒有列出)。在閹割后兩周，盡管胸腺細胞數(shù)量顯著增加，但正在繁殖的胸腺細胞的比例并沒有變化，再一次顯示細胞擴充的同步性(圖4)。免疫組織學顯示閹割兩周后，胸腺細胞增殖的定位化(localization)和分裂細胞的程度與兩個月大的胸腺類似(數(shù)據(jù)沒有列出)。當分析代表細胞增殖群的每個亞群的比例時，CD8 T細胞的百分比顯著增加(p＜0.001)，該T細胞是在增殖群內(nèi)(在兩個月和兩年大的時候為1％，在閹割后兩周增至約6％)(圖5A)。
圖5B說明在年輕的、老的、和閹割過的小鼠中每個亞類增殖的程度。DN亞類的增殖有顯著的下降(p≤0.001)(兩個月時為35％，2年時為4％)。CD8+T細胞的增殖也顯著下降(p≤0.001)，同時說明了免疫組化發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)沒有列出)，其中在年老胸腺的髓質(zhì)中沒有明顯的分裂。在閹割后4周DN增殖的下降沒有恢復到正常年輕胸腺的水平。然而，CD8+T細胞亞類的增殖在閹割后兩周明顯增加(p≤0.001)并在閹割后四周恢復到正常年輕胸腺的水平。
DN亞類的增殖下降可用CD44和CD25兩個標記物進行進一步分析。DN亞群，除了胸腺細胞前體之外，還包括αβTCR+CD4-CD8-胸腺細胞，認為其在轉(zhuǎn)變成SP細胞時具有下游調(diào)節(jié)共同受體的功能(Godfrey & Zlotnik，1993)。通過選擇性控制這些成熟細胞，能夠分析真正的TN區(qū)域(compartment)(CD3-CD4-CD8-)，結(jié)果顯示細胞的增殖速率不隨年齡或閹割發(fā)生變化(圖5C)。然而，對表達CD44和CD25的亞群進行的分析顯示，TN1亞類(CD44+CD25-)的增殖明顯降低(p≤0.001)，從年輕正常狀態(tài)的20％到18個月時的6％左右(圖5D)，閹割后4周其得到恢復。TN1亞類的增殖降低可由TN2亞群(CD44+CD25+)增殖的顯著增加(p≤0.001)進行補償，該細胞亞群在閹割后兩周恢復到年輕正常狀態(tài)(圖5D)。
年齡對胸腺微環(huán)境的影響通過免疫熒光法檢測了胸腺微環(huán)境隨年齡的變化，其中利用來自MTS系列的單克隆抗體(MAbs)延伸板，經(jīng)多克隆抗細胞角蛋白抗體雙標記。
由這些單克隆抗體識別的抗原可分為三組胸腺上皮亞類、血管相關抗原、和在基質(zhì)細胞和胸腺細胞上均存在的那些抗原。
(i)上皮細胞抗原對兩年大的小鼠胸腺進行抗角蛋白(泛上皮)染色顯示胸腺的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，伴隨嚴重的上皮細胞結(jié)構(gòu)破壞和缺乏明顯的皮質(zhì)-髓質(zhì)連接。使用單克隆抗體、MTS10(髓質(zhì))、和MTS44(皮質(zhì))進行的進一步分析顯示，皮質(zhì)大小隨年齡明顯減小，伴有不很明顯的髓質(zhì)上皮的減小(數(shù)據(jù)沒有列出)。在年老的胸腺中，無上皮細胞區(qū)域或角蛋白陰性區(qū)域(KNA’s，van Ewijk等，1980；Godfrey等，1990；Bruijnties等，1993)更明顯并且尺寸變大，與用抗細胞角蛋白標記一樣明顯。在老年胸腺中還出現(xiàn)胸腺上皮“囊泡狀”結(jié)構(gòu)，尤其是在髓質(zhì)區(qū)域特別明顯(數(shù)據(jù)沒有列出)。用抗細胞角蛋白染色確實顯示脂肪沉積、胸腺尺寸的嚴重減小、和皮質(zhì)-髓質(zhì)連接完整性的下降(數(shù)據(jù)沒有列出)。在閹割后兩周胸腺開始再生。明顯表現(xiàn)在胸腺葉的大小、皮質(zhì)上皮的增加(如通過MTS44所顯示的)、以及髓質(zhì)上皮的定位化。用MTS10檢測髓質(zhì)上皮，在兩周時，仍然有MTS10染色的副囊(subpockets)分散在整個皮質(zhì)中。在閹割后4周，有明顯的髓質(zhì)和皮質(zhì)以及明顯的皮質(zhì)-髓質(zhì)連接(數(shù)據(jù)沒有列出)。
MTS20和24標記可用于檢測原始上皮細胞(Godfrey等，1990)，并且進一步說明老年胸腺的退化情況。退化表現(xiàn)為在E14時的豐度，在4-6周可檢測到單獨的髓質(zhì)上皮細胞簇，但年老的胸腺中強度再次增加(數(shù)據(jù)沒有列出)。在閹割后，所有這些抗原在與年輕成體胸腺相當?shù)乃缴线M行表達(數(shù)據(jù)沒有列出)，并且MTS20和24恢復到在皮質(zhì)-髓質(zhì)連接處的散在的副囊。
(ii)血管相關抗原認為血-胸腺屏障與T細胞前體向胸腺遷移和成熟T細胞從胸腺遷移到外周相關。
單克隆抗體MTS15是胸腺血管內(nèi)皮特異性的，顯示粒狀、分散的染色圖(pattern)(Godfrey等，1990)。在老年胸腺中，MTS15表達顯著增加，并反映血管及其血管周圍空間的頻率和尺寸的增加(數(shù)據(jù)沒有列出)。
胸腺細胞外基質(zhì)，包括重要的結(jié)構(gòu)和細胞粘連分子，例如膠原、層粘連蛋白、和纖維蛋白原，可用單克隆抗體MTS16檢測。MTS16表達在正常年輕胸腺中較為分散，在老年胸腺中表達則更廣泛并且存在內(nèi)在聯(lián)系。在閹割后2周，MTS16的表達進一步增加，而閹割后4周，該表達表現(xiàn)為2月胸腺的典型的狀態(tài)(數(shù)據(jù)沒有列出)。
(iii)共享抗體正常年輕胸腺中的MHCII表達(用單克隆抗體MTS6檢測)在皮質(zhì)上皮為強陽性(粒狀)(Godfrey等，1990)，在髓質(zhì)上皮染色較弱。老年胸腺中MHCII表達下降并在閹割后兩周表達顯著上升。在閹割后4周，表達再次降低并且和2個月大的胸腺類似(數(shù)據(jù)沒有列出)。
胸腺細胞遷移在年輕小鼠中，每天大約有1％的T細胞從胸腺中排出(Scollay等，1980)。我們發(fā)現(xiàn)T細胞遷移速率在14個月和甚至2年大時與正常年輕小鼠相當(圖5)，盡管細胞數(shù)量明顯減少(p≤0.0001)。胸腺最近排出物的CD4∶CD8比率從2個月時的約3∶1增至26個月時的7∶1。閹割后1周，遷移的總速率保持在1-1.5％，但遷移到外周中的細胞數(shù)量顯著增加。
實施例如下實施例提供本發(fā)明的方法的特定實施例，但并非對本發(fā)明內(nèi)容進行限制。為了方便起見，這些實施例描述用于防治HIV感染的基因治療。
實施例1T細胞清除進行T細胞消除以盡可能多的除去HIV感染細胞。同時也除去識別非自身抗原的T細胞，以便使用非自體的、遺傳修飾的細胞。該步驟的一種標準程序如下?；颊呓邮芸筎細胞抗體的方式如下以每天15mg/kg的劑量注射抗胸腺細胞丙種(Atgam)(異種抗T細胞球蛋白，Pharmacia Upjohn公司)10天，與T細胞活性抑制劑環(huán)孢菌素A(3mg/kg)聯(lián)合用藥，連續(xù)注射3-4周，之后(如果需要的話)以每天9mg/kg的劑量服用片劑。這種治療并不影響患者胸腺的早期T細胞發(fā)育，因為由于人類胸腺的大小和結(jié)構(gòu)，不能給予具有此種效果所需的抗體劑量。治療持續(xù)約4-6周，使性類固醇水平降低和胸腺的重組有充分的時間。T細胞反應活性的抑制可與第二水平信號抑制劑(如白介素或細胞粘連分子)一起施用，以增強T細胞消融。
這種外周T細胞的清除能夠最大程度降低移植排斥的危險，因為它非特異性地清除所有T細胞，包括與外來供體有潛在反應性的T細胞。與此同時，然而，由于缺乏T細胞，該程序會誘導全身性(generalized)免疫缺陷狀態(tài)，這意味著患者對感染、尤其是病毒感染高度敏感。在缺乏適當?shù)腡細胞幫助的條件下，甚至B細胞應答也不能正常進行。
此外，在治療前和整個過程中采用HAART治療以降低病毒效價。
實施例2性類固醇消融治療采用對患者施用LHRH激動劑的形式進行性類固醇消融治療。以Leucrin(長效制劑；22.5mg)或醋酸性瑞林(灌輸；10.8mg)形式給藥，任何一種單劑藥效持續(xù)3個月。這可有效降低性類固醇的水平，從而足以重新激活胸腺。在某些情況下，也需要在整個性類固醇消融治療過程中施用抑制腎上腺產(chǎn)生性類固醇的抑制劑，如每天服用一片Cosudex(5mg/day)。腎上腺產(chǎn)生的性類固醇占人體類固醇的約10-15％。
將血液中的性類固醇降到最低值約需1-3周；與之相對應的是胸腺的重新激活。在某些情況下，需要將治療延長，進行第二個三個月的注射/灌輸療程。
實施例3其他給藥方法可采用其它方法來代替這種3個月的長效制劑注射或移植注入LHRH激動劑的方法。在一個實施例中，患者的皮膚可用激光器(如鉺釔鋁石榴石激光器)進行輻照，來消融或蝕變皮膚，從而減少角質(zhì)層的阻礙效應(impeding effect)。
A.激光消融或改變紅外激光輻射脈沖是由固態(tài)的、脈沖鉺釔鋁石榴石激光器產(chǎn)生，該激光器由如下部分組成兩個平面共振腔反射鏡(flat resonator mirrors)、作為激活介質(zhì)的鉺釔鋁石榴石晶體、電源、和聚焦激光束的方式。激光束的波長為2.94微米。使用單脈沖。
操作參數(shù)如下每個脈沖能量為40、80、或120mJ，焦點位置的光束大小為2mm，產(chǎn)生的能注量為1.27、2.55、或3.82J/cm2。脈沖時域為300μs，產(chǎn)生的能注量率(energy fluence rate)為0.42、0.85、或1.27×104W/cm2。
接著，一定劑量的LHRH激動劑施用在皮膚上并且分散在輻照部位。該LHRH激動劑的形式可為軟膏，以便保持在輻照部位。可選地，封閉貼片(occlusive patch)可置于激動劑上，使其保持于輻照部位上。
可選地，使用分束器來分裂激光束，從而產(chǎn)生多部位的消融或蝕變。該方法使LHRH激動劑快速通過皮膚進入血流中。部位數(shù)量可以提前決定，使激動劑在患者體內(nèi)保持需要的約30天時間。
B.壓力波一定劑量的LHRH激動劑被置于適合的容器(如可變形的塑料墊圈(washer)(直徑大約1英寸(25.4mm)，厚度大約1/16英寸(1.5875mm))內(nèi)，并放于要產(chǎn)生壓力波的皮膚處。該部位的皮膚用靶材料(如大約1mm厚的黑色聚苯乙烯片)覆蓋。Q開關固態(tài)紅寶石激光器(脈沖持續(xù)20ns，每個脈沖能夠產(chǎn)生達2J的能量)用于產(chǎn)生激光束，該激光束擊中靶材料并產(chǎn)生單個短暫脈沖。黑色聚苯乙烯靶材料完全吸收激光輻射以至于皮膚只暴露于短暫脈沖，而不會暴露于激光輻射。該過程不產(chǎn)生疼痛。這種操作可每天重復，或根據(jù)需要進行，以維持循環(huán)血液中的激動劑的水平。
實施例4HSC的遺傳修飾因為大多數(shù)HIV感染患者的HSC細胞濃度很低，所以優(yōu)選采用供體來供應細胞。實際應用中，在收集細胞之前，通過以10μg/kg的劑量給供體注射粒細胞集落刺激因子(G-CSF)2-5天，來增強供體血液中的HSC水平。CD34+供體細胞從供體血液或骨髓中純化得到，優(yōu)選利用流式細胞計(flow cytometer)或免疫磁珠(immunomagnetic beading)。來自供體的HSC經(jīng)流式細胞計分析被確定是CD34+?？蛇x地，這些HSC可以采用干細胞因子在體外擴增。
反轉(zhuǎn)錄病毒載體含有HIV-1 rev基因的反顯性突變株，RevM10，其抑制HIV復制(Bonyhadi等，1997)。含有上清液的兩性(Amphotropic)載體由經(jīng)載體轉(zhuǎn)染的嗜同生產(chǎn)者細胞(ecotropicproducer cells)的過濾上清液感染得到。收集的CD34+細胞在加有IL-3、IL-6和干細胞因子(SCF)(每種10ng/ml)的LCTM培養(yǎng)基中預激活24h，以誘導細胞進入細胞周期。含有載體的上清液重復加入到細胞中2-3天，以完成載體進入細胞的轉(zhuǎn)導過程。
在施用LHRH激動劑約1-3周后，剛好在胸腺重新激活之前或在胸腺重新激活的時候，患者用基因重組的HSC感染，優(yōu)選劑量為約2-4×106個細胞/kg?？蛇x地，在受體體內(nèi)也可注射G-CSF來幫助HSC的擴充。
重新激活的胸腺吸收遺傳修飾的HSC，并在將受體的HSC轉(zhuǎn)化為受體型T細胞和樹突狀細胞的同時，將它們轉(zhuǎn)化為供體型T細胞和樹突狀細胞。通過細胞凋亡清除細胞或通過免疫調(diào)節(jié)細胞誘導耐受性，供體樹突狀細胞使任何與受體具有潛在反應性的T細胞耐受性。
實施例5其它方法在縮短供體遺傳修飾細胞的移植時間的情況下，實施例1-4中的時限(timeline)可以修改。T細胞消融和性類固醇消除可以同時開始。T細胞消融持續(xù)約10天，而性類固醇消除持續(xù)約3個月。
實施例6免疫抑制的終結(jié)當胸腺嵌合體已經(jīng)建立并且新的成熟T細胞群開始從胸腺中排出時，從患者體內(nèi)取血，并且用標準淋巴細胞混合反應體外檢測T細胞對供體細胞的免疫應答的缺乏性。如果沒有應答，就將免疫抑制治療逐漸減少以允許抗感染的自我防御產(chǎn)生。如果沒有排斥現(xiàn)象，如由血液中存在活化T細胞所部分地表明的，則最終完全停止免疫抑制治療。因為HSC有很強的自我更新能力，如此形成的造血嵌合體(chimera)在理論上在患者一生中都是穩(wěn)定的(如對于正常、沒有耐受化、和非移植人群而言)。
實施例7利用LHRH激動劑重新激活人類的胸腺為了說明本發(fā)明的方法可以重新激活人類胸腺，這些方法用于已經(jīng)接受化療的前列腺癌患者。在性類固醇消融治療前和治療后4月，對前列腺癌癥患者進行評估。結(jié)果總結(jié)在圖23-27中。總的來講，數(shù)據(jù)說明許多患者體內(nèi)T細胞狀態(tài)在質(zhì)量和數(shù)量上都有改善。
LHRH治療對總淋巴細胞數(shù)目及其T細胞亞類的影響采用LHRH激動劑治療前列腺癌患者(所有患者大于60歲)，對外周血淋巴細胞的表型組成進行分析(圖23)。在開始LHRH激動劑治療之前和4個月后進行患者樣品分析。所有患者的每ml血液的總淋巴細胞數(shù)量在治療前是位于對照值的較低端。在治療之后，6/9的患者體內(nèi)淋巴細胞總數(shù)明顯上升(在某些情況下總細胞數(shù)加倍)。與此相關的是6/9的患者總T細胞數(shù)增加。就CD4+亞類而言，這種增長更加明顯，8/9的患者CD4+T細胞水平增加。而在CD8+亞類中，趨勢不是很明顯，有4/9的患者的水平升高，雖然一般來說升高的程度也小于CD4+T細胞。
LHRH治療對T細胞亞類比例的影響對LHRH激動劑治療前后患者血液的分析表明T細胞、CD4+或CD8+T細胞的總比例沒有明顯變化，但CD4+∶CD8+比率在治療后有不同的變化(圖24)。這顯示，盡管治療后總T細胞數(shù)明顯增加，但治療對各T細胞亞類的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持幾乎沒有影響。所有的值與對照值相比較。
LHRH治療對B細胞和骨髓性細胞比例的影響對LHRH激動劑治療的患者外周血中的B細胞和骨髓性細胞(NK、NKT、和巨噬細胞)的比例進行分析，結(jié)果表明各亞類有不同程度的變化(圖25)。雖然治療后NK、NKT、和巨噬細胞的比例相對不變，但在4/9的患者中B細胞比例下降。
LHRH激動劑治療對B細胞和骨髓性細胞總數(shù)的影響對治療后的外周血內(nèi)的B細胞和骨髓性細胞總數(shù)進行分析，分析結(jié)果清楚顯示治療后NK(5/9患者)、NKT(4/9患者)、和巨噬細胞(3/9患者)的細胞數(shù)目明顯增加(圖26)(圖29)。B細胞的數(shù)量變化沒有明顯趨勢2/9的患者水平增加，4/9的患者沒有明顯變化、以及3/9的患者水平下降。
LHRH治療對相對于記憶細胞的純真細胞水平的影響在LHRH激動劑治療后所見到的主要變化是在外周血T細胞群內(nèi)。尤其是，純真(CD45RA+)CD4+細胞比例選擇性增加，同時CD4+T細胞亞類中的純真細胞(CD45RA+)對記憶細胞(CD45RO+)的比率在6/9的患者中增加(圖27)。
結(jié)論因此可得出這樣的結(jié)論，采用LHRH激動劑治療動物(如具有萎縮胸腺的人類)，可以誘導胸腺的重新激活。接受性類固醇消融治療的前列腺癌患者，其血液T淋巴細胞的狀態(tài)顯示出總體的改善。然而要精確確定這些細胞是否僅來自于胸腺是非常困難的，因為還沒有關于其他的T細胞主要來源(CD8αβ鏈)的描述，我們可以從邏輯上得出上述結(jié)論。胃腸道T細胞主要是TCRγδ或CD8αα鏈。
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權(quán)利要求
1.對患者進行基因改造的方法，包括以下步驟基因修飾細胞，其中所述細胞是選自HSC、淋巴祖細胞、骨髓性祖細胞、上皮干細胞、及其組合；以及將它們輸送到所述患者體內(nèi)，同時所述患者的胸腺處于重新激活狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括在施用細胞之前進行T細胞消融。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者的胸腺已至少部分失活。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述患者處于青春期后。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述患者患有或曾經(jīng)患有疾病或得到疾病治療，其至少部分使所述患者胸腺失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞是來自所述患者。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞不是來自所述患者。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者患有T細胞紊亂。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述T細胞紊亂由選自由T細胞功能紊亂、HIV感染、和T細胞白血病病毒感染的疾病所組成的組所引起。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細胞經(jīng)遺傳修飾抑制病毒對所述細胞的感染。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細胞經(jīng)遺傳修飾以抑制病毒在T細胞內(nèi)復制。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述T細胞紊亂由HIV感染引起。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述細胞經(jīng)遺傳修飾以包括穩(wěn)定表達的多核苷酸，所述多核苷酸選自由船形盆轉(zhuǎn)錄因子基因、編碼剪切HIV tat和/或rev基因的核酶的基因、HIV-1 rev基因的反顯性突變株(RevM10)、HIV-1 rev應答元件(RRE)的過表達結(jié)構(gòu)、及其功能片段組成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述HSC是CD34+。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述遺傳修飾細胞大約在所述胸腺開始重新激活時或稍后對所述患者施用。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中阻斷傳向所述胸腺的所述性類固醇介導的信號的所述方法是通過施用一種或多種藥物。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述藥物是選自由LHRH激動劑、LHRH拮抗劑、抗LHRH疫苗、及其組合組成的組。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述LHRH激動劑是選自由氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、組氨瑞林、那法瑞林、黃體瑞林、亮丙瑞林、和地洛瑞林組成的組。
19.一種防止患者受到HIV感染的方法，包括下述步驟T細胞消融、阻斷傳向胸腺的性類固醇介導的信號、以及給予遺傳修飾細胞，其中所述遺傳修飾細胞是選自遺傳修飾的HSC、淋巴樣祖細胞、骨髓性祖細胞、及其組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述遺傳修飾細胞含有能阻止T細胞受HIV感染的穩(wěn)定表達的多核苷酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述穩(wěn)定表達的多核苷酸是選自由船形盆轉(zhuǎn)錄因子基因、編碼剪切HIV tat和/或rev基因的核酶的基因、HIV-1 rev基因的反顯性突變株(RevM10)、HIV-1 rev應答元件(RRE)的過表達結(jié)構(gòu)、及其功能片段組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述HSC是CD34+。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述遺傳修飾細胞大約在所述胸腺開始重新激活或稍后對所述患者施用。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中阻斷傳向所述胸腺的所述性類固醇介導的信號的所述方法是通過施用一種或多種藥物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述藥物是選自由LHRH激動劑、LHRH拮抗劑、抗LHRH疫苗、及其組合組成的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述LHRH激動劑是選自由氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、組氨瑞林、那法瑞林、黃體瑞林、亮丙瑞林、和地洛瑞林組成的組。
全文摘要
本發(fā)明提供利用造血干細胞(HSC)、淋巴祖細胞、和/或骨髓性祖細胞進行基因治療的方法。這些細胞通過基因重組產(chǎn)生能夠在這些細胞及其分化后的后代細胞中表達的基因。在優(yōu)選的具體實施例中，這些細胞含有能抵抗HIV感染和/或復制的基因或基因片段。這些細胞與重新激活患者胸腺的治療聯(lián)合用藥。因為患者在胸腺重新活化過程中產(chǎn)生外來細胞抗性，因而這些細胞可以是自體的、同種同基因的、同種異基因的、或異種異基因的。在優(yōu)選的具體實施例中，造血干細胞是CD3文檔編號A61K48/00GK1582178SQ01820138
公開日2005年2月16日 申請日期2001年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月13日
發(fā)明者理查德·博伊德 申請人:莫納什大學