專利名稱：心錨蛋白重復(fù)蛋白基因上游序列、含有該序列的載體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域。具體涉及基因表達(dá)靶向領(lǐng)域，更具體而言，涉及用于轉(zhuǎn)基因特異性表達(dá)的新系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與發(fā)展。本發(fā)明的主題具體是能夠控制心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因體內(nèi)表達(dá)的水平和特異性的新啟動子序列。本發(fā)明描述了能夠控制和指導(dǎo)心肌細(xì)胞中核酸表達(dá)的新型組合物、構(gòu)建體和載體。由本發(fā)明衍生的用途很多，例如在實(shí)驗(yàn)、臨床、治療和診斷領(lǐng)域，更具體而言，對于某些心臟病的治療和/或預(yù)防。
背景技術(shù)：
對于許多用途而言，控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平和靶向是必要的。因此，對于基因治療，治療成功可能需要由轉(zhuǎn)基因合成的蛋白質(zhì)之靶向作用，從而使得有可能限制副作用的擴(kuò)散。轉(zhuǎn)基因動物的構(gòu)建和基因作用的研究都是能夠采用適當(dāng)控制蛋白質(zhì)表達(dá)的特異性并能產(chǎn)生改進(jìn)的例子。
在這方面，已經(jīng)檢驗(yàn)了多種啟動子指導(dǎo)心特異性表達(dá)的能力。具體包括編碼下列物質(zhì)的基因的啟動子大鼠心肌球蛋白輕鏈(MLC-2)(Henderson S.A.等人，J Biol Chem，264(1989)18142-8；Lee K.J.等人，J Biol Chem，126(1992)15875-85)、小鼠心α-肌動蛋白(Biben C.等人，Dev Biol，173(1996)200-12)、利尿因子(ANF)(Harris A.N.等人，J MolCell Cardiol，29(1997)515-25)、α-或β-肌球蛋白重鏈(α-或β-MHC)(Colbert M.C.等人，J Clin Invest，100(1997)1958-68)、兔肌肉肌酸激酶(MCK)(Vincent C.K.等人，M0l Cell Biol，13(1993)567-74)或心肌鈣蛋白T(US 5,266,488)。
公知這些啟動子能提供一定程度的組織特異性，也公知其活性水平大大低于那些所謂的強(qiáng)啟動子，通常低10-100倍，以致不能真正地展望其治療用途。
例如，F(xiàn)ranz W.M.等人(Cardiovasc Res，35(1997)560-6)和Griscelli F.等人(C R Acad Sci III，320(1997)103-12)表示，腺病毒構(gòu)建體中編碼大鼠α-MHC和MLC-2的基因的上游序列的活性水平大大低于RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動子，大約低10倍。
因此更準(zhǔn)確地說，本申請涉及一種來源于CARP(心錨蛋白重復(fù)蛋白)基因上游區(qū)的新啟動子序列。它不僅能指導(dǎo)心特異性表達(dá)，而且顯示與強(qiáng)啟動子如CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動子相當(dāng)?shù)母咚降捏w內(nèi)表達(dá)。
曾經(jīng)研究了CARP蛋白，并在小鼠(Zou Y.等人，Development，24(1997)793-804)、兔(Aihara Y.等人，Biochim Biophys Acta，28(1999)318-24)和人(Chu W.等人，J Biol Chem，270(1995)10236-45)中對其基因的編碼部分進(jìn)行了測序，CARP蛋白是區(qū)別MLC-2v基因表達(dá)調(diào)節(jié)中作用于同源框基因Nbx2.5下游的心肌細(xì)胞的第一種標(biāo)記物之一。
Kuo H.等人(Development，126(1999)4223-34)克隆了一條10Kb的片段，并且對小鼠CARP基因編碼序列上游的2.5Kb片段進(jìn)行了測序。該片段在5’具有缺失，顯示位于核苷酸-166與+47之間(相對于轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)+1)的啟動子的213bp區(qū)足以在體外引起心特異性表達(dá)，這提示在5’端存在控制啟動子特異性的元件。Kuo等人也生產(chǎn)了含有CARP基因上游2.5Kb片段的轉(zhuǎn)基因小鼠系，在胚胎發(fā)育早期，轉(zhuǎn)基因在心肌和骨骼肌細(xì)胞中顯示特異性表達(dá)，這種表達(dá)在發(fā)育過程中受到抑制。
申請WO 00/15821描述了小鼠CARP基因編碼序列上游5’中的一部分，相對于轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)+1，它位于核苷酸-2285與+62之間。利用腺病毒載體特別評價(jià)了該序列的體內(nèi)活性。但是獲得的活性水平仍然極低，因此發(fā)現(xiàn)，為了檢測體內(nèi)活性，分離位于腺伴隨病毒兩個反向末端重復(fù)序列(AAV-ITR)之間的啟動子序列是必要的。
申請人致力于更好地表征CARP蛋白基因5’中的區(qū)域。從而能鑒定CARP基因上游的一種新序列，并且證明這種新序列的意料之外的和有利的特性，特別是體內(nèi)活性水平的顯著提高。
發(fā)明人確實(shí)驚奇地發(fā)現(xiàn)，這種新鑒定的序列不引起明顯的體外表達(dá)，相反能獲得水平極高的體內(nèi)活性，與所謂的強(qiáng)啟動子相當(dāng)，而且在心臟組織中的表達(dá)保持較高的選擇性。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的主題是一種多核苷酸，其含有CARP蛋白基因編碼序列上游的一部分，或者在高嚴(yán)格條件下與該上游序列雜交的一部分，該多核苷酸能夠誘導(dǎo)在其控制下的轉(zhuǎn)基因在心臟組織中的特異性表達(dá)。
本發(fā)明也涉及天然來源的或者通過化學(xué)合成獲得的任何一種多核苷酸，其顯示與序列SEQ ID NO1有至少93％，優(yōu)選地至少95％的同一性。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸顯示與序列SEQ ID NO1有至少98％的同一性。
表述“天然來源的多核苷酸”是指利用限制酶酶切細(xì)胞DNA獲得的基因組DNA片段。
表述“通過化學(xué)合成獲得的多核苷酸”是指通過自動合成，例如利用適當(dāng)?shù)淖詣友b置產(chǎn)生的DNA片段。
對于本發(fā)明而言，術(shù)語“高嚴(yán)格條件”具有Maniatis等人，1982(《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊》，Cold Spring Harbor CSH，N.Y.，USA)或其最新版本之一所述的含義。例如，為了除去未雜交的片段，雜交條件是在0.2 SSC和0.1％SDS存在下，在65℃下洗滌3次。
表達(dá)的“特異性”特征是指在心臟組織的細(xì)胞中啟動子的活性顯著提高。盡管在其它細(xì)胞中也可能存在非特異性表達(dá)，但是與在心臟細(xì)胞中所見的相比，相應(yīng)的活性水平通常極低(可以忽略)，一般至少低10倍。
就此而言，實(shí)施例的結(jié)果顯示表達(dá)的差異可達(dá)1000倍，這反映了根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸在體內(nèi)心臟細(xì)胞中的高選擇性。
而且，下列實(shí)施例的結(jié)果清楚地表明，使用多核苷酸使本發(fā)明的系統(tǒng)具有高水平的表達(dá)，高于已知為心臟組織特異性的其它啟動子，相差可能超過100倍。因此這些元件說明了根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸在心臟組織中目的核酸的表達(dá)強(qiáng)度和特異性方面的優(yōu)點(diǎn)和意料之外的特性。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸有利地在-2266與+92之間(相對于轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)+1)含有一部分序列，其序列SEQ ID NO1在附錄中列出。
因此本發(fā)明的主題是在高嚴(yán)格條件下可與序列SEQ ID NO1雜交的序列。
但是本發(fā)明不限于含有小鼠基因上游片段的多核苷酸，而是涉及具有相同特性的任何功能變體或其它任何種的其它任何序列，即能夠特異性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在心臟組織中的體內(nèi)表達(dá)。
因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能方便地參考在GenBank以AF131884保藏的人類基因上游序列，其序列SEQ ID NO2在附錄中列出。因此本發(fā)明涵蓋含有CARP蛋白基因上游序列片段的任何序列，例如由于特定結(jié)構(gòu)缺失而修飾，并且保留與序列SEQ ID NO1相同或相似的功能。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸顯示與序列SEQ ID NO2有至少80％，更優(yōu)選地至少90％的同一性。
表述功能變體是指保留上述多核苷酸的特性的任何修飾序列。修飾包括所述序列中核苷酸添加、突變、缺失和/或置換中的一種或多種。這些修飾可以通過常規(guī)分子生物學(xué)方法引入，如定點(diǎn)誘變，或者用更實(shí)用的方法，用合成儀人工合成該序列。然后檢測獲得的變體控制心肌細(xì)胞中的表達(dá)特異性的能力，與具有序列SEQ ID NO1的多核苷酸相比較。
本發(fā)明的另一個主題涉及一種表達(dá)盒，它包含如上所述的多核苷酸，與一種轉(zhuǎn)基因有效連接，使得后者在心肌中的表達(dá)被特異性引導(dǎo)。
有利地，本發(fā)明的盒還包含一種轉(zhuǎn)錄終止信號，其位于轉(zhuǎn)基因核苷酸序列的3’。
優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)基因含有一種具有治療用途的核酸，該核酸編碼可能與心臟病(如心功能不全、心臟肥大、缺氧、局部缺血或心臟移植排斥)有關(guān)的蛋白質(zhì)或RNA。
具有治療用途的蛋白質(zhì)尤其包括-誘導(dǎo)血管形成的蛋白質(zhì)，如VEGF家族的成員，F(xiàn)GF家族的成員，更具體而言，如FGF1、FGF2、FGF4、FGF5、血管生成素、EGF、TGFα、TGFβ、TNFα、分散因子/HGF，angiopoietin家族的成員，細(xì)胞因子，特別是白介素，包括IL-1、IL-2、IL-8、血管緊張肽-2、纖溶酶原激活物(TPA)、尿激酶(uPA)，參與活性脂(前列腺素，Cox-1)合成的分子；-參與控制心肌收縮性的蛋白質(zhì)，如受磷蛋白、受磷蛋白抑制劑、SERCA-2a、β2-腎上腺素能受體或肌營養(yǎng)不良蛋白或小肌營養(yǎng)不良蛋白(FR 91 11947)；-具有冷凍保護(hù)活性，特別是可阻斷凋亡的蛋白質(zhì)，如bcl家族成員的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)激酶如AKT/PKB；-轉(zhuǎn)錄因子，如天然或嵌合核受體，其含有DNA結(jié)合域、配體結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活或抑制域，如融合蛋白tetR-NLS-V16、來源于雌激素受體的融合蛋白、來源于類固醇激素受體的融合蛋白、來源于孕酮受體的融合蛋白、CID(二聚化的化學(xué)誘導(dǎo)劑)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，如Rivera等人(Rivera等人，Nature Medicine，2(1996)1028-1032)所述。嵌合核受體具體可包括核受體PPAR(過氧化物酶體增殖物激活的受體)，特別是PPARγ2，如申請WO 96/23884和FR 99 07957和Frohnert等人(J Biol Chem 274(1999)3970-3977)和Mukherjee等人(J Biol Chem272(1997)8071-8076)所述，其或?yàn)樘烊恍问?，一級結(jié)構(gòu)沒有修飾，或者是含有一個或多個配體結(jié)合位點(diǎn)或E/F域的修飾PPARγ2(Schoonjans等人，Biochim.Biophys.Acta.1302(1996)93-109)，如具有序列SEQ ID NO3的PPARγ2γ2；-免疫抑制劑，如白介素2和10，它們能完全或部分抑制免疫信號傳導(dǎo)途徑，從而延長心臟移植的持續(xù)時(shí)間；-作為試劑參與緩解缺氧的蛋白質(zhì)，如NOS(氧化氮合成酶)、B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2(bcl-2)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶。
具有治療用途的RNA可包括，例如反義RNA，按照專利EP 140308所述的技術(shù)，它們可用于控制基因表達(dá)或細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄，從而阻斷翻譯為蛋白質(zhì)，以及如EP 321 201所述能選擇性破壞靶RNA的核酶。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，本發(fā)明不限于蛋白質(zhì)或RNA的具體實(shí)例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過簡單的實(shí)驗(yàn)操作，利用它們在心臟細(xì)胞中表達(dá)任何核酸。
本發(fā)明的主題還包括含有根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒的載體。這種載體可含有轉(zhuǎn)基因在靶組織中表達(dá)所需的其它任何DNA序列，尤其是含有在心臟細(xì)胞中有效的復(fù)制起點(diǎn)。
本發(fā)明的載體可以是不同性質(zhì)和/或不同來源的，特別是來源于質(zhì)粒、附加體、染色體、病毒或噬菌體。優(yōu)選地是質(zhì)?；蛑亟M病毒。
為了說明含有多核苷酸或表達(dá)盒的質(zhì)粒，例如可以提到質(zhì)粒pXL3634、pXL3728和pXL3759，它們在下文描述。
根據(jù)第一個實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的載體是質(zhì)粒類型的。質(zhì)粒載體包括本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的任何克隆和/或表達(dá)質(zhì)粒，它們一般含有一個復(fù)制起點(diǎn)。也包括攜帶復(fù)制起點(diǎn)和/或已經(jīng)確定的標(biāo)記的新一代質(zhì)粒，如申請WO 96/26270所述。
根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施方案，質(zhì)粒載體是一種小質(zhì)粒，含有一個復(fù)制起點(diǎn)，它在宿主細(xì)胞中的功能性需要存在至少一種對于該細(xì)胞而言特異且外源的蛋白質(zhì)。申請WO 97/10343中具體描述了這類載體。
根據(jù)第二個實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的載體是病毒載體。后者包括重組腺病毒、重組腺伴隨病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、皰疹病毒和痘苗病毒，它們的制備可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法進(jìn)行。優(yōu)選地使用嵌合病毒載體，如申請WO 95/22617所述的腺病毒-逆轉(zhuǎn)錄病毒嵌合載體，以及Leblois等人(Mol Ther(2000)1(4)，314-322)和申請WO 97/47757所述的附加體/腺病毒載體。
當(dāng)根據(jù)該實(shí)施方案使用腺病毒時(shí)，優(yōu)選地是來源于缺陷腺病毒的載體，即它們在靶細(xì)胞中不能自主復(fù)制。這類缺陷病毒的構(gòu)建以及它們的傳染性在文獻(xiàn)中已有廣泛描述(具體參見，S.Baeck和K.L.March，Circul.Research，82，(1998)295-305；T.Shenk，B.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley等人(1996)，腺病毒科病毒與復(fù)制(《病毒學(xué)》)211-2148，EDS-Ravens Publishers Philadelphia；Yeh，P.等人FASEB11(1997)615-623)。
已經(jīng)表征了多種腺病毒血清型，它們的結(jié)構(gòu)和特性略有不同。在這些血清型中，本發(fā)明優(yōu)選地使用2型或5型人類腺病毒(Ad2或Ad5)或動物來源的腺病毒，如申請F(tuán)R 93 05954所述，或混合來源的腺病毒。本發(fā)明能夠使用的動物來源的腺病毒包括犬、牛、鼠(Beard等人，Virology 75(1990)81)、綿羊、豬、鳥或猿來源的腺病毒。動物來源的腺病毒優(yōu)選地是犬腺病毒，更優(yōu)選地是CAV2腺病毒(Manhattan或A26/61株)，如申請WO 94/26914所述。
本發(fā)明的缺陷腺病毒通常在每個末端含有反向末端重復(fù)序列(ITR)、允許包殼的序列(Psi)、E1基因和選自基因E2、E4和L1-L5中的至少一種，這些基因已經(jīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的任意一種技術(shù)滅活(Levero等人，Gene，101(1991)195，EP 185 573；Graham，EMBOJ.3(1984)2917)。
有利地，本發(fā)明中使用的重組腺病毒在其基因組的E1區(qū)含有缺失。更具體而言，包括E1a和E1b區(qū)的缺失。例如，影響核苷酸454-3328、382-3446或357-4020的缺失(對于Ad5的基因組)。
根據(jù)一個優(yōu)選變化，本發(fā)明中使用的重組腺病毒還包括基因組E4區(qū)中的缺失。更具體而言，E4區(qū)中的缺失影響所有開放閱讀框。例如33466-35535或33093-35535缺失。申請WO 95/02697和WO 96/22378中描述了E4區(qū)中其它類型的缺失，在此引用作為參考。
至于腺伴隨病毒(AAV)，它們是相對較小的DNA病毒，能以穩(wěn)定和位點(diǎn)特異的方式整合到所感染的細(xì)胞的基因組中。它們能感染廣譜的細(xì)胞，而不誘發(fā)對細(xì)胞生長、形態(tài)學(xué)或分化的任何影響。而且，它們似乎與人類的病理學(xué)無關(guān)。AAV基因組已經(jīng)克隆、測序并表征。它含有大約4700個堿基，在每個末端含有一個大約145堿基的反向末端重復(fù)序列(ITR)，作為病毒的復(fù)制起點(diǎn)。基因組的其余部分被分為兩個具有包殼功能的必需區(qū)基因組的左側(cè)部分，含有參與病毒復(fù)制和病毒基因表達(dá)的rep基因；基因組的右側(cè)部分，含有編碼病毒衣殼蛋白的cap基因。
AAV衍生載體在體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用在文獻(xiàn)中已有描述(具體見WO 91/18088；WO 93/09239；US 4,797,368，US 5,139,941，EP 488528)。這些申請描述了rep和/或cap基因已經(jīng)缺失并被置換為目的基因的不同AAV衍生構(gòu)建體，以及它們在體外(到培養(yǎng)的細(xì)胞上)或體內(nèi)(直接到生物中)轉(zhuǎn)移該目的基因中的用途。根據(jù)本發(fā)明的缺陷重組AAV可以如下制備用含有以兩個AAV反向末端重復(fù)序列(ITR)為界的本發(fā)明的核酸序列的一種質(zhì)粒，和攜帶AAV包殼基因(rep和cap基因)的一種質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染被人輔助病毒(例如腺病毒)感染的一種細(xì)胞系。然后用常規(guī)技術(shù)純化產(chǎn)生的重組AAV。
根據(jù)該實(shí)施方案也可以使用慢病毒；它們允許向靜止細(xì)胞中轉(zhuǎn)移和高效、穩(wěn)定地整合目的基因。
例如動物慢病毒的HTLV-1，如FIV(貓傳染性病毒)、EIAV(馬傳染性貧血病毒；WO 98/51810)、BIV(牛免疫缺陷病毒)、SIV(猿免疫缺陷病毒)、CAEV(山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒)(WO 98/39463；Naldini等人，Science 272(1996)263-267；Schnele等人，Hum Gen Ther 11(2000)439-447)，或者與引起AIDS的病毒HIV-2(在人類中不是高度致病的)有關(guān)的一種慢病毒(Kundra等人，Hum Gen Ther 9(1998)1371-1380)。
表達(dá)盒可以在重組基因組的不同位點(diǎn)插入。它可以在E1、E3或E4區(qū)的水平上插入，置換抑制的或多余的序列。也可以在產(chǎn)生病毒所需的順式序列(ITR序列和包殼序列)之外的其它任意位點(diǎn)插入。
然而應(yīng)當(dāng)指出，向上述載體中導(dǎo)入根據(jù)本發(fā)明的序列不是必需的，這樣可以用含有這些序列的DNA直接轉(zhuǎn)染心臟細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可以在該核酸與促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞或轉(zhuǎn)運(yùn)到核中的化合物共價(jià)偶聯(lián)之后導(dǎo)入，產(chǎn)生的偶聯(lián)物任選地包封于聚合微顆粒中，如國際申請WO 94/27238所述。
根據(jù)另一個實(shí)施方案，該核序列可包含于一種轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中，該系統(tǒng)包括促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞中的多肽，如國際申請WO 95/10534所述。
這些多核苷酸、表達(dá)盒和載體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的任何方法原位施用，例如通過冠狀輸注(Barr等人，Gene Ther，1.(1994)51-58)、心內(nèi)注射、心表注射，即通過心室壁(Guzman等人，Cir Res，73(1993)1202-1207)、心包內(nèi)注射(Fromes等人，Gene Ther，6(1999)683-688)或通過冠狀靜脈回輸(retrofusion)(Boeckstegers等人，Circulation，100(Suppl I)(1999)，I-815)。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、表達(dá)盒或載體可以以含有它們的組合物的形式方便地施用，例如利用促進(jìn)轉(zhuǎn)染心臟細(xì)胞的化學(xué)或生物化學(xué)轉(zhuǎn)移劑。表述“化學(xué)或生物化學(xué)轉(zhuǎn)移劑”是指促進(jìn)核酸進(jìn)入細(xì)胞中的任一化合物?？赡馨栯x子劑，如陽離子脂、肽、聚合物(聚乙烯亞胺、聚賴氨酸)、小顆粒，或非陽離子劑，如非陽離子脂質(zhì)體、非陽離子小顆粒或聚合物，這些試劑本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，尤其在申請WO95/18863、WO 97/18185和WO 98/15639中描述。
另外，本發(fā)明還涉及含有這些多核苷酸、表達(dá)盒或載體的藥物，以及以藥學(xué)有效的量含有它們和藥學(xué)相容的賦形劑的藥物組合物。
這些多核苷酸、表達(dá)盒或載體可方便地用于生產(chǎn)向心臟組織中施用的藥物，它們尤其可表達(dá)編碼目的蛋白質(zhì)的基因，用于治療心臟病，特別是治療和/或預(yù)防心功能不全、缺氧、心臟肥大、心肌炎、心臟局部缺血，或者預(yù)防心臟移植中的排斥。
例如，這種藥物可以含有根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或載體，根據(jù)希望治療的心臟病，它能表達(dá)受損基因的功能形式。
對于可注射的，尤其是心內(nèi)注射的制劑，藥物組合物優(yōu)選地含有藥學(xué)可接受的載體。具體包括等滲、無菌鹽溶液(磷酸一鈉或二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或干燥的，特別是凍干的組合物，視情況不同，它們在加入無菌水或生理鹽水后，即配制成可注射溶液。也可以使用其它賦形劑，如水凝膠。這種水凝膠可以用任何生物相容的和無細(xì)胞毒性的聚合物(同聚物或異聚物)制備。例如在申請WO 93/08845中描述了這些聚合物。其中一些可以作為商品獲得，特別是例如由乙烯和/或環(huán)氧丙烷獲得的?？梢愿鶕?jù)不同參數(shù)調(diào)節(jié)注射用劑量，特別是根據(jù)使用目的(標(biāo)記、病理學(xué)、篩查等)、將要表達(dá)的轉(zhuǎn)基因或希望的表達(dá)時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒通常以104-1014pfu，優(yōu)選地以106-1010pfu的劑量配制和施用。術(shù)語pfu(噬斑形成單位)對應(yīng)于病毒溶液的感染力，通過感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物并測定感染細(xì)胞的噬斑數(shù)來確定。測定病毒溶液pfu滴度的技術(shù)在領(lǐng)域中眾所周知。
另外，本發(fā)明的主題還包括一種表達(dá)具有治療用途的轉(zhuǎn)基因的方法，在該方法中使用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、表達(dá)盒或載體，以使轉(zhuǎn)基因能夠表達(dá)。
此外，本發(fā)明還涉及用如上所述的表達(dá)盒或載體(特別是腺病毒)修飾的任何細(xì)胞。表述“修飾的”細(xì)胞是指含有根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或表達(dá)盒的任何細(xì)胞。這些細(xì)胞可以按照申請WO 95/14785所述的方法植入生物內(nèi)。這些細(xì)胞基本上是人類心臟細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因動物，特別是攜帶上述多核苷酸或表達(dá)盒的小鼠，其中編碼具有治療用途的蛋白質(zhì)的基因被置換為一種報(bào)道基因。這種轉(zhuǎn)基因小鼠可用來根據(jù)對編碼CARP蛋白的基因的調(diào)節(jié)序列的活性篩選分子。
可以對小鼠施用分子，在殺死后制備組織切片，來鑒定用報(bào)道基因染色的組織。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物也是用于了解遺傳性心臟病(如心功能不全、心臟肥大、心臟增生和心肌梗死)分子機(jī)制的分子生物學(xué)研究工具。
例如，用于研究心肌炎的鼠模型，其中編碼干擾素-1(IFN-1)的基因被滅活(Aitken等人，Circulation，90(1994)1-139)。
根據(jù)本發(fā)明的其它目的動物模型可含有根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，它們與轉(zhuǎn)基因(如原癌基因或癌基因)相連接，例如與c-myc連接，形成缺氧模型(Jackson等人，Mol Cell Biol，10(1990)3709-3716)，與p21-ras連接，形成心室肥大模型(Hunter等人，J Biol Chem，270(1995)23176-23178)，為了研究某些心肌病，可含有EB病毒核抗原(Huen等人，J Gen Virol，74(1993)1381-1391)。
根據(jù)另一個實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物形成心臟肥大實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停鼈兒幸环N表達(dá)盒，其中轉(zhuǎn)基因編碼例如鈣調(diào)蛋白(Gruver等人，Endocrinology，133(1993)376-388)、白介素-6或白介素-6受體(Hirota等人，Proc Natl Acad Sci，92(1995)4862-4866)、cardiotrophin-1(Pennica等人，Proc Natl Acad Sci，92(1995)1142-1146)，最后是α-腎上腺素能受體(Milano等人，Proc Natl AcadSci，92(1994)10109-10113)。
另外，經(jīng)過修飾使得CARP基因表達(dá)增強(qiáng)的根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸也是本發(fā)明的一部分。這樣獲得的轉(zhuǎn)基因動物是心肌梗死的實(shí)驗(yàn)工具(Stanton等人，Circul Res，86(2000)939-945)。
為了實(shí)施本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能方便地參考下列手冊“SAMBROOK等人，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊》，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989，或其最新版本之一。
通過下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為這些實(shí)施例是說明性的，并且是非限制性的。


圖1顯示編碼小鼠CARP蛋白的基因上游多核苷酸的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；圖2顯示編碼人CARP蛋白的基因上游多核苷酸的核苷酸序列(SEQ ID NO2)；圖3是質(zhì)粒pXL3634的圖示；圖4是質(zhì)粒pXL3728的圖示；圖5顯示質(zhì)粒pXL3635和pXL3634的相對體外活性，相對于CMV啟動子(pRL-CMV)的參照活性。每種啟動子的活性代表用花蟲(Renilla reniformis)螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化的螢火蟲(Photinus Pyralis)螢光素酶活性。
圖6A是質(zhì)粒pXL3759的圖示；圖6B是腺病毒AV1.0 CARP-luc+的圖示；圖7A顯示對大鼠心內(nèi)透膈注射不同量的質(zhì)粒pXL3031和pXL3634 7天后的螢光素酶活性(pg螢光素酶/心臟)；圖7B顯示對大鼠心臟心內(nèi)透膈注射25μg質(zhì)粒pXL3031和pXL3635、pXL3130和pXL3153 7天后的螢光素酶表達(dá)(pg螢光素酶/心臟)；圖8顯示心內(nèi)施用質(zhì)粒pXL3031、pXL3634、pXL3635、pXL3153和pXL3130后獲得的，隨心臟表達(dá)而變化的心臟內(nèi)螢光素酶表達(dá)與肌肉內(nèi)表達(dá)之比。
實(shí)施例實(shí)施例1CARP基因上游多核苷酸的表征克隆編碼CARP蛋白的小鼠基因5’序列的2.3Kb BamHI-XhoI片段，利用測序酶試劑盒(United States Biochemical，Cleveland，Ohio)通過鏈終止法(Sanger等人，1977，PNAS，74，5463)對兩條鏈進(jìn)行測序。序列示于圖1中，因此在核苷酸-2266與+92之間(相對于轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)+1)含有編碼小鼠CARP蛋白的基因上游的一部分(SEQ ID NO1)。
實(shí)施例2CARP質(zhì)粒載體的構(gòu)建2.1質(zhì)粒pXL3634在實(shí)施例1中表征的2.3Kb BamHI-XhoI片段，在補(bǔ)平BamHI位點(diǎn)后克隆到預(yù)先用XhoI和SmaI消化的質(zhì)粒pGL3-Basic(Promega)中，獲得質(zhì)粒pXL3634。圖3顯示該質(zhì)粒的圖示。
2.2質(zhì)粒pXL3728質(zhì)粒pXL3728由質(zhì)粒pXL3179獲得，后者是一種來源于質(zhì)粒pXL2774(WO 97/10343)的載體，其中導(dǎo)入編碼人成纖維細(xì)胞干擾素信號肽與FGF1(成纖維細(xì)胞生長因子1)cDNA的融合體的基因(sp-FGF1，Jouanneau等人，PNAS 88(1991)，2893-2897)，置于從人巨細(xì)胞早期區(qū)(hCMV IE)獲得的啟動子和SV40病毒晚期區(qū)(GenBankSV4CG)的聚腺苷酸化信號控制下。
在實(shí)施例1中表征的2.3Kb BamHI-XhoI片段，在其末端補(bǔ)平后克隆到預(yù)先用XbaI和EcoRI消化的質(zhì)粒pXL3179(pCOR CMV-FGF)中，獲得質(zhì)粒pXL3728。圖4顯示該質(zhì)粒的圖示。
2.3質(zhì)粒pXL3729將質(zhì)粒pXL3634的EcoRI-SalI片段克隆到預(yù)先用EcoRI-SalI消化的質(zhì)粒pXL3728中，獲得質(zhì)粒pXL3729。
實(shí)施例3比較質(zhì)粒3.1質(zhì)粒pXL3130和pXL3153質(zhì)粒pXL3130和pXL3153分別含有與CMV增強(qiáng)子(-522，-63)偶聯(lián)的人平滑肌α-肌動蛋白啟動子(-680，+30)和小鼠SM22啟動子(-436，+43)，如申請WO 00/18908所述。
3.2質(zhì)粒pXL3635通過PCR從含有較長形式的RSV啟動子(包含于Ad1.0RSVLAcZ中，Stratford-Perricaudet等人，J Clin Invest 90(1992)626-30)的構(gòu)建體中克隆RSV-229，+34啟動子，PCR中使用引物5’-GGC GAT TTAAAT AAT GTA GTC TTA TGC AAT-3’和5’-GGG GTC TAG AAGGTG CAC ACC AAT GTG GTG A-3’，它們分別在PCR片段的5’和3’引入一個SwaI和XbaI位點(diǎn)。然后利用這兩個限制酶切位點(diǎn)將啟動子片段導(dǎo)入pGL3-basic中，產(chǎn)生pXL3635。
3.2質(zhì)粒pXL3031質(zhì)粒pXL3031如Soubrier等人，Gene Ther.6(1999)，1482-8所述。它是一種來源于質(zhì)粒pXL2774(WO 97/10343)的載體，其中導(dǎo)入從pGL3basic(GenBankCVU47295)中獲得的編碼修飾螢火蟲(Photinuspyralis)螢光素酶的luc基因(細(xì)胞質(zhì))，置于從人巨細(xì)胞病毒早期區(qū)(hCMV IE，GenBank HS5IEE)獲得的啟動子和SV40病毒晚期區(qū)(GenBank SV4CG)的聚腺苷酸化信號控制下。
實(shí)施例4細(xì)胞培養(yǎng)建立大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。為此，在CO2飽和的容器中殺死懷孕的大鼠。切開腹部后，取出子宮角，在室溫下用PBS洗滌。從包膜中取出胚胎，切下胎盤(每只大鼠10-12個胚胎)。取出心臟，用ADS/葡萄糖洗滌。在雙目透鏡下，取出心耳和大血管，然后再次用ADS/葡萄糖清洗心臟，只留下心室，并用無菌ADS/葡萄糖漂洗3次。
然后使用終濃度為0.1mg/ml的胰蛋白酶T 4674(Sigma，St Louis，Missouri)，在每個心臟0.3ml ADS/葡萄糖/胰蛋白酶混合物中胰酶消化心臟，37℃20分鐘，其間輕輕攪拌(每分鐘60-100轉(zhuǎn))。
然后吸取上清液，加入1ml去補(bǔ)體的FCS滅活胰蛋白酶。在以1500rpm離心10分鐘后，吸取上清液，心臟細(xì)胞在1ml去補(bǔ)體的FCS中吸收。與此平行地，胰蛋白酶處理步驟重復(fù)5-6次，直到細(xì)胞完全解離。細(xì)胞集合體以1500rpm離心10分鐘，然后用FCS洗滌兩次，最后用柵網(wǎng)濾器過濾細(xì)胞。
然后培養(yǎng)這樣分離的細(xì)胞，對于24孔板而言，濃度為106細(xì)胞/孔，對于12孔板，濃度為2×106細(xì)胞/孔。每孔含有1ml培養(yǎng)基。
在100ml的總體積中，培養(yǎng)基含有68ml DMEM(不含丙酮酸)(Gibco-BRL)、17ml M199(Sigma M4530)、10ml去補(bǔ)體的馬血清(Sigma H6762)、5ml去補(bǔ)體的FCS(Gibco-BRL)和1ml 100×青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺混合物(Gibco-BRL)。
心肌細(xì)胞培養(yǎng)約1天或2天。
實(shí)施例5心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)物用總量等于每孔500ng的DNA共轉(zhuǎn)染，其中含有1ng質(zhì)粒pRL-CMV(Promega Inc.，Madison，WI)，含量在1-100ng之間不等的如上所述的質(zhì)粒pXL3635和pXL3634，適量500ng pUC19。
為此，在終體積為20μl的150mM NaCl和50mM碳酸氫鹽中，質(zhì)?；旌衔锱c6nmol RPR 120535B(Byk等人，J Med Chem.41(1998)229-35)/μg DNA(0.3μl 10mM脂溶液)溫育，然后振蕩混合5秒，再次在室溫下溫育大約20-30分鐘。
然后將該混合物加入250μl無血清培養(yǎng)基中，與細(xì)胞溫育至少2小時(shí)。最后吸出培養(yǎng)基，細(xì)胞在5％CO2和37℃下溫育24小時(shí)至7天。
在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)或48小時(shí)收獲細(xì)胞，用Promega雙發(fā)光試劑盒按照使用說明書分析花蟲螢光素酶和熒火蟲螢光素酶活性?；钚杂肰ictor裝置讀取。
實(shí)施例6多核苷酸體外活性的比較評價(jià)通過大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)物的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在體外評價(jià)CARP多核苷酸(pXL3634)和RSV(pXL3635)啟動子的相對活性，表示相對于質(zhì)粒pRL-CMV的活性(圖5)。
結(jié)果表明，采用的CARP基因(pXL3634)上游的多核苷酸具有極低的體外活性，相對于CMV啟動子約為0.04％。
非特異性強(qiáng)RSV啟動子(pXL3635)的相對活性也較低，分別約為參照CMV啟動子的0.05％和0.68％。
實(shí)施例7腺病毒的構(gòu)建可使在CARP啟動子控制下的螢光素酶表達(dá)的腺病毒按照Crouzet等人(PNAS，94(1997)1414-1419)的方法構(gòu)建，表達(dá)盒與質(zhì)粒pXL3634的相同(圖3)。
允許在大腸桿菌中重組的穿梭載體通過兩個階段構(gòu)建。首先，向pXL3474(用ScaI和BglII消化)的ITR-Ψ區(qū)與pIX之間導(dǎo)入CARP啟動子(片段用Klenow補(bǔ)平的XhoI/BamHI)，產(chǎn)生質(zhì)粒pXL3758。然后向BstBII(用Klenow補(bǔ)平)和BstEII消化的pXL3758中導(dǎo)入含有螢光素酶cDNA和SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)的片段(pXL3634的用Klenow補(bǔ)平的BamHI片段/BstEII)，產(chǎn)生pXL3759。圖6A是pXL3759的圖示。
在大腸桿菌中的同源雙重組如上所述完成，針對含有ΔE1/ΔE3腺病毒基因組的質(zhì)粒pXL3215，其中向E1區(qū)內(nèi)導(dǎo)入了一個RSV-LacZ表達(dá)盒。質(zhì)粒pXL3215是質(zhì)粒pXL2689的衍生物，它含有質(zhì)粒RK2的復(fù)制起點(diǎn)，四環(huán)素抗性基因(Crouzet等人，PNAS，1997)。這種雙重組的產(chǎn)物，質(zhì)粒pXL3778，通過表達(dá)盒測序驗(yàn)證。為了釋放線性病毒基因組，在用PacI酶切后，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Per.C6細(xì)胞系(WO97/00326)，產(chǎn)生病毒AV1.0CARP-Luc+。
也通過限制酶切分析、表達(dá)盒測序證實(shí)該病毒，并通過與探針Ψ雜交檢驗(yàn)RCA E1+(復(fù)制型腺病毒)顆粒的存在。
高病毒滴度的原種如下獲得在Per.C6系中擴(kuò)增病毒，用CsCl梯度純化病毒顆粒。通過層析獲得該病毒的滴度，單位為病毒顆粒/ml(vp/ml)，其體外活性如下檢測在感染骨骼肌或心肌細(xì)胞后，滴定螢光素酶活性，并與作為對照的含CMV啟動子的病毒相比較。
實(shí)施例8體內(nèi)DNA注射以1ml/kg經(jīng)腹膜內(nèi)途徑注射，用氯胺酮(70mg/ml)/賽拉嗪(6mg/ml)混合物麻醉體重為200g的CD SPRAGUE大鼠。
在剖腹手術(shù)后，用100μl Hamilton玻璃注射器經(jīng)透膈途徑進(jìn)行心肌內(nèi)注射，該注射器與Steriflex導(dǎo)管(ref.167.10 G19 V)相連，具有一個終止凸緣，頂端為BD 26G*3.8針頭(短刃)。
50μl DNA溶液用0.9％NaCl配制，注射5秒鐘以上。
殺死動物后，取出心臟，用0.9％NaCl溶液漂洗，肉眼觀察。然后利用勻漿器(Ultra-thurax，Diax600 Heidolph)，在試劑盒所帶的含蛋白酶抑制劑(CΦmpleteTM，Roche Diagnostics)的裂解緩沖液中研磨，并在4℃下以4000rpm離心20分鐘，之后用試劑盒(Promega E151A)分析螢光素酶活性。用裝置LUMAT LB 9501(10μl上清液+50μlPromega螢光素酶底物)讀數(shù)。應(yīng)用Mir等人(PNAS 96(1999)，4262-4267)所述的校準(zhǔn)，將螢光素酶活性轉(zhuǎn)化為每個心臟的螢光素酶質(zhì)量(pg螢光素酶/心臟)。
此外，心臟也在3.7％低聚甲醛中固定，并通過免疫組化分析FGF-1的表達(dá)。
實(shí)施例9CARP多核苷酸的體內(nèi)活性的比較評價(jià)圖7A匯集的結(jié)果表明，在注射劑量逐漸升高的1、5、25和125μg質(zhì)粒pXL3031和pXL3634之后獲得的螢光素酶表達(dá)水平?jīng)]有顯著不同，從而清楚地證實(shí)，CRAP基因上游多核苷酸能誘導(dǎo)高水平的表達(dá)，與強(qiáng)啟動子如CMV相當(dāng)。
另一方面，用另一種強(qiáng)病毒啟動子RSV啟動子(pXL3635)獲得的表達(dá)弱于用CMV啟動子或CARP基因上游多核苷酸獲得的表達(dá)(圖7B)。
另外，盡管證實(shí)在平滑肌細(xì)胞啟動子(SMα-肌動蛋白，pXL3130，或SM22，pXL3153)上游添加CMV增強(qiáng)子在體外非常有效(WO00/18908)，但在體內(nèi)在心臟細(xì)胞中似乎無效。
實(shí)施例10CARP多核苷酸表達(dá)特異性的評價(jià)通過心內(nèi)透膈注射對大鼠施用各25μg質(zhì)粒pXL3634、pXL3435和pXL3031。
與此平行地，向小鼠組顱頸肌中肌內(nèi)注射10μg這些質(zhì)粒，進(jìn)行或不進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。
注射7天后如(PNAS 96(1999)，4262-4267)所述分析螢光素酶的表達(dá)。
心臟中的螢光素酶表達(dá)水平相對于在顱頸肌中觀察到的水平表示，匯集于圖8中。
結(jié)果清楚地表明，CARP基因上游的多核苷酸和CMV啟動子是僅有的兩種能夠在心臟組織中誘導(dǎo)最高表達(dá)的啟動子。然而，使用CMV啟動子時(shí)，心臟/肌肉表達(dá)比為1，而在使用CARP基因上游多核苷酸時(shí)，這一比值接近100，這清楚地表明后者對心臟組織的極高選擇性。
相對于含有平滑肌細(xì)胞特異的增強(qiáng)子和啟動子(如編碼蛋白質(zhì)SM-22和肌動蛋白的基因的)的其它構(gòu)建體，該多核苷酸的表達(dá)特異性優(yōu)勢明顯，為了說明起見，在圖8中也顯示了其心臟/肌肉表達(dá)比。
序列表序列表<110>AVENTIS PHARMA SATHE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA<120>CARP基因上游序列，含有該序列的載體及其用途<130>CART<140>ST00033<141>2000-12-05<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2358<212>ADN<213>Mus musculus<400>1ggatcctttc atgtttaaca atatcaaccc taacccaagg ggaacagcct gcctgacagt 60ggctttgcca cccatgaata cttcctagtc tagtccgttt gtgaaactca gcccatccca 120acacttctgc aagccccatc ctctacaagg tgctcattgg gaatttcctg gagcttctct 180ttcaggatca gcctgattct agggcagcag ttctcaacct gggggcctcg acccctttgg 240gggaatcaaa cgacccttta caggggtcac atatcatcta tcctatatgt caggtattta 300cattacgatt cgtaacagta gcaaaattac aggtatgaaa tagcaatgaa ataattttat 360gattgaaggt caccacaaca tgaggccgcc acactgttct agagaaaaat cacctgggtg 420gggaaaggtt tgggaaagcc tttctgtcca ttcttcattc ttcaaagtga tgtgttcaca 480gaaagccttt cagctgttct gctggggctc ttagtaagtc tgagtaggaa ctgtatgtac 540caggtctgct tcttatgggt ggagccaaga cgcatcgtgg gtggagcgaa gacgcaacct 600caccttctag ctctgcatcc atagcaagta gcctaatgtt tctgtgtcta ggtgtcatct 660ctgtgaatcg agatccttgg ccttgcttga attagggagg cacaaaatac tcagagattc 720aagactgctc agcagcccag agtccttcct caaaggaaag gtctcaactc tcagcccccc 780ttagctctga gtcaggcctg gaacaaacgg ccacaggaat gagaaaagct gccatagctg 840cttgtcactt caagaggtca aagaaaatag tgttaaccat gaaaacgaga agaccaacag 900ttatccattg atagcgtctc aggacagata ggacagagag aacactagga gaggggaacc 960cacgaaggac aaggtattag tgtgttggtt ttcagggcaa tgtcttgtac tgaagattct 1020agaaacacaa tttgctggtt gaacagctga agtggggtgg gggttcttac cccatgttca 1080tggaagggtg agtgaggaga gacagatata tgatggccag cataacaaac atacacaaca 1140ccctaattaa cacttccctc ttctactgac acccccttca ctctcctctt tcataaaaaa 1200taaaaaaagt attttatgtg gctcttacga tagaatcttt cctcgaacta taaaaagatc 1260taaatattta tatttttcac attttaatat cttagcgatg acaagccaga aacaagtatt 1320ttttgcctct ctcaacagca aagcttgggg cctttttgtt tccgtgttag gaatagaaca 1380cgagagcccc gtgtatctag gcagatgctc tatcattagc ccatgagtct ccagcctcag 1440acgcacattt ttctcgggct ctcttaagct tttcccacag cattgggaaa ctttactgac 1500agcatccaag ttgtgcttct gctaagaact ggactcacat ctctctgtgc atcacttcgg 1560cccgttttgg ggtagatcct ctgattagcc ttcagattta gaacacggtg agcctgtggt 1620gcactaatta tggccagtga caccatagag tcaaagtgca ttactgaatg ctttcaattt 1680ctcctaatgc tggtacgatg gcatgtcaca gggccatttt agctgcagac atcactccag 1740agaattccaa acagatagag acaagtggca cccagaccca tctccttccc ctcgggctga 1800ttatccccag aaataggatg tcccaaagca acacttccca gccaactgga gtgctgataa 1860gtccagttat cagaaagata tggctgtaag tgtgatgcac agtgcttgca ttttcttgat 1920acgttagtca tatgagagct gacaaagaag gaaaaagagc agcgatgtgg tgcaatatta 1980acaggcagct gtcccctggc ttcccgatac gtgggatgac tcgcattgct gagcggtgtg 2040gtcactgcca aaggaatgac cctctcacat ttcttcctga ttcgcatacg ccgcggccag 2100cttgtcatct ccctcttggg cttcccagac actaagtctg gaatgaaaat tcacctgcct 2160ctgaattggc cactggtggg ggcaggggtg tgacttggct tcccaggctg gaagattatc 2220tcacccagcc ctagctatat aacgggctgg tgtggagggg ctccacaggg ccagttccag 2280gggttcatcc acaagagaga aaaacataga ctcgaggtct agggagcttg catgcctgca 2340ggtcggaggc caccatgg 2358<210>2<211>2074<212>ADN<213>Homo sapiens<400>2ctgcagcaag ttacttaatg ttttttgcct cagcatcctc tctgtaaaat gagagcatta 60gtcttgctcc aacttcgagg gcatggacag ctctgggatt tcatatccaa gacccttaaa 120catcccacag tccttccccc aaacacttct cctcctaata cctccctcag tttgggtcag 180gcctggaaca aaaaggcata cgaaatggta gaaaaagtgt ccatgactac ttctgactta 240gatgaagaga ccaatgaaaa tagtaatgac tctgtttgct tcagcaggac atatactaaa 300ataggagcta tacaaagaag attagcatgg actctgtgca agaatgacac acaaatttgt 360gaaacattcc atatattaaa aataaataaa taataaagag aaaaggaaaa aattaaaaag 420aaaatagtga tagctgtgtc catctcaaag aaaagcccag gagatttcct ttatttaccc 480cctttaagat agaatattag gagaccggaa catatgatac aggaggtact gggagggtcc 540ctctttgtca atgttttgtc ttggggtggg gagtcgatgt cttctcaaag tttcagaaac 600accatccact gactgagcat tcaaggggca agaggagaat ggcagccaca tttgttgatt 660gggtgagttt ggggagaaat agacacacaa aggtcaaaca taacttccta attaacactt 720ccctccattc acaattccct tctcccattc ttctctcctg tcttttacts akaraaaccc 780agtttttcct gaaactataa aaataccccc agtatgttta cataatttac acctcaaaga 840ttagaaacca gaaatagaga ccttttcaac ccttccggaa gcaaagtgca ttatccctcc 900agccacgtgt ctcaaatctt gatgcatcag aatcatctgg gtgctttkaa attcaagatg 960attcctacga gttaccataa atcaactcag aattccctgg agtggggcca gggatctgta 1020tttctgacaa gctcccacag gtgattcctt tccccacagc atttgagaac ttcagctcaa 1080tgacctaatc agagtcctgc cattgctaat atctggtctc atttttbtca tatatatata 1140tagtatttgt ggtagagatg ggattttgcc atgttgccca ggctagtatt gaactcctaa 1200gctaagcaat cttcctgtct ctgcctccca aaatgttggg attacaggtg taagccactg 1260cacccggctg atagctggtt tcatttactc tatttcttga ccactctgat ccattttgaa 1320gtaaaaatgc tccaattatt atgctgtttt agaacacggt aagcatgtca tgtgctaatg 1380gccagtgaca tcataaaaga aaagtgcatt actgaatgct ttcaatgtct tataatgatg 1440gtaaggtggc atgtcatggg gcctatttag cccagacatc actccaaaga attccaaaca 1500gatatagaca agtgccttta gggcccagat cccttcccct caggctgttt acccagggaa 1560taggatgtcc tgggacaagt ttcccctaag tgaagtgttg ataagtctgc ttatcagaaa 1620gatattactg ggggtgtgat atgtagggca tctacatttt cttgataggt agtcatatga 1680aagctgacaa agaaaaaaag ggcagtgatg tggtgcaatg tcaacagaca gctgtcccct 1740gactcttgac aaataggatg acttgcattg ctgagcgatg tgatcaccac caaaggaatg 1800gccctctcac atttcttcct gattcacata ttcagcaggg ttagcttgtc ctcccctccc 1860tcttcagctt cccagacact gagtctggaa tgaaaattca cctgcctctg agttggctcc 1920taatgggggc gggagtgtta cttcggttcc caggttggaa gattatctca cccggcccca 1980gctatataag ctgaccggtg tggaggggcc cagcagggcc aactccaggg attccttcca 2040cgacagaaaa acatacaaga ctccttcagc caac 2074<210>3<211>750<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Met Gly Glu Thr Leu Gly Asp Ser Pro Ile Asp Pro Glu Ser Asp Ser1 5 10 15Phe Thr Asp Thr Leu Ser Ala Asn I1e Ser Gln Glu Met Thr Met Val20 25 30Asp Thr Glu Met Pro Phe Trp Pro Thr Asn Phe Gly Ile Ser Ser Val35 40 45Asp Leu Ser Val Met Glu Asp His Ser His Ser Phe Asp Ile Lys Pro50 55 60Phe Thr Thr Val Asp Phe Ser Ser Ile Ser Thr Pro His Tyr Glu Asp65 70 75 80Ile Pro Phe Thr Arg Thr Asp Pro Val Val Ala Asp Tyr Lys Tyr Asp85 90 95Leu Lys Leu Gln Glu Tyr Gln Ser Ala Ile Lys Val Glu Pro Ala Ser100 105 110Pro Pro Tyr Tyr Ser Glu Lys Thr Gln Leu Tyr Asn Lys Pro His Glu115 120 125Glu Pro Ser Asn Ser Leu Met Ala Ile Glu Cys Arg Val Cys Gly Asp130 135 140Lys Ala Ser Gly Phe His Tyr Gly Val His Ala Cys Glu Gly Cys Lys145 150 155 160Gly Phe Phe Arg Arg Thr Ile Arg Leu Lys Leu Ile Tyr Asp Arg Cys165 170 175Asp Leu Asn Cys Arg Ile His Lys Lys Ser Arg Asn Lys Cys Gln Tyr180 185 190Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Ser His Asn Ala Ile195 200 205Arg Phe Gly Arg Met Pro Gln Ala Glu Lys Glu Lys Leu Leu Ala Glu210 215 220Ile Ser Ser Asp Ile Asp Gln Leu Asn Pro Glu Ser Ala Asp Leu Arg225 230 235 240Ala Leu Ala Lys His Leu Tyr Asp Ser Tyr Ile Lys Ser Phe Pro Leu245 250 255Thr Lys Ala Lys Ala Arg Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys260 265 270Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp275 280 285Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu290 295 300Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala305 310 315 320Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn325 330 335Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu340 345 350Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu355 360 365Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu370 375 380Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val385 390 395 400Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile405 410 415Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys420 425 430Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln435 440 445Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu450 455 460Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu465 470 475 480Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu485 490 495Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr Ala Trp Ala Ile Leu Thr Gly500 505 510Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu515 520 525Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln530 535 540Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe545 550 555 560Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile565 570 575Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys580 585 590Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn595 600 605Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu610 615 620Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys625 630 635 640Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp645 650 655Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly660 665 670Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln675 680 685Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser ger Gln Leu690 695 700Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr705 710 715 720Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met725 730 735Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr740 745 750
權(quán)利要求
1.多核苷酸，其特征在于它含有CARP蛋白基因編碼部分上游的具有序列SEQ ID NO1的序列片段，或在高嚴(yán)格條件下可與該序列雜交的序列，該多核苷酸能夠誘導(dǎo)與該多核苷酸有效連接的基因在心臟細(xì)胞中特異性體內(nèi)表達(dá)。
2.多核苷酸，其特征在于它顯示與序列SEQ ID NO1至少有93％的同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其特征在于該片段包含于位于小鼠CARP蛋白基因的核苷酸-2266與+92之間的序列中(SEQ IDNO1)。
4.表達(dá)盒，其特征在于它含有編碼具有治療用途的蛋白質(zhì)或RNA的序列，它置于如權(quán)利要求1-3中任一所述的DNA序列控制下。
5.表達(dá)盒，其特征在于它含有編碼具有治療用途的蛋白質(zhì)或RNA的序列，它置于與序列SEQ ID NO2至少有80％序列同一性的DNA序列控制下。
6.根據(jù)權(quán)利要求4和5任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其特征在于該蛋白質(zhì)或該RNA能夠激活心臟細(xì)胞的生長，降低或抑制免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)血管形成，矯正肌肉收縮性、心臟肥大、心功能不全和心肌炎。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其特征在于這種具有治療用途的蛋白質(zhì)是包括VEGF、FGF、angiopoietin和細(xì)胞因子的家族的一種蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其特征在于這種具有治療用途的蛋白質(zhì)是一種激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其特征在于這種具有治療用途的蛋白質(zhì)是一種免疫抑制蛋白，如白介素-10、白介素-2和白介素-8。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其特征在于具有治療用途的RNA是一種反義RNA，它能控制心臟細(xì)胞中的基因表達(dá)或阻斷mRNA轉(zhuǎn)錄。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-6的表達(dá)盒，其特征在于該蛋白質(zhì)是一種減少缺氧的試劑，選自NOS(氧化氮合成酶)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶。
12.載體，其特征在于它含有根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多核苷酸。
13.載體，其特征在于它含有根據(jù)權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)的表達(dá)盒。
14.載體，其特征在于它含有一個在心臟細(xì)胞中有效的復(fù)制起點(diǎn)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的載體，其特征在于它是一種質(zhì)粒、粘?；蛭幢徊《景鼩さ娜魏我环NDNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求12和14任一項(xiàng)的載體，其特征在于它是一種重組病毒，選自腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺伴隨病毒或其衍生物。
17.組合物，其特征在于它含有根據(jù)要求12-16中任一項(xiàng)的載體。
18.組合物，其含有根據(jù)要求12-16中任一項(xiàng)的載體和化學(xué)或生物化學(xué)轉(zhuǎn)移劑。
19.藥物，其特征在于它含有根據(jù)要求12-16中任一項(xiàng)的載體。
20.藥物組合物，其特征在于它含有有效量的多核苷酸或根據(jù)要求1-3和12-16中任一項(xiàng)的載體。
21.根據(jù)要求1-3中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)要求12-16中任一項(xiàng)的載體在生產(chǎn)用于治療心功能不全的藥物中的用途。
22.根據(jù)要求1-3中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)要求12-16中任一項(xiàng)的載體在生產(chǎn)用于治療心臟肥大的藥物中的用途。
23.根據(jù)要求1-3中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)要求12-16中任一項(xiàng)的載體在生產(chǎn)用于治療缺氧的藥物中的用途。
24.根據(jù)要求1-3中任一項(xiàng)的多核苷酸或根據(jù)要求12-16中任一項(xiàng)的載體在生產(chǎn)用于預(yù)防心臟移植排斥的藥物中的用途。
25.轉(zhuǎn)基因動物，其特征在于它攜帶根據(jù)要求1-3中任一項(xiàng)的多核苷酸，其中編碼具有治療用途的蛋白質(zhì)的基因被置換為一種報(bào)道基因。
26.在體內(nèi)表達(dá)具有治療用途的基因的方法，其特征在于a)分離根據(jù)要求12-16中任一項(xiàng)的載體，和b)在允許目的基因表達(dá)的條件下，向心臟組織中導(dǎo)入有效量的該載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及新啟動子序列，它們來源于CARP蛋白(心錨蛋白重復(fù)蛋白)基因編碼序列上游的一部分，能夠控制轉(zhuǎn)基因在心肌細(xì)胞中體內(nèi)表達(dá)的水平和特異性。本發(fā)明描述了新組合物、構(gòu)建體、載體及其在向心肌細(xì)胞中體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達(dá)核酸中的體內(nèi)用途。本發(fā)明的主題也包括啟動子序列在生產(chǎn)作為研究某些心臟病的模型的轉(zhuǎn)基因動物中的用途。
文檔編號A61K48/00GK1483040SQ01821309
公開日2004年3月17日 申請日期2001年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月7日
發(fā)明者B·施沃茨, D·布拉乃爾萊克, K·奇恩, 陳炬, P·貝諾伊特, B 施沃茨, 狄撂, 碩 晨 申請人:甘瑟爾股份有限公司, 加利福尼亞大學(xué)董事會