專利名稱：佐劑組合制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨烷基葡糖胺磷酸鹽化合物、其衍生物或類似物的使用；與細(xì)胞因子或淋巴因子，特別是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子或白細(xì)胞介素-12組合，作為抗原性或免疫原性組合物中的佐劑本文，以提高脊椎動(dòng)物宿主對(duì)所選抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)使用多種機(jī)制攻擊病原體。然而，在免疫接種后并不是所有這些機(jī)制都必須激活。免疫接種誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫力依賴于免疫原性組合物引起適當(dāng)免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力，以抵抗或消除病原體。取決于病原體，這也許需要細(xì)胞介導(dǎo)的和/或體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。
目前輔助T細(xì)胞在免疫應(yīng)答反應(yīng)中的作用的范例是，T細(xì)胞可根據(jù)它們產(chǎn)生的細(xì)胞因子分成亞群，在這些細(xì)胞中觀察到的不同細(xì)胞因子分布決定了它們的功能。這種T細(xì)胞模式包括兩個(gè)主要的亞群產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2(IL-2)和干擾素γ的TH-1細(xì)胞，它們?cè)鰪?qiáng)細(xì)胞和體液(抗體)免疫應(yīng)答反應(yīng)；以及產(chǎn)生白細(xì)胞介素-4，白細(xì)胞介素-5和白細(xì)胞介素-10(分別是IL-4，IL-5，IL-10)的TH-2細(xì)胞，它們?cè)鰪?qiáng)體液免疫應(yīng)答反應(yīng)(參考文獻(xiàn)條目1)。
常常需要提高抗原的免疫源性能力以在被免疫生物中獲得更強(qiáng)的免疫應(yīng)答并增強(qiáng)宿主對(duì)抗原攜帶因子的抵抗力。在一些情況下，需要使免疫應(yīng)答反應(yīng)從體液(TH-2)應(yīng)答占主導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)楦胶獾募?xì)胞(TH-1)和體液(TH-2)應(yīng)答反應(yīng)。
細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)包括產(chǎn)生CD8+CTL(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)反應(yīng)。這種應(yīng)答對(duì)于免疫原性組合物抗細(xì)胞內(nèi)病原體發(fā)展是需要的?？垢鞣N病原體的保護(hù)力要求強(qiáng)粘膜應(yīng)答反應(yīng)，高血清滴定度，CTL誘導(dǎo)和強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。這些應(yīng)答反應(yīng)不能由大部分抗原制品所提供，包括傳統(tǒng)的亞基免疫原性組合物。這些病原體之一是人類免疫缺陷性病毒(HIV)。
因此，需要開發(fā)能在脊椎動(dòng)物宿主中產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的抗原組合物制劑。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的之一是在含氨烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)的抗原組合物或其衍生物或類似物中使用佐劑組合制劑，與細(xì)胞因子或淋巴因子組合，特別是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或白細(xì)胞介素-12(IL-12)、或上述細(xì)胞因子或淋巴因子激動(dòng)劑或拮抗劑。尤其，AGP是2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]乙基2-脫氧-4-氧-磷?；?3-氧-[(R)-3-十四酰氧十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]-β-D-吡喃(型)葡萄糖苷，也稱為529(以前稱為RC529)。
佐劑是與免疫原或抗原一起給予時(shí)能增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)。本發(fā)明的佐劑制劑與選定的抗原一起在抗原性或免疫原性組合物中給予。本發(fā)明的抗原組合物能增強(qiáng)脊椎動(dòng)物宿主對(duì)所選抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)。所選的抗原也許是多肽，肽或(1)衍生自致病性病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲的片斷，或(2)衍生自癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的片斷，或(3)衍生自過敏原的片斷以干擾IgE的生成從而調(diào)節(jié)對(duì)過敏原的過敏反應(yīng)，或(4)衍生自淀粉樣前體蛋白的片斷以預(yù)防或治療脊椎動(dòng)物宿主中特征為淀粉樣沉積性疾病。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，選定的抗原來自HIV。該選定的HIV抗原也許是HIV蛋白、多肽、肽或上述蛋白的片斷。在本發(fā)明的一個(gè)特別實(shí)施方案中，HIV抗原是特異性肽。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該選定抗原是β-淀粉樣肽(也稱為Aβ肽)，這是淀粉樣前體蛋白(APP)的內(nèi)部39-43氨基酸片斷，經(jīng)β和γ分泌酶對(duì)APP加工而產(chǎn)生。
AGP可作為水溶液或穩(wěn)定化的水包油乳劑(穩(wěn)定的乳劑或SE)存在。在本發(fā)明一較佳實(shí)施方案中，該水包油乳劑含鯊烯、甘油和磷脂酰膽堿。在SE配制中，在給予前將ACG與細(xì)胞因子或淋巴因子混合以形成抗原組合物。在本發(fā)明一較佳實(shí)施方案中，AGP是SE形式。該抗原組合物還包括稀釋劑或載體。
本發(fā)明還涉及提高含有所選抗原的抗原組合物能力的方法，所選定抗原(1)來自致病病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲以誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物宿主的免疫應(yīng)答，或(2)來自癌抗原或來自癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的腫瘤相關(guān)抗原以誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物宿主的治療或預(yù)防性抗癌作用，或(3)來自過敏原以干擾IgE的生成從而調(diào)節(jié)對(duì)過敏原的過敏反應(yīng)，或(4)來自宿主以不良方式、數(shù)量或位置產(chǎn)生(自體分子)的分子或蛋白質(zhì)，通過包含有效輔佐劑量的細(xì)胞因子或淋巴因子的組合種減良作用，具體是AGP與GM-CSF或IL-12、或上述細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑或拮抗劑組合。
本發(fā)明還涉及提高含有選定抗原的抗原組合物能力的方法，所選定抗原來自致病病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲，通過包含有效輔佐劑量的細(xì)胞因子或淋巴因子的組合在脊椎動(dòng)物宿主中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，具體是APG與GM-CSF或IL-12、或上述細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑或拮抗劑組合。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了以如物質(zhì)免疫接種轉(zhuǎn)基因小鼠的抗Aβ1-42肽抗體的幾何平均滴度組1-Aβ1-42肽加PBS(沒有顯示)；組2-Aβ1-42肽加MPLTMSE(正方形)；組3-Aβ1-42肽加MPLTMSE和GM-CSF(三角形)；組4-Aβ1-42肽加529 SE和GM-CSF(倒三角形)。
圖2描述了用圖1所述四組物質(zhì)免疫接種轉(zhuǎn)基因小鼠的總Aβ皮質(zhì)水平。
圖3描述了用圖1所述四組物質(zhì)免疫接種轉(zhuǎn)基因小鼠的Aβ1-42肽皮質(zhì)水平。
圖4描述了用圖1所述四組物質(zhì)免疫接種轉(zhuǎn)基因小鼠的前皮層淀粉樣負(fù)擔(dān)。
圖5描述了用圖1所述四組物質(zhì)免疫接種轉(zhuǎn)基因小鼠的前皮層神經(jīng)炎負(fù)擔(dān)。
圖6描述了在如圖1所述四組物質(zhì)免疫接種轉(zhuǎn)基因小鼠中的后夾肌皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞增生水平。
圖7描述了兩組獼猴短尾猿(每組四只動(dòng)物)血清HIV C4(E9V)-V389.6P肽-特異性IgG抗體滴定度的幾何平均值。組1動(dòng)物只用C4(E9V)-V389.6P肽鼻內(nèi)免疫。組2動(dòng)物用C4(E9V)-V389.6P肽與529 SE和GM-CSF作肌肉內(nèi)免疫。箭頭表示在0、4、8、18和23周時(shí)免疫接種。
圖8描述了圖7所述相同動(dòng)物子宮頸陰道灌洗液樣品的抗體滴度幾何平均值。
圖9描述了圖7所述相同動(dòng)物洗鼻液樣品的抗體滴度幾何平均值。
發(fā)明詳述佐劑、細(xì)胞因子和淋巴因子是免疫調(diào)節(jié)化合物，能夠提高和操縱對(duì)本身免疫原性弱的各種抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)展和分布。適當(dāng)選擇佐劑、細(xì)胞因子和淋巴因子可誘導(dǎo)在缺乏佐劑、細(xì)胞因子和淋巴因子時(shí)不發(fā)展的良好體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。特別是，佐劑、細(xì)胞因子和淋巴因子在增強(qiáng)對(duì)免疫原性組合物中的亞基和肽抗原免疫應(yīng)答反應(yīng)上有顯著效果。它們的刺激活性也有利于對(duì)蛋白抗原的抗原-特異免疫應(yīng)答的發(fā)展。對(duì)于各種需要強(qiáng)粘膜應(yīng)簽、高血清滴度、CTL誘導(dǎo)和強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的抗原、佐劑及細(xì)胞因子/淋巴因子組合提供了大多數(shù)抗原制品不能提供的刺激。
許多研究在動(dòng)物模型中評(píng)估了不同的佐劑制劑，但鋁(氫氧化鋁或磷酸鋁)是目前唯一得到許可廣泛應(yīng)用于人類的佐劑。另一個(gè)佐劑是StimulonTMQS-21(QS-21)(Antigenics Inc.，F(xiàn)ramingham，MA(2))。一組佐劑、穩(wěn)定的乳劑、含多種油包水或水包油組合，由于它們的免疫增強(qiáng)能力已受到了相當(dāng)注意。這些制劑通常由可代謝的或惰性油的各種組合構(gòu)成，這些油的作用是在注射處穩(wěn)定和貯存抗原。一種這樣的佐劑是包含礦物油、水和乳化劑的不完全弗氏佐劑(IFA)。完全弗氏佐劑(CFA)是IFA加上熱-殺死分枝桿菌。特別注意的是使用這類佐劑可引起注射部位相關(guān)刺激，常常引起單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致肉芽腫損害。因此，正在研究可作為潛在佐劑的其他化合物和制劑。
一組此類化合物是氨烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGPs)，在美國(guó)專利號(hào)6,113,918中有所描述，例如第2列，14行至第3列，38行，將其納入本文參考文獻(xiàn)中(3)。AGPs具有氨烷基(苷元)團(tuán)通過糖苷鍵連接于2-脫氧-2-氨基-α-D-吡喃(型)葡萄糖(葡糖胺)形成基本結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步取代包括葡糖胺環(huán)4或6位碳的磷酸化和3個(gè)3-烷酰氧?；鶜埢?。
一種AGP是命名為529(化學(xué)全稱是2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]乙基2-脫氧-4-氧-磷?；?3-氧-[(R)-3-十四酰氧十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]-β-D-吡喃(型)葡萄糖苷)的化合物，由Corixa生產(chǎn)(Hamilton，MT)。
Corixa也可配制一種可代謝的水包油制劑，當(dāng)與529混合時(shí)，形成命名為529SE的穩(wěn)定化乳劑。此穩(wěn)定化乳劑通過用鯊烯油、甘油和磷脂酰膽堿顯微流化529而產(chǎn)生。目前的制劑是GMP-合格的微流化乳劑。含1％油(盡管其它濃度也使用)的乳劑將在以下實(shí)驗(yàn)中描述。
當(dāng)529 SE皮下給予Balb/c或Swiss-Webster小鼠時(shí)，不產(chǎn)生可辨別的總體組織病理。還制備了含相同成分但沒有529的穩(wěn)定化乳劑作比較。具體說，皮下免疫接種40個(gè)氨基酸的HIV肽T1SP10MN(A)的半胱氨酸缺失的39個(gè)氨基酸(40個(gè)氨基酸的肽(+Cys)其17位處半胱氨酸缺失)，或Aβ1-42(APP的內(nèi)部42氨基酸片斷)，各自與佐劑529 SE和GM-CSF組合配制，不產(chǎn)生可辨別的炎癥、紅腫、腫脹或硬結(jié)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括529和其它AGPs的衍生物及類似物。這些化合物包括，但不限于在美國(guó)專利號(hào)6,113,918中描述的化合物(3)。
將細(xì)胞因子和淋巴因子摻入到免疫原性組合物中顯示出能擴(kuò)增和提高該免疫原性組合物能力的良好前景(4)。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-12(IL-12)證明可激發(fā)和增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)免疫力，是通過將輔助T細(xì)胞亞群的擴(kuò)增轉(zhuǎn)變?yōu)門h1細(xì)胞因子分布類型(也就是在小鼠模式中向IgG2a亞類轉(zhuǎn)變)(5-7)。在小鼠中，重組鼠IL-12顯示能提高Th1占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答類型(4)。
IL-12由多種抗原呈遞細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生。它是誘導(dǎo)原初T細(xì)胞成為TH1細(xì)胞的關(guān)鍵要素。產(chǎn)生IL-12或?qū)λ鼞?yīng)答的能力，顯示在保護(hù)性TH1類型應(yīng)答的發(fā)展中起關(guān)鍵作用(例如，在寄生蟲感染中，最著名的是利什曼病(8))，也增強(qiáng)對(duì)病原性細(xì)菌或病毒(9)、或癌細(xì)胞抗原(10)的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答。IL-12的作用很大程度上由NK細(xì)胞和輔助T細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-γ所介導(dǎo)。干擾素-γ對(duì)于誘導(dǎo)抗T-依賴性蛋白抗原的IgG2a抗體和抗T-不依賴性抗原的IgG3應(yīng)答是關(guān)鍵的(12)。IL-12原來稱為自然殺傷細(xì)胞刺激因子，是一種異二聚體細(xì)胞因子(13)。在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)和分離IL-12蛋白在出版的國(guó)際專利申請(qǐng)WO90/05147中有所描述(14)。
另一有潛在希望作為佐劑的細(xì)胞因子是GM-CSF。GM-CSF是一類特殊的集落刺激因子(CSF)。CSFs是一個(gè)在骨髓中發(fā)現(xiàn)的能誘導(dǎo)祖代細(xì)胞分化成特殊種類的成熟血細(xì)胞的淋巴因子家族。如美國(guó)專利號(hào)5,078,996中描述(15)，將其納入本文參考文獻(xiàn)中，GM-CSF活化巨噬細(xì)胞或前體單核細(xì)胞而介導(dǎo)了非特異性腫瘤殺傷活性。編碼人GM-CSF基因的核苷酸序列已有描述(15)。已將含GM-CSF cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并保存在美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，編號(hào)39900。如美國(guó)專利號(hào)5,229,496描述(16)，將其納入本文參考文獻(xiàn)中，也已將GM-CSF基因插入酵母表達(dá)質(zhì)粒并保存于ATCC編號(hào)53157。另外，如美國(guó)專利號(hào)5,073,627描述(17)，將其納入本文參考文獻(xiàn)中，已取得編碼含有糖基化位點(diǎn)的GM-CSF的DNA序列，保存在ATCC編號(hào)67231。
GM-CSF顯示能上調(diào)抗原呈遞細(xì)胞上的已知能增強(qiáng)免疫應(yīng)答的蛋白分子(18)，并影響經(jīng)分揀純化的小鼠B細(xì)胞的Ig分泌(19)。也報(bào)道GM-CSF可用作免疫原組合物的佐劑。
其它細(xì)胞因子或淋巴因子顯示有免疫調(diào)節(jié)活性，包括但不限于白細(xì)胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，干擾素-α、β和γ，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子及腫瘤壞死因子α和β。
與細(xì)胞因子或淋巴因子全身給藥相關(guān)的問題是與細(xì)胞因子或淋巴因子活性相關(guān)的生物學(xué)結(jié)果。此外，如果能保持細(xì)胞因子或淋巴因子的局部濃度，應(yīng)能增強(qiáng)細(xì)胞因子或淋巴因子輔助產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的效果。
已評(píng)價(jià)了組合3-氧-脫酰單磷酰脂質(zhì)A或單磷酰脂質(zhì)a與GM-CSF或IL-12的效果；觀察到多種免疫應(yīng)答參數(shù)的提高(21)。
本發(fā)明以上所述顯示通過抗原、選定的細(xì)胞因子或淋巴因子佐劑和第二佐劑AGP(優(yōu)選穩(wěn)定的可代謝性乳劑)的組合，抗原特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)得到提高。
本發(fā)明的抗原組合物包括的選定抗原，包含蛋白質(zhì)衍生肽或多肽、蛋白質(zhì)以及以下任一物質(zhì)的片段糖、蛋白、多或寡核苷酸或其它大分子成分。如本文所用的，“肽”包含一系列至少3個(gè)氨基酸并包含至少一個(gè)抗原決定簇或表位，“多肽”是比肽更長(zhǎng)的分子，但不構(gòu)成全長(zhǎng)蛋白。可將這樣的肽、多肽或蛋白質(zhì)可偶聯(lián)于一不相關(guān)的蛋白質(zhì)，如破傷風(fēng)類毒素或白喉毒素。如本文所用，“片斷”包括糖、蛋白、多或寡核苷酸或其它大分子成分的一部分但不到全部。在HIV的情況下，本發(fā)明的抗原組合物還包含全長(zhǎng)HIV蛋白。
本發(fā)明首先在采用HIV衍生的肽抗原模型體系中舉例說明。這些肽的描述或衍生見美國(guó)專利5,013,548(22)和5,019,387(23)，將其納入本文參考文獻(xiàn)中并予以小結(jié)。已產(chǎn)生的這些肽含有對(duì)應(yīng)于能誘導(dǎo)中和抗體和T細(xì)胞應(yīng)答的HIV包膜蛋白其區(qū)域的氨基酸序列。
HIV是導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的一種人逆轉(zhuǎn)錄病毒。HIV通過其外包膜糖蛋白與T淋巴細(xì)胞表面CD4(T4)分子結(jié)合面感染免疫系統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞，因此使用CD4(T4)分子作為受體進(jìn)入和感染T細(xì)胞。通過免疫接種誘導(dǎo)對(duì)HIV-感染的特異性保護(hù)性免疫應(yīng)答的嘗試獲得的成功非常有限。在嘗試中目前使用了一些方法來確定該免疫原性組合物發(fā)展的有效和保護(hù)性策略。這些方法包括采用表達(dá)HIV表位減毒和重組細(xì)菌載體(24)、重組腺病毒(25)或牛痘病毒載體(26)、DNA免疫接種(27)和包含多種HIV的T和B細(xì)胞表位的合成肽(28)。
HIV外包膜糖蛋白gp120顯示能夠在人體中誘導(dǎo)中和抗體。編碼整個(gè)gp120分子大約三分之一的重組蛋白PB1，顯示包含了能誘導(dǎo)中和抗體形成的包膜蛋白部分。然而，黑猩猩的研究證明無論是完整的gp120還是PB1都不能誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的中和抗體。
以常規(guī)方法合成了對(duì)應(yīng)于gp120抗原決定簇并產(chǎn)生可中和病毒的抗體應(yīng)答誘導(dǎo)抗病毒輔助T細(xì)胞和CTL應(yīng)答的短肽。
這樣一個(gè)肽是命名為T1SP10MN(A)(+Cys)的C4/V3含多表位的HIV-1MN肽和半胱氨酸缺失變種T1SP10MN(A)(-Cys)。這些肽包含有Th、TCTL和B抗原表位，但不誘導(dǎo)干擾CD4結(jié)合的抗體。以前已證明這些C4/V3 HIV肽當(dāng)與CFA或CFA類似佐劑一起使用時(shí)，是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有希望候選物(29-34)。這些肽包含先前顯示在小鼠和人中都能激發(fā)CD4+Th細(xì)胞應(yīng)答的抗原表位，它含有一個(gè)主要的中和決定簇和Balb/c小鼠與人CD8+CTL識(shí)別的位點(diǎn)，在人中是HLA B7+。該39個(gè)氨基酸的肽近來證明在HIV感染病人中既有免疫原性又安全。
T1SP10MN(A)(+Cys)有如下序列的40氨基酸Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(31)(SEQ ID NO1)。
合成了在17位沒有半胱氨酸的T1SP10MN(A)(-Cys)其有如下序列的39個(gè)氨基酸Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)。
此半胱氨酸殘基位于Th細(xì)胞、CTL或B細(xì)胞識(shí)別的功能性表位的外側(cè)。其它來自HIV病毒基因組不同區(qū)域的HIV肽在美國(guó)專利號(hào)5,861,243(35)、美國(guó)專利號(hào)5,932,218(36)、美國(guó)專利號(hào)5,939,074(37)、美國(guó)專利號(hào)5,993,819(38)、美國(guó)專利號(hào)6,037,135(39)、出版的歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?71,947(40)和美國(guó)專利號(hào)6,024,965(41)中有所描述，也納入本文參考文獻(xiàn)中。
也采用了命名為ST1/p11C的28氨基酸肽偶聯(lián)物。此偶聯(lián)物由名為ST-1的16個(gè)氨基酸的SIV env-衍生的輔助T肽組成，偶聯(lián)于名為p11C的12個(gè)氨基酸的SIVmac 251 Gag肽(Gag的179-190氨基酸)上(42)。p11c肽的四聚體形式在SIV mac感染的Mamu-A*01恒河猴中顯示出CTL活性(43)。ST1-p11C的肽偶聯(lián)物有如下氨基酸序列Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val GlyLys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro TyrAsp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)；也采用命名為C4-V389.6P的39個(gè)氨基酸的肽偶聯(lián)物(44)。這個(gè)肽偶聯(lián)物的C4區(qū)(16氨基酸)來自HIV-1包膜蛋白的第四恒定區(qū)且代表一通用的輔助T抗原表位。此肽的V3區(qū)(23氨基酸)來自HIV-1包膜蛋白的第三超變區(qū)且代表一關(guān)鍵中和決定簇。C4-V389.6P肽偶聯(lián)物有如下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val GlyLys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn AsnThr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly ArgAla Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)。
HIV抗原可以是蛋白質(zhì)、多肽、肽或上述蛋白質(zhì)的片斷。蛋白質(zhì)可以是如gp41、gp120或gp160的糖蛋白。另外，該蛋白質(zhì)可以是由如gag、pol、bif、rev、vpr、tat、nef或env基因編碼的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)衍生的肽將含至少一個(gè)長(zhǎng)度至少為6個(gè)氨基酸的抗原決定簇(表位)。
對(duì)HIV肽的免疫應(yīng)答反應(yīng)可通過共價(jià)連接(偶聯(lián))該肽于藥學(xué)上可接受的載體分子而提高。合適載體分子的例子包括破傷風(fēng)類毒素、白喉毒素、鑰孔血藍(lán)蛋白和其它對(duì)應(yīng)于HIV gp120糖蛋白T細(xì)胞表位的肽。
現(xiàn)在認(rèn)為一個(gè)成功的抗HIV免疫接種策略需要激發(fā)對(duì)HIV的粘膜免疫力以及良好的CTL應(yīng)答。近來一次小鼠研究采用T1SP10MN(A)多表位肽和粘膜佐劑(霍亂毒素)，顯示鼻內(nèi)免疫接種誘導(dǎo)了中和性血清IgG1抗體(45)。后來的研究也采用HIV-V3環(huán)肽，顯示誘導(dǎo)了粘膜合成IgA抗體和強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答反應(yīng)，包括肽特異CTL(46)。高滴度的全身抗體和中和抗體在預(yù)防或穩(wěn)定HIV感染個(gè)體中的功能作用還不知道，盡管高滴度病毒特異性抗體的據(jù)認(rèn)為在防止病毒傳播上有重要作用。
在本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，配制了含529的穩(wěn)定水包油乳劑，然后與細(xì)胞因子IL-12或GM-CSF混合。下面給出的數(shù)據(jù)表明529加GM-CSF的組合產(chǎn)生了高滴度HIV-中和血清抗體。529和GM-CSF組合在免疫接種雌鼠的陰道拱頂中誘導(dǎo)了高滴度的抗原特異性IgG抗體，包括IgG1和IgG2a亞類。用與529SE和GM-CSF配制的T1SP10MN(A)(-Cys)肽免疫接種小鼠，誘導(dǎo)了強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高了抗原特異性細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌入培養(yǎng)液中以及誘導(dǎo)了肽特異性CTL應(yīng)答。類似的結(jié)果在小鼠用含529 SE和GM-CSF的APP的Aβ1-42肽免疫接種時(shí)也觀察到。
通常，由529或529 SE混合GM-CSF或IL-12以及選擇的蛋白或肽配制的抗原/佐劑制劑，可誘導(dǎo)高滴度抗原特異性抗體和病毒中和抗體，IgG亞類的比例明顯轉(zhuǎn)變?yōu)檠a(bǔ)體結(jié)合性IgG抗體(在小鼠中傾向IgG2a)占更大比例，在對(duì)體外抗原刺激的應(yīng)答中，單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖升高。
529 SE的優(yōu)點(diǎn)是此制劑在注射位置不誘導(dǎo)肉芽腫積聚和炎癥；而通常油包水或水包油佐劑制劑誘導(dǎo)注射部位的反應(yīng)。
做了一個(gè)實(shí)驗(yàn)以比較只給予HIV肽T1SP10MN(A)(-Cys)和529 SE，或529 SE加IL-12，或529 SE加GM-CSF的效果。
在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中(下表1)，Balb/c小鼠用與529 SE配制的HIV肽T1SP10MN(A)(-Cys)皮下免疫，只注射了兩次后誘導(dǎo)了肽特異性血清IgG滴度。也誘導(dǎo)了IgG1和IgG2a亞類滴度。包括第二個(gè)佐劑，GM-CSF或IL-12時(shí)，提高了IgG總滴度和IgG1亞類滴度。加入IL-12提高了IgG2a亞類滴度；而加入GM-CSF不提高IgG2a亞類滴度。
在另一實(shí)驗(yàn)中，作為功能性細(xì)胞倡導(dǎo)免疫力的衡量參數(shù)，評(píng)估了用529 SE，或529SE加IL-12，或529 SE加GM-CSF，與多表位肽T1SP10MN(A)(-Cys)一起配制免疫接種小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生HIVMN特異CTL應(yīng)答的能力。
如表2所示，用任何佐劑免疫接種的小鼠脾細(xì)胞，顯示出對(duì)未標(biāo)記或用不相關(guān)IIIB CTL表位脈沖標(biāo)記的靶細(xì)胞的低活性。而當(dāng)給予529 SE加IL-12時(shí)與只用529 SE比較，HIVMN特異性CTL介導(dǎo)的靶細(xì)胞裂解顯著增加，且當(dāng)給予529 SE加GM-CSF時(shí)仍會(huì)進(jìn)一步增加(表2)。
在另一實(shí)驗(yàn)中，恒河猴用ST1-p11C或C4-V389.6P肽和IFA或529 SE加GM-CSF免疫(表15所示各組)。分析的結(jié)果列在表16-22中并予以小結(jié)。
ST1-p11C肽制劑本身似乎在所有試驗(yàn)動(dòng)物中耐受性良好。然而，與佐劑IFA一起使用時(shí)注意到有顯著的注射部位反應(yīng)。此外，佐劑制劑529 SE/GM-CSF可能的微弱副作用在末次免疫接種后可立即觀察到。含IFA的ST1-p11C肽制劑能在兩只Mamu-A*01陽性實(shí)驗(yàn)恒河猴之一中誘導(dǎo)出強(qiáng)p11C特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。含529SE/GM-CSF的ST1-p11C肽制劑也能在兩只Mamu-A*01陽性實(shí)驗(yàn)恒河猴之一中誘導(dǎo)出p11C特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。
含IFA的C4-V389.6P肽制劑能產(chǎn)生滴度范圍1∶25,600-1∶102,400的血漿ELISA抗體峰和抗SHIV89.6及SHIV89.6P中和抗體滴度。含529 SE/GM-CSF的C4-V389.6P肽制劑能產(chǎn)生滴度范圍1∶6,400-1∶12,800的血漿ELISA抗體峰和對(duì)SHIV89.6但不cfSHIV89.6P的低水平中和抗體應(yīng)答。
鑒于每組動(dòng)物數(shù)量少(2只)，得出具體的結(jié)論很困難。然而，含529 SE/GM-CSF的二種肽制劑產(chǎn)生的免疫應(yīng)答(包括體液和細(xì)胞)水平，在定性上比采用IFA佐劑的動(dòng)物觀察到的免疫應(yīng)答低。經(jīng)常需要注意的是IFA在用于人的商品化組合物中是還未獲批準(zhǔn)的成分。此外，一些有限的證據(jù)表明應(yīng)答細(xì)胞的功能特性和表型(也就是細(xì)胞因子分布)可能取決于使用的佐劑制劑而不同。
在另一次實(shí)驗(yàn)中，第二種靈長(zhǎng)類的動(dòng)物短尾猿，用9號(hào)氨基酸殘基谷氨酸變?yōu)槔i氨酸修飾的C4-V389 6P肽免疫接種。所得的肽偶聯(lián)物，命名為C4(E9V)-V389.6P，有如下序列Lys G1n Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val GlyLys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn AsnThr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly ArgAla Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
動(dòng)物用C4(E9V)-V389.6P肽免疫接種，沒有佐劑或與529 SE加GM-CSF組合。
結(jié)果表明C4(E9V)-V389.6P肽當(dāng)與529 SE/GM-CSF組合作肌肉注射時(shí)激發(fā)的血清肽特異性IgG滴度遠(yuǎn)高于同樣劑量的C4(E9V)-V389.6P肽在沒有佐劑時(shí)注射肌肉(圖7-9)所獲得的。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清楚證明當(dāng)與適當(dāng)佐劑組合聯(lián)用時(shí)，HIV肽免疫原能誘導(dǎo)全身體液免疫。
預(yù)防或治療脊椎動(dòng)物宿主以淀粉樣沉積(自體分子)為特征的疾病的理想免疫原性組合物，包含本發(fā)明的佐劑組合，包括含有β淀粉樣前體蛋白(APP)部分的那些組合物。此疾病名稱多樣，如阿爾茨海默氏病，淀粉樣變性病或淀粉樣遺傳病。β-淀粉樣肽(也稱為Aβ肽)是APP的內(nèi)部的39-43個(gè)氨基酸的片斷，由β和γ分泌酶加工APP而產(chǎn)生。Aβ1-42肽有如下序列Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO6)。
在一些病人中，淀粉樣沉積采取聚集的Aβ肽形式。令人驚訝的事，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)給予分離的Aβ肽在脊椎動(dòng)物宿主中誘導(dǎo)了對(duì)淀粉樣沉積物的Aβ肽成分的免疫應(yīng)答(47)。因此，本發(fā)明的免疫原性組合物包括本發(fā)明的佐劑組合加Aβ肽以及Aβ肽的片斷、衍生物或修飾以及抗Aβ肽或其片斷、衍生物或修飾的抗體。一種這樣的Aβ肽片斷是有如下序列的28個(gè)氨基酸肽(48)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ ID NO7)。
其它感興趣的Aβ肽片斷包括但不限于氨基酸1-10、1-7、1-6、1-5、3-7、1-3和1-4，它們可以非偶聯(lián)形式或與不相關(guān)蛋白偶聯(lián)后給予。
用Aβ1-42肽和多種佐劑進(jìn)行了一系列研究?，F(xiàn)在介紹其結(jié)果總結(jié)。
在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，Swiss-Webster小鼠在臀部用Aβ1-42肽皮下免疫接種產(chǎn)生肽特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a滴度，證明Aβ1-42肽是可行的候選抗原。加入GM-CSF到529 SE和Aβ1-42肽中導(dǎo)致血清抗體IgG、IgG1和IgG2a滴度比接受529 SE和Aβ1-42肽的小鼠增加(見表3-8)。接受529 SE加GM-CSF組合各小鼠的血清抗體比只接受529 SE各小鼠增加更多且上升更快(數(shù)據(jù)未列出)。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)實(shí)驗(yàn)用年紀(jì)較大的Swiss-Webster小鼠(6-8個(gè)月而不是小于3個(gè)月)重復(fù)時(shí)，觀察到了與表3-8類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，Swiss-Webster小鼠在臀部用Aβ1-42肽和529 SE與不同劑量GM-CSF皮下免疫接種。IgG終點(diǎn)滴度隨著GM-CSF量增加(從0.1到1到10μg)以劑量依賴方式提高(表9)。所有529 SE加GM-CSF組合的IgG滴度比只接受另一種佐劑QS-21或和GM-CSF一起要高。不同的529 SE加GM-CSF組小鼠的IgG1亞類滴度與第一次劑量接受529 SE加GM-CSF和第二劑量只接受529 SE的組(表10)相比也增加。不同的529 SE加GM-CSF組小鼠的IgG2a亞類滴度以劑量依賴方式與只接受529 SE的組相比也上升(表11)。
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，Swiss-Webster小鼠在臀部用Aβ1-42肽和529 SE在有或沒有不同劑量GM-CSF的情況下皮下免疫接種。不同529 SE加GM-CSF組小鼠的IgG(0.5到2到5到10μg)終點(diǎn)滴度增加，盡管不以劑量依賴方式(表12)。不同529 SE加GM-CSF組小鼠的IgG1和IgG2a亞類滴度與只接受529 SE的組相比也提高，盡管不以劑量依賴方式(表13[IgG1]和14[IgG2a])。
在第四個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用了表達(dá)變體形式的在717殘基有一突變(纈氨酸被苯丙氨酸替代)的β-淀粉樣前體蛋白(APP)轉(zhuǎn)基因小鼠。此突變與人類家族性阿爾茨海默氏病相關(guān)。這些轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為PDAPP小鼠)逐漸地產(chǎn)生出許多阿爾茨海默氏病的病理特征，包括Aβ沉積、神經(jīng)炎斑塊和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，因此可作為人類阿爾茨海默氏病的動(dòng)物模式。
在此第四個(gè)實(shí)驗(yàn)中，PDAPP小鼠用Aβ1-42肽與或不與佐劑以表A中列出的劑量皮下免疫接種。具體說，組1小鼠接受Aβ1-42肽和MPLTM(Corixa，Hamilton，MT)以穩(wěn)定的乳劑形式(SE)作為陽性對(duì)照；組2小鼠接受Aβ1-42肽和MPLTMSE加小鼠GM-CSF；組3小鼠接受Aβ1-42肽和529 SE加小鼠GM-CSF；組4小鼠接受PBS作為陽性對(duì)照。組2和3表現(xiàn)出更迅速的抗Aβ1-42抗體滴度值增加和比組1或4更高的峰值。然而，組2和3的滴度在2-3個(gè)月內(nèi)跌回組1陽性對(duì)照相等的滴度(圖A)。當(dāng)與組4陰性對(duì)照相比時(shí)，組1、2、3顯示ELISA測(cè)定的腦Aβ水平大幅下降(表B-C和圖B-C)，淀粉樣負(fù)擔(dān)減少(表D和圖D)和神經(jīng)炎性營(yíng)養(yǎng)失調(diào)減低(表E和圖E)。組2和3與組1陽性對(duì)照相比星形膠質(zhì)細(xì)胞增生顯著減少(圖F)。
因此，529 SE和GM-CSF或IL-12的佐劑性能當(dāng)一起配制時(shí)看來是互相促進(jìn)的。
本發(fā)明的抗原組合物在給予該組合物后通過提高脊椎動(dòng)物宿主抗體應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)免疫力而調(diào)節(jié)了免疫應(yīng)答。該抗原組合物包含選自病原性病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲的抗原，和有效劑量的AGP佐劑，如529(以水合或穩(wěn)定乳劑形式)與細(xì)胞因子或淋巴因子，特別是GM-CSF或IL-12的組合。顯示有免疫調(diào)節(jié)活性的其它細(xì)胞因子或淋巴因子，包括但不限于，白細(xì)胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，干擾素-α、β和γ，粒細(xì)胞集落刺激因子，腫瘤壞死因子α和β。
某些細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑或拮抗劑也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所用，術(shù)語“激動(dòng)劑”意味以上述細(xì)胞因子或淋巴因子的同樣方式提高活性或功能的分子。這種激動(dòng)劑的一個(gè)例子是上述細(xì)胞因子或淋巴因子的模擬物。如本文所用，術(shù)語“拮抗劑”意味能抑制或防止上述細(xì)胞因子或淋巴因子活性的分子。這種拮抗劑的例子是可溶性IL-4受體和可溶性TNF受體。
如本文所用，術(shù)語“有效的輔佐劑量”意味上述的佐劑組合的劑量，適于在脊椎動(dòng)物宿主中誘導(dǎo)對(duì)所選抗原的免疫應(yīng)答比，接受無佐劑的所選抗原的宿主要強(qiáng)。具體的劑量部分取決于宿主的年齡、體重和醫(yī)學(xué)狀況及使用方法和抗原。在一較佳的實(shí)施方式中，佐劑組合采用0.1-500μg/每劑范圍的529。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該范圍是1-100μg/每劑。合適的劑量本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定。本發(fā)明的抗原組合物可與免疫學(xué)上可接受的稀釋劑或載體以傳統(tǒng)方式混合，以制備可注射的液體溶液或懸浮液。
本發(fā)明的抗原或免疫原性組合物可通過多種途徑注入人體或非人脊椎動(dòng)物，包括但不限于，鼻內(nèi)、口、陰道、直腸、腸胃外、皮內(nèi)、誘皮(見納入本文參考文獻(xiàn)的國(guó)際申請(qǐng)WO98/20734(50))、肌肉、腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)。該抗原組合物的抗原成分量部分根據(jù)抗原性質(zhì)而不同，也取決于宿主的年齡，體重和醫(yī)學(xué)狀況及給予方法。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定合適的劑量。優(yōu)選同時(shí)給予抗原和佐劑的組合盡管并不要求。本領(lǐng)域技術(shù)人員也不難確定該抗原組合物的劑量數(shù)和劑量方案。在一些情況下，佐劑組合的佐劑特性也許會(huì)減少需要的劑量數(shù)或劑量方案的時(shí)間要求。
本發(fā)明的佐劑組合適合用于抗原性或免疫原性組合物，包括各種病源性微生物的各種抗原，包括但不限于感染人和非人脊椎動(dòng)物的病毒、細(xì)菌、真菌或寄生性微生物，或癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的抗原。抗原可包括蛋白質(zhì)衍生的肽或多肽，和以下任何物質(zhì)的片段糖、蛋白、多或寡核苷酸、癌或腫瘤細(xì)胞、過敏原、自體分子(例如淀粉樣前體蛋白)或其它大分子成分。在一些情況下，該抗原組合物中可包含一種以上的抗原。
包含本發(fā)明佐劑組合的理想的病毒免疫原性組合物，包括但不限于預(yù)防和/或治療由下列病毒引起的疾病人類免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、流感病毒、單純皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、杯狀病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、腺病毒、狂犬病毒、犬瘟熱病毒、牛瘟病毒、人肺炎后病毒、禽肺炎病毒(以前的火雞鼻氣管炎病毒)、Hendra病毒、Nipah病毒、冠狀病毒、細(xì)小病毒、有傳染性鼻氣管炎病毒、貓白血病病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、禽傳染性囊病病毒、新城設(shè)病毒、Marek’s病病毒、豬呼吸和生殖綜合癥病毒、馬動(dòng)脈炎病毒和各種腦炎病毒。
包含本發(fā)明佐劑組合的理想的細(xì)菌免疫原性組合物，包括但不限于預(yù)防和/或治療由以下細(xì)菌引起的疾病流感嗜血桿菌(典型和非典型)、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、生膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、乳泌缺乏鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、糞腸球菌(Streptococcus faecalis)、幽門螺酐菌(Helicobacter pylori)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisserisameningitidis)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci)、百日咳博徳特菌(Bordetella pertussis)、Alloiococcus otiditis、傷寒沙門菌(Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、霍亂沙門菌(Salmonella choleraesuis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、志賀菌(Shigella)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、白喉棒狀桿菌(Corrynebacteriumdiphtheriae)、結(jié)核病分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、貪食分枝桿菌-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合體(Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellularecomplex)、奇異變形菌(Proteus mirabilis)、普通變形菌(Proteus vulgaris)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、破傷風(fēng)桿菌(Clostridum tetani)、問號(hào)鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)、布氏疏螺旋體(Borrelia bugdoferi)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuopneumoniae)和支原體(Mycoplasmagallisepticum)。
包含本發(fā)明佐劑組合的理想的抗真菌免疫原性組合物包括但不限于預(yù)防和/或治療由以下真菌引起的疾病，曲霉菌(Aspergillis)、芽生菌(Blastomyces)、假絲酵母菌(Candida)、球孢子菌(Coccidiodes)、隱球菌(Cryptococcus)和組織胞漿菌(Histoplasma)。
包含本發(fā)明佐劑組合的理想的抗寄生蟲免疫原性組合物包括但不限于預(yù)防和/或治療由以下寄生蟲引起的疾病，利什曼原蟲major(Leishmania major)、蛔蟲(Ascaris)、鞭蟲(Trichuris)、賈第鞭毛蟲(Giardia)、血吸蟲(Schistosoma)、似隱孢菌(Cryptosporidium)、滴蟲(Trichomonas)、鼠弓漿蟲(Toxoplasmagondii)、肺囊蟲(Pneumocystis carinii)。
誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物宿主治療性或預(yù)防性抗癌作用的理想免疫原性組合物包含本發(fā)明佐劑組合，包括那些使用癌抗原或腫瘤相關(guān)抗原的組合物包括但不限于前列腺特異抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。
用于在脊椎動(dòng)物宿主中調(diào)節(jié)對(duì)過敏原應(yīng)答的理想免疫原性組合物包含本發(fā)明佐劑組合，包含過敏原及其片斷的組合物。這些過敏原的例子在美國(guó)專利號(hào)5,830,877(51)和出版的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O99/51259(52)中有所描述，本文納入作為參考文獻(xiàn)，包括花粉、昆蟲毒液、動(dòng)物頭皮屑、真菌孢子和藥物(例如青霉素)。此種免疫原性組合物可干擾已知是過敏反應(yīng)原因的IgE抗體產(chǎn)生，。
用于在脊椎動(dòng)物宿主中調(diào)節(jié)對(duì)自體分子應(yīng)答反應(yīng)的理想的免疫原性組合物包含本發(fā)明的佐劑組合，包括那些含自體分子或其片斷的組合物。這類自體分子的例子除了上面描述過的Aβ1-42肽外，包括參與糖尿病的β鏈胰島素、參與胃食管逆流病的G17分子和下調(diào)諸如多發(fā)性硬化、狼瘡和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病自身免疫反應(yīng)的抗原。
在HIV和SIV的情況中，此抗原組合物包括至少一種蛋白質(zhì)、多肽、肽或上述蛋白質(zhì)的片斷。在一些情況下，該抗原組合物包含多個(gè)HIV或SIV蛋白、多肽、肽和/或片斷。
本發(fā)明的佐劑組合制劑也適于作為多核苷酸免疫原性組合物(也稱為DNA免疫原性組合物)的佐劑。這種免疫原性組合物還可包括促進(jìn)劑如bupivicaine(見美國(guó)專利號(hào)5,593,972(53))，納入本文的參考文獻(xiàn)中。
為更好了解本發(fā)明，設(shè)置了下列實(shí)施例。這些實(shí)施例只是描述而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法在下面的實(shí)施例2-7中報(bào)道的實(shí)驗(yàn)中使用了下列材料和方法。
動(dòng)物雌性Balb/c小鼠，7-9周齡，從Taconic Farm有限公司購買(德國(guó)城，紐約)。雌性Swiss-Webster小鼠，7-9周齡，也從Taconic Farm有限公司購買。所有的小鼠飼養(yǎng)在由美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)批準(zhǔn)的設(shè)施中。小鼠在研究開始一周前適應(yīng)居宿設(shè)施。
抗原在下面實(shí)施例2-3的HIV實(shí)驗(yàn)中，使用了兩種不同合成肽。多表位HIV-1-MN肽T1SP10MN(A)(-Cys)(在此稱也為MN10)的序列如下Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)。此肽前面已描述過(33，34)，包含能激發(fā)小鼠和人CD4+Th細(xì)胞應(yīng)答的HIV-1 gp120MN的序列、主要中和決定簇和Balb/c小鼠中CD8+CTL識(shí)別位點(diǎn)。此肽由R.Scearce博士提供(杜克大學(xué)，Durham，NC)。在CTL分析中，一命名為IIIB的不相關(guān)肽用于比較，此肽對(duì)應(yīng)于HIV-1-IIIBV3環(huán)內(nèi)的CTL表位(Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe ValThr Ile((SEQ ID NO8))，從Genosys生物技術(shù)有限公司購買(Woodlomds，德克薩斯)。使用前，將肽溶于無菌水中，以適當(dāng)緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋。
在下面實(shí)施例4-6的淀粉樣實(shí)驗(yàn)中，使用了命名為Aβ1-42的肽。Aβ1-42的序列如下Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO6)。
此肽前面已描述過(47)，對(duì)應(yīng)于淀粉樣前體蛋白一內(nèi)部的42個(gè)氨基酸片斷。Aβ1-42由Elan制藥所提供(南舊金山，加州)。使用前，將此肽溶于無菌水中，適當(dāng)緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋。
佐劑所有含529的佐劑制品購自Corixa(Hamilton，MT)。以基于水包油(0.8-2.5％)乳劑預(yù)先配制的鯊烯制備529 SE，529濃度范圍從0至-50μg。磷酸鋁由本室準(zhǔn)備。完全弗氏佐劑(CFA)和不完全佐劑(IFA)從Difco實(shí)驗(yàn)室，底特律，密歇根購買。T1SP10MN(A)肽和弗氏佐劑用兩個(gè)相連注射器以1∶1比例乳化。重組表達(dá)的小鼠IL-12由Genetics硬度所提供(劍橋，MA)。重組小鼠GM-CSF購自BiosourceIntornation)(Camarillo，加州)作為無載體凍干粉。StimulonTMQS-21購自Antigenics有限公司(Framingham，MA)。
免疫接種臀部皮下免疫小鼠，0.2ml總體積平分用于臀部每側(cè)。免疫接種如下面所示在不同的時(shí)間間隔進(jìn)行。免疫接種前不到16小時(shí)在無菌條件下，將抗原和細(xì)胞因子以磷酸鹽緩沖液稀釋到適當(dāng)濃度并加佐劑制備。將免疫原性組合物溫和攪動(dòng)混合，儲(chǔ)存在4℃。在免疫前立即振蕩混合制備。
用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分析血清動(dòng)物在初次免疫前和標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)采血。以各小鼠抗體滴度的幾何平均值分析血清。為分析HIV肽特異性抗體和亞類分布，鈄肽懸浮于碳酸鹽緩沖液(15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)或PBS中，濃度為1μg/ml，并以100∶1加入96孔微量滴定板(Nunc)中。37℃培育過夜后，洗板并室溫封閉(0.1％明膠/PBS)2-4小時(shí)。用洗滌緩沖液(PBS，0.1％TweenTM20)洗滌ELISA板，然后加入系列稀釋的血清(PBS，0.1％明膠，0.05％TweenTM20，0.02％疊氮化鈉)。培育四小時(shí)后，洗孔并加入適當(dāng)稀釋的生物素化抗同型/亞類抗體，4℃培養(yǎng)過夜。洗孔并用鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根氧化物酶溫育。溫育后洗孔并用ABTS顯色。讀取諸孔405nm。滴定度用對(duì)照血清標(biāo)準(zhǔn)化。
同樣的操作用于分析Aβ1-42肽特異性抗體和亞類分布，除了使用濃度為0.3μg/ml的每微量滴定板外。
細(xì)胞準(zhǔn)備對(duì)于增殘?jiān)囼?yàn)和體外細(xì)胞因子分析，在標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)從小鼠獲得脾細(xì)胞。單細(xì)胞懸浮液合并3-5個(gè)小鼠的細(xì)胞而制備。對(duì)于增殖和細(xì)胞因子分析，將細(xì)胞懸浮在用HIV抗原、對(duì)照蛋白或只有RPMI預(yù)包被過應(yīng)的圓形底96孔培養(yǎng)板中。用含2X補(bǔ)充物的培養(yǎng)基以5×105細(xì)胞/孔加入脾細(xì)胞。培養(yǎng)開始后3或6天從三分之一孔收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于細(xì)胞因子分析。收集上清液后，培養(yǎng)物立即用3H-胸苷脈沖18-24小時(shí)，收集之以定量細(xì)胞增殖。
實(shí)施例2相應(yīng)的抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點(diǎn)總滴度和亞類滴度在初次免疫接種后5周、第二次免疫接種后2周從合并的血清(n＝5 Balb/c)測(cè)定于相應(yīng)的終點(diǎn)IgG亞類滴度。小鼠在臀部用25μg T1SP10MN(A)(-Cys)皮下免疫接種，0.2ml總體積平均分成兩個(gè)0.1ml在0和3周注射于各側(cè)。稀釋529 SE以產(chǎn)生含每劑量1.25％鯊烯油和25μg 529的乳劑。SE是含鯊烯、甘油和乳化劑的水包油乳劑載體。重組小鼠IL-12以40ng/小鼠給予。重組小鼠GM-CSF以25μg/小鼠給予。結(jié)果在表1中列出，和各組的幾何平均滴度加標(biāo)準(zhǔn)誤差。
表1相應(yīng)的抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點(diǎn)總滴度和亞類滴定度終點(diǎn)滴度佐劑 μg HIV肽IgG IgG1 IgG2a529(25)SE25 206,301 37,567 180,671(1.25％油)+/- +/- +/-175,149 31,526 277,211
529(25)SE 25460,516 74,269 222,446(1.25％油)+ +/- +/- +/-rIL-12(.04) 690,712 169,868 400,716529(25)SE 251,085,658 238,379 117,657(1.25％油)+ +/- +/- +/-GM-CSF(25) 1,064,924 62,199 25,301實(shí)施例3Balb/c小鼠的CTL分析免疫接種小鼠按實(shí)施例2的操作方案。評(píng)估了第二次免疫接種后14天小鼠的分離脾細(xì)胞的CTL活性。529 SE用25μg含1.25％油的529 SE加或不加10μgGM-CSF或40ngIL-12，和25μgT1SP10MN(A)(-Cys)配制。
從第二次免疫接種后14天的免疫接種小鼠分離脾細(xì)胞用于CTL分析?；景凑涨懊婷枋龅牟僮?39)進(jìn)行。簡(jiǎn)單說，收集每組3只小鼠的剔除紅細(xì)胞-的脾細(xì)胞。脾效應(yīng)細(xì)胞(4×106/ml)在24孔培養(yǎng)板1.5-2ml體積以1μg/ml“MN-10”肽(“IIIB”10mer CTL抗原表位肽)或無HIV肽再刺激7天。CTL抗原表位限于H-2Dd。培養(yǎng)物于最后5天培養(yǎng)中添加了10U/ml的重組小鼠IL-12(Biosource)。為分析細(xì)胞毒活性，P815細(xì)胞用Cr51標(biāo)記并用5μg/ml肽(IIIB或MN-10)脈沖4小時(shí)，加入到培養(yǎng)的脾效應(yīng)細(xì)胞中。當(dāng)不用HIV肽時(shí)，不脈沖那批靶細(xì)胞。使用3倍稀釋的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞比例(“E∶T”)，從30∶1到1.1∶1。以鉻釋放百分比計(jì)算CTL活性百分比采用((特異性鉻釋放-自發(fā)鉻釋放)/(最大鉻釋放-自發(fā)鉻釋放))×100。經(jīng)6小時(shí)培育后評(píng)估鉻釋放。平均自發(fā)鉻釋放總是低于15％的最大鉻釋放。第28天的數(shù)據(jù)結(jié)果列于表2。
表2效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的比例

*不加佐劑實(shí)施例4相應(yīng)的抗Aβ1-42IgG終點(diǎn)總滴度和亞類滴度將遠(yuǎn)交Swiss-Webster小鼠分成每組10只。每組接受30μg對(duì)應(yīng)于APP的一內(nèi)部42個(gè)氨基酸長(zhǎng)區(qū)域的Aβ1-42肽。第一組不接受佐劑；第二組接收50μg含2.5％油的529 SE；第三組接受50μg含2.5％油的529 SE加10μgGM-CSF；第四組接受10μgGM-CSF；第五組接受含1.25％油的SE；第六組接受含1.25％油的SE加10μgGM-CSF第七組接收50μg QS-21。小鼠在臀部皮下免疫接種，0.2ml總體積平分接種到尾/臀底部的兩個(gè)位點(diǎn)。免疫接種在第0和3周進(jìn)行。
小鼠在第0、20、35和70天采血。分析各個(gè)小鼠的血清。第5和10周測(cè)定了各血清(n＝10 Swiss-Webster)相應(yīng)的抗Aβ1-42肽IgG終點(diǎn)滴定和亞類滴度。IgG終點(diǎn)結(jié)果在表3(第5周)和表4(第10周)中給出。IgG1亞類結(jié)果在表5(第5周；未接受佐劑或QS-21的組沒有測(cè)定)和表6(第10周)中給出。IgG2a亞類結(jié)果在表7(第5周；未接受佐劑或QS-21的組沒有測(cè)定)和表8(第10周)給出。
表3抗Aβ1-42第5周IgG終點(diǎn)滴度佐劑 幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差無12,976 +/-14,386529 SE(50)16,204 +/-225,221529 SE(50)+GM-CSF(10) 608,474 +/-623,575GM-CSF(10)214,497 +/-609,067SE(1％) 33,342 +/-15,493SE(1％)+GM-CSF(10)453,367 +/-162,750QS-21(50) 4,076 +/-9,036表4抗Aβ1-42第10周IgG終點(diǎn)滴度佐劑幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差無 21,426 +/-24,959529 SE(50) 86,847 +/-187,792529 SE(50)+GM-CSF(10) 943,075 +/-989,177GM-CSF(10) 1,049,414 +/-390,525SE(1％) 255,631 +/-114,025SE(1％)+GM-CSF(10) 1,005,899 +/-407,108QS-21(50) 47,222 +/-159,775
表5抗Aβ1-42第5周IgG1終點(diǎn)滴度佐劑幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差529 SE(50) 461 +/-627529 SE(50)+GM-CSF(10) 1,936 +/-12,680GM-CSF(10) 8,654 +/-10,100SE(1％) 4,515 +/-6,273SE(1％)+GM-CSF(10) 24,422 +/-19,764表6抗Aβ1-42第10周IgG1終點(diǎn)滴度佐劑幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差無 2,086 +/-2,448529 SE(50) 969+/-521529 SE(50)+GM-CSF(10) 2,076 +/-4,901GM-CSF(10) 8,483 +/-10,998SE(1％) 3,623 +/-3,456SE(1％)+GM-CSF(10) 12,472 +/-11,502QS-21(50) 988+/-895表7抗Aβ1-42第5周IgG2a終點(diǎn)滴度佐劑幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差529 SE(50) 2,224 +/-10,099529 SE(50)+GM-CSF(10) 94,764 +/-849,173GM-CSF(10) 25,554 +/-13,191SE(1％) 1,484 +/-2,271SE(1％)+GM-CSF(10) 8,405 +/-31,303表8抗Aβ1-42第10周IgG2a終點(diǎn)滴度佐劑幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差無 5,910 +/-39,626529 SE(50) 5,944 +/-9,100529 SE(50)+GM-CSF(10) 47,694 +/-88,053GM-CSF(10) 64,910 +/-54,824SE(1％) 2,350 +/-2,326SE(1％)+GM-CSF(10) 7,421 +/-31,153QS-21(50) 3,544 +/-26,332
實(shí)施例5以不同劑量GM-CSF接種時(shí)相應(yīng)的抗Aβ1-42終點(diǎn)總滴度和亞類滴度將遠(yuǎn)交Swiss-Webster小鼠分成每組10只。每組在第0和3周接受兩次30μgAβ1-42肽免疫接種。第一組接受25μg529 SE加10μg GM-CSF；第二組接受25μg529加1μg GM-CSF；第三組接受25μg529 SE加0.1μg GM-CSF；第四組在首次劑量時(shí)接受25μg529 SE加10μg GM-CSF，隨后在第二次劑量時(shí)只接受25μg529 SE；第五組接受25μg QS-21；第六組接受25μg QS-21加10μg GM-CSF。小鼠在臀部皮下免疫接種，0.2ml總體積平分接種到尾/臀底部?jī)蓚€(gè)位點(diǎn)。
小鼠在第0、21和42天采血。第6周測(cè)定各血清(n＝10)相應(yīng)的終點(diǎn)抗Aβ1-42肽IgG類和亞類滴度。IgG終點(diǎn)結(jié)果在表9中給出。IgG1亞類結(jié)果在表10中給出。IgG2a亞類結(jié)果在表11中給出。
表9抗Aβ1-42第6周IgG終點(diǎn)滴度佐劑 幾何平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差529 SE(25)+GM-CSF(10) 353,660 +/-148,940529 SE(25)+GM-CSF(1) 150,935 +/-218,332529 SE(25)+GM-CSF(0.1)86,145+/-91,724529 SE(25)* 25,365+/-54,083QS-21(25) 1,866 +/-18,430QS-21(25)+GM-CSF(10) 48,970+/-116,106*第一次劑量529 SE(25)+GM-CSF(10)；第二次劑量只有529 SE(25)表10抗Aβ1-42第6周IgG1終點(diǎn)滴度佐劑 幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差529 SE(25)+GM-CSF(10) 10,867 +/-18,333529 SE(25)+GM-CSF(1) 24,909 +/-18,625529 SE(25)+GM-CSF(0.1) 6,608 +/-17,736529 SE(25)*4,511 +/-8,154QS-21(25) 581 +/-126QS-21(25)+GM-CSF(10) 7,618 +/-29,145*第一次劑量529 SE(25)+GM-CSF(10)；第二次劑量只有529 SE(25)
表11抗Aβ1-42第6周IgG2a終點(diǎn)滴度佐劑 幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差529 SE(25)+GM-CSF(10) 243,758 +/-354,383529 SE(25)+GM-CSF(1) 116,222 +/-143,140529 SE(25)+GM-CSF(0.1)98,018 +/-391,797529 SE(25)* 16,018 +/-165,298QS-21(25) 沒做+/-沒做QS-21(25)+GM-CSF(10) 30,133 +/-134,774*第一次劑量529 SE(25)+GM-CSF(10)；第二次劑量只有529 SE(25)實(shí)施例6以不同劑量GM-CSF接種時(shí)相應(yīng)的抗Aβ1-42終點(diǎn)總和亞類滴度將遠(yuǎn)交Swiss-Webster小鼠分成每組10只。每組在第0和3周接受免疫接種，每次用30μg Aβ1-42肽。在第0周免疫接種時(shí)，第一組接受50μg529 SE；第二組接受50μg529加10μg GM-CSF；第三組接受50μg529 SE加5μg GM-CSF；第四組接受50μg529 SE加2μg GM-CSF；第五組接受50μg 529SE加0.5μg GM-CSF；第六組接受1％SE。在第3周免疫接種時(shí)，第一到第五組接受與第0周免疫接種相同的劑量，除了將529 SE從50μg減少至25μg。第六組接受的SE量從第0周免疫接種的1％增加到第三周免疫接種的1.2％。小鼠在臀部皮下免疫接種，0.2ml總體積平分接種到尾/臀底部?jī)蓚€(gè)位點(diǎn)。
小鼠在第2、20和35天采血。在第5周測(cè)定各血清(n＝10)相應(yīng)的終點(diǎn)抗Aβ1-42肽IgG類和亞類滴度。IgG終點(diǎn)結(jié)果在表12中給出。IgG1亞類結(jié)果在表13中給出。IgG2a亞類結(jié)果在表14中給出。
表12抗Aβ1-42第5周IgG終點(diǎn)滴度佐劑 幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差529 SE(50)6,119 +/-3,103529 SE(50)+GM-CSF(10) 52,312 +/-78,421529 SE(50)+GM-CSF(5) 16,392 +/-17,706529 SE(50)+GM-CSF(2) 321,524+/-224,875529 SE(50)+GM-CSF(0.5)36,934 +/-29,449SE(1％) 7,784 +/-9,041
表13抗Aβ1-42第5周IgG1終點(diǎn)滴度佐劑 幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差529 SE(50)499+/-676529 SE(50)+GM-CSF(10) 1,424 +/-2,468529 SE(50)+GM-CSF(5) 3,407 +/-5,653529 SE(50)+GM-CSF(2) 18,328 +/-8,067529 SE(50)+GM-CSF(0.5)3,526 +/-17,606SE(1％) 2,556 +/-5,615表14抗Aβ1-42第5周IgG2a終點(diǎn)滴度佐劑 幾何平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差529 SE(50)1,386 +/-5,173529 SE(50)+GM-CSF(10) 48,519 +/-148,981529 SE(50)+GM-CSF(5) 11,659 +/-23,132529 SE(50)+GM-CSF(2) 124,815+/-167,340529 SE(50)+GM-CSF(0.5)26,190 +/-40,254SE(1％) 694+/-1,325實(shí)施例7恒河猴的Th-CTL和C4-V3肽免疫接種設(shè)計(jì)了下面的實(shí)驗(yàn)用于直接比較一些肽和佐劑組合制劑在靈長(zhǎng)類動(dòng)物(恒河猴)中的效果以鑒定可能的肽/佐劑組合從而向人臨床試驗(yàn)推進(jìn)。具體是，將佐劑制劑529 SE和人GM-CSF與不完全弗氏佐劑(IFA)作比較進(jìn)行評(píng)估，結(jié)合(1)具有如下序列的SIV env-衍生的輔助T/SIV gag CTL肽偶聯(lián)物(ST1-p11C)Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val GlyLys Asn Val Tyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro TyrAsp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)或(2)具有如下序列的HIV-1衍生的C4-V3肽偶聯(lián)物(C4-V389.6P)Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val GlyLys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn AsnThr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly ArgAla Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)
研究設(shè)計(jì)總共8只動(dòng)物用于研究，如表15描述的4只Mamu-A*01+和4只Mamu-A*01-。
表15529 SE & GM-CSF與IFA相比分組# #動(dòng)物 動(dòng)物 免疫原性組合物佐劑1 2Mamu-A01+95X009ST1-p11C IFA93X0212 2Mamu-A01+98N002ST1-p11C 529 SE/GM-CSF98N0083 2Mamu-A01-98N007C4-V389.6PIFA98N0134 2Mamu-A01-95X011C4-V389.6P529 SE/GM-CSF96X004組1動(dòng)物接受0.5ml Th-CTL肽ST1-p11C(1.0mg/ml)與0.5ml IFA制成油包水乳劑，總體積1.0ml。組2動(dòng)物接受0.5ml ST1-p11C(1.0mg/ml)，加250μg人GM-CSF和50μg529 SE總體積1.0ml，最終油濃度為1％。組3動(dòng)物接受0.5ml C4-V389.6P肽(2.0mg/ml)與0.5ml IFA制成油包水油乳劑，總體積1.0ml。最后組4動(dòng)物接受0.5ml C4-V389.6P肽(2.0mg/ml)加250μg人GM-CSF和50μg529 SE總體積1.0ml，終油濃度為1％。
所有動(dòng)物按第0、4和8周的時(shí)間表進(jìn)行肌肉注射免疫接種。在每次免疫接種前馬上和之后1或2周采取外周血樣品，通過四聚物染色、p11C(Cys Thr Pro TyrAsp Ile Asn Gln Met；SEQ ID NO3，氨基酸19-27)-特異性ELISPOT反應(yīng)和大批量培養(yǎng)CTL反應(yīng)(組1和2)以及用于肽特異抗體應(yīng)答(組1-4)監(jiān)測(cè)CTL誘導(dǎo)。
安全和耐受性ST1-p11C+IFAST1-p11C+IFA制劑在組1動(dòng)物一部位3次肌肉注射伴有，顯著的注射部位反應(yīng)。一動(dòng)物(93x021)第二次免疫接種后兩周在注射部位發(fā)生了1.5cm大小膿腫。另一動(dòng)物(95x009)也在第三次穿透皮膚和需要敷料的免疫接種后兩周在注射部位發(fā)生了2cm大小膿腫。
ST1-p11C+529 SE/GM-CSFST1-p11C+529 SE/GM-CSF制劑在組2動(dòng)物一位置3次肌肉注射伴有微弱的副作用。組2二只動(dòng)物在第8周接受第三次免疫接種后不久都嘔吐。沒有發(fā)現(xiàn)其它的副作用。
C4-V389.6P+IFAC4-V389.6P+IFA制劑在組3動(dòng)物一位置3次肌肉注射，伴有顯著的注射部位反應(yīng)。一動(dòng)物(980n013)第二次免疫接種后一周在注射部位發(fā)生了1.0cm大小膿腫。另一動(dòng)物(98n007)在第二次免疫后一周注射部位也出現(xiàn)31.5cm大小膿腫，此動(dòng)物的膿腫四周后需要引流和敷料包扎。
C4-V389.6P+529 SE/MC-CSFC4-V389.6P+529 SE/GM-CSF制劑在組4動(dòng)物一位置3次肌肉注射伴有一微弱的副作用。組4動(dòng)物之一(95x011)在第8周接受第三次免疫接種后不久嘔吐。沒有發(fā)現(xiàn)其它的副作用。
在所有接受IFA作為佐劑的組1和組3的動(dòng)物中，觀察到顯著的注射部位反應(yīng)。這些結(jié)果表明0.5ml IFA在一位置肌肉注射給予時(shí)耐受性差。同樣值得注意的是接受529 SE/GM-CSF作為佐劑的4只動(dòng)物中3只在第8周免疫接種后不久嘔吐。盡管所用麻醉劑(克他命)已知伴有嘔吐，但研究過程中沒記錄到其它的動(dòng)物嘔吐情況。此時(shí)，存在的證據(jù)不足以將動(dòng)物嘔吐歸因于529 SE/GM-CSF相關(guān)的副作用。
結(jié)果細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)(組1和2)的誘導(dǎo)新鮮血液p11C-四聚物染色免疫前、免疫后1和2周，用可溶MHC I型四聚物染色，篩選所有Mamu-A*01陽性動(dòng)物(組1和2)的新鮮分離外周血液是否存在p11C特異CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞。如表16所示，只有一只接受ST1-p11C肽加IFA的動(dòng)物(93x021)顯示了在未刺激的外周血液中有免疫接種-誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答證據(jù)。
表16新鮮分離的外周血液中p11C-四聚物染色和p11C特異性ELISPOT反應(yīng)的百分比第0周 第5周第6周免疫前 第二次免疫接種后1周 第二次免疫接種后2周ELISPOT ELISPOT ELISPOT新鮮血液新鮮血液新鮮血液#SPC#SPC#SPC動(dòng)物/制劑四聚物 每106四聚物 每106四聚物 每106(組) 染色a細(xì)胞 染色 細(xì)胞 染色 細(xì)胞95x009(1)ST1-p11C0.02 0.0 0.00 0.0 0.00 3.8+IFA93x021(1)ST1-p11C0.02 Ndb 0.15 56.3 0.12 21.9+IFA98n002(2)ST1-p11C0.00 0.6 0.05 0.0 0.01 6.3+529SE/GM-CSF98n008(2)ST1-p11C0.05 0.0 0.04 15.0 0.01 9.4+529SE/GM-CSF
第8周 第9周 第10周第二次免疫接種后4周第三次免疫接種后1周第三次免疫接種后2周動(dòng)物 制劑 新鮮血液ELISPOT新鮮血液ELISPOT新鮮血液ELISPOT95x009(1)ST1-p11C 0.00Nd 0.012.50.021.9+IFA93x021(1)ST1-p11C 0.02Nd 0.14Nd 0.02Nd+IFA98n002(2)ST1-p11C 0.06Nd 0.00Nd 0.003.8+529SE/GM-CSF98n008(2)ST1-p11C 0.02Nd 0.02Nd 0.000.0+529SE/GM-CSFa報(bào)告為新鮮血液CD3+CD8+淋巴細(xì)胞的p11C-四聚物染色陽性百分比；ND，沒做。
bNd＝無數(shù)據(jù)(在此表和隨后的表中)p11C特異性ELISPOT反應(yīng)為進(jìn)一步評(píng)估在組1和組2動(dòng)物中誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，用ELISPOT分析篩選新鮮分離外周血淋巴細(xì)胞是否存在p11C特異性CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞。如表16所示，只有用新鮮血液四聚物分析顯示出可檢測(cè)水平的p11C特異性CD8+淋巴細(xì)胞的動(dòng)物(93x021)，用ELISPOT分析具有可檢測(cè)的p11C特異CD8+T淋巴細(xì)胞。在所有情況下，p11C四聚物分析陽性反應(yīng)由陽性p11C特異ELISPOT反應(yīng)所確證。
體外肽p11C刺激后p11C特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答在一次提高分析前p11C特異性細(xì)胞數(shù)的努力中，用肽p11C和rhIL-2體外刺激新鮮分離外周血淋巴細(xì)胞。14天后，篩選所得效應(yīng)細(xì)胞是否存在p11C-四聚物結(jié)合以及在標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放CTL試驗(yàn)中功能性p11C特異性裂解活性。p11C-四聚物分析和功能性CTL試驗(yàn)結(jié)果列在表17中。在新鮮分離淋巴細(xì)胞中一致性顯示出p11C特異性免疫應(yīng)答的動(dòng)物93x021，第二次免疫接種后1周表現(xiàn)出非常高水平的四聚物結(jié)合及功能性CTL活性。這表明誘導(dǎo)了非常強(qiáng)的p11C特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。與新鮮分離的淋巴細(xì)胞中觀察到的結(jié)果相反，組2的一只動(dòng)物(98n 008，STI-p11C+529SE/GM-CSF)在第二次免疫接種后二周開始顯示出p11C特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的證據(jù)。然而，組2動(dòng)物觀察到的p11C特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答比組1反應(yīng)動(dòng)物中觀察到的程度明顯為低。
表17體外肽p11C刺激后p11C-四聚物染色和功能性p11C特異性CTL應(yīng)答的百分比第0周 第5周 第6周免疫前 第二次免疫接種后1周 第二次免疫接種后2周動(dòng)物/(組) 制劑 四聚物CTL四聚物 CTL四聚物CTL染色a20∶1 E∶Tb染色 20∶1 E∶Tb染色 20∶1 E∶Tb95x009(1) ST1-p11C 0.03 0.60.23 Nd 0.27 0.0+IFA93x021(1) ST1-p11C 0.03 0.034.31 66.3 15.15 4.69+IFA98n002(2) ST1-p11C 0.21 0.0Nd Nd 0.73 Nd+529SE/GM-CSF98n008(2) ST1-p11C 0.16 0.0Nd Nd 5.84 Nd+529SE/GM-CSF第8周第9周 第6周第二次免疫接種后4周 第三次免疫接種后1周 第三次免疫接種后2周動(dòng)物/ 制劑四聚物 CTL 四聚物CTL 四聚物CTL(組) 染色 20∶1E∶T 染色 20∶1 E∶T染色 20∶1 E∶T95x009(1) ST1-p11cNd Nd0.76 3.0 0.72 0.0+IFA93x021(1) ST1-p11cNd Nd4.90 7.3 NdNd+IFA98n002(2) ST1-p11cNd Nd0.07 5.7 0.39 0.0+529SE/GM-CSF98n008(2) ST1-p11cNd Nd2.24 11.4 5.00 0.0+529SE/GM-CSFa報(bào)告為CD3+CD8+培養(yǎng)細(xì)胞p11C-四聚物染色陽性的百分比。
b報(bào)告為在效靶比例(E∶T)為20∶1時(shí)p11C特異性裂解(負(fù)背景)的百分比。
細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分析為進(jìn)一步特征鑒定免疫原誘導(dǎo)的肽p11C特異性淋巴細(xì)胞的功能和表型特性，監(jiān)測(cè)了Th1型細(xì)胞因子INF-γ、TNF-α、IL-2和Th2型細(xì)胞因子IL-4的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。監(jiān)測(cè)了外周血淋巴細(xì)胞在最初體外刺激后在10μM肽p11C和rhIL-2存在情況下細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)。培養(yǎng)物隨后維持在40U/ml IL-2中14天。2周后，只用培養(yǎng)基或以10μM肽p11C+抗人CD28和抗人CD49d刺激培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。1小時(shí)后，細(xì)胞用Brefeldin A再處理5小時(shí)以使細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。隨后用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)(表18&19)。
如表18所示，體外肽p11C刺激后2周，組1動(dòng)物93x021(ST1-p11C+IFA)的CD3+外周血淋巴細(xì)胞，顯示出低水平Th1型細(xì)胞因子表達(dá)，低于所有活躍地分泌IN F-γ、TNF-α或IL-2細(xì)胞的1.5％。所有CD3+淋巴細(xì)胞的大約8％在體外肽p11C刺激后活躍地分泌Th2型細(xì)胞因子IL-4，發(fā)現(xiàn)IL-4分泌細(xì)胞限于CD3+CD4+淋巴細(xì)胞亞群。在短暫重接觸肽p11C后，p11C四聚物+和CD3+CD8+淋巴細(xì)胞亞群活躍也分泌Th1型細(xì)胞因子IN F-γ和TNF-α，但不能被誘導(dǎo)分泌顯著升高水平的IL-2。肽p11C重接觸后，Th2型細(xì)胞因子IL-4的分泌不受影響。
表18細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分析，組1動(dòng)物93x021，第二次免疫接種后2周淋巴細(xì)胞 培養(yǎng)基INF-γ 培養(yǎng)基TNFα亞群 P11CaS.I. p11C S.I.
bp11C-四聚物+977 27,61228.39020,342226.0bBulkCD3+7,628 65,5678.6 12,25651,3614.2bCD3+CD4+2,488 5,545 2.2 6,252 2,827 0.4bCD3+CD8+5,273 60,57311.56,865 48,4397.1IL-2 IL-4培養(yǎng)基p11C S.I. 培養(yǎng)基p11C S.I.
bp11C-四聚物+751 2,0042.7NdNdNdbBulk CD3+2,879 6,4632.278,06990,5631.2bCD3+CD4+1,377 1,6831.271,27581,4371.1bCD3+CD8+1,502 4,7833.26,794 9,126 1.3
表19細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分析，組2動(dòng)物98n008，第三次免疫接種后1周INF-γ TNFα淋巴細(xì)胞亞群 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基p11CaS.I. p11C S.I.
bp11C-四聚物+545 560 1.0 748 454 0.0bBulk CD3+6,829 10,4891.5 3,402 13,4434.0bCD3+CD4+3,310 3,789 1.1 1,428 2,567 1.8bCD3+CD8+3,189 6,825 2.1 2,587 11,3244.4IL-2 IL-4培養(yǎng)基p11C S.I.培養(yǎng)基 p11C S.I.
bp11C-四聚物+77456 5.9 nd nd ndbBulk CD3+385 2,868 7.4 219,789202,1220.9bCD3+CD4+1,379 1,761 1.3 170,804158,1750.9bCD3+CD8+362,095 58.249,053 44,083 0.9aS.I.，刺激指數(shù)b報(bào)告為每106CD3+細(xì)胞的所示細(xì)胞因子陽性染色數(shù)，負(fù)背景(同型對(duì)照)染色數(shù)。
如表19所示，體外肽p11C刺激后2周，組2動(dòng)物98n008(ST1-p11C+529SE/GM-CSF)的CD3+外周血液淋巴細(xì)胞，顯示出低水平的Th1型細(xì)胞因子表達(dá)，低于所有活躍分泌IN F-γ、TNF-α或IL-2細(xì)胞的1.0％。令人感興趣的是，所有CD3+淋巴細(xì)胞的大約20％活躍地分泌Th2型細(xì)胞因子IL-4，IL-4產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)量與組1動(dòng)物相比增加2.5倍。與組1動(dòng)物情況一樣，發(fā)現(xiàn)IL-4分泌細(xì)胞限于CD3+CD4+淋巴細(xì)胞亞群。在短暫重接觸肽p11C后，組2動(dòng)物的p11C四聚物+和CD3+CD8+淋巴細(xì)胞亞群可被刺激分泌TNFα，但不分泌INF-γ。與組1動(dòng)物相反，肽p11C重接觸后，顯示出CD3+CD8+細(xì)胞IL-2表達(dá)顯著升高。與組1動(dòng)物情況一樣，重接觸肽p11C后，Th2型細(xì)胞因子IL-4的分泌沒有改變。
結(jié)果免疫原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答(組1和2)為評(píng)估免疫原-特異性體液抗體應(yīng)答，測(cè)定了組1和2動(dòng)物免疫接種前立即及第二次和第三次免疫接種后1和2周血清抗ST1-p11C ELISA抗體滴度。結(jié)果總結(jié)于表20中。
表20用ST1-p11C免疫接種的恒河猴(組1和2)血清的ELISA終點(diǎn)滴度動(dòng)物 組別 制劑 周 ST1-p11C抗體滴度a95x0091 ST1-p11C+IFA 512,800612,80096,40010 12,80093x0211 ST1-p11C+IFA 551,2006102,400951,20010 51,20098x0022 ST1-p11C+529SE/GM-CSF5＜506＜5091,60010 ＜5098n0082 ST1-p11C+529SE/GM-CSF52006200912,80010 6,400a測(cè)定的抗體終點(diǎn)結(jié)合滴度作為實(shí)驗(yàn)/對(duì)照(E/C)OD讀數(shù)＞3.0的血漿最高稀釋度的倒數(shù)。
免疫原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答(組3和4)為評(píng)估免疫原-特異性和佐劑-特異性體液抗體應(yīng)答的誘導(dǎo)，測(cè)定了組3和組4動(dòng)物免疫接種前立即及第二次和第三次免疫接種后1和2周血漿抗C4-V389.6P和抗GM-CSF ELISA抗體滴度。結(jié)果總結(jié)于表21。結(jié)果表明在所有試驗(yàn)動(dòng)物中峰值血漿C4-V389.6P抗體滴度在第二次免疫接種后1周產(chǎn)生。組3動(dòng)物(C4-V389.6P+IFA)峰值血漿抗體滴度比組4(C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF)觀察到的峰值血漿抗體滴度高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。組4動(dòng)物顯示出低的但可檢測(cè)水平的抗GM-CSF抗體滴度，第三次免疫接種后1周達(dá)到峰值。
表21用C4-V389.6P免疫接種的恒河猴(組3和4)血漿的ELISA終點(diǎn)抗體滴度動(dòng)物/組 制劑周 C4-V3抗體抗人GM-CSF滴定度a抗體滴定度98n007(3)C4-V389.6P+IFA 5 102,400 ＜106 25,600 ＜109 25,600 ＜1010 25,600 ＜1098n013(3)C4-V389.6P+IFA 5 12,800 ＜106 6,400＜109 12,800 1010 12,800 ＜1096x004(4)C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF5 6,4003206 1,6001609 3,2002,56010 1,6001,28095x011(4)C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF5 1,6001606 800 809 1,6001,28010 1,6001,280a測(cè)定的抗體終點(diǎn)結(jié)合滴度作為實(shí)驗(yàn)/對(duì)照(E/C)OD讀數(shù)＞3.0的血漿最高稀釋度的倒數(shù)。
還監(jiān)測(cè)了組3和4動(dòng)物中中和抗體的誘導(dǎo)；結(jié)果總結(jié)在表22中。結(jié)果表明組3和組4動(dòng)物都產(chǎn)生能體外中和SHIV89.6病毒的中和抗體。組3動(dòng)物中觀察到的SHIV89.6中和抗體滴度普遍比組4動(dòng)物中觀察到的高。此外，最后一次免疫接種后，組3動(dòng)物的血清顯示出低水平的對(duì)抗難以中和的SHIV89.6p病毒株的中和活性。
表22用C4-V389.6P免疫接種的恒河猴(組3和4)血清終點(diǎn)中和抗體滴度動(dòng)物/組中和抗體a制劑周SHIV89.6SHIV89.6P98n007(3)C4-V389.6P+IFA 0 ＜10＜105 22 ＜106 46 ＜109 113 461074 7198n013(3)C4-V389.6P+IFA 0 ＜10＜105 12 ＜106 19 ＜109 36 181022 ＜1096x004(4)C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF0 ＜10＜105 ＜10＜106 ＜10＜109 26 ＜1010＜10＜1095x011(4)C4-V389.6P+529 SE/GM-CSF0 ＜10＜105 11 ＜106 ＜10＜109 19 ＜1010＜10＜10a中和抗體滴度是根據(jù)中性紅攝取測(cè)定保護(hù)50％細(xì)胞避免病毒誘導(dǎo)的殺傷時(shí)相應(yīng)的血清稀釋度。
實(shí)施例8用Aβ1-42和佐劑處理的PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠的治療效果研究設(shè)計(jì)了下列實(shí)驗(yàn)以比較一些佐劑組合制劑在PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠中測(cè)試Aβ1-42肽的治療效果。
研究設(shè)計(jì)將十個(gè)半到十二個(gè)半月齡PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠(雄性和雌性)40只小鼠分成四組，每組按年齡、性別和轉(zhuǎn)基因親代盡可能接近互相匹配挑選。分組如表23所描述表23轉(zhuǎn)基因小鼠處理分組組別 佐劑 劑量 Aβ1-42肽劑量 起始數(shù) 結(jié)束數(shù)1 MPL SE 25μg 75/60μg 40 352 MPL SE+GM-CSF25μg/10μg 64/60μg 41 343 529+GM-CSF 25μg/10μg 64/60μg 40 314 PBS nana 40 37Aβ1-42肽購自Elan制藥公司，529 SE和MPLTMSE購自Corixa，小鼠GM-CSF購自Biosource。所有小鼠在第0、2、4、8、12、16、20和24周接受注射。小鼠在注射后5-7天，第二次注射后采血。組1、2和3用200μl體積皮下注射，而組4接受250μl皮下劑量。動(dòng)物在研究的第25周處死。使用最高光密度讀數(shù)值50％時(shí)的稀釋度獲得滴度。
結(jié)果免疫原性和抗體應(yīng)答所有組在第二次(RC529+GM-CSF)或第三次采血(MPLTMSE，MPLTMSE+GM-CSF)達(dá)到它們抗Aβ1-42肽抗體的峰值幾何平均值滴度(GMT)(見圖1)。在峰值GMT時(shí)，MPLTMSE+GM-CSF為16,400，而529+GM-CSF為13,400或MPLTMSE對(duì)照9,700的約1.5倍。然而，兩種含GM-CSF的制劑(組2和3)滴度跌回到MPLTMSE對(duì)照的接近水平，MPLTMSE的最終GMTs為4600，MPLTMSE+GM-CSF的為5350，529 SE+GM-CSF的為4650。
為確定兩種含GM-CSF制劑的滴度最終下降是否由于抗GM-CSF抗體應(yīng)答所致，采用ELISA以確定是否在免疫接種過程中形成了抗GM-CSF抗體。在此實(shí)驗(yàn)中滴定了所有接受GM-CSF動(dòng)物的血清抗所用的小鼠GM-CSF的抗體。在任何處理動(dòng)物中未發(fā)現(xiàn)抗GMCSF抗體的證據(jù)(數(shù)據(jù)未列出)。
腦Aβ水平所有三個(gè)處理組在PDAPP小鼠腦的皮質(zhì)區(qū)域顯著減少了總Aβ肽(圖2-個(gè)體結(jié)果；表24-匯合結(jié)果)和Aβ1-42(圖3-個(gè)體結(jié)果；表25-匯合結(jié)果)的積聚。如前所述(54)使用胍溶解的腦勻漿進(jìn)行了AβELISAs(總的和1-42形式)。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較使用顯著性Mann-Whitney測(cè)試。
表24皮層總Aβ水平PBS MPL SE MPL SE+ 529 SE+GM-CSF GM-CSF中值(ng/g)6,4781,707 925 1,313范圍 64-17,20833-8,50167-5,29379-5,271下降％--- 74 86 80P值 --- ＜0.0001＜0.0001＜0.0001(M-W)N 37 35 34 31表25皮層Aβ水平PBS MPL SE MPL SE+ 529 SE+GM-CSF GM-CSF中值(ng/g) 5,6091,799 779 1,127范圍 284-14,004 10-6,71543-4,82429-4,442下降％ --- 68 86 80P值 --- ＜0.0001＜0.0001＜0.0001(M-W)N36 35 34 31淀粉樣負(fù)擔(dān)淀粉樣變性病程度可用前面描述的免疫組織化學(xué)方法(55)在前皮層定量測(cè)定。所有三個(gè)處理組顯示出淀粉樣負(fù)擔(dān)顯著下降(圖4-個(gè)體結(jié)果；表26-匯合結(jié)果)。
表26前皮層淀粉樣負(fù)擔(dān)PBS MPL SE MPL SE+ 529 SE+GM-CSF GM-CSF中值(％AB)7.98 0.49 0.000.04范圍 0.00-27.37 0.00-9.630.00-.830.00-5.53下降％------ 94 100 99.5P值 ------ ＜0.0001 ＜0.0001＜0.0001(M-W)N 29 33 29 30神經(jīng)炎負(fù)擔(dān)用前面描述的免疫組織化學(xué)方法(55)評(píng)估了對(duì)前皮層神經(jīng)炎營(yíng)養(yǎng)失調(diào)發(fā)展的處理效果。所有三個(gè)處理組顯示神經(jīng)炎負(fù)擔(dān)程度相對(duì)PBS對(duì)照顯著減少(圖5-個(gè)體結(jié)果；表27-匯合結(jié)果)。
表27前皮層神經(jīng)炎負(fù)擔(dān)PBS MPL SE MPL SE+ 529 SE+GM-CSFGM-CSF中值(％NB) 0.35 0.14 0.04 0.02范圍 0.00-1.210.00-0.820.00-0.60 0.00-0.91下降％ --- 60 8895P值--- ＜0.0153 ＜0.0001 ＜0.0001(M-W)N 29 33 2930星形膠質(zhì)細(xì)胞增生后夾肌皮層中星形膠質(zhì)細(xì)胞增生程度如前所述(55)進(jìn)行定量測(cè)定。含GM-CSF處理組顯示顯著下降的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生(圖6)。
實(shí)施例9短尾猿的C4(E9V)-V389.6P肽免疫接種本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃u(píng)估HIV-1 ENV-衍生肽偶聯(lián)物、C4(E9V)-V389.6P，在有或沒有本發(fā)明佐劑組合制劑用于另一靈長(zhǎng)類動(dòng)物短尾猴時(shí)的免疫源性。實(shí)施例7描述的C4-V389.6P肽通過改變第9氨基酸殘基谷氨酸為纈氨酸進(jìn)行了修飾。使用命名為C4(E9V)-V389.6P的所得肽的偶聯(lián)物，有如下序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val GlyLys Ala Met Tyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn AsnThr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly ArgAla Phe Tyr Ala Arg Arg (SEQ ID NO5)。此肽C4區(qū)谷氨酸變?yōu)槔i氨酸在小鼠模型中提高了該肽的免疫原性，超過未修飾序列。
此HIV-1 ENV-衍生肽能在小鼠中誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。然而，由于難于將小鼠結(jié)果外推到人，必須在繼續(xù)進(jìn)入人工期臨床試驗(yàn)之前在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物上測(cè)試此可能的HIV-1免疫原性組合物。在此實(shí)驗(yàn)中，評(píng)估了肌肉(IM)和鼻內(nèi)(IN)給予途徑。動(dòng)物在第0、4、8、18和23周免疫接種5次。每周收集血液樣品和子宮頸陰道及粘膜洗液和分析是否存在針對(duì)此免疫原性組合物的抗體直至25周。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)總共8只短尾猴，每組4只(表28)，用于該實(shí)驗(yàn)。組1未接受佐劑；組2接受佐劑制劑529 SE加GM-CSF。動(dòng)物在動(dòng)物飼養(yǎng)在保護(hù)設(shè)施中和評(píng)估。
表28529 SE加GM-CSF與無佐劑相比分組#免疫原 佐劑 途徑1C4(E9V)-V389.6P肽 無 鼻內(nèi)2C4(E9V)-V389.6P肽 529 SE/GM-CSF肌肉內(nèi)免疫接種所有鼻內(nèi)免疫接種用100μl劑量鼻噴霧裝置進(jìn)行。所有肌肉注射用針和注射器注入四頭肌肌肉。所有動(dòng)物按第0、4、8、18和23周時(shí)間表免疫接種。
制劑組11000μg C4(E9V)-V389.6P肽溶于無菌生理鹽水中，終體積200μl(100μl每鼻孔)。
組21000μg C4(E9V)-V389.6P肽，50μg 529 SE和250μg人GM-CSF，最終油濃度1％，終體積1.0ml(肌肉注射500μl/每四頭肌)。
用于監(jiān)測(cè)免疫原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答試驗(yàn)所有動(dòng)物免疫接種前刻和之后用以下試驗(yàn)密切監(jiān)測(cè)免疫原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答(1)用ELISA測(cè)血清抗C4(E9V)-V389.6P肽IgG血清抗體滴定度。
(2)用ELISA測(cè)粘膜(子宮頸陰道，鼻)抗C4(E9V)-V389.6P肽IgG抗體滴度。
結(jié)果免疫原安全性和耐受性當(dāng)單獨(dú)或加入佐劑529 SE/GM-CSF給予時(shí)，C4(E9V)-V389.6P肽極其良好地耐受。通過肌肉途徑用針和注射器免疫接種的動(dòng)物，沒有發(fā)現(xiàn)注射部位副作用反應(yīng)。每次注射免疫原后緊接在24小時(shí)內(nèi)密切監(jiān)測(cè)所有動(dòng)物體溫變化。在研究中沒有任何動(dòng)物任何時(shí)間表現(xiàn)異常升高的體溫讀數(shù)(數(shù)據(jù)未列出)。
免疫原-特異性血清抗體應(yīng)答所有動(dòng)物血清樣品在每次免疫接種前立即及之后1和2周獲得(總共25周)。最后一次免疫接種后2周，分析所有血清樣品是否存在抗C4(E9V)-V3肽IgG抗體。鼻內(nèi)免疫接種的組1動(dòng)物(只有C4(E9V)-V389.6P肽)沒能顯示高于免疫前水平的血清抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗體滴度(圖7)。相反，組2動(dòng)物(肌肉注射C4(E9V)-V389.6P+529 SE/GM-CSF)產(chǎn)生了顯著水平的血清C4(E9V)-V3-特異性IgG抗體(圖7)。報(bào)告的終點(diǎn)滴度幾何平均值用各動(dòng)物最低滴度計(jì)算，是同樣稀釋度的混合原初血清讀數(shù)的3倍。
組1動(dòng)物(無佐劑)子宮頸陰道灌洗液樣品抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗體滴度只在第四次免疫接種后高于免疫前水平，但然后下降(圖8)。相反，組2動(dòng)物(有佐劑)子宮頸陰道灌洗液樣品抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗體滴度在第一次免疫接種后高于免疫前水平且隨后每次免疫接種后上升(盡管每次稍后有一些下跌)(圖8)。
組1動(dòng)物(無佐劑)鼻沖洗液抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗體滴度未能顯示高于免疫前水平(圖9)。相反，組2動(dòng)物(有佐劑)鼻沖洗液樣品產(chǎn)生了顯著水平的抗C4(E9V)-V389.6PIgG抗體滴度(圖9)。
參考文獻(xiàn)1.Mosmann，T.R.等，J.Immunol.，136，2348-2357(1986).
2.美國(guó)專利號(hào)5,057,5403.美國(guó)專利號(hào)6,113,918.
4.Ahlers，J.D.等，J.Immunol.，158，3947-3958(1997).
5.Scharton-Kersten，T.等，J.Immunol.，154，5320-5330(1995).
6.Ghalib，H.W.等，J.Immunol.，154，4623-4629(1995).
7.Murray，H.W.和Hariprashad，J.，.J.-Exp.Med.，181，387-391(1995).
8.美國(guó)專利號(hào)5,571,515.
9.美國(guó)專利號(hào)5,723,127.
10.美國(guó)專利號(hào)5,976,539.
11.Finkelman，F(xiàn).D.和Holmes，J.，Ann.Rev.Immunol.，8，303-333(1990).
12.Snapper，C.M.等，J.Exp.Med，175，1367-1371(1992).
13.Kobayashi，M.等，J.Exp.Med，170，827-845(1989).
14.出版的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O90/05147.
15.美國(guó)專利號(hào)5,078,996.
16.美國(guó)專利號(hào)5,229,496.
17.美國(guó)專利號(hào)5,073,627.
18.Alderson，M.R.等，J.Exp.Med.，178，669-674(1993).
19.Snapper，C.M.等，J.Immunol.，154，5842-5850(1995).
20.美國(guó)專利號(hào)5,679,356.
21.出版的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O00/69456.
22.美國(guó)專利號(hào)5,013,548.
23.美國(guó)專利號(hào)5,019,387.
24.Charbit，A.等，Vaccine，11，1221-1228(1993).
25.Natuk，R.J.等，AIDS Res.Hum.Retroviruses，9，395-404(1993).
26.Johnson，R.P.等，J.Virol.，68，3145-3153(1994).
27.Fuller，D.H.等，AIDS Res.Hum.Retroviruses，10，1433-1441(1994).
28.Berzofsky，J.A.等，J.Clin.Invest.，88，876-884(1991).
29.Palker，T.J.等，J.Immunol.，142，3612-3619(1989).
30.Hart，M.K.等，J.Immunol，145，2677-2685(1990).
31.Haynes，B.F.等，J.Immunol，151，1646-1653(1993).
32.Hart，M.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88，9448-9452(1991).
33.Bartlett，J.A.等，AIDS，12，1291-1300(1998).
34.Haynes，B.F.等，AIDS Res.Hum.Retroviruses，11，211-221(1998).
35.美國(guó)專利號(hào)5,861,243.
36.美國(guó)專利號(hào)5,932,218.
37.美國(guó)專利號(hào)5,939,074.
38.美國(guó)專利號(hào)5,993,819.
39.美國(guó)專利號(hào)6,037,135.
40.出版的歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?71,947.
41.美國(guó)專利號(hào)6,024,965.
42.Miller，M.D.等，J.Immunol.，147，320-329(1991).
43.Kuroda，M.J.等，J.Exp.Med，.187，1373-1381(1998).
44.Liao，H-X等，J.Virol，74，254-263(2000).
45.Staats，H.F.等，J.Immunol，157，462-472(1996).
46.Porgador，A.等，J.Immunol，158，834-841(1997).
47.出版的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O99/27944.
48.美國(guó)專利號(hào)4,666,829.
49.Games，D.等，Nature，373，523-527(1995).
50.出版的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O98/20734.
51.美國(guó)專利號(hào)5,830,877.
52.出版的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O99/51259.
53.美國(guó)專利號(hào)5,593,972.
54.Johnson-Wood，D.等，Proc.Natl.Acad.Sci，94，1550-1555(1997).
55.Schenk，D.等，Nature，400，173-177(1999)。
序列表<110>美國(guó)氰胺公司(American Cyanamid Company)<120>佐劑組合制劑<130>AM100449PCT<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>1Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro20 25 30Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys35 40<210>2<211>39<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>2Lys G1n Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly20 25 30Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys35
<210>3<211>28<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>3Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn Val Tyr Leu1 5 10 15Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu20 25<210>4<211>39<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>4Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly20 25 30Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg35<210>5<211>39<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>5Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly20 25 30Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg35
<210>6<211>42<212>PRT<213>淀粉樣前體蛋白的內(nèi)部片段<400>6Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>7<211>28<212>PRT<213>淀粉樣前體蛋白的內(nèi)部片段<400>7Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 25<210>8<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒的人工序列<400>8Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile1 5 10
權(quán)利要求
1.一種抗原組合物，其特征在于，它包含選自病原性病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲，或選自癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，或選自過敏原，或選自自體分子的抗原，和有效輔助劑量的以下物質(zhì)的組合(1)氨烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)，或其衍生物或類似物，和(2)細(xì)胞因子或淋巴因子，或所述細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑，其中所述佐劑組合可增強(qiáng)脊椎動(dòng)物宿主對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中，所選抗原是衍生自蛋白質(zhì)的多肽、肽或片斷。
3.如權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中，所述AGP以穩(wěn)定的水包油乳劑的形式施用。
4.如權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中，所述細(xì)胞因子或淋巴因子選自粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白細(xì)胞介素-12。
5.如權(quán)利要求4所述的抗原組合物，其中，所述細(xì)胞因子或淋巴因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
6.如權(quán)利要求5所述的抗原組合物，其中，所述AGP以穩(wěn)定的水包油乳劑的形式施用。
7.如權(quán)利要求4所述的抗原組合物，其中，所述細(xì)胞因子或淋巴因子是白細(xì)胞介素-12。
8.如權(quán)利要求7所述的抗原組合物，其中，所述AGP以穩(wěn)定的水包油乳劑的形式施用。
9.如權(quán)利要求1所述的抗原組合物，它還包括稀釋劑或載體。
10.如權(quán)利要求9所述抗原組合物，其中，所述AGP以穩(wěn)定的水包油乳劑的形式施用。
11.如權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中，所述AGP是2-[(R)-3十四酰氧十四酰氨基]乙基2-脫氧-4-氧-磷酰基-3-氧-[(R)-3-十四酰氧十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧十四酰氨基]-β-D-吡喃(型)葡萄糖苷(529)。
12.如權(quán)利要求1所述的抗原組合物，其中，所選抗原來自人類免疫缺陷性病毒(HIV)。
13.如權(quán)利要求12所述的抗原組合物，其中，所選HIV抗原是HIV蛋白質(zhì)，衍生自所述蛋白質(zhì)的多肽、肽或片斷。
14.如權(quán)利要求13所述的抗原組合物，其中，所選抗原是選自含有以下氨基酸序列的肽的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)；Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)；以及Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
15.如權(quán)利要求14所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽含有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)。
16.如權(quán)利要求14所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)
17.如權(quán)利要求14所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)。
18.如權(quán)利要求14所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)
19.如權(quán)利要求14所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
20.如權(quán)利要求12所述的抗原組合物，其中，所述AGP以穩(wěn)定的水包油乳劑的形式施用。
21.如權(quán)利要求12所述的抗原組合物，其中，所述細(xì)胞因子或淋巴因子選自粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白細(xì)胞介素-12。
22.如權(quán)利要求21所述的抗原組合物，其中，所述細(xì)胞因子或淋巴因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
23.如權(quán)利要求22所述的抗原組合物，其中，所述AGP以穩(wěn)定的水包油乳劑的形式施用。
24.如權(quán)利要求21所述的抗原組合物，其中，所述細(xì)胞因子或淋巴因子是白細(xì)胞介素-12。
25.如權(quán)利要求24所述的抗原組合物，其中，所述AGP以穩(wěn)定的水包油乳劑的形式施用。
26.如權(quán)利要求12所述的抗原組合物，它還包括稀釋劑或載體。
27.如權(quán)利要求26所述的抗原組合物，其中，所述AGP以穩(wěn)定的水包油乳劑的形式施用。
28.如權(quán)利要求12所述的抗原組合物，其中，所述AGP是529。
29.一種提高含有選自病源性病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲的抗原的抗原組合物引發(fā)脊椎動(dòng)物宿主免疫應(yīng)答能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用如權(quán)利要求1所述的抗原組合物。
30.一種提高含有選自病源性病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲的抗原的抗原組合物引發(fā)脊椎動(dòng)物宿主免疫應(yīng)答能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用如權(quán)利要求9所述的抗原組合物。
31.一種提高含有HIV抗原的抗原組合物引發(fā)脊椎動(dòng)物宿主免疫應(yīng)答能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用如權(quán)利要求12所述的抗原組合物。
32.一種提高含有HIV抗原的抗原組合物引發(fā)脊椎動(dòng)物宿主免疫應(yīng)答能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用如權(quán)利要求26所述的抗原組合物。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所選抗原是選自含有以下氨基酸序列的肽的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)；Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)；以及Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
34.如權(quán)利要求33所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽含有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)。
35.如權(quán)利要求33所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)
36.如權(quán)利要求33所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)。
37.如權(quán)利要求33所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)
38.如權(quán)利要求33所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
39.一種提高含有選自病源性病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲的抗原的抗原組合物引發(fā)脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用如權(quán)利要求1所述的抗原組合物。
40.一種提高含有選自病原性病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲的抗原的抗原組合物引發(fā)脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用如權(quán)利要求9所述的抗原組合物。
41.一種提高含有HIV抗原的抗原組合物引發(fā)脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用如權(quán)利要求12所述的抗原組合物。
42.一種提高含有HIV抗原的抗原組合物誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用如權(quán)利要求26所述的抗原組合物。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中，所選抗原是選自含有以下氨基酸序列的肽的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)；Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)；Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)；以及Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
44.如權(quán)利要求43所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽含有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO1)。
45.如權(quán)利要求43所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys(SEQ ID NO2)
46.如權(quán)利要求43所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Arg Gln Ile Ile Asn Thr Trp His Lys Val Gly Lys Asn ValTyr Leu Glu Gly Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu(SEQ ID NO3)。
47.如權(quán)利要求43所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO4)
48.如權(quán)利要求43所述的抗原組合物，其中，所述HIV肽具有以下氨基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Val Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Glu Arg Leu SerIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Arg Arg(SEQ ID NO5)。
49.一種提高含有選自癌細(xì)胞、或腫瘤細(xì)胞的癌抗原或腫瘤相關(guān)抗原的抗原組合物在脊椎動(dòng)物宿主中引發(fā)治療或預(yù)防性抗癌效應(yīng)能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用一種抗原組合物，該此組合物包含選自癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的所述癌抗原或腫瘤相關(guān)抗原和有效輔助劑量的以下物質(zhì)的組合(1)AGP，或其衍生物或類似物，和(2)細(xì)胞因子或淋巴因子，或所述細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑。
50.一種提高含有所選的過敏原的抗原組合物調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物宿主過敏性反應(yīng)能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用一種抗原組合物，此組合物包含所述過敏原和有效輔助劑量的以下物質(zhì)的組合(1)AGP，或其衍生物或類似物，和(2)細(xì)胞因子或淋巴因子，或所述細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑。
51.一種抗原組合物，它含有選自宿主在不良方式、數(shù)量或位置下產(chǎn)生的分子或其部分的抗原，并包含有效輔助劑量的以下物質(zhì)的組合(1)AGP，或其衍生物或類似物，和(2)細(xì)胞因子或淋巴因子，或所述細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑，以降低這種不良作用。
52.如權(quán)利要求51所述的抗原組合物，其中，所選抗原是衍生自淀粉樣前體蛋白的多肽、肽或片斷，或它們的抗體。
53.如權(quán)利要求52所述的抗原組合物，其中，所選抗原是Aβ肽或Aβ肽的片斷，所述Aβ肽是淀粉樣前體蛋白質(zhì)的內(nèi)在39-43氨基酸片斷。
54.如權(quán)利要求53所述的抗原組合物，其中，所選抗原是含有以下氨基酸序列的Aβ肽Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO6)。
55.如權(quán)利要求54所述的抗原組合物，其中，所述AGP是529。
56.一種提高抗原組合物能力的方法，所述抗原組合物含有選自宿主在不良方式、數(shù)量或位置下產(chǎn)生的分子或其部分的抗原，并包含有效輔助劑量的以下物質(zhì)的組合(1)AGP，或其衍生物或類似物，和(2)細(xì)胞因子或淋巴因子，或所述細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑，以降低這種不良作用。
57.一種增強(qiáng)抗原組合物在脊椎動(dòng)物宿主中預(yù)防或治療以淀粉樣沉積為特征的疾病的能力的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述宿主施用衍生自淀粉樣前體蛋白的多肽、肽或片斷，或它們的抗體，和有效輔助劑量的以下物質(zhì)的組合(1)AGP，或其衍生物或類似物，和(2)細(xì)胞因子或淋巴因子，或所述細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中，所選抗原是Aβ肽或Aβ肽的片斷，所述Aβ肽是淀粉樣前體蛋白質(zhì)的內(nèi)在39-43氨基酸片斷。
59.如權(quán)利要求58所述的抗原組合物，其中，所選抗原是含有以下氨基酸序列的Aβ肽Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO6)。
60.如權(quán)利要求59所述的抗原組合物，其中，所述AGP是529。
61.一種佐劑制劑，其特征在于，所述制劑含有以下物質(zhì)的組合(1)氨烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)，或其衍生物或類似物，和(2)細(xì)胞因子或淋巴因子，或所述細(xì)胞因子或淋巴因子的激動(dòng)劑。
62.如權(quán)利要求61所述的佐劑制劑，其中，所述AGP以穩(wěn)定的水包油乳劑的形式施用。
63.如權(quán)利要求61所述的佐劑制劑，其中，所述細(xì)胞因子或淋巴因子選自粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白細(xì)胞介素-12。
64.如權(quán)利要求61所述的佐劑制劑，它還包括稀釋劑或載體。
65.如權(quán)利要求61所述的佐劑制劑，其中，所述細(xì)胞因子或淋巴因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
66.如權(quán)利要求61所述的佐劑制劑，其中，所述細(xì)胞因子或淋巴因子是白細(xì)胞介素-12。
67.如權(quán)利要求61所述的佐劑制劑，其中，所述AGP是529。
全文摘要
氨烷基葡糖胺磷酸鹽化合物，或其衍生物或類似物的應(yīng)用，與細(xì)胞因子或淋巴因子如粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子或白細(xì)胞介素－12組合，可用作抗原組合物中的佐劑組合以提高脊椎動(dòng)物宿主對(duì)所選抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K39/39GK1533285SQ01821386
公開日2004年9月29日 申請(qǐng)日期2001年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月10日
發(fā)明者M·哈根, M 哈根 申請(qǐng)人:惠氏控股有限公司