專利名稱：aopB基因,蛋白,同系物,片段和它們的變體,以及它們?cè)诩?xì)胞表面展示方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該項(xiàng)發(fā)明是關(guān)于根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的AopB外膜蛋白、它的變體、同系物、片段和相應(yīng)的DNA分子，它們可用于細(xì)菌細(xì)胞表面的蛋白展示。
背景技術(shù)：
分子展示技術(shù)已發(fā)展用于構(gòu)建和篩選多肽與抗體展示庫(kù)，并用于開(kāi)發(fā)重組疫苗、吸附劑、重組生物催化劑，以及用于診斷和分析的固相試劑。分子展示技術(shù)的概念在于它提供了基因型(如抗體的可變區(qū)基因)和表型(如抗原結(jié)合)之間的物質(zhì)連接，達(dá)到同時(shí)篩選編碼欲求功能(如結(jié)合)蛋白的基因的目的。
噬菌體展示已經(jīng)用于探明多肽-配體之間的相互作用和廣泛的應(yīng)用于高親和蛋白的分離，包括抗體(Winter G，Milstein C.1991.Man-madeantibodies.Nature 349293-299；Vaughan T.J.，Williams A.J.，Pritchard K.，Osbourn J.K.，Pope A.R.，Earnshaw J.C.，McCafferty J.，Hodits R.A.，Wilton J.，Johnson K.S.1996.Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolatedfrom a large non-immunized phage display library.Nat Biotechnol 14309-314).噬菌體庫(kù)的篩選過(guò)程通常是用固定后的配體進(jìn)行重復(fù)的噬菌體捕獲和洗脫，然后將噬菌體在細(xì)菌中加以擴(kuò)增。最近提出一種展示技術(shù)是應(yīng)用核糖體使多肽和其編碼RNA在體外加以連接(Hanes J.，Pluckthun A.1997.Invitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display.Proc Natl Acad Sci USA 944937-42)。然而，在這兩種方法中使用的噬菌體和核糖體都不能夠自我復(fù)制，而且太小以致于不能夠利用強(qiáng)有力的細(xì)胞分選技術(shù)例如熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)的協(xié)助。
FACS可有助于高效大量篩選在細(xì)菌表面展示的蛋白或抗體庫(kù)，因?yàn)槠涫褂玫捏w積相對(duì)大的細(xì)菌細(xì)胞能讓該系統(tǒng)挑選可與熒光標(biāo)記后的配體高親和、高特異性結(jié)合的克隆(Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of an optimized expression system for the screening ofantibody libraries displayed on the Escherichia coli surface.Protein Eng.12613-21；Steidler L；Viaene J；Fiers W；Remaut E.1996.Functional display of aheterologous protein on the surface of Lactococcus lactis by means of the cellwall anchor of Staphylococcus aureus protein A.Immunotechnology.297-102；Andreoni C，Goetsch L，Libon C，Samuelson P，Nguyen TN，Robert A，Uhlen M，Binz H，Stahl S.1997.Flow cytometric quantification of surface-displayedrecombinant receptors on staphylococci.Biotechniques.23696-702，704)。使用當(dāng)前的高速細(xì)胞分選儀，1小時(shí)可以分選出108個(gè)細(xì)胞，其篩選量類似于通過(guò)噬菌體庫(kù)篩選可獲得的結(jié)果。因而，細(xì)胞表面展示結(jié)合FACS為蛋白工程提供了非常重要可供選擇的展示技術(shù)。噬菌體展示方法是為靈敏的親和篩選而設(shè)計(jì)，它依賴于單個(gè)分子的結(jié)合或者通過(guò)gpIII融合的單價(jià)展示。相對(duì)而言，細(xì)胞表面方法通常每個(gè)細(xì)胞可以獲得104-105個(gè)拷貝。從而，在穩(wěn)定性或表達(dá)水平方面的隨機(jī)變異不會(huì)影響到細(xì)胞表面庫(kù)的篩選。
細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的發(fā)展起始于小的肽融合到一些外膜蛋白，例如OmpA，LamB，和PhoE后可以定位到大腸埃希氏菌(Escherichia coli)的細(xì)胞表面(Charbit A，Boulain J.C，Ryter A，Hofnung M.1986.Probing the topologyof a bacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitopeexpression at the cell surface.EMBO J.53029-37；Freudl R，MacIntyre S，Degen M，Henning U.1986.Cell surface exposure of the outer membraneprotein OmpA of Escherichia coli K-12.J Mol Biol.188491-494；Agterberg M，Adriaanse H，Tommassen J.1987.Use of outer membrane protein PhoE as acarrier for the transport of a foreign antigenic determinant to the cell surface ofEscherichia coli K-12.Gene.59145-50)。在細(xì)菌細(xì)胞表面表達(dá)蛋白的最吸引人的應(yīng)用之一就是可以用來(lái)開(kāi)發(fā)活的細(xì)菌疫苗。在細(xì)菌細(xì)胞表面展示抗原被認(rèn)為是有利的，因?yàn)楸┞对诒砻娴目乖欣诿庖呦到y(tǒng)的識(shí)別，而且，外膜上的脂多糖可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)，還可能作為錨定在細(xì)胞表面多肽的輔助因子發(fā)揮作用(Lee J.S.，Shin K.S.，Pan J.G.，and Kim C.J.2000.Surface-displayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine.Nat.Biotechnol.18645-648)。另外，細(xì)菌還有容易操作、制造和流通成本低的優(yōu)點(diǎn)。這種方法產(chǎn)生新的重組疫苗目前已經(jīng)有成功的報(bào)道(Kim EJ；Yoo SK.1999.Cellsurface display of hepatitis B virus surface antigen by using Pseudomonassyringae ice nucleation protein.Lett Appl Microbiol 29292-297；Lee J.S.，ShinK.S.，Pan J.G.，and Kim C.J.2000.Nat.Biotechnol.18645-648)。細(xì)菌表面展示系統(tǒng)另外的應(yīng)用包括生產(chǎn)用于生物除污的全細(xì)胞吸附劑和新的生物催化劑(Kim YS；Jung HC；Pan JG.2000.Bacterial cell surface display of an enzymelibrary for selective screening of improved cellulase variants.Appl EnvironMicrobiol.66788-793；Jung HC；Lebeault JM；Pan JG.1998.Surface displayof Zymomonas mobilis levansucrase by using the ice-nucleation protein ofPseudomonas syringae.Nat Biotechnol.16576-80)。
普遍應(yīng)用的Lpp-OmpA表面展示系統(tǒng)包括三部分信號(hào)序列和成熟的大腸埃希氏菌脂蛋白N端開(kāi)始的9個(gè)氨基酸(Lpp)，大腸埃希氏菌外膜蛋白OmpA的46-159位氨基酸，和過(guò)客(passenger)蛋白(Francisco JA，Earhart CF，Georgiou G.1992.Transport and anchoring of beta-lactamase to the extemalsurface of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci U S A.892713-2717)。這個(gè)系統(tǒng)已經(jīng)成功的用于展示β-內(nèi)酰氨酶(Francisco JA，Earhart CF，Georgiou G.1992.Proc Natl Acad Sci U S A.892713-2717)，綠色熒光蛋白(Shi，Huidong；Su，Wei Wen.2001.Display of green fluorescent protein on Escherichia coli cellsurface.Enzyme and Microbial Technology.2825-34)，單鏈Fv(scFv)庫(kù)(Daugherty PS；Chen G；Olsen MJ；Iverson BL，Georgiou G.1998.Antibodyaffinity maturation using bacterial surface display.Protein Eng.11825-32；Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of anoptimized expression system for the screening of antibody libraries displayed onthe Escherichia coli surface.Protein Eng.12613-21)，和最近的HIV反轉(zhuǎn)錄酶(Bumett MS，Wang N，Hofmann M，Kitto GB.2001.Potential live vaccines forHIV.Vaccine.19735-742)。然而，這個(gè)系統(tǒng)仍然有其局限性(1)當(dāng)Lpp-OmpA處于一個(gè)組成性表達(dá)的條件下，細(xì)胞的存活力非常低；因而必須使用一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控系統(tǒng)和一個(gè)合適的低拷貝質(zhì)粒來(lái)優(yōu)化展示系統(tǒng)，尤其是對(duì)于大的過(guò)客蛋白(Daugherty PS，Olsen MJ，Iverson BL，Georgiou G.1999.Development of an optimized expression system for the screening of antibodylibraries displayed on the Escherichia coli surface.Protein Eng.12613-21；Earhart C.F.2000.Use of an Lpp-OmpA fusion vehicle for bacterial surfacedisplay.Methods Enzymol.326506-516)。(2)這個(gè)系統(tǒng)不能展示象細(xì)菌的堿性磷酸酶(PhoA)一樣的二聚蛋白(Stathopoulos C，Georgiou G，Earhart CF.1996.Characterization of Escherichia coli expressing an Lpp′OmpA(46-159)-PhoAfusion protein localized in the outer membrane.Appl Microbiol Biotechnol.45112-119)。PhoA的功能需要二硫鍵的形成，其形成不能自發(fā)而是需要至少在二硫鍵形成中的催化作用(Bardwell JC，McGovern K，Beckwith J.1991.Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo.Cell 67581-589；Kamitani S，Akiyama Y，Ito K.1992.Identification andcharacterization of an Escherichia coli gene required for the formation ofcorrectly folded alkaline phosphatase，a periplasmic enzyme.EMBO J 1157-62).
很多活性蛋白和酶都是多亞基結(jié)構(gòu)，并且很多都需要通過(guò)二硫鍵進(jìn)行分子間和分子內(nèi)的相互作用。二硫鍵的形成和在壁膜間隙的過(guò)客蛋白的折疊會(huì)阻礙這些蛋白的有效展示。因而，在培養(yǎng)基中加入還原劑有助于提高CtxB域和PhoA的轉(zhuǎn)運(yùn)效率(Klauser T，Pohlner J，Meyer TF.1990.Extracellular transport of cholera toxin B subunit using Neisseria IgA proteasebeta-domainconformation-dependent outer membrane translocation.EMBO J.91991-1999；Stathopoulos et al.，1996；Suzuki T，Lett MC，Sasakawa C.1995.Extracellular transport of VirG protein in Shigella.J Biol Chem.27030874-30880)。然而，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入還原劑，還會(huì)打斷分子間和分子內(nèi)相互作用所需的二硫鍵。這會(huì)影響到一些酶或蛋白質(zhì)的活性和/或展示，也可能還會(huì)改變細(xì)菌的生長(zhǎng)和基因的表達(dá)，尤其是在大規(guī)模的應(yīng)用中，還可能會(huì)提高操作的成本，細(xì)胞表面展示技術(shù)的相關(guān)參考文獻(xiàn)包括美國(guó)專利5,348,867，美國(guó)專利5,516,637，美國(guó)專利5,866,344，美國(guó)專利6,274,345，美國(guó)專利6,300,065和美國(guó)專利6,190,662。
發(fā)明概要該項(xiàng)發(fā)明的一個(gè)方面是提供了包含編碼以下任一種多肽的核酸序列的核酸分子(a)SEQ ID No2；(b)包含從SEQ ID No2的N端開(kāi)始的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段；和(c)(a)或(b)的變體，其滿足(i)與(a)或(b)相應(yīng)的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)當(dāng)該變體在革蘭氏陰性菌中制備時(shí)，它是一種外膜蛋白。
包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段可至少包括了SEQ ID No2的N端區(qū)域。該發(fā)明的實(shí)施方案包括了SEQ ID No2的N端區(qū)至少125，134，172，183，207個(gè)氨基酸的片段。
該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了包含編碼以下任一種多肽的核酸序列的核酸分子(a)SEQ ID No4；(b)包含從SEQ ID No4的N端開(kāi)始的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，和(c)a)或(b)的變體，其滿足(i)與(a)或(b)相應(yīng)的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)當(dāng)該變體滿足如下條件時(shí)，它是一種外膜蛋白(1)在讀框內(nèi)與細(xì)菌的分泌信號(hào)和引導(dǎo)信號(hào)連接，(2)產(chǎn)生于革蘭氏陰性菌。
包含SEQ ID No4的N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段可至少包括了SEQ ID No2的N端區(qū)域。該發(fā)明的實(shí)施方案包含了SEQ ID No2N端區(qū)的至少102，111，149，160，184個(gè)氨基酸的片段。
該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是其提供了一種編碼一融合蛋白的核酸序列，上述的融合蛋白包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽由該項(xiàng)發(fā)明的核酸分子編碼。在該發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第二多肽被融合到第一多肽的C端。
該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了一個(gè)包含SEQ ID No1中的6至309核苷酸的土壤桿菌屬啟動(dòng)子。
本項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了一個(gè)分離出的5-100個(gè)核苷酸的探針或10-40個(gè)核苷酸的引物，其可與SEQ ID No1或3的核酸分子，或與該核酸分子的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的。
該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是其提供了一個(gè)表達(dá)載體，其包括本項(xiàng)發(fā)明中的核酸分子，它與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控序列可操作地連接。在該發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)調(diào)控序列含有aopB啟動(dòng)子；另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是大腸桿菌中的表達(dá)載體，其表達(dá)調(diào)控序列適合于在大腸桿菌中表達(dá)核酸。另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是土壤桿菌屬中的表達(dá)載體，它適合在土壤桿菌屬中表達(dá)核酸分子，尤其是在根癌土壤桿菌中。
該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一個(gè)由本發(fā)明的核酸分子或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的重組微生物。在該發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重組體微生物在其表面展示了本發(fā)明的多肽或融合蛋白。
該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了包括以下任一種氨基酸序列的多肽，(a)SEQ ID No2；(b)包含從SEQ ID No2的N端開(kāi)始的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段；和(c)(a)或(b)的變體，其滿足(i)與(a)或(b)相應(yīng)的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)如果這個(gè)變體制備于革蘭氏陰性細(xì)菌，那么它是一種外膜蛋白。
該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了包括以下任一種氨基酸序列的多肽(a)SEQ ID No4；(b)包含從SEQ ID No4的N端開(kāi)始的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，和(c)a)或(b)的變體，其滿足(i)與(a)或(b)相應(yīng)的多肽的氨基酸序列至少65％相同；和(ii)當(dāng)該變體滿足如下條件時(shí)，它是一種外膜蛋白(1)與細(xì)菌的分泌信號(hào)和引導(dǎo)信號(hào)在讀框內(nèi)連接，并且(2)產(chǎn)生于革蘭氏陰性菌。
該項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了生產(chǎn)本發(fā)明的多肽和融合蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)經(jīng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的微生物，所述表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明的多肽或融合蛋白的核酸分子，其中，該核酸分子與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控序列可操作地連接。
本項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是提供了能與本發(fā)明的多肽或融合蛋白中的載體蛋白特異性反應(yīng)的抗體。在該發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體為單克隆抗體。
本項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一個(gè)生產(chǎn)能夠在其表面展示過(guò)客蛋白的微生物的方法，該方法包括以下步驟(1)將表達(dá)載體導(dǎo)入到微生物中；和(2)培養(yǎng)從步驟(1)中得到的微生物，以表達(dá)蛋白。
該展示方法中的表達(dá)載體包含(a)編碼載體蛋白的核酸，載體蛋白可從本發(fā)明的多肽，特別是與AopB相關(guān)的蛋白以及AopB相關(guān)的外膜蛋白家族成員中選擇；載體蛋白需要適合用于微生物的展示，并帶有在微生物中有功能的細(xì)菌分泌信號(hào)。
(b)編碼過(guò)客蛋白的核酸，該核酸要與編碼載體蛋白的核酸在3′端框內(nèi)連接。
(c)編碼載體蛋白的核酸要與表達(dá)調(diào)控序列相連而起作用，該表達(dá)調(diào)控序列要適合在該微生物中表達(dá)編碼該載體蛋白的核酸。
該發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)調(diào)控序列含有aopB啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在展示方法中所用的微生物在酸性條件下培養(yǎng)。
在另一實(shí)施方案中，載體蛋白和展示方法中所用的微生物是在以下的組中進(jìn)行選擇(a)載體蛋白是與AopB相關(guān)的多肽、片段或其變體，并且，可用于展示的微生物是土壤桿菌屬，(b)載體蛋白包含RopB多肽序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是根瘤菌屬(Rhizobium)，(c)載體蛋白包含布魯氏菌屬(Brucella)外膜蛋白序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是布魯氏菌屬。
(d)載體蛋白包含Pap31多肽序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是巴爾通氏體屬(Bartonella)，(e)載體蛋白包含PomA多肽序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是巴斯德氏菌屬(Pasteurella)(Mannheimia)，(f)載體蛋白包含PPE多肽序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，并且可用于其展示的微生物是分枝桿菌屬(Mycobacterium)，(g)載體蛋白包含主要外膜蛋白序列N端150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，可用于其展示的微生物是嗜血菌屬(Haemophilus)，或(h)載體蛋白包含外膜孔多肽序列N端150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，可用于其展示的微生物是弧菌屬(Vibrio)。
在該發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，分泌信號(hào)和載體蛋白一起發(fā)揮作用，展示了包含SEQ ID No2中1-23氨基酸的過(guò)客蛋白，在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物為根癌土壤桿菌。
該發(fā)明的展示方法進(jìn)一步包含檢測(cè)所培養(yǎng)微生物表面是否帶有過(guò)客蛋白和選擇在表面帶有過(guò)客蛋白的微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該分析方法采用了熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。
本項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面提供了在土壤桿菌屬表面表達(dá)融合蛋白的方法，具體步驟包括(1)將載體導(dǎo)入土壤桿菌屬的細(xì)菌中；并且(2)培養(yǎng)由第一步得到的細(xì)菌，以表達(dá)融合蛋白；其所用載體包括(a)編碼該發(fā)明的融合蛋白的核酸序列，其中的融合蛋白帶有細(xì)菌的分泌信號(hào)；和(b)與編碼融合蛋白的核酸可操作連接的表達(dá)調(diào)控序列，其中，該表達(dá)調(diào)控序列是適合在土壤桿菌屬中表達(dá)所述編碼融合蛋白的核酸。
本項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一個(gè)能夠選擇編碼所需性質(zhì)多肽的核酸的方法，該方法包含本發(fā)明的展示方法，其中的過(guò)客蛋白是多種的、已推斷含有所需特性的多肽。這種方法進(jìn)一步含有檢測(cè)展示過(guò)客蛋白的微生物是否展示著過(guò)客蛋白的所需特性；選擇和分離在其表面上展示著所需特性過(guò)客蛋白的微生物；以及從生物中分離表達(dá)載體的步驟。
在選擇編碼具有所需性質(zhì)的多肽的核酸的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，過(guò)客蛋白是來(lái)自于抗體表達(dá)庫(kù)。欲求特性可以是與抗體特異的抗原的緊密結(jié)合、特異的抗原決定基的存在、或者是催化活性。
本發(fā)明的另一方面是提供一個(gè)從液體中去除污染物的方法，該方法包含該發(fā)明的展示方法，其中的過(guò)客蛋白能夠與污染物結(jié)合，而且這種方法進(jìn)一步包括用展示過(guò)客蛋白的微生物與含有污染物的液體在一定條件下接觸一段時(shí)間，所述條件有利于過(guò)客蛋白與污染物結(jié)合；然后將微生物從液體中去除的步驟。在其中的一個(gè)實(shí)施方案中，污染物是重金屬，而過(guò)客蛋白是金屬硫蛋白。
本發(fā)明的另一方面是提供一個(gè)可激發(fā)哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的方法，這種方法包括該發(fā)明的展示方法，其中的過(guò)客蛋白可以激發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)。這種方法進(jìn)一步包含在有利于哺乳動(dòng)物對(duì)過(guò)客蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的時(shí)間和條件下給藥展示著過(guò)客蛋白的微生物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，展示微生物是根癌土壤桿菌，它可用來(lái)當(dāng)作活的疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一個(gè)固相酶促反應(yīng)的方法，這個(gè)方法包括該發(fā)明的展示方法，其中的過(guò)客蛋白可以用來(lái)催化反應(yīng)，該方法進(jìn)一步包括使欲催化的反應(yīng)底物在有利于酶促反應(yīng)的時(shí)間和條件下，與展示著過(guò)客蛋白的微生物接觸一段時(shí)間的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述過(guò)客蛋白是堿性磷酸酶。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一個(gè)提純化合物的方法，該方法包含該發(fā)明的展示方法，其中的過(guò)客蛋白能夠特異性地與該化合物結(jié)合，該方法進(jìn)一步包括使含有該化合物的組合物與展示著過(guò)客蛋白的微生物接觸，讓接觸時(shí)間和條件利于過(guò)客蛋白與化合物結(jié)合；在利于去除非特異性結(jié)合的污染物的條件下和時(shí)間內(nèi)，洗所述微生物；以及在利于打斷過(guò)客蛋白和化合物之間特異性結(jié)合的條件下和時(shí)間內(nèi)，從所述微生物洗脫得到所要提純的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物是抗體，所述過(guò)客蛋白是其特異性的抗原。


以下對(duì)附圖的描述有利于更深入的理解這項(xiàng)發(fā)明。
圖1指示的是aopB位點(diǎn)的序列和其相關(guān)的構(gòu)建體。
A.1.4kb的NheI片段的DNA序列包含了aopB和所推導(dǎo)出的AopB氨基酸序列。垂直的箭頭指示的是mini-Tn5轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)。被下畫(huà)線標(biāo)記的氨基酸是推測(cè)的信號(hào)肽。粗體顯示的是推測(cè)的核糖體結(jié)合部位SD序列(AGGAG)。水平箭頭指示的重復(fù)序列，其功能可能是不依賴于ρ因的轉(zhuǎn)錄終止子。
B.不同構(gòu)建體的遺傳和物理圖譜。垂直線上方的數(shù)字指示的是DNA序列的位置；圓括號(hào)中的數(shù)字指示的是在AopB中氨基酸的位置。套著方框的水平箭頭指示的是aopB的開(kāi)放讀框；黑色區(qū)域指示的是推測(cè)的信號(hào)肽?！糁甘镜氖莔ini-Tn5轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)。垂直的箭頭指示的是活性phoA-aopB融合體上TnphoA轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)。帶有垂直線的水平箭頭指示的是引入了限制性位點(diǎn)的PCR引物。
圖2示意的是aopB和ropB基因產(chǎn)物的氨基酸序列對(duì)比。這個(gè)對(duì)比是通過(guò)DNASIS程序完成的。陰影字母代表的是兩個(gè)基因產(chǎn)物中相同的氨基酸。
圖3示意的是aopB基因的Southern雜交分析。根癌土壤桿菌菌株全DNA的獲得與實(shí)施例1中提到的方法一樣，根癌土壤桿菌不同菌株的全DNA與泳道的對(duì)應(yīng)分別是GMI9023(泳道1)，A136(泳道2)，A6(泳道3)，C58(泳道4)和CGI1(泳道5)，苜蓿中華根瘤菌(Rhizobium meliloti)RCR2011全DNA對(duì)應(yīng)于泳道6。DNA用SphI消化，并用熒光素標(biāo)記的aopB探針進(jìn)行雜交。
圖4指示的是AopB蛋白在根癌土壤桿菌中的亞細(xì)胞定位。誘導(dǎo)的根癌土壤桿菌菌株C58細(xì)胞(泳道1，3，5，7，9，11)和CGI1細(xì)胞(泳道2，4，6，8，10，12)按照實(shí)施例1中介紹的進(jìn)行收集和分級(jí)分離為全細(xì)胞裂解物(CL)(泳道1和2)，周質(zhì)(P)(泳道3和4)，胞質(zhì)(C)(泳道5和6)，全膜(TM)(泳道7和8)，內(nèi)膜(IM)(泳道9和10)和外膜(OM)(泳道11和12)級(jí)分。然后將來(lái)自同一制品的樣品進(jìn)行SDS/12％PAGE凝膠電泳分離，之后將蛋白轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜上通過(guò)AopB抗體使其可見(jiàn)。
圖5示意的是對(duì)細(xì)菌表面的AopB進(jìn)行的檢測(cè)。根癌土壤桿菌A6010菌株按照實(shí)施例1描述的培養(yǎng)。得到的細(xì)胞直接用于與以下不同抗體的相互作用兔多克隆AopB抗體，小鼠多克隆VirJ抗體或小鼠單克隆GFP抗體。全細(xì)胞的ELISA檢測(cè)按照實(shí)施例1描述的進(jìn)行，誤差棒指示的是三次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖6示意的是用全細(xì)胞ELISA檢測(cè)AopB-GFP(A)和AopB-PhoA融合蛋白(B)在細(xì)胞表面展示的結(jié)果。按照實(shí)施例1中描述的方法對(duì)根癌土壤桿菌菌株C58(GFP-)，CG19(產(chǎn)生胞質(zhì)GFP)，CGI1(染色體上含有aopB-gfp)，C58(pJYH21)(質(zhì)粒上含有aopB-gfp)進(jìn)行培養(yǎng)、固定；并且用全細(xì)胞ELISA檢測(cè)AopB-GFP在細(xì)胞表面的展示(A)。質(zhì)粒pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207含有aopB-phoA融合體，其PhoA分別融合在AopB的39，125，134，172和207位氨基酸位點(diǎn)上。pJYH5包含野生型的aopB基因，而pJYH23含有由展示載體攜帶的phoA編碼序列。這些質(zhì)粒都被引入到C58菌株；含有這些質(zhì)粒的C58細(xì)胞再被用來(lái)用PhoA抗體進(jìn)行全細(xì)胞ELISA的方法檢測(cè)AopB-PhoA的展示(B)。誤差棒指示三次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖7示意的是通過(guò)流式細(xì)胞儀分析評(píng)估AopB-PhoA在細(xì)胞表面展示的結(jié)果。含有pJYH5，pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207的根癌土壤桿菌C58細(xì)胞按照實(shí)施例1中描述的在IB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。小鼠抗-AP抗體按1∶1000加入，羊抗小鼠r-PE偶聯(lián)物按照1∶100使用。總樣本數(shù)為10,000。GMean代表幾何平均值，幾何平均值則是所記錄細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。
圖8示意的是蛋白酶的可接近性(accessibility)分析的結(jié)果。包含pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207的根癌土壤桿菌菌株C58，CGI1，和C58在IB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。沖洗后，按照實(shí)施例1的方法在有和沒(méi)有胰蛋白酶的情況下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分別的處理。用抗-AopB抗體使AopB-GFP和AopB-PhoA融合蛋白可見(jiàn)，并且周質(zhì)蛋白ChvE用抗-ChvE抗體使其可見(jiàn)。
圖9示意的是展示載體pJYH20的物理圖譜。這個(gè)質(zhì)粒包含aopB啟動(dòng)子和編碼AopB由1到172位氨基酸的aopB的1到516bp。多接頭被引入到aopB的下游，以便于在aopB的開(kāi)放讀框內(nèi)克隆和融合編碼過(guò)客蛋白的外源基因。
圖10示意的是AopB-PhoA在不同條件下表達(dá)情況的檢測(cè)結(jié)果。根癌土壤桿菌菌株C58(pJYH23)，大腸埃希氏菌DH5α(pJYH23)和苜蓿中華根瘤菌RCR2011(pJYH23)在指定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。收集細(xì)菌細(xì)胞，并且通過(guò)抗-AP抗體使AopB172-PhoA可見(jiàn)。
圖11示意的是生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌表面展示的影響。包含質(zhì)粒pJYH5或pJYH23的根癌土壤桿菌菌株C58細(xì)胞置于MG/L培養(yǎng)基，在28℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后在OD600＝0.3時(shí)可以轉(zhuǎn)移到新鮮的AB或IB培養(yǎng)基，然后28℃培養(yǎng)18小時(shí)。展示效率通過(guò)全細(xì)胞ELISA確定。C58(pJYH5)作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
圖12示意的是流式細(xì)胞儀分析得到的AopB-PhoA展示結(jié)果。帶有pJYH5或pJYH23的根癌土壤桿菌在MG/L，AB或IB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。小鼠的抗-AP抗體按1∶1000加入，羊抗小鼠r-PE偶聯(lián)物按1∶100使用。全樣本為10,000，GMean代表幾何平均值，幾何平均值則是記錄細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。
發(fā)明詳述A.AOPB基因和AOPB蛋白根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)染色體基因aopB已經(jīng)被鑒定。這段基因與豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中編碼外膜蛋白的ropB基因有高度同源。通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入造成的aopB突變并不會(huì)影響細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。
在pH 5.5的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)的CGI1突變細(xì)胞(包含aopB-gfp融合體)在紫外照射下顯現(xiàn)強(qiáng)烈的熒光，而在中性的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞卻沒(méi)有熒光，這表明aopB基因可被酸性環(huán)境誘導(dǎo)。aopB編碼一條長(zhǎng)218個(gè)氨基酸的推測(cè)蛋白，其預(yù)計(jì)分子重量為22.8 kDa。TnphoA轉(zhuǎn)座子插入突變，亞細(xì)胞分級(jí)分離和全細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)均表明AopB是一個(gè)暴露在細(xì)菌細(xì)胞表面的外膜蛋白，并且非常嚴(yán)謹(jǐn)，不會(huì)在其他部位出現(xiàn)。
以下是所舉序列的描述SEQ ID No1包含aopB基因的核苷酸序列SEQ ID No2AopB的全長(zhǎng)氨基酸序列SEQ ID No3編碼AopB的aopB核苷酸序列，但缺少推定的信號(hào)序列SEQ ID No4 AopB的氨基酸序列，但缺少推定的信號(hào)肽序列SEQ ID No5引物p54SEQ ID No6引物p55SEQ ID No7引物p119SEQ ID No8引物p112SEQ ID No9引物p118SEQ ID No10GFPuvFh3SEQ ID No11GFPuvRp1SEQ ID No12PhoAfH3SEQ ID No13PhoAreP1AopB已經(jīng)被確定為革蘭氏陰性菌膜蛋白家族(此后稱為AopB相關(guān)膜蛋白)中的一員。這個(gè)蛋白族中包括RopB(60％氨基酸序列相似性)，布魯氏菌膜外的免疫原性蛋白(42-47％氨基酸序列相似性)，漢氏巴爾通氏體(Bartonella hensela)經(jīng)噬菌體侵染產(chǎn)生的Pap31(46％氨基酸序列相似性)，溶血巴斯德氏菌(Pasteurella(Mannheimia)haemolytica)外膜蛋白PomA(47％氨基酸序列相似性)，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的PPE(39％氨基酸序列相似性)，杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)的主要外膜蛋白(43％氨基酸序列相似性)，和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的外膜孔蛋白(40％氨基酸序列相似性)，還有假單胞菌(Pseudomonas)的孔蛋白F(OprF)的C端部分。
轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控序列可以是DNA的調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多腺苷酸信號(hào)、終止子、和可以為編碼序列在寄主細(xì)胞提供表達(dá)的序列。
“啟動(dòng)子序列”是DNA分子上的一段調(diào)控序列，能夠和細(xì)胞中的RNA聚合酶結(jié)合沿下游(3′方向)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄編碼序列。為了闡明該發(fā)明，啟動(dòng)子序列可以在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的3′端結(jié)合，并向上游(5′方向)延伸使其包括能夠起始轉(zhuǎn)錄的最少的堿基或者元件數(shù)目。在啟動(dòng)子序列內(nèi)有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(通常通過(guò)核酸酶S1作圖而確定的)，還有可以用于結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合區(qū)域(共有序列)。原核生物啟動(dòng)子除了含有-10和-35共有序列外還包括SD序列。
表達(dá)調(diào)控序列是一段操縱和控制另一段DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。編碼序列則“受控于”轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，它在細(xì)胞內(nèi)可被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)。
“分離的多核苷酸”被定義為是從其發(fā)生的環(huán)境中被去除而得的多核苷酸。分離的多核苷酸是結(jié)構(gòu)上不同于自然產(chǎn)生的多核苷酸。這個(gè)詞因此包括例如(a)一段DNA，其序列包括自然產(chǎn)生的基因組分子的部分序列，但是不包含該序列兩側(cè)的編碼序列；(b)一段被整合到載體或原核或真核基因組中的多核苷酸，但所產(chǎn)生的分子與所有自然條件下發(fā)生的載體或基因組DNA分子都不一樣；(c)一個(gè)分離的分子，例如cDNA，基因組片段，PCR產(chǎn)物片段或限制性酶切的片段；和(d)雜合基因的一部分的重組核苷酸序列，也就是編碼融合蛋白的基因。特別指出要排除在這個(gè)定義之外的是處于在含有以下的混合物中的多核苷酸(i)DNA分子、(ii)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、和(iii)細(xì)胞克隆，例如是出現(xiàn)在DNA文庫(kù)，如cDNA或基因組DNA文庫(kù)中的那些細(xì)胞克隆。
例如，一個(gè)DNA分子天然存在于細(xì)菌基因組或作為基因文庫(kù)的一部分時(shí)并不是分離而得的，但是如果該分子分離于細(xì)菌基因組中剩下的部分是由于比如說(shuō)發(fā)生了克隆事件(擴(kuò)增)而得，那么它就是分離的分子了。通常，分離的DNA分子不受DNA區(qū)域(例如，編碼區(qū)域)的限制，在自然發(fā)生的基因組中，它會(huì)緊鄰5′或3′端。這樣的分離的多核苷酸可以是載體或組合物或外源基因組的一部分，但仍然可以定義為分離的分子，因?yàn)樗鼈儾⒉皇窃谧匀磺闆r下的一部分。
本項(xiàng)發(fā)明的多核苷酸可以是RNA或DNA(cDNA，基因組DNA，或合成的DNA)，或其修飾物，變體、同系物或片段。其DNA可以是單鏈或雙鏈，并且，如果是單鏈可以是編碼鏈，也可以是非編碼鏈(反義鏈)。任何一個(gè)象SEQ ID NO1或3所編碼的本發(fā)明的多肽序列可以是(a)編碼序列，(b)由(a)所轉(zhuǎn)錄的核糖核苷酸序列，或(c)用冗余或簡(jiǎn)并的遺傳密碼子編碼相同多肽的編碼序列。
多肽或蛋白指的是不管長(zhǎng)度或翻譯后是否修飾(例如，糖基化或磷酸化)的任一氨基酸鏈，兩個(gè)詞在本申請(qǐng)中可以互換。
氨基酸序列可來(lái)源于SEQ ID NO2或4的同源的序列。象這里所用的“同源的氨基酸序列”是指在低于嚴(yán)格的熔解溫度(Tm)25-35℃下，其編碼序列可與SEQ ID NO1或3的任一部分核苷酸序列進(jìn)行雜交。其中同源的氨基酸序列是指與SEQ ID NO2或4中的氨基酸序列不同的氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，優(yōu)選是保守取代。這樣的序列也包含血清型變體(定義見(jiàn)下文)以及包含了缺失或插入，但仍保留所述多肽的原有遺傳特性如免疫活性的序列。優(yōu)選，這樣的序列要與SEQ ID NO2或4至少61％相同(例如，65％，68％，70％，73％，75％，78％相同)，優(yōu)選至少80％相同(例如，82％，85％，88％，90％，93％，95％，98％相同)。
同源的氨基酸序列包括與SEQ ID NO2或4序列相同或者實(shí)質(zhì)相同的序列。所謂“實(shí)質(zhì)相同的氨基酸序列”是指至少有90％(例如92％，94％，95％，96％，97％，98％)并優(yōu)選有99％與參考序列相同的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，同源序列可不同于參考序列，但這些變化多數(shù)是保守的氨基酸取代。
保守氨基酸的取代就是發(fā)生在同一類氨基酸中的取代。這些氨基酸類別包括，例如，極性不帶電荷的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；堿性氨基酸如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；和非極性氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
同源多聚核苷酸的定義與此類似。優(yōu)選同源序列是與SEQ ID No1或3的編碼序列至少有45％(例如50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，87％，90％，93％，96％)和優(yōu)選有99％相同的序列。
同源性通常由如Sequence Analysis Software Package of the GeneticsComputer Group的序列分析軟件(University of Wisconsin BiotechnologyCenter，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)來(lái)測(cè)定。氨基酸序列按最大一致性排列。間隙可以人為地在序列中加以引入以達(dá)到合適的排列。一旦最佳的排列建立后，就可以通過(guò)比較兩個(gè)序列在各個(gè)位置的氨基酸相對(duì)于所有位點(diǎn)的同一性來(lái)確定其同源性的水平。
這里所用的兩個(gè)氨基酸或核苷酸序列間的“百分比同源性”、“百分比同一性”或“百分比相似性”都是通過(guò)按照最高匹配原則排列而確定的?！巴恍浴被颉跋嗨菩浴睂?shí)質(zhì)上是通過(guò)巧妙的衡量方式并且可以通過(guò)現(xiàn)有的技術(shù)計(jì)算出來(lái)。這里用來(lái)比對(duì)兩個(gè)氨基酸或核苷酸序列同一性或相似性的計(jì)算機(jī)軟件是DNAStar(DNAStar Inc.，Madison，Wis.)。然而，其他的一些軟件如GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research(1984)12(1)387)和BLASTP，BLASTN，F(xiàn)ASTA(Atschul，S.F.et al.，J MolecBiol(1990)215403)也可以用。這里確定的同源性(同一性或相似性)則是按照大家都知道的BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group.University Research Park，575Science Drive，Madison，Wis.53711)而確定的。當(dāng)使用BESTFIT或其他的序列排列軟件來(lái)確定某一特定序列是否有例如與參考序列間大約90％的同源性時(shí)，根據(jù)當(dāng)前的發(fā)明，參數(shù)應(yīng)該設(shè)定保證同一性百分?jǐn)?shù)是在參考核苷酸序列或氨基酸序列的全長(zhǎng)的基礎(chǔ)上計(jì)算的，而且允許同源區(qū)中的間隙可達(dá)到約參考序列總核苷酸數(shù)的10％。
兩個(gè)多肽的百分相似性也可以通過(guò)使用包括BESTFIT在內(nèi)的本領(lǐng)域已知的軟件比對(duì)兩個(gè)多肽鏈的氨基酸序列進(jìn)行評(píng)測(cè)，通過(guò)使用鑒定相似性的默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。
Karlin和Altschul的運(yùn)算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990)，經(jīng)由Karlin和Altschul修飾后(Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877，1993)，已被吸收到Altschul等的NBLAST和XBLAST中(J.Mol.Biol.215403-410，1990)，而用于搜索與參考序列同源的序列。
BLAST核苷酸序列搜索使用的是NBLAST程序，score＝100，wordlength＝12，以得到與本發(fā)明同源的序列。BLAST蛋白搜索使用的是XBLAST程序，score＝50，wordlength＝3，以得到與參考多肽(例如SEQ IDNO2或4)有同源性的氨基酸序列。要得到用于比對(duì)的帶有間隙的排列，需要按照Altschul等(Nucleic Acids Res.25389-3402，1997)介紹的GappedBLAST進(jìn)行。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，使用了各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。參考http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
與SEQ ID NO2或4同源的多肽鏈包括自然發(fā)生的等位基因變體，以及保留了參考多肽遺傳特性的突變體或非自然發(fā)生的變體。對(duì)AopB而言，這樣的遺傳特性包括了其作為革蘭氏陰性菌暴露在表面的外膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
正如我們所知道的，等位基因的變體是一種多肽的替換形式，其特征可以是因?yàn)榘l(fā)生了取代、缺失、或者一或幾個(gè)氨基酸的添加，但卻并不改變多肽的生物學(xué)功能。生物學(xué)功能是指多肽在自然狀態(tài)下的細(xì)胞中所發(fā)揮的作用，即使這個(gè)功能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活并不必要。例如，孔蛋白的生物學(xué)功能就是允許胞外介質(zhì)中存在的化合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
等位基因的變體在自然界非常普遍。例如，一個(gè)細(xì)菌種如M.catarrhalis，通常由多種不同的菌株來(lái)代表，它們之間有著微小的等位基因的變異。事實(shí)上，一個(gè)在不同菌株間行使相同生物學(xué)功能的多肽在每一菌株中可以有不同的氨基酸序列(和核苷酸序列)，這種等位基因的變異在多核苷酸水平也得到了很好的體現(xiàn)。
一個(gè)獲得編碼同源多肽或等位基因變體的多聚核苷酸的方法是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增由常規(guī)的方法提取的細(xì)菌基因組DNA。這涉及到與編碼序列5′和3′端的上、下游配對(duì)的合成的寡核苷酸引物的使用。適宜的引物是通過(guò)SEQ ID NO1或3提供的核苷酸序列信息設(shè)計(jì)的。步驟如下選擇包含10到40個(gè)核苷酸(如13，16，19，22，24等等)，更優(yōu)選包含15-25個(gè)核苷酸的引物。選擇含有足以保證有效雜交的C G比例的引物是有利的；也就是說(shuō)，C和G的量至少占總核苷酸含量的40％，優(yōu)選占50％。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)通常每100μL包含0.5到5個(gè)單位的Taq DNA聚合酶，20到200μM的每種脫氧核苷酸，優(yōu)選每種核苷酸具有相同的濃度，超過(guò)總脫氧核苷酸濃度0.5到2.5mM的鎂，105到106靶標(biāo)分子，和大約20pmol的每種引物。進(jìn)行大約25到50個(gè)PCR循環(huán)，低于引物實(shí)際Tm 15℃到5℃的退火溫度。更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟葘⒂兄谙徽_的退火引物和減少不正確的核苷酸結(jié)合到引物的3′端。盡管更高的溫度適合于對(duì)G+C豐富的靶標(biāo)變性，通常變性溫度是95℃到97℃。循環(huán)的數(shù)量依賴于初始加入的靶標(biāo)分子的濃度，盡管超過(guò)40個(gè)循環(huán)不加推薦，這是由于循環(huán)次數(shù)過(guò)多會(huì)造成非特異性背景產(chǎn)物的增加。
另一個(gè)可用來(lái)得到編碼同源多肽或等位基因變體的多核苷酸的方法是通過(guò)分子雜交的方法篩選DNA或RNA文庫(kù)。雜交的步驟廣為人知并被詳細(xì)描述如Sambrook等(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning aLaboratory Manual 2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor N.Y)。優(yōu)化雜交條件的重要參數(shù)可通過(guò)用于獲得臨界(critical)熔解溫度的公式反映，大于該熔解濕度時(shí)，兩條互補(bǔ)的DNA鏈可互相分開(kāi)。對(duì)于大于或約等于600個(gè)核苷酸的多核苷酸，公式是Tm＝81.5+0.41×(％G+C)+16.6log(陽(yáng)離子濃度)-0.63×(％甲酰胺)-600/堿基數(shù)。在適當(dāng)?shù)膰?yán)謹(jǐn)條件下，雜交溫度(Th)大約是低于計(jì)算的Tm的20到40℃，20到25℃，或優(yōu)選30到40℃。在這方面本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定出最佳的溫度和鹽濃度。
這里所提出的雜交核酸可以用來(lái)例如作為克隆探針、引物或者是診斷探針。分子雜交通常是要在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行。核酸雙鏈體或雜交體的穩(wěn)定性由熔解溫度或Tm值來(lái)表達(dá)，即雜交鏈分開(kāi)的溫度。這個(gè)熔解溫度用來(lái)確定雜交所需的嚴(yán)謹(jǐn)條件。如果要鑒定的序列與探針序列有相關(guān)性并且基本一致而并非完全一致時(shí)，那么先確定最低的雜交溫度是非常有用的，這樣在特定的鹽(例如SSC OR SSPE)濃度環(huán)境中，在該確定的最低溫度時(shí)只有同源序列雜交。然后，假設(shè)每有1％的錯(cuò)配就會(huì)導(dǎo)致Tm值下降1℃，雜交反應(yīng)最后沖洗的溫度也相應(yīng)降低(例如，如果序列與探針有超過(guò)95％的一致性，最后的沖洗溫度就降低5％)。實(shí)際上，每1％的錯(cuò)配所帶來(lái)的Tm的變幅可以介于0.5℃和1.5℃之間。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件可以通過(guò)預(yù)雜交和雜交孵育來(lái)獲得(i)在含有50％甲酰胺的6×SSC中在42℃雜交4-16小時(shí)，或(ii)在6×SSC(1M NaCl，0.1M枸椽酸鈉(pH 7.0))水溶液中在65℃雜交4-16h小時(shí)。通常，雜交實(shí)驗(yàn)要在60℃-68℃溫度下進(jìn)行，例如65℃。在這種溫度條件下，可以在6×SSC，更好的是2×SSC或1×SSC，最好是在0.5×SSC，0.3×SSC或0.1×SSC(不含甲酰胺)中獲得嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。1×SSC包含0.15M NaCl和0.015M枸椽酸鈉。
有用的同系物和其中的非自然片段由已知的方法來(lái)設(shè)計(jì)，它們可用來(lái)鑒定抗原上可容許氨基酸序列變化和(或)缺失的區(qū)域。比如，比較來(lái)自不同種的同源多肽就可以鑒定出保守序列。越是差異多的序列就越能容許序列的變化。序列間的同源性可以通過(guò)上述的方法進(jìn)行分析，比如Altschul等的BLAST同源搜索運(yùn)算法則(Nucleic Acids Res.；253389-3402(1997))。另外，序列可以在體外修飾，然后按照下文介紹的方法篩選能展示過(guò)客蛋白的序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易了解到采用這項(xiàng)發(fā)明中的篩選步驟并不需要做不必要的實(shí)驗(yàn)就可確定SEQ ID NO2或4的特定同系物或片段是否保持了AopB外膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并且，是否可做為載體蛋白展示過(guò)客蛋白。一般的分析過(guò)程包括以下步驟(i)將實(shí)驗(yàn)同系物或片段在讀框內(nèi)連接上一個(gè)報(bào)告蛋白(過(guò)客蛋白)如GFP。通常，編碼過(guò)客蛋白和編碼實(shí)驗(yàn)同系物或片段的核酸分子在讀框內(nèi)連接后就可產(chǎn)生融合蛋白。編碼這個(gè)融合蛋白的核酸分子于是被插入到一個(gè)表達(dá)載體上，然后在細(xì)菌中通過(guò)步驟(ii)表達(dá)這個(gè)融合蛋白；(ii)用編碼該融合蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)化革蘭氏陰性菌，優(yōu)選根癌土壤桿菌；并且(iii)使用適合的全細(xì)胞分析手段如FACS來(lái)分析報(bào)告蛋白在轉(zhuǎn)化細(xì)菌中的活性。在細(xì)胞表面的報(bào)告蛋白的活性將顯示所述同系物或片段是外膜蛋白，而且可作為一個(gè)用于展示的載體蛋白。
由此衍生的多肽包括SEQ ID NO2或4的部分序列，與SEQ ID NO2或4有同源性的多肽序列的部分序列，由全長(zhǎng)多肽內(nèi)部缺失而得的多肽和融合蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，AopB的片段來(lái)自SEQ ID No2的N-端區(qū)域。另一些實(shí)施方案中，來(lái)自SEQ ID No2的N-端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的AopB片段是優(yōu)選的，例如來(lái)自SEQ ID No2的N-端的125，134，172，183和207個(gè)連續(xù)氨基酸。將過(guò)客蛋白與SEQ ID No2的125，134，172，183和207個(gè)氨基酸的片段融合已得以例證，而且顯示了其用于細(xì)胞表面展示的有效性。
尤其優(yōu)選的是SEQ ID No.2 N-端的134到183個(gè)連續(xù)氨基酸片段，例如140，150，155，160，165，166，168，170，172，174，176，178，180個(gè)氨基酸的片段。
載體蛋白與過(guò)客蛋白的融合可讓載體片段與過(guò)客蛋白氨基酸序列直接鄰近而形成。另外還可以通過(guò)連接子序列連接載體片段和過(guò)客蛋白，如來(lái)自免疫球蛋白的靈活的連接子序列(參見(jiàn)美國(guó)專利5,516,637)。連接子可以含有蛋白酶特異的切割位點(diǎn)，以便于將過(guò)客蛋白從載體蛋白上可控制地釋放下來(lái)。這樣的蛋白酶切位點(diǎn)的例子包括對(duì)凝血因子X(jué)a、腸激酶、膠原酶、Igase(來(lái)自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae))、凝血酶和TEV(煙草蝕紋病毒)蛋白酶的切割特異的位點(diǎn)。
來(lái)自SEQ ID NO1或3的30到600個(gè)核苷酸的多聚核苷酸或其互補(bǔ)體、同系物、變體至少可以用來(lái)作為得到其他同系物或變體的探針。得到部分序列的一個(gè)方法是通過(guò)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增應(yīng)用的參數(shù)上文提到，應(yīng)用的引物與要擴(kuò)增的片段的5′和3′端上游和下游序列配對(duì)。其擴(kuò)增的模板可以是SEQ ID NO1或3的全長(zhǎng)或它們相關(guān)的同系物或變體，或包含在多聚核苷酸混合物如DNA或RNA文庫(kù)中的特定多聚核苷酸。另一種得到部分序列的方法是在如上文介紹的條件下，使用推算Tm的公式進(jìn)行篩選雜交。30到600個(gè)核苷酸片段的獲得，其Tm值要通過(guò)減法(600/多核苷酸堿基對(duì)數(shù)目)進(jìn)行校正，并且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件其雜交溫度要低于Tm 5到10℃。要獲得低于20-30個(gè)堿基寡核苷酸時(shí)，Tm的計(jì)算公式為Tm＝4×(G+C)+2(A+T)。例如，50％G+C的18個(gè)核苷酸的片段Tm約為54℃。
SEQ ID NO2或4中短的氨基酸片段或它們相應(yīng)的同源序列，可以通過(guò)化學(xué)合成的辦法得到(E.Gross and H.J.Meinhofer，4 The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology；Modern Techniques of Peptide Synthesis，John Wiley &Sons(1981)，and M.Bodanzki，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag(1984))。
編碼含有較大內(nèi)部缺失的多肽片段的多核苷酸可以按照標(biāo)準(zhǔn)的方法構(gòu)建(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning a Laboratory Manual 2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y.)。這個(gè)方法包括標(biāo)準(zhǔn)的PCR、反向PCR、和對(duì)DNA克隆分子的限制性內(nèi)切酶處理。這些方法中所用的成分和使用的儀器可以從很多公司購(gòu)買如Stratagene。
某些氨基酸可以取代蛋白上其他的氨基酸而不改變蛋白的活性區(qū)域比如結(jié)合位點(diǎn)。既然活性區(qū)域決定一個(gè)蛋白的生物學(xué)功能，那么就可以通過(guò)某些氨基酸的取代來(lái)獲得相似生物學(xué)功能的蛋白。所以可以預(yù)期，可以改變AopB的多肽序列或其編碼的DNA序列而不改變其生物學(xué)功能和活性。
在進(jìn)行這種改變的時(shí)候，通常要考慮到氨基酸的親水指數(shù)(hydropathicindex)。氨基酸的親水指數(shù)對(duì)蛋白的生物學(xué)功能有非常重要的意義，這一點(diǎn)本領(lǐng)域已有共識(shí)(Kyte，J.，and Doolittle，R.F.(1982)Simple method fordisplaying the hydropathy character of a protein.J Mol Biol 157105-132)。相關(guān)的親水氨基酸構(gòu)成蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因而決定了蛋白與其他分子的相互作用，例如與酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等等的相互作用。膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以通過(guò)Sipos和von Heijne(Sipos et al.，1993，Eur.J.Biochem2131333-1340)描述的算法進(jìn)行預(yù)測(cè)。
根據(jù)其親水性和所帶電荷對(duì)每一種氨基酸都進(jìn)行了親水指數(shù)的賦值(kyte和Dodittle，1982)。分別是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5).
已經(jīng)知道某些氨基酸可以被另外的具有與其相似親水指數(shù)的氨基酸取代而不改變蛋白的生物學(xué)活性，也就是說(shuō)，得到功能相同的蛋白。要進(jìn)行這種改變，取代氨基酸的親水指數(shù)應(yīng)該在被取代氨基酸親水指數(shù)的.+-.2范圍內(nèi)，當(dāng)然如果能控制在.+-.1甚至.+-.0.5就更好了。
同時(shí)可以根據(jù)美國(guó)專利4,554,101提供的氨基酸的親水性更有效的進(jìn)行氨基酸的取代，其指出了與蛋白生物特性相關(guān)的由相鄰氨基酸的親水性決定的蛋白的局部最大平均親水性。
根據(jù)美國(guó)專利4,554,101的詳細(xì)介紹，指定的氨基酸親水值分別是精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
已經(jīng)知道一個(gè)氨基酸可以被另外一個(gè)與之有相似親水值的氨基酸取代，從而得到保持原有生物學(xué)特性，并且尤其是免疫學(xué)特性的蛋白。要做這樣的改變，取代氨基酸的親水值應(yīng)該在被取代氨基酸親水值的.+-.2范圍內(nèi)，當(dāng)然如果能控制在.+-.1甚至.+-.0.5就更好了。
正如上文所述，氨基酸的取代通常要考慮到相關(guān)相似性的側(cè)鏈取代，比如其疏水性、親水性、電荷、大小等等，本領(lǐng)域技術(shù)人員一定知道考慮了前述各種情況的取代的實(shí)例包括精氨酸和賴氨酸；天冬氨酸和谷氨酸，絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的取代。
如這里所使用的，融合蛋白是包含本發(fā)明中多肽或由本發(fā)明中多肽得到的多肽與任何其他多肽(這里后面稱為過(guò)客蛋白或多肽)在N或C端的融合。得到這種融合多肽的一個(gè)最簡(jiǎn)單的方法是翻譯讀框內(nèi)連接的多聚核苷酸，即雜合基因。編碼融合蛋白的雜合基因被插入到一個(gè)表達(dá)載體上，用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染寄主細(xì)胞。另外，編碼多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列也可以插入到其中已存在編碼過(guò)客蛋白多肽的多核苷酸的表達(dá)載體中。大的蛋白可以有效的用于表面表達(dá)，所述蛋白包括β-內(nèi)酰胺酶，堿性磷酸酶，纖維素酶的纖維素結(jié)合域，或者單鏈Fv抗體。
融合蛋白的有利事例如其一可以將本發(fā)明的多肽或同系物或片段(‘載體蛋白′)融合到一個(gè)具有酶活性的蛋白上，如堿性磷酸酶，或一個(gè)可以進(jìn)行二級(jí)修飾的酶上(例如糖基化酶或二硫化物異構(gòu)酶)。另外還可以將載體蛋白融合到一個(gè)可以結(jié)合化合物的過(guò)客多肽上，所述化合物如污染物(例如溶液中的重金屬或血液中的濾過(guò)型污染物)或者其他的蛋白(例如抗體)。如果過(guò)客蛋白本身就是一個(gè)抗體，那么融合蛋白可以用來(lái)純化該抗體特異的抗原，或用來(lái)去除溶液中某種特定抗原。如果過(guò)客蛋白是一個(gè)抗原蛋白，融合蛋白可以用來(lái)作為一個(gè)疫苗來(lái)激發(fā)免疫反應(yīng)來(lái)抵抗這個(gè)抗原。
為了有效的融合，過(guò)客多肽可以融合到本發(fā)明多肽的N-或者更好是C端。優(yōu)選的氨基酸插入位點(diǎn)是SEQ ID No2第39，125，134，172，183和207位的氨基酸，最好是插入到172位氨基酸上游或下游10個(gè)氨基酸的位置。
本發(fā)明中的多聚核苷酸同時(shí)也可以編碼雜合的多肽前體(precursorpolypeptides)，其包括來(lái)自異源的信號(hào)肽，成熟以后成為本發(fā)明中的多肽。“異源的信號(hào)肽”是指在自然發(fā)生的本發(fā)明的多肽前體中沒(méi)有的信號(hào)肽。優(yōu)選的異源信號(hào)肽是那些或來(lái)自于或衍生自革蘭氏陰性菌的信號(hào)肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，異源信號(hào)肽與載體蛋白成熟序列的N端相連。
革蘭氏陰性菌擁有非常獨(dú)特和復(fù)雜的細(xì)胞包被結(jié)構(gòu)，其包括細(xì)胞的內(nèi)細(xì)胞膜、周質(zhì)和外細(xì)胞膜。要在利用本發(fā)明中的載體蛋白在細(xì)胞表面展示過(guò)客蛋白，表達(dá)的融合蛋白必須能夠穿過(guò)內(nèi)細(xì)胞膜和外細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌表面并保留在細(xì)菌表面。
為了使融合蛋白能夠被定位在細(xì)胞的表面，載體蛋白必須含有有效的分泌信號(hào)序列以助載體蛋白穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜和用于將融合蛋白錨定在細(xì)胞表面的靶標(biāo)序列。信號(hào)序列和靶標(biāo)序列可以在自然發(fā)生的載體蛋白前體中獲得，或者他們可以是異源序列，也就是說(shuō)，可以從同一個(gè)細(xì)菌蛋白或相同或不同細(xì)菌的不同蛋白獲得。
在革蘭氏陰性菌中，細(xì)胞外膜是一個(gè)限制蛋白向外運(yùn)輸?shù)恼系K。通常只有菌毛蛋白、鞭毛蛋白、特異性的酶和少數(shù)毒素可以完全穿過(guò)外膜到達(dá)胞外。這些蛋白的大多數(shù)都是首先通過(guò)一般的分泌方式分泌到壁膜間隙，然后在一些其他的基因產(chǎn)物的輔助下穿過(guò)外膜。
對(duì)于一些外膜蛋白，如PhoE孔蛋白，對(duì)適當(dāng)定位和聚集必要的信息分布在引物序列里。或者，靶標(biāo)序列可能包含在一段短的連續(xù)片段內(nèi)。例如，大腸埃希氏菌脂蛋白N端的頭9個(gè)氨基酸對(duì)于其定位在外膜是必要的。將這段短序列與可溶性周質(zhì)蛋白β-內(nèi)酰胺酶融合將會(huì)使融合蛋白定位到胞外。同樣，對(duì)OmpA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)154位和180位之間的氨基酸殘基對(duì)于定位是關(guān)鍵的。對(duì)于OmpA，靶標(biāo)定位和外膜聚合則顯示截然不同的事件。
在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)雜合的多肽前體包含SEQ ID No4和與之N端連接的，決定向外膜分泌的氨基酸序列。膜靶向序列已經(jīng)在很多種膜蛋白中得到鑒定，其中包括Lpp。通常對(duì)于Lpp，其作為定位信號(hào)的蛋白域是相當(dāng)短的。Lpp靶向序列包含信號(hào)序列和成熟蛋白的前面9個(gè)氨基酸。這些氨基酸在Lpp N端發(fā)現(xiàn)。其它的可以作為分泌和膜定位信號(hào)源的蛋白包括大腸埃希氏菌外膜脂蛋白如TraT，OsmB，NlpB，BlaZ；銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)脂蛋白1；流感嗜血菌(Haemophilus influenza)PA1和PCN蛋白；立氏立克次氏體(Rickettsia rickettsii)17kDa脂蛋白；淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)H.8蛋白等等。
本發(fā)明的一個(gè)方面包含(i)一個(gè)表達(dá)盒包含本發(fā)明的多聚核苷酸，其表達(dá)受控于所需的調(diào)控元件，尤其是適合的啟動(dòng)子；(ii)一個(gè)表達(dá)載體包含本發(fā)明的表達(dá)盒；(iii)經(jīng)本發(fā)明表達(dá)盒和/或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了的原核或真核細(xì)胞；還有(iv)一個(gè)由編碼本發(fā)明的多肽或多肽衍生物的核苷酸序列產(chǎn)生多肽的方法，其包括在利于本發(fā)明DNA分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)經(jīng)本發(fā)明表達(dá)盒和/或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了的原核或真核細(xì)胞，然后從培養(yǎng)物中回收所編碼的多肽或多肽衍生物。
豌豆根瘤菌細(xì)胞可以通過(guò)Garg B，Dogta RC，Sharma PK.1999介紹的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。High-efficiency transformation of Rhizobium leguminosarum byelectroporation.Applied and Environmental Microbiology 652802-2804；和Giddings G，Mytton L，Taylor L，Thomas S，Allen D，Skot L.2000.A secondaryeffect of transformation in Rhizobium leguminosarum transgenic for Bacillusthuringiensis Subspecies tenebrionis delta-endotoxin(cryIIIA)genes.Theoreticaland Applied Genetics 100820-823。
苜蓿中華根瘤菌細(xì)胞可以通過(guò)Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000介紹的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Efficient transformation ofMesorhizobium huakuii subsp rengei and Rhizobium species.Journal ofBioscience and Bioengineering 89550-553。
Mesorhizobium loti細(xì)胞可以通過(guò)Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000介紹的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Journal of Bioscience andBioengineering 89550-553。
大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)細(xì)胞可以通過(guò)HattermannDR，Stacey G.1990描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Efficient DNA transformation ofBradyrhizobium japonicum by electroporation.Applied and EnvironmentalMicrobiology 56833-836；和Hayashi M，Maeda Y，Hashimoto Y，Murooka Y.2000.Journal of Bioscience and Bioengineering 89550-553。
馬爾他布魯氏菌(B.melitensis)細(xì)胞可以通過(guò)Ekaza E，Guilloteau L，Teyssier J，Liautard JP，Kohler S.2000描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Functionalanalysis of the ClpATPase ClpA of Brucella suis，and persistence of a knockoutmutant in BALB/c mice.Microbiology 1461605-1616；和Jubier-Maurin V，Boigegrain RA，Cloeckaert A，Gross A，Alvarez-Martinez MT，Terraza A，Liautard J，Kohler S，Rouot B，Dornand J，Liautard JP.2001.Major outermembrane protein Omp25 of Brucella suis is involved in inhibition of tumornecrosis factor alpha production during infection of human macrophages.Infection and Immunity 694823-4830。
漢氏巴爾通氏體細(xì)胞可以通過(guò)Dehio M，Knorre A，Lanz C，Dehio C.1998描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Construction of versatile high-level expressionvectors for Bartonella henselae and the use of green fluorescent protein as a newexpression marker.Gene 215223-229。
五日熱巴爾通氏體(Bartonella quintana)細(xì)胞可以通過(guò)Dehio M，KnorreA，Lanz C，Dehio C.1998描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Construction of versatilehigh-level expression vectors for Bartonella henselae and the use of greenfluorescent protein as a new expression marker.Gene 215223-229。
Mannheimia haemolytica細(xì)胞可以通過(guò)Marciel AM，Highlander SK.2001描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Use of operon fusions in Mannheimia haemolyticato identify environmental and cis-acting regulators of leukotoxin transcription.Infection and Immunity 696231-6239。
結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)細(xì)胞可以通過(guò)Hinds J，Mahenthiralingam E，Kempsell KE，Duncan K，Stokes RW，Parish T，Stoker NG.1999描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Enhanced gene replacement in mycobacteria.Microbiology 145519-527；和Bachrach G，Colston MJ，Bercovier H，Bar-NirD，Anderson C，Papavinasasundaram KG. 2000.A new single-copymycobacterial plasmid，pMF1，from Mycobacterium fortuitum which iscompatible with the pAL5000 replicon.Microbiology 146297-303.
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、傘菌假單胞菌(Pseudomonasagarici)和褐鞘假單胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)細(xì)胞可以通過(guò)Enderle PJ，F(xiàn)arwell MA.1998描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Elctroporation of freshly platedEscherichia Coli and Pseudomonas aeruginosa cells.Biotechniques 25954；和Kim C，Wood TK.1998.Electroporation of pink-pigmented methylotrophicbacteria.Applied Biochemistry and Biotechnology 7381-88。
天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)細(xì)胞可以通過(guò)Oh SH，Chater KF.1997描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Denaturation of circular or linear DNA facilitatestargeted integrative transformation of Streptomyces coelicolor A3(2)Possiblerelevance to other organisms. Journal of Bacteriology 179122-127；和Gregorovic G，Vujaklija D.2001.High efficiency of direct plasmid transferbetween two Streptomyces spp.，and between Streptomyces spp.and E.coli.FoodTechnology and Biotechnology 3949-53.
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)細(xì)胞可以通過(guò)Panda DK，Banerjee R，Das J.1995介紹的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Construction of shuttle vectors for cloning in vibriocholerae and Escherichia coli.Journal of Biosciences 20367-376。
杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)細(xì)胞可以通過(guò)Hansen EJ，Latimer JL，Thomas S E，Helminen M，Albritton WL，Radolf JD.1992介紹的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Use of electroporation to construct isogenic mutants ofHaemophilus ducreyi.Journal of Bacteriology 1745442-5449；和Windsor HM，Gromkova RC，Koornhof HJ.1993.Transformation of v-factor independence from Haemophilusducreyi to haemophilus influenzae and haemophilus parainfluenzae.MedicalMicrobiology Letters 2159-167。
這項(xiàng)發(fā)明還包括(i)如上面所描述的表達(dá)盒或載體，用來(lái)表達(dá)編碼多肽或多肽衍生物的核苷酸序列，其多肽是定位在外膜的，和(ii)用表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化了的原核細(xì)胞并且其在細(xì)胞的表面表達(dá)多肽。
具體的這個(gè)多肽是載體蛋白和過(guò)客蛋白的融合體，過(guò)客蛋白能夠到達(dá)細(xì)胞表面，這可以通過(guò)蛋白酶可接近性分析(protease accessibility)或放射碘化作用(radio-iodination)的方法進(jìn)行確定。
重組的表達(dá)系統(tǒng)是從原核或真核寄主中選擇的，從原核中更適宜。真核寄主包括酵母細(xì)胞(例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris))，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，COS1，NIH3T3，或JEG3細(xì)胞)，以及植物細(xì)胞。原核寄主包括革蘭氏陰性菌，具體包括土壤桿菌屬，更適宜的是根癌土壤桿菌，根瘤菌屬(Rhizobium)，布魯氏菌屬(Brucella)，漢氏巴爾通氏體，溶血巴斯德氏菌，結(jié)核分枝桿菌，杜氏嗜血菌，單胞菌屬(Pseudomonas)，大腸埃希氏菌，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，歐文氏菌屬(Erwinia)，志賀氏菌屬(Shigella)，沙門氏菌屬(Salmonella)，霍亂弧菌，乳桿菌屬(Lactobacillus)，卡-介二氏菌(Bacille biliédeCalmette-Guérin)(BCG)，以及鏈球菌屬(Steptococcurs)，優(yōu)選不產(chǎn)毒素的霍亂弧菌突變菌株和減毒的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella tyPhimurium)菌株。
細(xì)菌和真核細(xì)胞可以從多種渠道包括從商業(yè)渠道獲得，例如可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Rockville，Maryland)獲得，用于重組蛋白表達(dá)的商購(gòu)細(xì)胞在購(gòu)買時(shí)還附帶了其使用說(shuō)明。
不產(chǎn)毒素的霍亂弧菌突變株據(jù)美國(guó)專利4,882,278描述的，其含有兩個(gè)ctxA等位基因缺失以致于不產(chǎn)生功能性的霍亂毒素。WO 92/11354描述了一個(gè)菌株，其中的irgA位點(diǎn)被突變失活，這個(gè)突變可以和單鏈的ctxA突變組合。WO 94/01533描述了一個(gè)缺失突變體，其缺少功能型的ctxA和attRS1DNA序列。如WO 94/19482所描述的，這些突變株通過(guò)遺傳工程使其表達(dá)異源蛋白。
WO 92/11361描述了減毒的鼠傷寒沙門氏菌菌株能否通過(guò)遺傳工程表達(dá)重組的異源蛋白。
目前發(fā)明的其它的用于作為蛋白表達(dá)寄主的細(xì)菌菌株如；High等EMBO(1992)111991和Sizemore等Science(1995)270299中描述的弗氏志賀代菌(Shigella flexneri)；Medaglini等描述的格氏鏈球菌(Sreptococcusgordonii)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)926868；和Flynn J.L描述的卡-介二氏菌，Cell.Mol.Biol.(1994)40(suppl.I)31，WO 88/06626，WO 90/00594，WO 91/13157，WO 92/01796，和WO 92/21376。
本發(fā)明通常使用一種或多種通?？梢缘玫降母锾m氏陰性菌作為寄主細(xì)胞。但是，對(duì)于一些突變?cè)斐善淠こ煞钟兴淖兊拇植?rough)突變體，我們?nèi)匀幌Ｍ淇捎糜诒景l(fā)明的實(shí)踐。含有較高磷脂的膜，例如可能會(huì)給融合多肽在高溫下的表達(dá)創(chuàng)造更好的條件。另一方面，可能由于脂質(zhì)-蛋白間相互作用的增強(qiáng)，可使一些多肽更接近膜表面，從而可能會(huì)達(dá)到增強(qiáng)免疫原反應(yīng)或改變吸附特性的目的。象這樣的突變，自發(fā)的或非自發(fā)的，我們都希望其可以作為寄主細(xì)胞或作為膜定位序列或跨膜序列的來(lái)源。
在細(xì)菌中，我們發(fā)明的多肽可以插入到細(xì)菌基因組中或仍然作為質(zhì)粒的一部分而保持自由狀態(tài)。
表達(dá)系統(tǒng)的選擇要依賴于我們所期望的表達(dá)多肽的特征決定。例如，將本發(fā)明多肽制備成一種特定的脂化形式可能是有利的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，不是所有的載體和表達(dá)調(diào)控序列以及寄主都同樣適合表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。然而，在以下所述的指導(dǎo)下，不用做不必要的試驗(yàn)，便可對(duì)載體，表達(dá)調(diào)控序列和寄主所出選擇，同時(shí)不偏離本發(fā)明的保護(hù)范圍。
在選擇載體方面，寄主一定要選擇適合載體在其中存在和復(fù)制，同時(shí)，還要考慮載體的拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力以及其他蛋白如抗生素抗性蛋白的表達(dá)。在選擇表達(dá)調(diào)控序列方面，需要考慮很多因素，其中重要的因素是考慮序列的相關(guān)強(qiáng)度(如在不同條件下控制表達(dá)的能力)，控制序列功能的能力，要表達(dá)的多核苷酸與調(diào)控序列間的適宜性(例如，要考慮避免出現(xiàn)會(huì)抑制有效轉(zhuǎn)錄的發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu))。在選擇寄主方面，所選寄主要是與所選載體相適宜的單細(xì)胞寄主，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的可能毒性要有一定耐受力，如果需要其產(chǎn)物要能夠分泌到外膜，要能夠表達(dá)要求構(gòu)象的蛋白，容易擴(kuò)大規(guī)模以及容易純化終產(chǎn)物。
對(duì)表達(dá)盒的選擇依賴于所選擇的寄主系統(tǒng)以及表達(dá)多肽的所需特征。通常，一個(gè)表達(dá)盒包括在寄主系統(tǒng)中有功能并且可以組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的啟動(dòng)子；核糖體結(jié)合位點(diǎn)；如果有必要還需要一個(gè)起始密碼子(ATG)；編碼信號(hào)肽例如脂質(zhì)化(lipidation)信號(hào)肽的區(qū)域；本發(fā)明的DNA分子；終止密碼子和任選3′終止區(qū)(翻譯和/或轉(zhuǎn)錄終止子)。信號(hào)肽的編碼序列與發(fā)明中的多聚核苷酸鄰近并且放置在一個(gè)合適的讀框內(nèi)。信號(hào)肽的編碼序列與編碼成熟多肽的DNA分子同源或異源并且與用于表達(dá)的寄主的分泌裝置相適宜。本發(fā)明中DNA分子的開(kāi)放讀框，單獨(dú)或與信號(hào)肽一起，都放置在啟動(dòng)子之下以便于在寄主內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。啟動(dòng)子和信號(hào)肽編碼區(qū)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的且可得到，這些包括例如，鼠傷寒沙門氏菌啟動(dòng)子(和由此得到的衍生物)可以在阿拉伯糖(啟動(dòng)子araB)的誘導(dǎo)下并且在革蘭氏陰性菌如大腸埃希氏菌中有作用(如美國(guó)專利5,028,530和Cagnon等，(Cagnon et al.，Protein Engineering(1991)4(7)843)所描述的)；噬菌體T7編碼RNA聚合酶的基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在表達(dá)T7聚合酶的多種大腸埃希氏菌菌株中起作用(美國(guó)專利4,952,496)；OspA脂質(zhì)化信號(hào)肽；以及RlpB脂質(zhì)化信號(hào)肽(Takase et al.，J.Bact.(1987)1695692)。
表達(dá)盒通常都是表達(dá)載體的一部分，根據(jù)在所選擇的表達(dá)系統(tǒng)中的復(fù)制能力對(duì)其進(jìn)行選擇。表達(dá)載體(例如質(zhì)粒)可以從例如Pouwels等描述的載體中進(jìn)行選擇(Cloning VectorsA Laboratory Manual 1985，Supp.1987)。合適的表達(dá)載體可以從不同的商業(yè)公司購(gòu)買。
用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染寄主細(xì)胞的方法已經(jīng)廣為人知，并且依賴于如Sambrook，J.E.F.等在Molecular Cloning a Laboratory Manual 2nded(1989)介紹的對(duì)寄主細(xì)胞的選擇。Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor N.Y.
在表達(dá)方面，發(fā)明中的重組多肽(或由此得到的多肽)產(chǎn)生并保持在細(xì)胞內(nèi)，分泌到細(xì)胞外介質(zhì)中或壁膜間隙或嵌入膜中。所述多肽可以從培養(yǎng)的細(xì)胞提取物或重組細(xì)胞培養(yǎng)物離心后得到的上清液中得到純化。通常重組多肽是通過(guò)基于抗體的親和進(jìn)行純化的或其他的可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員采用的方法進(jìn)行純化，如編碼多肽的多聚核苷酸或其衍生物與小的親和結(jié)合域的融合體。利用抗體通過(guò)免疫親和來(lái)純化本發(fā)明多肽的方法將在以下介紹。
在這里提供的序列信息有助于設(shè)計(jì)用于診斷的特異的核苷酸探針和引物。因而，本發(fā)明的另一方面提供了在SEQ ID NO1或3或相關(guān)的同源序列中存在的或由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而從上述這些序列中衍生得到的核酸探針或引物。
這里所提的“探針”是指在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1或3中核酸分子、或其相關(guān)同源序列、互補(bǔ)或反義序列雜交的DNA(較好的是單鏈)或RNA分子(或其修飾物或其組合)。通常，探針要比全長(zhǎng)序列明顯短。這樣的探針包含約5到約100(例如，10，12，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60...等等)，優(yōu)選約從10到約80個(gè)核苷酸。具體地，探針至少要有75％(例如至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％)，優(yōu)選至少要有95％與SEQ ID NO1或3的部分同源。探針也可以包含和這些序列和部分互補(bǔ)的序列。探針也可以包含一些修飾的堿基如肌苷，5甲基脫氧胞苷，脫氧尿苷，二甲氨基-5-脫氧尿苷或二氨基-2，6-嘌呤。糖和磷酸殘基也可以修飾或取代。例如，一個(gè)脫氧核糖可以被聚酰胺取代(Nielsen et al.，Science(1991)2541497)而且磷酸酯殘基可以被酯基團(tuán)如二磷酸酯，烷基酯，芳基膦酸酯和偶磷硫羰酸酯所代替。此外核糖核苷酸中2′-羥基基因可以被包括如烷基在內(nèi)的基團(tuán)修飾。
本發(fā)明的探針可以作為捕獲或檢測(cè)探針被用于診斷。這種捕獲探針通常直接或間接通過(guò)共價(jià)的方式或被動(dòng)的吸附被固定在一個(gè)固相支持上。一個(gè)檢測(cè)探針是被檢測(cè)標(biāo)記物所標(biāo)記，這種標(biāo)記物包括放射性同位素、酶如過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶和能夠水解發(fā)色、發(fā)出熒光或發(fā)光的底物的酶、可以產(chǎn)色、發(fā)出熒光或發(fā)光的化合物、核苷酸堿基類似物和生物素。
本發(fā)明的探針可以用于傳統(tǒng)的各項(xiàng)雜交技術(shù)中，例如斑點(diǎn)雜交(dot blot)中(Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1982)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，Southern印跡，northern印跡，或夾心法技術(shù)中(Dunn et al.，Cell(1977)1223)。后項(xiàng)技術(shù)包括利用至少部分不同的核苷酸序列作為特異的捕獲探針和/或檢測(cè)探針的應(yīng)用。
引物通常是大約10到約40個(gè)核苷酸(例如，11，12，13，14，15，17，20，25，30或35個(gè)核苷酸)用于在擴(kuò)增過(guò)程(例如PCR)或延長(zhǎng)過(guò)程或反轉(zhuǎn)錄方法中起始DNA的酶促聚合。標(biāo)記涉及PCR的診斷方法中所用的引物的技術(shù)已廣為人知。
如這里所描述的，本發(fā)明還包括(i)包括本發(fā)明探針在內(nèi)應(yīng)用于檢測(cè)和/或鑒定土壤桿菌屬存在于生物材料的試劑；(ii)檢測(cè)和/或鑒定生物材料中土壤桿菌屬存在的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)和鑒定的方法包括以下步驟(a)從生物材料中得到樣本，(b)從所述材料中抽提DNA或RNA并變性，然后(c)在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下將本發(fā)明的探針例如可以是捕獲探針、檢測(cè)探針或兩者共存的與核酸雜交，檢測(cè)結(jié)果。在另一實(shí)施方案中，檢測(cè)和鑒定方法包括以下步驟(a)從生物材料中得到樣本，(b)從中抽提DNA，(c)至少一個(gè)，最好是二個(gè)本發(fā)明的引物用于對(duì)抽提DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，(d)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
很顯然，揭示SEQ ID NO1或3中多聚核苷酸或其同系物或部分的序列，可以得到相關(guān)的氨基酸序列。因此本發(fā)明還包括經(jīng)充分純化了的本發(fā)明多聚核苷酸編碼的多肽或其多肽衍生物。
“充分純化的多肽”是指將多肽與其自然發(fā)生環(huán)境完全分開(kāi)和/或與其合成環(huán)境中的大多數(shù)多肽分開(kāi)的多肽。例如，充分純化的多肽與細(xì)胞質(zhì)中的多肽分離。在SDS-PAGE凝膠上的一條帶并不等同于一個(gè)充分純化的多肽，這是因?yàn)槟z樣品含有很多種類的多肽。了解此項(xiàng)技術(shù)的人將會(huì)明白本發(fā)明中多肽可以從自然資源中純化如從一個(gè)土壤桿菌菌株純化，或通過(guò)重組的方式制備。
本發(fā)明包括的多肽、同系物或片段是經(jīng)過(guò)修飾的，以保持或改進(jìn)它們?cè)诩?xì)胞表面展示過(guò)客蛋白的能力。這些修飾包括前面介紹的氨基酸的取代、缺失和插入，但并不改變其固有的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和靶定到外膜的能力。
多肽或多肽的衍生物可以通過(guò)已知的實(shí)驗(yàn)手段產(chǎn)生和純化，并用于得到其抗體。如上所述，多肽或其衍生物可以作為一種融合蛋白產(chǎn)生，其融合蛋白上帶有利于純化的融合尾。融合蛋白用于刺激小的哺乳動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)得到抗所述多肽或多肽衍生物的抗體(單一特異性抗體(monospecificantibody)，因此，本發(fā)明還包括與本發(fā)明多肽或多肽衍生物結(jié)合的單一特異性抗體。
“單一特異性抗體”是指該抗體能和本發(fā)明中某一特異性蛋白發(fā)生反應(yīng)，所述蛋白即特異性的載體蛋白如AopB，其同系物或其中的片段。本發(fā)明中的抗體可以是單克隆的也可以是多克隆的。單一特異性抗體可能是重組體，例如，嵌和的(例如，由小鼠的可變區(qū)和人的恒定區(qū)組成)，人類化的(人的免疫球蛋白恒定骨架連接上動(dòng)物的超變區(qū)，例如小鼠起源的)，和/或單鏈的抗體。多克隆抗體和單克隆抗體都是免疫球蛋白的片段形式，例如F(ab)′2或Fab片段。本發(fā)明的抗體是任何類型的，例如IgG或IgA，并且多克隆抗體可以是一個(gè)單一類型或其混合物。
本發(fā)明中對(duì)應(yīng)多肽、同系物或其片段的抗體是由包含所述多肽，同系物或片段的組合物免疫激活哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的。這種抗體可以是多克隆的也可以是單克隆的。用于產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體的方法已經(jīng)被本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道。作為復(fù)習(xí)，參考Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Eds.E.Harlow and D.Lane(1988)，and D.E.Yelton et al.，1981.Ann.Rev.Biochem.50657-680.對(duì)于單克隆抗體，參考Kohler &Milstein(1975)Nature 256495-497。
由本發(fā)明的多肽或其衍生物如AopB產(chǎn)生的抗體可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的免疫方法進(jìn)行制備和鑒定，例如Western印跡分析，斑點(diǎn)印跡分析或ELISA(Sambrook，J.E.F.et.al.(1989)Molecular Cloning a Laboratory Manual2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y.)。這些抗體用于檢測(cè)樣品如生物樣品中土壤桿菌屬細(xì)菌的存在，也可以通過(guò)親和層析用于純化本發(fā)明中的多肽或其衍生物。
因此，本發(fā)明還提供了(i)用于檢測(cè)包括本發(fā)明抗體、多肽和多肽衍生物的生物樣品中土壤桿菌屬細(xì)菌存在的試劑，和(ii)一個(gè)檢驗(yàn)生物樣品中土壤桿菌存在的方法，其通過(guò)樣品與本發(fā)明中的抗體、多肽或其衍生物接觸組成了一個(gè)免疫復(fù)合物，并且通過(guò)檢測(cè)這個(gè)復(fù)合體來(lái)指示所述樣品或樣品來(lái)源的有機(jī)體中土壤桿菌屬細(xì)菌的存在。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地理解，這個(gè)免疫復(fù)合體是由樣品中的成分和抗體、多肽或多肽衍生物(可以選擇任何一種)形成的，在檢測(cè)該復(fù)合物之前都要將任何非結(jié)合的成分去除。
在診斷方面的應(yīng)用，反應(yīng)物(也就是來(lái)自本發(fā)明的抗體、多肽或多肽衍生物)或者保持自由狀態(tài)或者通過(guò)直接或間接的方法固定到一個(gè)固相支持上例如全細(xì)胞、試管、珠或任何其他經(jīng)常用于此領(lǐng)域的支持物上。直接固定的方法包括反應(yīng)物的細(xì)胞表面表達(dá)、被動(dòng)吸附(無(wú)共價(jià)鍵連接)或在反應(yīng)物與支持之間形成共價(jià)連接。間接方式是指可與反應(yīng)物反應(yīng)的抗反應(yīng)物性化合物首先被結(jié)合到固相支持物上。
本項(xiàng)發(fā)明的另一方面是提供了從生物樣品中純化多肽或多肽衍生物的方法，其包含與樣品間基于抗體的親和層析，其中抗體是本發(fā)明的單一特異性抗體。
應(yīng)用本發(fā)明的純化過(guò)程，抗體可以是單克隆的或多克隆的，并且優(yōu)選是IgG型的。純化的IgG通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法從抗血清中獲得。通常用的層析支持物以及偶聯(lián)抗體的方法在AntibodiesA Laboratory Manual，D.Lane，E.Harlow，Eds.(1988)中有描述，并且下文也會(huì)概要介紹。
簡(jiǎn)言之，生物樣品，如包含RopB的豌豆根瘤菌提取物較適于在一個(gè)非離子型的含去污劑的緩沖液中被上樣至層析材料，最好首先用稀釋生物樣品所使用的緩沖液平衡層析材料，以便于本發(fā)明多肽或多肽衍生物(也就是抗原)能吸附到所述料上。層析材料，如膠或樹(shù)脂與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)，或分批或裝入柱中。洗掉沒(méi)有結(jié)合的成分而抗原經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液洗脫回收，所述洗脫緩沖液例如甘氨酸緩沖液或包含離液劑的緩沖液如鹽酸胍，或高鹽溶液(如，3M MgCl2)。洗脫下來(lái)的級(jí)分經(jīng)回收，通過(guò)280nm吸收值確定抗原的存在。
本發(fā)明還與aopB基因5′區(qū)域一段有啟動(dòng)子活性的分離的DNA有關(guān)。尤其是，本發(fā)明涉及的aopB啟動(dòng)子包含從SEQ ID No1中6到309位核苷酸區(qū)域發(fā)現(xiàn)的功能元件。本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA至少包含aopB轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的5′側(cè)翼區(qū)的部分核苷酸序列。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子DNA包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)可以使啟動(dòng)子在酸性pH下被誘導(dǎo)。
B.表面展示本發(fā)明的一個(gè)方面是與細(xì)菌細(xì)胞表面展示系統(tǒng)相關(guān)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，根癌土壤桿菌的外膜蛋白AopB作為載體蛋白，并且根癌土壤桿菌作為寄主。用兩種過(guò)客蛋白即水母的綠色熒光蛋白(GFP)和大腸埃希氏菌的堿性磷酸酶(PhoA)進(jìn)行全細(xì)胞ELISA、免疫熒光顯微鏡檢測(cè)、流式細(xì)胞儀分析和蛋白酶的可接近性分析，試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種蛋白都可以定位在細(xì)菌細(xì)胞表面。
一方面，本發(fā)明提供了一個(gè)展示過(guò)客蛋白的系統(tǒng)，可以展示過(guò)客蛋白的原本狀態(tài)。所謂“原本狀態(tài)”是指相對(duì)于自然發(fā)生或參考狀態(tài)，過(guò)客蛋白的至少一個(gè)特性(例如酶活性)或結(jié)構(gòu)特征(例如結(jié)合位點(diǎn)或抗體的抗原決定基)保留在展示蛋白中。GFP和PhoA都在沒(méi)有加入還原劑或任何其他減少二硫鍵形成的條件下被定位到細(xì)胞的表面。在細(xì)胞表面展示的PhoA蛋白仍具有酶的活性，即使PhoA蛋白的活性狀態(tài)是二聚體形式并且需要形成分子內(nèi)的二硫鍵，而這種情況在其他的展示系統(tǒng)中會(huì)影響展示的過(guò)程。
AopB至少有4個(gè)位點(diǎn)(SEQ ID No2的氨基酸125，134，172，和207)可以有效的在細(xì)胞表面展示PhoA蛋白。只有AopB N端而并非C端需要參與展示的過(guò)程，這點(diǎn)與其他的展示載體蛋白不一樣。一個(gè)包含多克隆位點(diǎn)的表面展示載體被構(gòu)建，并且可以在AopB的第172位氨基酸位點(diǎn)展示過(guò)客蛋白。其它的展示載體也可以構(gòu)建用來(lái)在AopB的其它氨基酸位點(diǎn)展示過(guò)客蛋白。
另一方面，當(dāng)融合蛋白在aopB啟動(dòng)子的控制下時(shí)，本發(fā)明提供的展示系統(tǒng)可以通過(guò)pH來(lái)進(jìn)行調(diào)控。天然aopB啟動(dòng)子控制下的CGI1突變細(xì)胞中aopB-gfp融合基因的表達(dá)在酸性pH而不是中性pH下高效表達(dá)，這表明aopB啟動(dòng)子可以被酸誘導(dǎo)。所謂酸性pH是指小于7的pH值；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道選擇酸性需要兼顧其它因素比如細(xì)胞的存活力、對(duì)蛋白輸出裝置的影響以及所選pH對(duì)想要過(guò)客蛋白折疊的適宜性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于表面展示該融合蛋白的pH大約為5.5。調(diào)控融合蛋白的表達(dá)便于用于在細(xì)胞中展示本身對(duì)細(xì)胞有潛在毒害的過(guò)客蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可調(diào)控的展示系統(tǒng)使用aopB啟動(dòng)子在土壤桿菌屬中最好是根癌土壤桿菌中表達(dá)融合蛋白。
對(duì)于過(guò)客蛋白和載體蛋白間有效的融合，過(guò)客蛋白融合到本發(fā)明多肽的N端，或優(yōu)選融合到C端。這個(gè)融合蛋白包含一個(gè)連接肽或在載體蛋白與過(guò)客蛋白之間存在一個(gè)蛋白酶敏感的位點(diǎn)。
為了展示，雜合的多肽前體可以包含異源的信號(hào)肽。優(yōu)選的異源信號(hào)肽是那些革蘭氏陰性菌的或來(lái)自于革蘭氏陰性菌的信號(hào)肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，異源的信號(hào)肽與成熟載體蛋白的N端結(jié)合。優(yōu)選的信號(hào)肽包括AopB的信號(hào)序列，尤其是SEQ ID NO2的1-23位氨基酸或其變體或以及優(yōu)選來(lái)自于其它土壤桿菌的同系物。
其它有用的信號(hào)肽包括Lpp靶定序列，其包括信號(hào)序列和成熟蛋白的前面9個(gè)氨基酸。可以作為分泌和膜定位信號(hào)來(lái)源的蛋白包括大腸埃希氏菌外膜脂蛋白如TraT，OsmB，NlpB，BLaZ；銅綠假單胞菌脂蛋白1；流感嗜血菌PA1和PCN蛋白；立氏立克次氏體17 kDa脂蛋白；淋病奈瑟氏球菌H.8蛋白。
基于AopB的展示系統(tǒng)可以通過(guò)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH來(lái)調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)在酸性基本培養(yǎng)基中時(shí)展示效率最高，而當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)在中性基本培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基中時(shí)展示效率則較低?；贏opB的土壤桿菌屬展示代表了一個(gè)可以控制的展示系統(tǒng)，其除了可以展示單體蛋白，還可以直接展示活性的象PhoA(含有二硫鍵)的二聚體或多亞基的蛋白。該系統(tǒng)明顯提高了可展示蛋白的種類以及效率，是一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)以及有效的展示系統(tǒng)。
該發(fā)明不僅提供了AopB作為載體蛋白的展示系統(tǒng)，而且AopB的片段，尤其是AopB的N端片段，同系物以及其變體，還有與AopB同源的AopB相關(guān)膜蛋白都可以作為載體蛋白用于表面展示。AopB相關(guān)膜蛋白包括豌豆根瘤菌的RopB(60％的氨基酸序列的相似性)、布魯氏菌種的免疫原性外膜蛋白(42-47％的氨基酸序列的相似性)、經(jīng)噬菌體感染的漢氏巴爾通氏體的Pap31(46％的氨基酸序列的相似性)、溶血巴斯德氏菌外膜蛋白PomA(47％的氨基酸序列的相似性)、結(jié)核分枝桿菌的PPE(39％的氨基酸序列的相似性)、杜氏嗜血菌外膜主蛋白(43％的氨基酸序列的相似性)和霍亂弧菌的外膜孔蛋白(40％的氨基酸序列的相似性)以及假單胞菌種的孔蛋白F(OprF)的C端區(qū)域。
AopB相關(guān)膜蛋白包括那些對(duì)展示過(guò)客蛋白有功能的片段?；谕葱缘姆治?，預(yù)期AopB相關(guān)膜蛋白與AopB大約有相同的大小，也就是20kDa到24kDa，可以用于展示的載體蛋白片段至少包含自然狀態(tài)下的AopB相關(guān)膜蛋白N端的150到220氨基酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)以下步驟進(jìn)行了解，可以優(yōu)化AopB相關(guān)膜蛋白片段的大小使其適合作為一個(gè)載體蛋白。具體的分析包括以下步驟(i)將一個(gè)報(bào)告蛋白(過(guò)客蛋白)如GFP與測(cè)試片段即推測(cè)的載體蛋白在框內(nèi)連接。通常，通過(guò)編碼報(bào)告蛋白和所述測(cè)試片段的核苷酸序列的框內(nèi)連接來(lái)產(chǎn)生融合蛋白。然后將編碼融合蛋白的核苷酸序列插入到表達(dá)載體中，在細(xì)菌中按步驟(ii)表達(dá)融合蛋白；(ii)用編碼融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)化革蘭氏陰性細(xì)菌，最好是與推測(cè)載體蛋白的菌種是一樣的。并且(iii)使用適合于全細(xì)胞的分析方法例如FACS分析轉(zhuǎn)化菌株的報(bào)告蛋白活性。在細(xì)胞表面報(bào)告蛋白的高水平活性表示這個(gè)片段適合于作為載體蛋白。
苜蓿中華根瘤菌的一個(gè)22kDa的外膜蛋白R(shí)opB的序列可以通過(guò)EMBL登錄號(hào)X80767或AJ007906獲得。
布魯氏菌屬的不同外膜蛋白包括馬爾他布魯氏菌的OM25_BRUME25 kDa的外膜蛋白(EMBL登錄號(hào)U33003)，B.melitensis biovar Canis的OM25 BRUCA 25 kDa外膜蛋白(EMBL登錄號(hào)U39358)，B.melitensis biovarSuis的OM25 BRUSU 25kDa外膜蛋白(EMBL登錄號(hào)U39397)，B.melitensis biovar Abortus的OM25 BRUAB 25kDa外膜主蛋白前體(EMBL登錄號(hào)X79284)，B.melitensis biovar Neotomae的OM25_BRUNE 25kDa外膜蛋白(EMBL登錄號(hào)U39359)，B.melitensis biovar Ovis的OM25_BRUOV 25kDa外膜蛋白(EMBL登錄號(hào)U33004)，B.melitensis biovar Abortus的外膜蛋白(EMBL登錄號(hào)AJ313014)，和馬爾他布魯氏菌的OM31_BRUME 31kDa外膜蛋白(EMBL登錄號(hào)AF076290)。
漢氏巴爾通氏體噬菌體60457的Pap31的31K主蛋白的序列可以在EMBL登錄號(hào)AF001274；AF308165；AF308166；AF308167；AF308168；AF308169；和AF308170中查到。溶血巴斯德氏菌的外膜蛋白PomA的序列可以在EMBL登錄號(hào)AF133259中查到。
結(jié)核分枝桿菌的PPE序列可以在EMBL登錄號(hào)AL009198或AL008967(PE_PGRS)中查到。
霍亂弧菌的推導(dǎo)的外膜孔蛋白的序列可以在EMBL登錄號(hào)AF030977中查到。杜氏嗜血菌的外膜主蛋白的序列可以在EMBL的登錄號(hào)U60646中查到。
可作為寄主展示過(guò)客蛋白的細(xì)菌包括革蘭氏陰性菌，包括但并不局限于土壤桿菌屬，更適宜的包括根癌土壤桿菌，根瘤菌屬，布魯氏菌屬，漢氏巴爾通氏體，溶血巴斯德氏菌，結(jié)核分枝桿菌，杜氏嗜血菌，假單胞菌屬，大腸埃希氏菌，克雷伯氏菌，歐氏桿菌屬，志賀氏菌屬，沙門氏菌屬，霍亂弧菌，乳桿菌屬，卡-介二氏菌(BCG)，和鏈球菌屬，尤其是不產(chǎn)毒素的霍亂弧菌突變菌株和減毒的鼠傷寒沙門氏菌菌株。
本發(fā)明的載體蛋白更適合用于展示適宜寄主。所謂“展示適宜”是指載體蛋白和寄主細(xì)胞的組合能夠有效的展示過(guò)客蛋白。例如，根癌土壤桿菌作為寄主細(xì)胞和AopB作為載體蛋白的組合是展示適宜的。然而大腸埃希氏菌和AopB或苜蓿中華根瘤菌RCR2011和AopB的組合則是不適宜的。展示適宜性可以通過(guò)在寄主細(xì)胞中表達(dá)融合的載體蛋白和過(guò)客蛋白(通常是報(bào)告蛋白)，并且分析融合蛋白在細(xì)胞表面的存在情況而確定。
AopB，片段，變體和AopB相關(guān)膜蛋白的表面展示最好使用其天然的寄主菌。其同系物和變體可具體應(yīng)用如下RopB可以作為根瘤菌屬中的載體蛋白；布魯氏菌種的免疫原性外膜蛋白用于布魯氏菌屬中；漢氏巴爾通氏體的Pap31用于巴爾通氏體中，更好是用于漢氏巴爾通氏體；P.外膜蛋白PomA用于巴斯德氏菌屬中，更適宜的用于溶血巴斯德菌；結(jié)核分枝桿菌的PPE用于分枝桿菌屬中，更適宜的用于結(jié)核分枝桿菌；杜氏嗜血菌的外膜主蛋白用于嗜血菌屬，更適宜用于杜氏嗜血菌；霍亂弧菌的外膜孔蛋白用于弧菌屬，更適宜用于霍亂弧菌；和假單胞菌屬的孔蛋白F(OprF)用于假單胞菌屬。
在一次實(shí)施方案中，AopB，其同系物和變體和其融合體在天然的aopB啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)。在另些實(shí)施方案中，AopB相關(guān)膜蛋白和其片段是在其天然啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)用于展示過(guò)客蛋白，例如RopB是受ropB啟動(dòng)子控制。
本發(fā)明的細(xì)胞表面展示系統(tǒng)具有多種用途，其包括(I)活疫苗的發(fā)展。在這種應(yīng)用中，過(guò)客蛋白可以包含提呈給免疫系統(tǒng)的抗原決定基，從而在免疫系統(tǒng)中引發(fā)免疫反應(yīng)；(II)肽文庫(kù)的篩選。在這項(xiàng)應(yīng)用中，肽文庫(kù)可以展示并通過(guò)順序的結(jié)合和洗脫或熒光激活細(xì)胞分選術(shù)進(jìn)行篩選；(III)生物吸附。在這種應(yīng)用中，全細(xì)胞展示一個(gè)過(guò)客蛋白，該過(guò)客蛋白可以結(jié)合特定的配體，從而可以從溶液中去除這個(gè)配體。
(IV)純化。在這種應(yīng)用中，全細(xì)胞展示一個(gè)過(guò)客蛋白，該過(guò)客蛋白可以結(jié)合特定的配體或受體，當(dāng)將這種全細(xì)胞用做親合基質(zhì)時(shí)可以達(dá)到純化該配體或受體的目的。
(V)全細(xì)胞的催化作用。在這項(xiàng)應(yīng)用中，酶可以被固定在細(xì)胞表面，從而這些細(xì)胞可以當(dāng)作固相催化劑用于生物化學(xué)的反應(yīng)。
C.疫苗非重組活疫苗已經(jīng)很大比例的應(yīng)用了許多年，例如，活體減毒培養(yǎng)的卡一介二氏菌(BCG)可以賦予機(jī)體抵抗肺結(jié)核的免疫力。
最近，重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到對(duì)重組細(xì)菌疫苗的發(fā)展。在這種情況下疫苗包括用于口服的減毒的腸細(xì)菌寄主的活培養(yǎng)物比如大腸埃希氏菌或鼠傷寒沙門氏菌，其表達(dá)來(lái)自病原體的抗原肽。在體內(nèi)，一些細(xì)菌會(huì)找到適合其與野生型大腸埃希氏菌和其他腸道微生物共生的方式。這種方式確保體內(nèi)保存了一個(gè)低水平的抗原肽。因而活疫苗相對(duì)于亞單位或死亡的細(xì)菌疫苗保持了潛在的更有效的更長(zhǎng)時(shí)間的免疫力。
盡管抗原可以激發(fā)免疫反應(yīng)甚至當(dāng)抗原是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時(shí)，但如果多肽抗原在一個(gè)合適的寄主菌株表面表達(dá)可以顯著提高其免疫激活力，推測(cè)起來(lái)可能因?yàn)榧?xì)菌表面例如沙門氏菌或大腸埃希氏菌表面作為一種輔助因素來(lái)提高抗原的免疫激活力。暴露在細(xì)菌細(xì)胞表面的抗原可能更容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別(相對(duì)僅僅由細(xì)菌死亡和降解釋放的抗原)，這是由于表面抗原更利于與抗原識(shí)別和呈遞細(xì)胞(巨噬細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞)上的受體接觸。
本發(fā)明的展示方法因而可以用于在革蘭氏陰性菌中表面表達(dá)抗原。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于抗原展示的細(xì)胞是土壤桿菌屬或根瘤菌屬的細(xì)胞作為活疫苗使用，這是因?yàn)橥寥罈U菌屬或根瘤菌屬對(duì)哺乳動(dòng)物包括人類在內(nèi)都是無(wú)害的。由這些細(xì)菌得到的活疫苗應(yīng)該比來(lái)自于人類病原細(xì)菌的基因工程減毒的菌株更加安全。
其它的可以作為展示過(guò)客蛋白抗原的活體細(xì)菌載體的寄主細(xì)胞包括志賀氏菌屬，沙門氏菌屬，霍亂弧菌，乳桿菌屬，卡一介二氏菌(BCG)以及鏈球菌屬。
因?yàn)橥寥罈U菌屬和根瘤菌屬可以在野生的條件下生存良好，因此，基于AopB和RopB的展示技術(shù)可以用于產(chǎn)生魚(yú)類的活疫苗，其可以直接釋放到水中。
不產(chǎn)毒素的霍亂弧菌突變菌株已作為口服疫苗為人所知。美國(guó)專利4,882,278描述了兩個(gè)ctxA等位基因中每個(gè)編碼序列的大量缺失以致于不產(chǎn)生有功能的霍亂毒素的菌株。WO 92/11354描述了irgA位點(diǎn)被突變失活的菌株，這個(gè)突變可與ctxA突變?cè)趩我痪曛薪M合。WO 94/01533描述了缺少功能型ctxA和attRSl DNA序列的缺失突變，這些突變菌株可通過(guò)基因工程的手段來(lái)表達(dá)異源的抗原，如WO 94/19482所描述的?；魜y弧菌菌株可以表達(dá)本發(fā)明的多肽或多肽衍生物，其有效使用劑量一般大約從1×105到大約1×109，比較好的是約1×106到約1×108，其劑量是指試劑中與服用方法相適宜的活細(xì)菌的量。首選的服用方法包括所有的粘膜途徑，最好是通過(guò)鼻腔或口服。
通過(guò)基因工程手段構(gòu)建的用于表達(dá)或不表達(dá)重組或異源抗原的減毒鼠傷寒沙門氏菌菌株，其用作口服疫苗如WO 92/11361所描述。首選的服用方法包括所有的粘膜途徑，最好這些載體是通過(guò)鼻腔或口服。
本文中提到的目前發(fā)明的其它的作為疫苗載體的細(xì)菌菌株如弗氏志賀氏菌High et al.，EMBO(1992)111991和Sizemore et al.，Science(1995)270299所介紹；還有Medaglini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)926868提到的格氏鏈球菌；和在Flynn J.L.，Cell.Mol.Biol.(1994)40(suppl.I)31，WO 88/06626，WO 90/00594，WO 91/13157，WO 92/01796，和WO92/21376中的卡一介二氏菌。
在細(xì)菌載體中，本發(fā)明的多聚核苷酸被插入到細(xì)菌基因組或作為質(zhì)粒一部分保持自由狀態(tài)。
多種抗原決定基可與激活物(如IL-4)一起表達(dá)在細(xì)胞表面，以進(jìn)一步刺激針對(duì)表面暴露蛋白的免疫反應(yīng)。
活體細(xì)菌疫苗的服用方法通常是非腸道途徑，如通過(guò)注射或口服。口服制劑包括一些賦形劑如可藥用的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂鹽、糖的鈉鹽、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物形成溶液、懸液、藥片、藥丸、膠囊，緩釋制劑或粉末，其中包含10-95％活性成分，較適宜的是25-70％的活性成分。
疫苗的服用方式要與劑型相適宜，并且其用量要能夠產(chǎn)生治療效果和免疫激活作用。服用量要依據(jù)治療的特定對(duì)象決定，包括，例如個(gè)體免疫系統(tǒng)生成抗體的能力和需要保護(hù)的程度。需要服用的活性成分的精確用量依賴于醫(yī)生的判斷。然而，適合的劑量范圍是每次接種的活性成分大約是幾百微克。初次給藥和加強(qiáng)給藥的適宜方案可以有所變化，但通常后來(lái)的接種或其它的給藥跟隨最初的服用方法。
應(yīng)用的范圍可以很廣。任何常用的服用方法對(duì)疫苗都可行。包括生理允許的固相的口服或生理可接受的擴(kuò)散，非腸道途徑、注射等。給藥疫苗的劑量取決于服用途徑并且會(huì)因寄主大小不同而變化。
在很多情況下，需要多次投放疫苗，一般不超過(guò)6次，更常見(jiàn)的是不超過(guò)4次并且較適宜是一次或一次以上，通常至少是約3次。疫苗間正常有2到12個(gè)星期的間隔期，更常見(jiàn)的是3到5星期。免疫過(guò)程之后檢測(cè)針對(duì)抗原的抗體。該檢測(cè)可以通過(guò)常規(guī)的標(biāo)記如放射性核苷酸、酶、熒光劑等等來(lái)完成。這些技術(shù)是已知的且可以通過(guò)很多專利對(duì)該種分析的說(shuō)明來(lái)進(jìn)行，如美國(guó)專利3,791,932；4,174,384和3,949,064。
D.文庫(kù)篩選細(xì)胞表面展示系統(tǒng)可以用于在一個(gè)庫(kù)中篩選想要特性的蛋白質(zhì)。通過(guò)將載體核酸與編碼侯選過(guò)客蛋白的核酸庫(kù)的可表達(dá)融合體轉(zhuǎn)化到寄主生物中，可根據(jù)想要的功能篩選在細(xì)胞表面展示侯選蛋白的寄主細(xì)胞，所述功能例如與配體如抗體或抗原的特異性結(jié)合功能。篩選的方法包括，例如親和分離技術(shù)，包括親和柱層析，從親合基質(zhì)材料中分批洗脫，以及熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。
本發(fā)明的細(xì)菌展示庫(kù)可以通過(guò)FACS進(jìn)行篩選，其使用熒光標(biāo)記的配體作為探針來(lái)檢測(cè)表達(dá)所要過(guò)客蛋白的細(xì)菌。于是使用分選單個(gè)細(xì)菌的FACS裝置便可分離得到已經(jīng)不含有非表達(dá)子的細(xì)菌細(xì)胞。
本發(fā)明提供的篩選抗體的方法可以從在寄主細(xì)胞表面表達(dá)的大量侯選抗體中篩選抗體或片段。這些抗體是從由編碼抗體或抗體片段的DNA制備的表達(dá)載體文庫(kù)中獲得的。這些DNA的一個(gè)來(lái)源可以是由一個(gè)選定的抗原在動(dòng)物中免疫獲得的；另外，可以使用其它來(lái)源的抗體基因如來(lái)源于雜交瘤制備的或通過(guò)對(duì)已知抗體基因的誘變制備的。一個(gè)較好的獲得DNA片段的方法是從免疫動(dòng)物抗體生成細(xì)胞中獲得分離的mRNA。該mRNA可以被擴(kuò)增，例如通過(guò)PCR，并且用于準(zhǔn)備DNA片段來(lái)包括在載體內(nèi)。由編碼所選抗體或抗體片段的一種或多種DNA誘變所得的DNA片段也可以被使用。
一旦抗體表達(dá)庫(kù)準(zhǔn)備好了，用于鑒定和分離特異性抗體的抗原就可以用一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記。有許多類型的可檢測(cè)標(biāo)記，包括熒光標(biāo)記。標(biāo)記的抗原在適宜特異性抗原抗體結(jié)合的條件下與展示抗體表達(dá)庫(kù)的細(xì)胞接觸。其條件可以進(jìn)行改變以使在該條件下只有非常強(qiáng)的結(jié)合作用才可能發(fā)生，例如，通過(guò)使用非常低濃度的標(biāo)記抗原。
鑒定抗體或抗體片段表達(dá)的細(xì)胞可以通過(guò)依賴于檢測(cè)是否存在結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記的方法來(lái)完成。尤其優(yōu)選的鑒定和分離方法是細(xì)胞分選或流式細(xì)胞術(shù)如熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。
通過(guò)FACS鑒定表達(dá)抗體的細(xì)菌直接基于對(duì)可溶性半抗原的親和性，從而消去結(jié)合在固相表面的雜質(zhì)。這意味著與低濃度熒光標(biāo)記抗原結(jié)合后，只有高親和性的抗體可以通過(guò)分選重新獲得，陽(yáng)性克隆的分選只是受到流式細(xì)胞儀精確性的限制。
本發(fā)明的細(xì)菌展示庫(kù)同樣可以用親和層析進(jìn)行選擇，其中對(duì)過(guò)客蛋白特異性的配體被結(jié)合在基質(zhì)上。因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞比較大，所以上樣時(shí)需要十分小心，以防被非特異性的細(xì)胞堵塞了柱子。在利于過(guò)客蛋白與基質(zhì)所結(jié)合的配體結(jié)合的條件下上樣和平衡層析柱之后，細(xì)胞可以通過(guò)游離的配體通過(guò)層析柱或低pH進(jìn)行洗滌。
展示過(guò)客蛋白的寄主細(xì)胞可以進(jìn)一步培養(yǎng)并用于獲得融合蛋白。如果需要，當(dāng)載體蛋白和過(guò)客蛋白之間有特異性蛋白酶切位點(diǎn)存在的時(shí)候，可以通過(guò)蛋白酶處理使載體蛋白和過(guò)客蛋白分離。
一旦想要的過(guò)客蛋白被展示，編碼該過(guò)客多肽的DNA就可以被突變，例如，使用增變菌株。親和分離可以重新用于鑒定和選擇想要的突變體。
由細(xì)菌產(chǎn)生的重組免疫球蛋白庫(kù)包括重鏈和輕鏈的可變區(qū)域，以便于能夠象自然狀態(tài)的抗體一樣具有抗原結(jié)合的親和性。進(jìn)一步，由于隨機(jī)序列可以插入到抗體的編碼序列中，所以來(lái)自于細(xì)菌的重組抗體種類實(shí)際上是多于通過(guò)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的抗體種類，以便于更大抗體庫(kù)可以產(chǎn)生?？贵w在細(xì)菌表面的展示有助于選擇與特異性抗原高親和的抗體。因此，基于AopB的系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生抗體庫(kù)并對(duì)高親和的抗體進(jìn)行選擇。
本發(fā)明的展示方法可以用于對(duì)重組蛋白的檢測(cè)和定性。例如，這個(gè)方法可用于繪制一個(gè)未知的抗原決定基圖。依據(jù)說(shuō)明，將編碼(1)隨機(jī)肽庫(kù)或(2)從免疫反應(yīng)性的目的蛋白得到的多肽庫(kù)的序列克隆到本發(fā)明的表達(dá)載體中，用于表達(dá)AopB的融合蛋白。用該載體庫(kù)轉(zhuǎn)化AopB展示適宜的寄主細(xì)胞，并在細(xì)菌細(xì)胞表面展示肽庫(kù)-AopB的融合蛋白。在固體基質(zhì)上培養(yǎng)之后，通過(guò)與表達(dá)的融合蛋白反應(yīng)的標(biāo)記抗體對(duì)細(xì)菌進(jìn)行選擇。反應(yīng)性的克隆可以被挑選出并分離其載體。對(duì)插入序列的分析可以揭示抗體識(shí)別的與抗原決定基相應(yīng)的肽序列。
本發(fā)明的展示方法還可以用于檢測(cè)重組蛋白的活性如抗體的活性。例如，這個(gè)方法可以用來(lái)篩選重組的抗體-AopB融合蛋白庫(kù)。這些庫(kù)包括由重鏈和輕鏈可變區(qū)基因組成的組合的單鏈基因庫(kù)或特異性重組抗體基因的突變庫(kù)。要檢測(cè)的特性包括結(jié)合活性、催化活性、抑制活性和改變的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
本發(fā)明還可以用來(lái)作為一個(gè)最初的克隆系統(tǒng)。例如，cDNA文庫(kù)可以構(gòu)建和插入到本發(fā)明的載體并且文庫(kù)通過(guò)與配體的結(jié)合能力篩選。配體/結(jié)合分子的組合可以包括任何一對(duì)具有相互特異性結(jié)合的分子，例如，受體/配體，酶/底物(或類似物)，核酸結(jié)合序列/核酸等等。如果有了其中的一種，那么就可以用此方法分離相對(duì)應(yīng)的克隆。
E.生物吸附本發(fā)明的展示方法可以用于從液體中去除污染物。在這個(gè)方法中，在革蘭氏陰性菌外膜表達(dá)的受體蛋白可以用于與多種不想要的成分互作。例如金屬硫蛋白可以與多種重金屬結(jié)合，例如鐵、鎘、鋅、銅、釩以及其他相似的金屬。當(dāng)這些成分與革蘭氏陰性菌的細(xì)胞表面結(jié)合，我們就可以把這些重金屬?gòu)囊后w樣品中去除。
因而，過(guò)客蛋白作為生物吸附劑的一個(gè)例子就是金屬硫蛋白，人金屬硫蛋白已經(jīng)與一個(gè)外膜蛋白一起構(gòu)成的融合體被表達(dá)(Jacobs et al.Gene 83，95(1989))。由于構(gòu)建重組蛋白的方式，金屬硫蛋白被定位在大腸埃希氏菌外膜的內(nèi)側(cè)并朝向壁膜間隙的方向。然而，由于金屬離子可以擴(kuò)散穿過(guò)外膜，所以重組體細(xì)胞相對(duì)正常的大腸埃希氏菌可以結(jié)合超過(guò)66倍的鎘離子。
展示多肽如特定抗體的全細(xì)胞也可以作為吸附劑用來(lái)去除生物污染，例如來(lái)自水樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素或去除來(lái)自于血液的濾過(guò)性雜質(zhì)。這種全細(xì)胞吸附的效率可以通過(guò)細(xì)菌表面的交叉連接而提高。這也會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的穩(wěn)定性防止被裂解。穩(wěn)定的一個(gè)方法是通過(guò)細(xì)胞表面脂多糖形成細(xì)胞之間的特異交叉連接。因而細(xì)胞可以得到聚集和穩(wěn)定而沒(méi)有影響表面展示蛋白的功能。其它的細(xì)胞吸附劑類型是通過(guò)在細(xì)菌細(xì)胞外膜表達(dá)包括纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域、蛋白A、凝集素或蛋白酶受體等。
限制全細(xì)胞吸附劑發(fā)展的主要因素是缺少表面帶有合適的配體的細(xì)菌菌株。根據(jù)本發(fā)明的展示方法，在細(xì)菌細(xì)胞表面展示不同序列的不同肽庫(kù)應(yīng)該是可以做到的。能展示與特定靶標(biāo)分子有高親合的肽的細(xì)胞可以通過(guò)FACS進(jìn)行選擇。適合全細(xì)胞吸附的配體可以由此被選擇和應(yīng)用于基于AopB的展示系統(tǒng)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，土壤桿菌屬和根瘤菌屬分別帶有AopB和同系物RopB，被作為寄主細(xì)胞用于生物吸附。這兩個(gè)屬的細(xì)菌都可以在含有少量營(yíng)養(yǎng)的野生環(huán)境中存活數(shù)年。土壤桿菌屬和根瘤菌屬細(xì)胞可用于選擇和展示能與危害分子結(jié)合的過(guò)客蛋白。展示細(xì)胞可直接用于從環(huán)境中去除危害分子。
F.純化生物分子的親和純化主要依賴蛋白和配體間的強(qiáng)的互作。通常，配體結(jié)合在固相的基質(zhì)中，通過(guò)層析技術(shù)進(jìn)行分離。最近，淀粉顆?；蛑|(zhì)體用做親和純化的基質(zhì)。在一些最有用和特異性的分離中，親和的配體是蛋白如抗體、凝集素或蛋白受體。蛋白親和吸附劑的制備包括多肽的產(chǎn)生、純化和在固相支持基質(zhì)上的固定。這三個(gè)步驟對(duì)于大規(guī)模應(yīng)用通常是復(fù)雜和昂貴的。
在表面表達(dá)蛋白的細(xì)菌細(xì)胞可以作為重要的低花費(fèi)的固相親和基質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于純化抗體特異性抗原的親和基質(zhì)包含展示抗體的全細(xì)菌。相反，展示抗原的全細(xì)菌用作親合基質(zhì)可以用于純化特原特異的抗體。
G.全細(xì)胞催化此發(fā)明的展示方法可以用于固定酶。通過(guò)上述方法可以使多種有生物催化活性的多肽在細(xì)菌細(xì)胞表面得到表達(dá)。在細(xì)菌細(xì)胞表面得到表達(dá)的酶有利于增加與底物的可接近性，酶的穩(wěn)定性，及潛在提高脂類的溶解性。更特別的是，無(wú)需使用額外的細(xì)菌寄主細(xì)胞成分，固定于寄主細(xì)胞膜上的生物催化活性的多肽可以用于雙相反應(yīng)系統(tǒng)。固定化酶所提高的脂類溶解性能使在親脂溶劑中的催化劑底物之間相互作用通過(guò)對(duì)水溶性生成物的萃取進(jìn)入水相。這樣的固定化系統(tǒng)更深一步預(yù)期可以包括將膜表面的固定化酶包裹在脂質(zhì)體中或類似的小泡中。
整個(gè)細(xì)胞作為酶促催化劑的方法已經(jīng)使用了幾年了。通常，以產(chǎn)生特定酶的微生物作為生物催化劑使用，從而避免了與蛋白質(zhì)提純和固定化步驟相關(guān)的費(fèi)用。通常，首先需要將細(xì)胞滅活，然后用滲透劑處理以使反應(yīng)物及產(chǎn)物能擴(kuò)散進(jìn)入胞漿，最后細(xì)胞由化學(xué)交聯(lián)形式固定。對(duì)全細(xì)胞生物催化劑的制備近年來(lái)也有不少改進(jìn)。但，其固有的限制是當(dāng)前技術(shù)所不能逾越的。首先，用于細(xì)胞膜穿透(permeabilization)的化學(xué)方法同時(shí)會(huì)導(dǎo)致一些重要的酶鈍化。第二，其他一些細(xì)胞內(nèi)的酶可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)與底物作用而增加不必要的副產(chǎn)品產(chǎn)生及減少產(chǎn)量。第三，細(xì)胞內(nèi)部的降解過(guò)程會(huì)限制生物催化劑的功能性生命周期。如果酶附于細(xì)胞外部，這些問(wèn)題可以被減少。
基于AopB的展示系統(tǒng)可以在細(xì)胞表面產(chǎn)生固定的堿性磷酸酶，其可用做DNA片段脫磷酸化或其他用途。隨后用離心或過(guò)濾輕松除去固定化酶。
實(shí)施例以上內(nèi)容只是一般性的描述了這項(xiàng)發(fā)明。要想對(duì)其有一個(gè)更深入的了解，可以參考以下提供的特定的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是為了說(shuō)明的需要，而不是故意要限制本發(fā)明的范圍。形式上的變化和等價(jià)物的取代被認(rèn)為是可能有利的環(huán)境。雖然本文使用專業(yè)術(shù)語(yǔ)，這些術(shù)語(yǔ)是為了描述的方便而并非為了有所限制。
實(shí)施例1試驗(yàn)方案細(xì)菌菌株，質(zhì)粒和培養(yǎng)基該試驗(yàn)中所用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒如表1所示。在37℃用LB培養(yǎng)基(Sambrook et al.，1989)培養(yǎng)大腸埃希氏菌菌株，如果必要可在LB培養(yǎng)基中加50μg/ml卡那霉素，100μg/ml氨芐青霉素和/或10μg/ml四環(huán)素。根癌土壤桿菌菌株在28℃培養(yǎng)于MG/L，AB或IB培養(yǎng)基上(Cangelosi，G.A.，Best，E.A.，Maninetti，G.，Nester，E.W.，1991.Genetic analysis of Agrobacterium.Methods Enzymol.204，384-397)，如需要可加100μg/ml卡那霉素和/或5μg/ml四環(huán)素。苜蓿中華根瘤菌菌株置于LB/MC培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Finan，T.M.，Kunkel，B.，De Vos，G.F.，Signer，E.R.，1986.Second symbiotic megaplasmid in Rhizobium meliloticarrying exopolysaccharide and thiamine synthesis genes.J.Bacteriol.16766-72；Glazebrook J，Walker GC.1991.Genetic techniques in Rhizobiummeliloti.Methods Enzymol.204398-418)，必要時(shí)可加入10μg/ml四環(huán)素。質(zhì)粒DNA通過(guò)進(jìn)行三親交配(triparental mating)導(dǎo)入至C58根癌土壤桿菌菌株中，輔助菌株(helper strain)為MT616。
表1.細(xì)菌菌株和質(zhì)粒


aAmp，氨芐青霉素；Gm，慶大霉素；Km卡那霉素；Nal，萘啶酸；Rf，利福平；Sm，鏈霉素；Tc，四環(huán)素。
Berger，B.R.，Christie，P.J.，1994.Genetic complementation analysis of the根癌土壤桿菌virB operonvirB2 through virB11 are essential virulence genes.J.Bacteriol.1763646-3660；Cangelosi，G.A.，Best，E.A.，Martinetti，G.，Nester，E.W.，1991.MethodsEnzymol.204，384-397；
Charles，T.C.，Nester，E.W.，1993.A chromosomally encodedtwo-component sensory transduction system is required for virnlence of根癌土壤桿菌.J.Bacteriol.1756614-6625；Chen，C.Y.，Winans，S.C.，1991.Controlled expression of thetranscriptional activator gene virG in根癌土壤桿菌by using the Escherichiacoli lac promoter.J.Bacteriol.1731139-1144；Finan，T.M.，Kunkel，B.，De Vos，G.F.，Signer，E.R.，1986.J.Bacteriol.16766-72；Pan，S.Q.，Jin，S.，Boulton，M.I.，Hawes，M.，Gordon，M.P.，Nester，E.W.，1995.An Agrobacterium virnlence factor encoded by a Ti plasmid gene or achromosomal gene is required for T-DNA transfer into plants.Mol.Microbiol.17259-269；Rosenberg，C.，Huguet，T.，1984.The pAtC58 plasmid is not essential fortumor induction.Mol.Gen.Genet.196533-536；Green fluorescent protein-based reporter systems for genetic analysis ofbacteria including monocopy applications.Gene 19669-74；Watson，B.，Currier，T.C.，Gordon，M.P.，Chilton，M.D.，Nester，E.W.，1975.Plasmid required for virulence of根癌土壤桿菌.J.Bacteriol.123255-264；Yarosh，O.K.，Charles，T.C.，F(xiàn)inan，T.M.，1989.Analysis ofC4-dicarboxylate transport genes in Rhizobium meliloti.Mol.Microbiol.3813-823.
DNA操作除非有其他的說(shuō)明，通常都會(huì)常規(guī)選用DH5α作為克隆試驗(yàn)的受體菌株。如先前所描述的來(lái)制備高效感受態(tài)細(xì)胞。(Inoue，H.，Nojima，H.，Okayama，H.，1990.High efficiency transformation of Escherichia coli withplasmids.Gene 96，23-28)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(Sambrook et al.，1989)，通過(guò)轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒DAN導(dǎo)入大腸埃希氏菌。通過(guò)三親交配，其中MT616為輔助菌株(Ditta，G.，Stanfield，S.，Corbin，D.，Helinski，D.R.，1980.Broad host range DNAcloning system for gram-negative bacteriaconstruction of a gene bank ofRhizobium melioti.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 777347-7351)，或電穿孔(Cangelosi，G.A.，Best，E.A.，Martinetti，G.，Nester，E.W.，1991.MethodsEnzymol.204，384-397)，寬宿主譜的質(zhì)?？梢詫?dǎo)入根癌土壤桿菌。根癌土壤桿菌的全部DNA可以依據(jù)Charles和Nester的方法制備(Charles，T.C.，Nester，E.W.，1993.J.Bacteriol.1756614-6625)。
Southern分析為了制備DNA探針，由適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶|(zhì)粒DNA。可以用瓊脂糖凝膠分離DAN片段，并由GENECLEAN II試劑盒純化(Biol0l)。用熒光素(Amersham)隨機(jī)標(biāo)記探針。將根癌土壤桿菌全部的DNA消化得到片段，在1.0％瓊脂糖凝膠上分離片段，用PosiBlot 30-30 PressureBlotter(Stratagene)將片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。按制造廠商的說(shuō)明(Amersham)進(jìn)行雜交，洗滌和檢測(cè)。
AopB的克隆和測(cè)序提取突變菌株CGI1中的全部DNA，其中所述突變菌株CGI1的aopB基因上插入了mini-Tn5。Southern分析顯示，因?yàn)檗D(zhuǎn)座子中沒(méi)有SphI位點(diǎn)，9 kb的SphI DNA片段包含了插入兩邊的序列。從瓊脂糖凝膠回收的DNA片段然后由GENECLEAN II試劑盒(Biolol)純化。然后SphI DNA片段被克隆到pTZ19R的SphI位點(diǎn)。所生成的質(zhì)粒命名為pJYH2。通過(guò)mini-Tn5的特異性引物及M13的反向引物和-40通用引物對(duì)pJYH2測(cè)序，所測(cè)序列資料于是用于產(chǎn)生下一輪的引物用于進(jìn)一步測(cè)序。DNA測(cè)序使用的是ABI PRISM 377核酸序列分析儀。
為克隆全長(zhǎng)野生型aopB基因，設(shè)計(jì)引物p54(5′-GCAAATCGCTAGCTGTCACTCAGC-3′)和p55(5′-AGAACGGCTAGCGCACTGAAGCGG-3′)可分別再退火到aopB基因的上游和下游序列。兩個(gè)引物都有NheI位點(diǎn)(劃線處的核苷酸)協(xié)助隨后的克隆。以根癌土壤桿菌C58菌株的全部DNA為PCR的模板來(lái)擴(kuò)增一個(gè)1.4kb的片段。一份50μl的PCR反應(yīng)體系包括1X反應(yīng)緩沖液，0.2mM dNTPs，20pmol的每種p54和p55引物，和2.5單位的TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR反應(yīng)混合物在95℃變性1分鐘。隨后總共30個(gè)循環(huán)按如下操作95℃變性30秒，50℃退火30秒，和72℃延伸1.5分鐘，隨后進(jìn)行一個(gè)72℃10分鐘的延伸循環(huán)。然后用NheI消化PCR產(chǎn)物，再與已用XbaI消化的pSW172連接。雙方向分別測(cè)定所生成的質(zhì)粒pJYH5的序列，以得到確定的序列數(shù)據(jù)。用BLAST程序在數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找同源的序列。推定的信號(hào)肽由SMART確定。
MBP-AopB融合蛋白的純化和AopB的抗體的制備將包含有MBP-AopB框內(nèi)融合構(gòu)建體的DH5α(pJYH17)，置于添加了100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用新配制的培養(yǎng)液將細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋100倍，再37℃培養(yǎng)至OD600≈0.5。通過(guò)加入IPTG至最終濃度0.3mM及在37℃細(xì)胞培養(yǎng)2-3小時(shí)，完成MBP-AopB融合蛋白的誘導(dǎo)。MBP-AopB的純化是依據(jù)Pan et al.，1995.Mol.Microbiol.17259-269中所述進(jìn)行的。純化后的蛋白注入兔子體內(nèi)產(chǎn)生初級(jí)抗體。
用TnphoA的誘變確定AopB蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)將包含野生型aopB基因的pJYH5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到MT621中，MT621中包含了TnphoA轉(zhuǎn)座子。通過(guò)混合MT621(pJYH5)，A6010和MT616進(jìn)行三親交配，在MG/L瓊脂平板上28℃過(guò)夜培養(yǎng)。將混合物用滅菌的小木棒刮下，重懸于IB液體培養(yǎng)基中。細(xì)胞懸浮液涂在IB平板上并28℃培養(yǎng)3天，其中IB平板中包含卡那霉素、四環(huán)素以及顯色反應(yīng)物5-溴-4氯-3-吲哚磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)(X-phos，20μg/ml)。藍(lán)色的菌落轉(zhuǎn)至新配制的MG/L平板，其中為了純化加入了100μg/ml卡那霉素和2μg/ml四環(huán)素。通過(guò)三親交配，將包含TnphoA插入的質(zhì)粒導(dǎo)入MT607，由MT616作為輔助菌株。SmaI和ClaI用來(lái)繪制TnphoA插入的位置。通過(guò)使用phoA特異性的引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序以確定準(zhǔn)確的插入位點(diǎn)。為了測(cè)定堿性磷酸酶的活性，根癌土壤桿菌細(xì)胞在MG/L中28℃過(guò)夜培養(yǎng)，在OD600＝0.3時(shí)轉(zhuǎn)移到AB、IB或加有乙酰丁香酮(acetosyringone)(AS)(100μM)的IB中。通過(guò)測(cè)量對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate)的水解程度來(lái)確定PhoA融合體的堿性磷酸酶活性(Brickman，E.，Beckwith，J.，1975.Analysis of the regulation of Escherichia colialkaline phosphatase synthesis using deletions and phi80 transducing phages.J.Mol.Biol.96307-3 16)。用以下公式計(jì)算堿性磷酸酶活性的特定單位[(A420-1.75X A550)X 103]/[t(min)X A600]。
AopB基因表達(dá)的測(cè)定用aopB-gfp和aopB-phoA融合體來(lái)測(cè)定aopB基因表達(dá)。為了使用aopB-gfp融合體，將CGI1細(xì)胞置于不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按前面所述的方法測(cè)量相對(duì)熒光強(qiáng)度(Ir)(Tang，X.，Lu，B.F.，Pan，S.Q.1999.A bifunctional transposon mini-Tn5gfp-km which can be used to select forpromoter fusions and report gene expression levels in根癌土壤桿菌.FEMSMicrobiology Letters 17937-42)。用C58細(xì)胞為陰性對(duì)照。激發(fā)波長(zhǎng)為395nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510nm；及波長(zhǎng)間隙(wavelength slit)為5。使用aopB-phoA融合體時(shí)，帶有aopB-phoA融合體的細(xì)菌細(xì)胞的堿性磷酸酶活性可按較早描述的方法測(cè)定。
亞細(xì)胞的分級(jí)分離根癌土壤桿菌的亞細(xì)胞分級(jí)分離采用的是對(duì)先前描述的方法略有改動(dòng)的方法(De Maagd，R.A.，Lugtenberg，B.，1986.Fractionation of Rhizobium leguminosarum cells into outer membrane，cytoplasmic membrane，periplasmic，and cytoplasmic components.J.Bacteriol.1671083-1085)。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將根癌土壤桿菌菌株C58和CGI1置于MG/L培養(yǎng)基中28℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后3200xg離心5分鐘收集細(xì)胞。再用水清洗一次細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到新的OD600＝0.3的IB液體培養(yǎng)基中。28℃誘導(dǎo)細(xì)胞18-20小時(shí)，再按上述方法收集。室溫下，用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，通過(guò)離心洗滌細(xì)胞沉淀(cell pellet)3次。一部分細(xì)胞沉淀(OD600測(cè)量大概為2×1010個(gè)細(xì)胞)按如下方法用來(lái)分離細(xì)胞周質(zhì)級(jí)分。細(xì)胞沉淀重懸于5ml的50mMTris-HCl(pH 8.0)，20％蔗糖，2mM EDTA和0.2mg/ml溶菌酶中。細(xì)胞懸浮液室溫下培養(yǎng)30分鐘再在4℃3000xg離心15分鐘。取上清液在20,000xg離心15分鐘，其上層液體為胞周級(jí)分保存。另一部分的細(xì)胞沉淀(1×1011個(gè)細(xì)胞)按以下方法制備其他亞細(xì)胞級(jí)分。將細(xì)胞沉淀重懸于5ml的50mMTris-HCl(pH 8.5)，20％蔗糖，0.2mM DTT，0.2mg/ml DNase I和0.2mg/mlRNase A中。在20,000psi，將細(xì)胞懸浮液通過(guò)French Press mini-cell5次后，冰上培養(yǎng)30分鐘。細(xì)胞裂解物用兩倍體積的50mM Tris-HCl(pH 8.5)稀釋，在262,000xg下用Beckman SW80Ti轉(zhuǎn)子離心2小時(shí)。其上清液作為胞質(zhì)級(jí)分保存，然后再用超聲波將沉淀懸浮于20％蔗糖-5mM EDTA-0.2mM DTT中，而其中的一小部分懸浮液保存為全膜級(jí)分。將剩下的懸浮液鋪在下列密度梯度上2ml 60％蔗糖(wt/wt)，4ml 45％蔗糖(wt/wt)和5ml溶于5mM EDTA(pH 7.5)的30％蔗糖(wt/wt)。該梯度液在58,000xg用BeckmanSW41Ti轉(zhuǎn)子離心18小時(shí)。收集保存上帶的內(nèi)膜級(jí)分和下帶的外膜級(jí)分。加入3倍體積的丙酮沉淀胞周、胞質(zhì)、內(nèi)膜和外膜級(jí)分中的蛋白質(zhì)。在Laemmli樣本緩沖液中溶解各個(gè)級(jí)分。
AopB的全細(xì)胞ELISA將根癌土壤桿菌菌株A6010的細(xì)胞置于有100μM乙酰丁香酮(AS)的IB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)并用PBS(pH 7.4)通過(guò)在10,000g離心5分鐘洗滌2次。通過(guò)測(cè)量600nm的光密度來(lái)確定細(xì)胞濃度并調(diào)整至4×108細(xì)胞/ml。取50μl的細(xì)胞懸浮液移至IMMUNLON 2HB微量滴定板的孔中。加入50μl 8％多聚甲醛固定細(xì)胞，并在室溫下培養(yǎng)45分鐘。之后用PBS(pH 7.4)洗滌2次，并用120μl含2％牛血清白蛋白的PBS封閉45分鐘。用PBS洗滌3次后，將細(xì)胞與用PBST/BSA(PBS，0.02％Tween 20，0.2％BSA)稀釋(1∶500)的AopB抗體、VirJ抗體(Pan et al.，1995.Mol.Microbiol.17259-269)或GFP單克隆抗體(Clontech)一起孵育45分鐘。用PBST(PBS，0.05％Tween 20)洗滌細(xì)胞3次，每次10分鐘。加入50μl HRP偶聯(lián)的2級(jí)抗體(1∶2000稀釋)再培養(yǎng)45分鐘。在每孔加200μl TMB-ELISA(GIBCO)前，用PBST洗滌3次，再避光培養(yǎng)15分鐘。加入50μl 1N H2SO4來(lái)停止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸收值。
Western分析在Laemmli樣本緩沖液中將蛋白質(zhì)樣本煮沸5分鐘使蛋白質(zhì)樣本變性，再上樣至SDS/12％PAGE甘氨酸凝膠。進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(BIO-RAD)。增加的同時(shí)，按照制造商建議的方法(Pierce)，通過(guò)擴(kuò)增化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行封閉、洗脫、檢測(cè)。
抗血清按較早描述的方法制備兔抗AopB多克隆抗體。從ChemiconInternational購(gòu)買小鼠抗堿性磷酸酶單克隆抗體。從Clontech買小鼠抗GFP單克隆抗體。C.W.Jones惠贈(zèng)兔抗ChvE抗體。從Molecular Probes得到R-藻紅蛋白(r-PE)偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG。購(gòu)買Pierce的HRP偶聯(lián)的羊抗兔和羊抗小鼠IgG。
展示蛋白的全細(xì)胞ELISA在不同的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)根癌土壤桿菌細(xì)胞；用OD600確定細(xì)胞懸浮液的濃度；將細(xì)胞濃度調(diào)整到4×108細(xì)胞/ml。每50μl細(xì)胞懸浮液移到Immunlon 2HB微量滴定板(Dynex)的孔中。再每孔加入50μl的8％多聚甲醛固定細(xì)胞，并室溫培養(yǎng)1小時(shí)。用PBS(pH 7.4)洗2次，用含2％BSA的150μl PBS(PBS/BSA)封閉1小時(shí)。用PBS洗滌3次后，將該細(xì)胞用含0.02％Tween 20的PBS/BSA稀釋的(1∶500)第一抗體孵育1小時(shí)。用有0.05％Tween 20的PBS(PBST)，使用洗瓶洗滌細(xì)胞3次，在洗滌間隔中培養(yǎng)10分鐘。然后加入50μl按1∶2000稀釋的HRP偶聯(lián)的羊抗兔或羊抗小鼠IgG，培養(yǎng)1小時(shí)。在加入200μl TMB-ELISA(GIBCO)避光培養(yǎng)15分鐘前，用PBST洗細(xì)胞5次。用50μl 1N H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm的吸光值。
流式細(xì)胞分析按上述方法培養(yǎng)根癌土壤桿菌菌株C58(pJYH5)，C58(pJYH5039)，C58(pJYH5125)，C58(pJYH5134)，C58(pJYH5172)以及C58(pJYH5207)。對(duì)于每一個(gè)菌株，用10,000×g離心1分鐘收集4×108個(gè)細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次，再在1.5ml PBS/BSA中培養(yǎng)30分鐘。在PBS/BSA中按1∶1000稀釋單克隆小鼠抗AP抗體，之后加到懸浮液中。室溫輕輕振蕩培養(yǎng)懸浮液45分鐘。用PBST洗滌3次后，將細(xì)胞重懸于用PBS/BSA稀釋(1∶100)的1.0ml r-藻紅蛋白偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG(Molecular Probes)中并避光振蕩培養(yǎng)45分鐘。用PBST洗滌一次后，加入1ml 2％多聚甲醛在室溫下培養(yǎng)30分鐘固定細(xì)胞。再按上述方法洗滌4次；將細(xì)胞重懸于500μl PBS中并用FACS流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。記錄10,000個(gè)細(xì)胞的熒光。
共聚焦顯微鏡檢測(cè)(Confocal microscopy)為進(jìn)行上述流式細(xì)胞分析，用如上方法處理的15μl一份的細(xì)胞樣品，滴到玻璃載玻片上；為防止熒光的快速猝滅每一份細(xì)胞樣品加入一滴封片劑(Vector)并蓋上蓋玻片。在共聚焦顯微鏡下(激發(fā)波長(zhǎng)為543nm，發(fā)射波長(zhǎng)為570nm.)下檢測(cè)細(xì)胞。
蛋白酶的可接近性分析(Protease accessibility assays)在不同液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)根癌土壤桿菌。按先前的方法(Burnett MS，Wang N，Hofmann M，Kitto GB.2001.Vaccine.19735-742)略加修飾，用胰蛋白酶消化細(xì)胞。簡(jiǎn)單的說(shuō)，通過(guò)10,000×g離心1分鐘收集到OD600＝1的細(xì)胞懸浮液，并用1ml含有10mM MgCl2的25mM HEPES緩沖液(pH 8.0)洗滌一次。細(xì)胞沉淀重懸于50μl相同的緩沖液中再在冰上培養(yǎng)30分鐘。在細(xì)胞懸浮液中加入胰蛋白酶，使其最終濃度達(dá)到0.1mg/ml；該混合物37℃培養(yǎng)5分鐘。通過(guò)加入55μl的2×Laemmli樣品緩沖液來(lái)停止反應(yīng)。將樣品煮沸10分鐘，再將10μl的樣品加到SDS/10％聚丙烯酰胺/Tris-甘氨酸凝膠上。將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Bio-Rad)。按照制造商建議的方法(Pierce)，通過(guò)擴(kuò)增化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行封閉、洗脫、檢測(cè)。AopB-PhoA和AopB-GFP蛋白用抗AopB抗體可以檢測(cè)到。用抗ChvE抗體可以檢測(cè)到ChvE蛋白(用做對(duì)照)。
測(cè)定含有pJYH23的細(xì)菌細(xì)胞的堿性磷酸酶活性28℃在MG/L中過(guò)夜培養(yǎng)根癌土壤桿菌細(xì)胞；收集細(xì)胞并重懸于MG/L，AB，或IB中(OD600＝0.3)；再28℃培養(yǎng)18小時(shí)。大腸埃?；贚B培養(yǎng)基中28℃過(guò)夜培養(yǎng)；苜蓿中華根瘤菌細(xì)胞在LB/MC中28℃過(guò)夜培養(yǎng)。收集相當(dāng)于OD600＝1的細(xì)菌細(xì)胞用于一次處理，為測(cè)定蛋白酶的易接近性，按上述方法洗滌和處理，同時(shí)加入或不加入0.1mg/ml胰蛋白酶。然后用1M Tris-HCl(pH 8.0)洗滌細(xì)胞二次，再重懸于1ml的相同的緩沖液中。100μl的每一份細(xì)胞懸浮液用1MTris-HCl(pH 8.0)稀釋到1ml。用該細(xì)胞懸浮液來(lái)測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞(包含有pJYH23)的堿性磷酸酶(AP)活性，如先前所述(Brickman and Beckwith，1975)，其中的AopB172-PhoA蛋白的活性由底物對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate)的水解速度確定。按如下公式計(jì)算堿性磷酸酶活性的特異單位[(A420-1.75×A550)×103]/[t(min)×A600]。因胰蛋白酶處理而致的AP活性減少由胰蛋白酶處理后除去的AP活性的單位百分比表示。
實(shí)施例2aopB和aopB相關(guān)基因的鑒定和特征由包含可以編碼GFP變體的啟動(dòng)子缺少基因(promoter-less gene)的mini-Tn5轉(zhuǎn)座子誘變根癌土壤桿菌C58，在UV光下該GFP變體可以產(chǎn)生亮綠色的熒光(Li，L.，Li，Y.，Lim，T.M.，Pan，S.Q.，1999.GFP-aided confocal laserscanning microscopy can monitor根癌土壤桿菌cell morphology and geneexpression associated with infection.FEMS Microbiol.Lett.179141-146)。由質(zhì)粒pAG408攜帶mini-Tn5轉(zhuǎn)座子(Suarez，A.，Guttler，A.，Stratz，M.，Staendner，L.H.，Timmis，K.N.，Guzman，C.A.，1997.Green fluorescentprotein-based reporter systems for genetic analysis of bacteria includingmonocopy applications.Gene 19669-74)。其中的一個(gè)變體，CGI1，包含一個(gè)在轉(zhuǎn)座子插入一個(gè)可以通過(guò)基本培養(yǎng)基的低pH進(jìn)行的差異誘導(dǎo)的基因；在IB平板(基本培養(yǎng)基pH5.5)而不是AB(基本培養(yǎng)基pH7.0)上，CGI1可以產(chǎn)生明亮的熒光。CGI1和其親本C58在所有培養(yǎng)條件(MG/L，AB，IB)下生長(zhǎng)沒(méi)有差異。接種變體菌株CGI1和親本C58到Kalanchoe植物的葉子上。細(xì)胞濃度為5×109細(xì)胞/ml時(shí)，CGI1和C58所導(dǎo)致的腫瘤形成沒(méi)有明顯差異。但在低濃度5×107時(shí)，在植物上CGI1導(dǎo)致的瘤比C58較少、較小。為了分離包含mini-Tn5的DNA片段，用Southern分析估算他們的大小。將包含mini-Tn和帶有mini-Tn5插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列的9kb SphI DNA片段克隆到pTZ19R而產(chǎn)生了pJYH2。對(duì)pJYH2的片段分析說(shuō)明，插入了轉(zhuǎn)座子的基因和編碼根瘤菌屬外膜蛋白(ropB)的基因有同源性(Roest，H.P.，Mulders，I.H.，Wijffelman，C.A.，Lugtenberg B.J.，1995.Isolation of ropB，a gene encoding a 22-kDa Rhizobiumleguminosarum outer membrane protein.Mol.Plant-Microbe Interact.8576-583)。這個(gè)根癌土壤桿菌基因被指定為aopB(土壤桿菌屬外膜蛋白)。
為了確定該基因的全部序列，用PCR擴(kuò)增C58的DNA片段。其中一個(gè)1.4kb的片段包含有aopB的上游和下游的序列。將該片段克隆到pSW172中得到了質(zhì)粒pJYH5。當(dāng)將質(zhì)粒pJYH5導(dǎo)入變體CGI1時(shí)，變體可以恢復(fù)全部的致瘤能力，這說(shuō)明pJYH5攜帶了全長(zhǎng)的aopB基因。因?yàn)?.4kb PCR片段包含大概500bp的aopB基因下游序列，這個(gè)短序列可能包含一個(gè)小的ORF，其可以互補(bǔ)由轉(zhuǎn)座子造成的突變。為了排除轉(zhuǎn)座子突變對(duì)aopB下游基因的極性影響從而造成的CGI1的毒力減弱的可能，用p119(5′-AAATCGATCTATTGCTGGTTAGGC-3′)和p112(5′-CGACTGCAGAAGGATCAGAACTTG-3′)作引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增C58中的片段，其中的引物分別包括了位點(diǎn)ClaI和PstI。產(chǎn)生的較小的DNA片段，隨后克隆進(jìn)pSW172中得到pJYH31。這個(gè)片段攜帶了1.4kb片段(圖1B)從89到979bp的序列，但不包括aopB下游的ORF。通過(guò)三株交配，將pJYH31導(dǎo)入CGI1。在葉片上的毒力化驗(yàn)表明，CGI1(pJYH31)也恢復(fù)了全部的致瘤能力。這清楚地說(shuō)明，aopB上的突變削弱了CGI1的毒力。序列分析說(shuō)明，aopB基因座攜帶一個(gè)開(kāi)放讀框(ORF)，它編碼一個(gè)22.8kDa的218個(gè)氨基酸的推定蛋白(圖1A)。這個(gè)推定的蛋白與RopB有60％的同源性(圖2)。
為了確定aopB基因的位置，通過(guò)包含aopB的DNA片段為探針探測(cè)A6和C58衍生物A136和GMI9023的基因組DNA。Southern分析說(shuō)明，GMI9023，A136，A6，C58和CGI1中的每一個(gè)都帶有包含aopB基因的單個(gè)SphI片段(圖3)。這說(shuō)明，aopB基因作為單個(gè)拷貝存在于這些菌株染色體上，因?yàn)镚MI9023中沒(méi)有Ti質(zhì)粒也沒(méi)有隱性質(zhì)粒(cryptic plasmid)。因?yàn)镃GI1中有mini-Tn5轉(zhuǎn)位子插入在aopB，所以CGI1包括一個(gè)9 kb的片段，而GMI9023，A136和C58包括一個(gè)5.8kb片段。在A6中檢測(cè)到較大的SphI片段的說(shuō)明，章魚(yú)堿(octopine)菌株可能也包含aopB基因但其序列可能與胭脂堿(nopaline)的有所不同。因?yàn)閍opB基因和ropB基因的DNA序列的同源性只有66.5％，根瘤菌菌株中沒(méi)有檢測(cè)到有雜交信號(hào)。
在氨基酸序列水平上AopB蛋白和RopB有60％的相似性(圖2)。AopB還和布魯氏菌屬的免疫原性外膜蛋白有42-47％的相似性，和感染了噬菌體的漢氏巴爾通氏體的Pap31有46％的相似性，與溶血巴斯德氏菌的外膜蛋白PomA有47％的相似性，與結(jié)核分枝桿菌的PPE有39％的相似性，與杜氏嗜血菌的外膜主蛋白有43％的相似性，及與霍亂弧菌的外膜蛋白有40％的相似性。AopB蛋白和假單胞菌的孔蛋白F(OprF)的一部分在C端有同源性。
實(shí)施例3AopB在細(xì)胞表面的定位為確定AopB在細(xì)菌細(xì)胞上的位置，通過(guò)TnphoA轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)pJYH5的突變來(lái)確定AopB的亞細(xì)胞位置。從3000個(gè)轉(zhuǎn)化結(jié)合子(transconjugants)中共獲得了17個(gè)藍(lán)色菌落。從這些藍(lán)色菌落中的獲得的質(zhì)粒通過(guò)協(xié)助菌株MT616導(dǎo)入MT607。質(zhì)粒的限制酶切圖譜分析表明，它們中的14個(gè)在pJYH5的AopB開(kāi)放閱讀框包含TnphoA插入。限制圖譜和DNA測(cè)序都說(shuō)明，它們?cè)?個(gè)不同位點(diǎn)都包含phoA插入，這些位點(diǎn)都在全部AopB蛋白中標(biāo)出(圖1B)。AopB殘基134和207是TnphoA的轉(zhuǎn)位熱點(diǎn)，因?yàn)樵谶@些位點(diǎn)上分別標(biāo)注了5個(gè)和4個(gè)插入(圖1B)。這也可能是相同轉(zhuǎn)座子事件的復(fù)制所致。酶分析說(shuō)明在5個(gè)不同的位置上的轉(zhuǎn)座子插入產(chǎn)生水平相當(dāng)?shù)膲A性磷酸酶(PhoA)活性(表2)。aopB-phoA融合體產(chǎn)生的PhoA活性高于virJ-phoA融合體(表2)；而已知VirJ存在于周質(zhì)(Pan et al.，1995.Mol.Microbiol.17259-269)。這些結(jié)果說(shuō)明，全部的AopB蛋白位于周質(zhì)或外膜。
為確定蛋白質(zhì)位置，根據(jù)以前描述的步驟進(jìn)行亞細(xì)胞分級(jí)分離試驗(yàn)(DeMaagd，R.A.，Lugtenberg，B.，1986.J.Bacteriol.1671083-1085；Pan et al，1995.Mol.Microbiol.17259-269)。如圖4所示，因?yàn)樵谥苜|(zhì)、胞質(zhì)和內(nèi)膜級(jí)分中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AopB，似乎AopB只存在于外膜級(jí)分中。有趣的是，轉(zhuǎn)座子變異的CGI1中同樣也在外膜中檢測(cè)到框內(nèi)AopB-GFP融合蛋白(泳道12)。但，因?yàn)榕c細(xì)胞的總裂解物相比較(泳道2和12)，只在外膜上檢測(cè)到很少量的AopB-GFP而在其他部分沒(méi)有檢測(cè)到(泳道4，6，8和10)，說(shuō)明這個(gè)融合蛋白的表現(xiàn)不穩(wěn)定性。另一方面，天然的AopB蛋白的表現(xiàn)非常穩(wěn)定，因?yàn)闄z測(cè)的在細(xì)胞裂解物中的AopB量和在外膜的一樣(泳道1和11)。測(cè)序分析表明，TnphoA轉(zhuǎn)座子被插到了氨基酸位點(diǎn)183。這些結(jié)果說(shuō)明，183個(gè)氨基酸的N-端可以將融合蛋白運(yùn)輸?shù)酵饽ぁＲ驗(yàn)橹辉谕饽ぜ?jí)分中觀測(cè)到極少量的融合蛋白(泳道12)，所以融合蛋白可能與外膜連接不穩(wěn)定或在亞細(xì)胞分離分離過(guò)程中趨于降解。
進(jìn)行全細(xì)胞ELISA可以通過(guò)確定AopB是否暴露在外膜的細(xì)胞表面并且是否可與AopB抗體直接反應(yīng)來(lái)確認(rèn)AopB的位置。如圖5所示，經(jīng)誘導(dǎo)的土壤桿菌菌株A6010(包括野生型aopB)細(xì)胞可以與AopB抗體反應(yīng)，但不與VirJ或GFP抗體反應(yīng)。這進(jìn)一步證實(shí)了亞細(xì)胞分離的結(jié)果即AopB是外膜蛋白。因?yàn)橐阎猇irJ主要位于周質(zhì)級(jí)分中(Pan et al.，1995.Mol.Microbiol.17259-269)，所以除去了位于周質(zhì)的蛋白可以在全細(xì)胞ELISA試驗(yàn)制中抗體反應(yīng)的可能性。推定的AopB蛋白的親/疏水圖沒(méi)有顯現(xiàn)任何大的疏水區(qū)。綜上所述，可以斷定AopB位于外膜的細(xì)胞表面。
表2.phoA融合體的堿性磷酸酶(AP)活性a

a用在實(shí)施例1中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的根癌土壤桿菌細(xì)胞(含有質(zhì)粒，質(zhì)粒中包括virJ-pho4融合，virA-pho4融合或aopB-pho4融合)，來(lái)測(cè)量堿性磷酸酶活性。A6010(pVJ∷PhoA17)和A6010(pTC115A∷PhoA)分別用于正、負(fù)對(duì)照，因?yàn)閂irJ-PhoA位于周質(zhì)而VirA-PhoA位于細(xì)胞質(zhì)。
b在100μM乙酰丁香酮(AS)存在下誘導(dǎo)根癌土壤桿菌細(xì)胞A6010，A6010(pTC115A∷phoA)和A6010(pVJ∷phoA17)，因?yàn)檎T導(dǎo)virJ和virA基因需要有酚類化合物。
實(shí)施例4酸性pH誘導(dǎo)aopB基因?yàn)榇_定aopB基因可以由酸性pH誘導(dǎo)，比較在不同培養(yǎng)基中的突變體菌株CGI1(包含aopB-gfp融合)的相對(duì)的熒光亮度。如表3所示，在IB中培養(yǎng)比在AB中培養(yǎng)aopB-gfp表達(dá)增加了7倍。然而，在IB中有AS不影響aopB-gfp表達(dá)。另外，還用aopB-phoA融合體檢測(cè)aopB基因的表達(dá)。在IB中培養(yǎng)比在AB中培養(yǎng)aopB-phoA表達(dá)增加了4-5倍。同樣，AS不影響aopB-pho4表達(dá)。這些數(shù)據(jù)都說(shuō)明aopB基因可以用酸性pH誘導(dǎo)而不能用AS。
表3.aopB基因表達(dá)的誘導(dǎo)Ira或AP活性 誘導(dǎo)菌株 融合型 融合位置 培養(yǎng)基 單位b倍數(shù)cCGI1 AopB-GFP 183 AB 54±6 N/AIB 381±16 7.06IB±AS 384±19 7.11A6010(pJYH5039)AopB-PhoA39AB 184±8 N/AIB 925±61 5.03IB±AS 901±70 4.90A6010(pJYH5172)AopB-phoA172 AB 338±25 N/AIB 1409±126 4.17IB±AS 1431±864.23A6010(pVJ∷phoA17) VirJ-PhoA40IB+AS 82±6 N/A
胞漿結(jié)構(gòu)A6010(pTC115A∷phoA) VirA-PhoA IB+AS 0 N/A域a如例1所述，檢測(cè)土壤桿菌菌株CGI1(包含aopB-gfp融合)在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度(Ir)。
b如例1所述，檢測(cè)根癌土壤桿菌細(xì)胞(有virJ-phoA融合，virA-phoA融合或aopB-phoA融合的質(zhì)粒)在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的堿性磷酸酶(AP)活性。AP檢測(cè)過(guò)程中，分別以A6010(pVJ∷PhoA17)和A6010(pTC115A∷PhoA)為正、負(fù)對(duì)照，因?yàn)閂irJ-PhoA位于周質(zhì)并且VIrA-PhoA融合體位于胞質(zhì)。
c用以AB培養(yǎng)基中的基因表達(dá)水平為對(duì)照計(jì)算誘導(dǎo)倍數(shù)。
實(shí)施例5通過(guò)AopB進(jìn)行的GFP和PhoA的表面展示這個(gè)例子說(shuō)明，當(dāng)將AopB的N端區(qū)域融合到GFP或PhoA后，在細(xì)菌細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)AopB-GFP和AopB-PhoA融合蛋白。融合體中的GFP和PhoA都暴露在表面；他們可以與相應(yīng)的抗體相互作用。GFP和PhoA的初級(jí)(primary)抗體能夠與細(xì)菌表面的融合蛋白直接和特異性地相互作用。GFP或PhoA與初級(jí)抗體的復(fù)合物是穩(wěn)定的。一旦它們可以與酶偶聯(lián)的第二(secondary)抗體形成復(fù)合體，就可用比色法來(lái)觀測(cè)。相對(duì)大的蛋白質(zhì)堿性磷酸酶(其二聚體形式的分子量超過(guò)80kDa)在表面得到表達(dá)。
進(jìn)行全細(xì)胞ELISA用來(lái)測(cè)試AopB-GFP融合蛋白對(duì)小鼠GFP抗體的表面可接近性。測(cè)試GFP抗體是否可以結(jié)合由包含aopB-gfp融合體的CGI1產(chǎn)生的AopB-GFP蛋白；因?yàn)镃G19可以在細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生高水平的GFP蛋白，所以選CG19為陰性對(duì)照。如圖6所示，AopB-GFP確實(shí)位于細(xì)菌細(xì)胞的表面，因?yàn)镃GI1全細(xì)胞的AopB-GFP蛋白可與GFP抗體結(jié)合(A)。相反，由CG19產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)GFP如期的表現(xiàn)出與GFP抗體的不可接近性。
為了了解，AopB是否可以展示堿性磷酸酶(PhoA)蛋白，PhoA不能由其他系統(tǒng)容易地展示。前面構(gòu)建的pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172和pJYH5207質(zhì)粒包含aopB-phoA融合體，其中PhoA分別融合在氨基酸位點(diǎn)39，125，134，172和207。將這些質(zhì)粒導(dǎo)入C58并檢測(cè)AopB-PhoA融合蛋白對(duì)PhoA抗體的表面可接近性。全細(xì)胞ELISA(圖6，B)，流式細(xì)胞分析(圖7)和共聚焦顯微檢測(cè)都說(shuō)明AopB可在細(xì)胞表面展示PhoA。PhoA融合到AopB的氨基酸172時(shí)表面展示效率最高；當(dāng)融合發(fā)生在39位氨基酸時(shí)效率最低(圖6，Panel B；圖7)。數(shù)據(jù)說(shuō)明，AopB可以不需在培養(yǎng)基中增加任何還原劑就可直接展示PhoA蛋白。PhoA的展示可以由全細(xì)胞ELISA，流式細(xì)胞分析和共聚焦顯微鏡檢測(cè)到。
為進(jìn)一步確定由AopB表面展示的GFP和PhoA，進(jìn)行蛋白酶可接近性分析，因?yàn)樵诩?xì)胞表面展示的過(guò)客蛋白可由細(xì)胞外加入的蛋白酶降解(EarhartC.F.2000.Use of an Lpp-OmpA fusion vehicle for bacterial surface display.Methods Enzymol.326506-516)。胰蛋白酶消化法用于估算AopB-GFP的表面位置和含有pJYH5039，pJYH5125，pJYH5134，pJYH5172或pJYH5207的CGI1或C58中的AopB-PhoA融合蛋白的表面位置。進(jìn)行消化時(shí)可用10mMMgCl2防止蛋白酶穿透到壁膜間隙(Tommassen J，Lugtenberg B.1984.Aminoterminus of outer membrane PhoE proteinlocalization by use of a bla-phoEhybrid gene.J.Bacteriol.157327-329)。ChvE被認(rèn)為是周質(zhì)蛋白，ChvE蛋白可作為陰性標(biāo)記。
圖8所示，當(dāng)在產(chǎn)生融合蛋白的全細(xì)胞中加入胰蛋白酶后，位于AopB氨基酸183的AopB-GFP(AopB183-GFP)和位于AopB的氨基酸125，134，172和207的AopB-PhoA(AopB125-PhoA，AopB134-PhoA，AopB172-PhoA，AopB207-PhoA)，都有顯著的減少。相反，外加胰蛋白酶并未降解在所有測(cè)試菌株中的ChvE周質(zhì)蛋白。
與全細(xì)胞ELISA、流式細(xì)胞分析和共聚焦顯微一致，所有結(jié)果都顯示AopB N端的氨基酸125，134，172，183和207是引導(dǎo)外源蛋白到達(dá)細(xì)菌細(xì)胞表面的允許位點(diǎn)。但，檢測(cè)到的AopB39-PhoA的極少量被裂解，說(shuō)明氨基酸39位點(diǎn)可能不能造成PhoA的完全展示。全細(xì)胞ELISA試驗(yàn)也表明，氨基酸39位點(diǎn)不是一個(gè)展示的有效位點(diǎn)(圖6)。可能僅有AopB N端的39氨基酸不足以在細(xì)胞表面展示許多PhoA。然而，氨基酸位點(diǎn)172是PhoA展示的最適位置。
細(xì)胞表面展示的一個(gè)主要問(wèn)題是展示細(xì)胞外膜的完整性，因?yàn)槿绻饽ご嬖诮Y(jié)構(gòu)上的損傷，許多基于表面的試驗(yàn)將不可信。蛋白酶可接近性試驗(yàn)說(shuō)明AopB-GFP和AopB-PhoA融合蛋白可由外加的胰蛋白酶的裂解，而對(duì)周質(zhì)ChvE蛋白的消化則不顯著(圖8)。這說(shuō)明，對(duì)于以AopB為基礎(chǔ)的細(xì)菌細(xì)胞展示系統(tǒng)，外膜的完整性大多沒(méi)有受到破壞。
實(shí)施例6表面展示載體的構(gòu)建為了促進(jìn)不同蛋白質(zhì)的展示，以aopB為載體構(gòu)建質(zhì)粒載體(圖9)。為此，首先要確定只有編碼N端蛋白區(qū)域的aopB序列是否可以促進(jìn)展示。刪除AopB的C端區(qū)域(氨基酸173-218)和下游序列。保留aopB啟動(dòng)子和編碼AopBN端區(qū)域的序列(氨基酸1-172)。選擇AopB的氨基酸位點(diǎn)172作融合位點(diǎn)，因?yàn)檫@個(gè)位點(diǎn)是展示PhoA最有效的位點(diǎn)。用一對(duì)引物，P118(5′-CCGGTACCGGATCCTGCAGCTAGCAAGCTTCAACACCGGCACCAACCGTGTAAC-3′)和P119(5′-AAATCGATCTATTGCTGGTTAGGC-3′)，以C58基因組DNA為模板，來(lái)擴(kuò)增0.7kb的片段。所得的PCR產(chǎn)物中包含了aopB啟動(dòng)子(起始密碼子的上游223bp)和范圍從1到513bp的aopB編碼區(qū)。用ClaI和KpnI消化該片段，然后與用相同的酶剪切的pSWl72連接。得到的質(zhì)粒pJYH20帶有多克隆位點(diǎn)來(lái)協(xié)助外源基因的克隆(圖9)。
為了測(cè)試載體質(zhì)粒pJYH20是否可以用來(lái)展示象GFP和PhoA這樣的蛋白，用引物GFPuvFh3(5′-GGGAAGCTTGGAGTAAAGGAGAAGAAC-3′)和GFPuvRp1(5′AACTGCAGTCATTATTTGTAGAGC-3′)并以pGFPuv(Clontech)為模板，進(jìn)行PCR來(lái)克隆包含gfp編碼序列的0.7-kb片段。導(dǎo)入位點(diǎn)HindIII和PstI(劃線處)來(lái)協(xié)助后續(xù)的克隆。將起始密碼子ATG換成TGG(黑體)來(lái)避免從這點(diǎn)開(kāi)始翻譯。用HindIII和PstI消化得到的片段，再將該片段克隆到HindIII-PstI消化的pJYH20中。獲得的質(zhì)粒pJYH21帶有aopB-gfp的框內(nèi)融合體。擴(kuò)增1.3-kb phoA片段，之后將其克隆到pJYH20生成pJYH23。以JYH5039為模板；PhoAfH3(5′-GGGAAGCTTCTGACTCTTATACACAAGTAGCG-3′)和PhoAreP1(5′-GGCTGCAGTTATTTCAGCCCCAGAGCGGC-3′)為引物，引物分別帶有HindIII和PstI位點(diǎn)(劃線處)。pJYH23中有一個(gè)aopB-phoA框內(nèi)融合體，在aopB-phoA中的phoA基因沒(méi)有編碼N端信號(hào)肽的序列。然后通過(guò)三親交配將質(zhì)粒pJYH21和pJYH23導(dǎo)入C58。
按先前描述的方法進(jìn)行全細(xì)胞ELISA和胰蛋白酶消化試驗(yàn)，從而確定GFP和PhoA是否分別可以在菌株C58(pJYH21)和C58(pJYH23)的細(xì)胞表面得到表達(dá)。如圖6所示，以pJYH20為質(zhì)粒載體的GFP和PhoA的展示效率和原先的aopB-gfp和aopB-phoA融合體相似，因?yàn)镃58(pJYH21)和C58(pJYH23)的展示分別與CGI1和C58(pJYH5172)類似。在胰蛋白酶消化試驗(yàn)中，C58(pJYH21)產(chǎn)生的AopB-GFP和C58(pJYH23)產(chǎn)生的AopB-PhoA都可進(jìn)行胰蛋白酶消化。這直接證實(shí)了，AopB的N端而非C端是過(guò)客蛋白融合體易位到細(xì)胞表面所必需的。
這還說(shuō)明，展示載體質(zhì)粒pJYH20能夠用于高效地在細(xì)菌表面展示蛋白。位于aopB下游的特定限制性位點(diǎn)HindIII，PstI，BamHI，KpnI和SacI，可以使編碼過(guò)客蛋白的外源基因的克隆簡(jiǎn)單化。
實(shí)施例7條件對(duì)融合蛋白表達(dá)和展示的影響為了更深入了解AopB介導(dǎo)的表面展示的特征，通過(guò)試驗(yàn)來(lái)研究培養(yǎng)基對(duì)C58(pJYH23)中的AopB172-PhoA融合體表達(dá)水平的影響。如圖10所示，C58(pJYH23)在MG/L和IB中培養(yǎng)時(shí)，AopB172-PhoA的表達(dá)水平無(wú)差別，但在AB培養(yǎng)基中表達(dá)水平卻低很多。用全細(xì)胞ELISA和流式細(xì)胞分析來(lái)檢測(cè)在MG/L，AB和IB培養(yǎng)的C58(pJYH23)的AopB172-PhoA的展示效率。如圖11所示，當(dāng)在IB中培養(yǎng)時(shí)，AopB172-PhoA蛋白可以在細(xì)胞表面得到高效展示，但在MG/L和AB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)不能，雖然在MG/L中的表達(dá)水平與在IB中相同(圖10，11和12)。這說(shuō)明，在細(xì)菌表面通過(guò)AopB的蛋白展示可由酸性pH誘導(dǎo)。這可以作為一個(gè)重要因素來(lái)調(diào)控對(duì)外膜有害的蛋白的展示。
因?yàn)榇竽c埃希氏菌是多種遺傳學(xué)操作常用的宿主，所以需要確定aopB展示系統(tǒng)是否可以直接用于其他細(xì)菌如大腸埃希氏菌和苜蓿中華根瘤菌。將編碼AopB172-PhoA的質(zhì)粒pJYH23導(dǎo)入大腸埃希氏菌和苜蓿中華根瘤菌RCR2011中。如圖10所示，大腸埃希氏菌和苜蓿中華根瘤菌中融合蛋白的表達(dá)水平與根癌土壤桿菌相似，但全細(xì)胞ELISA、流式細(xì)胞分析和蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)表明其不能有效地展示融合蛋白在細(xì)胞表面。在IB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸埃希氏菌和苜蓿中華根瘤菌沒(méi)有使這些細(xì)菌在其細(xì)胞表面展示融合蛋白，即使在含有pJYH23的大腸埃希氏菌和苜蓿中華根瘤菌中可以檢測(cè)到堿性磷酸酶活性(表4)，這說(shuō)明PhoA被定位到壁膜間隙中。這些都證明，在細(xì)胞表面的AopB-PhoA融合體的展示需要根癌土壤桿菌中特有的一些內(nèi)源因子。這說(shuō)明，苜蓿中華根瘤菌的RopB(AopB的同系物)可以作為載體用在天然宿主苜蓿中華根瘤菌的表面展示中。
表4.不同培養(yǎng)條件下的AopB172-PhoA融合蛋白的堿性磷酸酶活性AP活性單位a胰蛋白酶處理后AP活菌株 培養(yǎng)基 無(wú)胰蛋白酶 胰蛋白酶消 性降低的百分比b消化化后C58MG/L 0 NTcNAaAB 0 NT NAIB 0 NT NAC58(pJYH23)MG/L 952±35 868±11 9±2AB 490±14 442±20 10±2IB 3044±80815±27 73±2DH5α LB 0 NT NADH5α(pJYH23) LB 89±4 82±5 8±2RCR2011LB/MC0 NT NARCR2011(pJYH23)LB/MC460±62 417±58 9±1a按材料和方法中描述的方法檢測(cè)生長(zhǎng)在不同培養(yǎng)基中帶有pJYH23(含編碼AopB172-PhoA的aopB-pho4融合體)的細(xì)菌細(xì)胞堿性磷酸酶(AP)活性。C58，DH5α和RCR2011分別作為C58(pJYH23)，DH5α(pJYH23)和RCR2011(pJYH23)的陰性對(duì)照。
bAP活性的降低由胰蛋白酶處理所降低的活性的百分比表示。
cNT，未檢測(cè)。
dNA，無(wú)必要。
實(shí)施例8表面展示的PhoA具有酶促活性。
為確定展示在細(xì)菌細(xì)胞表面的PhoA蛋白是否具有酶促活性，檢測(cè)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的包含aopB-phoA融合的C58(pJYH23)中的堿性磷酸酶(AP)活性。以前已經(jīng)闡明，只有當(dāng)PhoA通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入壁膜間隙或達(dá)到外膜上時(shí)，PhoA才具有酶促活性。如表4所示，在IB中培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞的AP活性比MG/L中的高約3.5倍，而在IB中培養(yǎng)細(xì)菌的AopB-PhoA融合蛋白的表達(dá)水平比MG/L略低(圖10)。然而，只有在IB中而不是在MG/L中培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞才表現(xiàn)出PhoA在細(xì)胞表面的展示(圖11和12)。雖然在MG/L中培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的AopB-PhoA不能展示在細(xì)胞表面，但融合蛋白有高AP活性，說(shuō)明AopB-PhoA轉(zhuǎn)移穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜。在IB中培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中的AopB-PhoA有較高的AP活性可能是因?yàn)锳P的底物更容易接觸到PhoA并因此有較快的酶促反應(yīng)，這是因?yàn)檫@些細(xì)胞的AopB-PhoA融合蛋白在細(xì)胞表面展示并且AP的底物不用穿透外膜即可到達(dá)PhoA蛋白。這說(shuō)明，在細(xì)胞表面展示的PhoA蛋白是具有酶促活性的。
為了確定展示顯現(xiàn)在表面的AopB-PhoA融合蛋白是酶促活性的，用試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)胰蛋白酶處理對(duì)表達(dá)AopB-PhoA的整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的AP活性的影響。如表4所述，胰蛋白酶消化可以減少IB培養(yǎng)的C58(pJYH23)中的AP活性大概73％，而在MG/L或AB中培養(yǎng)時(shí)，用胰蛋白酶處理細(xì)胞后AP活性大約只降低10％。在前面的試驗(yàn)中已經(jīng)說(shuō)明，在IB中培養(yǎng)的細(xì)菌可以展示PhoA，而在MG/L或AB中則不能(圖11和12)。因?yàn)橹挥斜┞对诩?xì)胞表面的蛋白質(zhì)才能接觸到外加的胰蛋白酶，由胰蛋白酶造成的AP活性的顯著降低說(shuō)明展示在細(xì)菌細(xì)胞表面的PhoA確實(shí)有酶促活性。觀測(cè)表明，當(dāng)沒(méi)有PhoA展示在細(xì)胞表面時(shí)，胰蛋白酶消化在不同細(xì)菌細(xì)胞中只能降低大約10％的AP活性，所述細(xì)菌細(xì)胞包括根癌土壤桿菌，大腸埃氏菌和苜蓿中華根瘤菌。在這些細(xì)菌細(xì)胞中的AP活性的輕微減少可能是由于胰蛋白酶會(huì)降解外膜膜孔上的一些蛋白并進(jìn)入周質(zhì)降解周質(zhì)的PhoA，而這些PhoA是由無(wú)展示的細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的。然而，所有數(shù)據(jù)都說(shuō)明展示的PhoA是酶促活性的。
因?yàn)镻hoA是含有二硫鍵的同二聚體起作用，所以以AopB為基礎(chǔ)的土壤桿菌屬展示系統(tǒng)代表了第一個(gè)可以用于直接展示活性狀態(tài)的二聚體蛋白，象PhoA(有二硫鍵)的系統(tǒng)。
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序 列 表<110>新加坡國(guó)立大學(xué)(National University of Singapore)<120>aopB基因，蛋白，同系物，片段和它們的變體，以及它們?cè)诩?xì)胞表面展示方面的應(yīng)用<130>79612-3<150>US 60/244,902<151>2000-02-11<160>13<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1435<212>DNA<213>根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)<220><221>CDS<222>(316)..(969)<220><221>misc_feature<222>(316)..(384)<223>編碼推測(cè)的信號(hào)肽<400>1ctagctgtca ctcagctcca aaagaattgg gcgatttttc attcacaatg caatttcggt 60ttaatttgaa tataactaag tttaaaggcg atctattgct ggttaggctt ctgttagggt 120taatataacc cttgtggcaa ttaggcaacg tctaattcta gtcacgtctc tgccccaaac 180aattcacatt ttggctcttt gatctccgca ttctcccatc aagttcagtt tccagagggg 240caaattaacc cgacgatttt taccgcgtct gaaaacaatg ttttgagtgc agagcggtcc 300tgaaaggaga ataac atg cgt att ttc gta gca acc ctt atg gct tcg acc 351Met Arg Ile Phe Val Ala Thr Leu Met Ala Ser Thr1 5 10atg gca gcc gcc ggt ttt tcg gct gct tac gcc gcc gac gcc gta aat399Met Ala Ala Ala Gly Phe Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Ala Val Asn15 20 25gag gtg ccg cag gca ccg gta gcc tac gac cag ccc gcc gcg gtc aag447Glu Val Pro Gln Ala Pro Val Ala Tyr Asp Gln Pro Ala Ala Val Lys30 35 40gat tgg tcc ggc gcc tac ctc ggt ggt acg gtc aac tat gactgg ggc 495Asp Trp Ser Gly Ala Tyr Leu Gly Gly Thr Val Asn Tyr Asp Trp Gly45 50 55 60cgt ttc agc tcc agc aat gac ggt cgt gac gcc aag ggc ttc ggt ggc543Arg Phe Ser Ser Ser Asn Asp Gly Arg Asp Ala Lys Gly Phe Gly Gly
65 70 75ggc gtc tat ggt ggt tac aac atg cag agc ggc cag atc gtt tac ggt 591Gly Val Tyr Gly Gly Tyr Asn Met Gln Ser Gly Gln Ile Val Tyr Gly80 85 90gct gaa gca gac gtg aac atg ggc gac gag aag ggc tcc gcc ggt acg 639Ala Glu Ala Asp Val Asn Met Gly Asp Glu Lys Gly Ser Ala Gly Thr95 100 105gtt gcc ggt cgc gcc gtc gaa ggc aag cag ggc gtc aac ggc tcg ctg 687Val Ala Gly Arg Ala Val Glu Gly Lys Gln Gly Val Asn Gly Ser Leu110 115 120cgt ggc cgc gtc ggt tac gac atg aac ccg ttc ctg ctt tat ggt acg 735Arg Gly Arg Val Gly Tyr Asp Met Asn Pro Phe Leu Leu Tyr Gly Thr125 130 135 140gcc ggt ctt gct gtc tcc gac aac aag gtt cgt gac ggc gtc aac aag 783Ala Gly Leu Ala Val Ser Asp Asn Lys Val Arg Asp Gly Val Asn Lys145 150 155gac agc gcc acg gct ctc ggt tac acg gtt ggt gcc ggt gtt gaa gcc 831Asp Ser Ala Thr Ala Leu Gly Tyr Thr Val Gly Ala Gly Val Glu Ala160 165 170atg gtg acc gac aac atc acc gct cgt ctg gaa tat cgc tac agc gat 879Met Val Thr Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Glu Tyr Arg Tyr Ser Asp175 180 185tac cag aag aag gac tac acg ctc ggc aac gat gcc ttc tcg cgt ggt 927Tyr Gln Lys Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Asn Asp Ala Phe Ser Arg Gly190 195 200ttt gac gac cac tcg gtc aag gcc ggt atc ggc gtc aag ttc 969Phe Asp Asp His Ser Val Lys Ala Gly Ile Gly Val Lys Phe205 210 215tgatccttct cggatcggtc aaggaaaagc cggggtttac gccccggctt ttttttgttt 1029ctgtgatttg ccatcgcctt aacgcccggt ggaaagaacc gggcgttttg ttcggcgggt 1089ctaggcggcg gctttcattt ccgcataggc gtcgaaacgc ttgccgaagg tttctggcca 1149ggctgccagc gcatcacgtc cctcggccca ctcaccggca aaacgcaggt cgagatagcc 1209gatcatcgct gcaagggcga aatggccgcc atgcagcttc ttgccggttt tcggcaggtt 1269ggcgttgagg tgatcgagcc cgcggaccac cttgctccac tgcttgtcga tccacggctg 1329atgaatcttg tcttccgggc ggaaacgccg ctcgtagacg atggcgagca ggcaatccat 1389gatgccgtcg cacagagctt ccagaatttc cgcttcagtg cgctag1435<210>2<211>218<212>PRT<213>根癌土壤桿菌<220><221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>推測(cè)的信號(hào)序列<400>2Met Arg Ile Phe Val Ala Thr Leu Met Ala Ser Thr Met Ala Ala Ala1 5 10 15Gly Phe Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Ala Val Asn Glu Val Pro Gln20 25 30Ala Pro Val Ala Tyr Asp Gln Pro Ala Ala Val Lys Asp Trp Ser Gly35 40 45Ala Tyr Leu Gly Gly Thr Val Asn Tyr Asp Trp Gly Arg Phe Ser Ser50 55 60Ser Asn Asp Gly Arg Asp Ala Lys Gly Phe Gly Gly Gly Val Tyr Gly65 70 75 80Gly Tyr Asn Met Gln Ser Gly Gln Ile Val Tyr Gly Ala Glu Ala Asp85 90 95Val Asn Met Gly Asp Glu Lys Gly Ser Ala Gly Thr Val Ala Gly Arg100 105 110Ala Val Glu Gly Lys Gln Gly Val Asn Gly Ser Leu Arg Gly Arg Val115 120 125Gly Tyr Asp Met Asn Pro Phe Leu Leu Tyr Gly Thr Ala Gly Leu Ala130 135 140Val Ser Asp Asn Lys Val Arg Asp Gly Val Asn Lys Asp Ser Ala Thr145 150 155 160Ala Leu Gly Tyr Thr Val Gly Ala Gly Val Glu Ala Met Val Thr Asp165 170 175Asn Ile Thr Ala Arg Leu Glu Tyr Arg Tyr Ser Asp Tyr Gln Lys Lys180 185 190Asp Tyr Thr Leu Gly Asn Asp Ala Phe Ser Arg Gly Phe Asp Asp His195 200 205Ser Val Lys Ala Gly Ile Gly Val Lys Phe210 215<210>3<211>585<212>DNA<213>根癌土壤桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(585)<220><221>misc_feature<223>沒(méi)有信號(hào)序列的AopB<400>3gcc gac gcc gta aat gag gtg ccg cag gca ccg gta gcc tac gac cag 48Ala Asp Ala Val Asn Glu Val Pro Gln Ala Pro Val Ala Tyr Asp Gln1 5 10 15ccc gcc gcg gtc aag gat tgg tcc ggc gcc tac ctc ggt ggt acg gtc 96Pro Ala Ala Val Lys Asp Trp Ser Gly Ala Tyr Leu Gly Gly Thr Val20 25 30aac tat gac tgg ggc cgt ttc agc tcc agc aat gac ggt cgt gac gcc 144Asn Tyr Asp Trp Gly Arg Phe Ser Ser Ser Asn Asp Gly Arg Asp Ala35 40 45aag ggc ttc ggt ggc ggc gtc tat ggt ggt tac aac atg cag agc ggc 192Lys Gly Phe Gly Gly Gly Val Tyr Gly Gly Tyr Asn Met Gln Ser Gly50 55 60cag atc gtt tac ggt gct gaa gca gac gtg aac atg ggc gac gag aag 240Gln Ile Val Tyr Gly Ala Glu Ala Asp Val Asn Met Gly Asp Glu Lys65 70 75 80ggc tcc gcc ggt acg gtt gcc ggt cgc gcc gtc gaa ggc aag cag ggc 288Gly Ser Ala Gly Thr Val Ala Gly Arg Ala Val Glu Gly Lys Gln Gly85 90 95gtc aac ggc tcg ctg cgt ggc cgc gtc ggt tac gac atg aac ccg ttc 336Val Asn Gly Ser Leu Arg Gly Arg Val Gly Tyr Asp Met Asn Pro Phe100 105 110ctg ctt tat ggt acg gcc ggt ctt gct gtc tcc gac aac aag gtt cgt 384Leu Leu Tyr Gly Thr Ala Gly Leu Ala Val Ser Asp Asn Lys Val Arg115 120 125gac ggc gtc aac aag gac agc gcc acg gct ctc ggt tac acg gtt ggt 432Asp Gly Val Asn Lys Asp Ser Ala Thr Ala Leu Gly Tyr Thr Val Gly130 135 140gcc ggt gtt gaa gcc atg gtg acc gac aac atc acc gct cgt ctg gaa 480Ala Gly Val Glu Ala Met Val Thr Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Glu145 150 155 160tat cgc tac agc gat tac cag aag aag gac tac acg ctc ggc aac gat 528Tyr Arg Tyr Ser Asp Tyr Gln Lys Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Asn Asp165 170 175gcc ttc tcg cgt ggt ttt gac gac cac tcg gtc aag gcc ggt atc ggc 576Ala Phe Ser Arg Gly Phe Asp Asp His Ser Val Lys Ala Gly Ile Gly180 185 190gtc aag ttc 585Val Lys Phe
195<210>4<211>195<212>PRT<213>根癌土壤桿菌<220><221>misc_feature<223>沒(méi)有信號(hào)序列的AopB<400>4Ala Asp Ala Val Asn Glu Val Pro Gln Ala Pro Val Ala Tyr Asp Glnl 5 10 15Pro Ala Ala Val Lys Asp Trp Ser Gly Ala Tyr Leu Gly Gly Thr Val20 25 30Asn Tyr Asp Trp Gly Arg Phe Ser Ser Ser Asn Asp Gly Arg Asp Ala35 40 45Lys Gly Phe Gly Gly Gly Val Tyr Gly Gly Tyr Asn Met Gln Ser Gly50 55 60Gln Ile Val Tyr Gly Ala Glu Ala Asp Val Asn Met Gly Asp Glu Lys65 70 75 80Gly Ser Ala Gly Thr Val Ala Gly Arg Ala Val Glu Gly Lys Gln Gly85 90 95Val Asn Gly Ser Leu Arg Gly Arg Val Gly Tyr Asp Met Asn Pro Phe100 105 110Leu Leu Tyr Gly Thr Ala Gly Leu Ala Val Ser Asp Asn Lys Val Arg115 120 125Asp Gly Val Asn Lys Asp Ser Ala Thr Ala Leu Gly Tyr Thr Val Gly130 135 140Ala Gly Val Glu Ala Met Val Thr Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Glu145 150 155 160Tyr Arg Tyr Ser Asp Tyr Gln Lys Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Asn Asp165 170 175Ala Phe Ser Arg Gly Phe Asp Asp His Ser Val Lys Ala Gly Ile Gly180 185 190Val Lys Phe195<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物 p54<400>5gcaaatcgct agctgtcact cagc 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物p55<400>6agaacggcta gcgcactgaa gcgg 24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物p119<400>7aaatcgatct attgctggtt aggc 24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物112<400>8cgactgcaga aggatcagaa cttg 24<210>9<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物p118<400>9ccggtaccgg atcctgcagc tagcaagctt caacaccggc accaaccgtg taac 54<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物 GFPuvFh3<400>10gggaagcttg gagtaaagga gaagaac 27<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物GFPuvRpl<400>11aactgcagtc attatttgta gagc 24<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物PhoAfH3<400>12gggaagcttc tgactcttat acacaagtag cg 32<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物PhoArePl<400>13ggctgcagtt atttcagccc cagagcggc 29
權(quán)利要求
1.一種核酸分子，其包含編碼以下任何一種多肽的核酸序列(a)SEQ ID No2；(b)包含SEQ ID No2N端起的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段；及(c)(a)或(b)的變體，它(i)有至少65％的氨基酸序列與(a)或(b)的相應(yīng)的多肽相同；并(ii)該變體制備自革蘭氏陰性菌時(shí)，是外膜蛋白。
2.權(quán)利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少125個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少134個(gè)氨基酸。
4.權(quán)利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少172個(gè)氨基酸。
5.權(quán)利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少183個(gè)氨基酸。
6.權(quán)利要求1中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少207個(gè)氨基酸。
7.一種核酸分子，其包含編碼以下任何一種多肽的核酸序列(a)SEQ ID No4；(b)包含SEQ ID No4N端起的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段；和(c)(a)或b)的變體，其(i)至少有65％的氨基酸序列與(a)或(b)的相應(yīng)的多肽相同；并且，(ii)該變體(1)與細(xì)菌的分泌信號(hào)框內(nèi)連結(jié)，而且(2)產(chǎn)生于革蘭氏陰性菌時(shí)，是外膜蛋白。
8.權(quán)利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少102個(gè)氨基酸。
9.權(quán)利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少111個(gè)氨基酸。
10.權(quán)利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少149個(gè)氨基酸。
11.權(quán)利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少160個(gè)氨基酸。
12.權(quán)利要求7中的核酸分子，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少184個(gè)氨基酸。
13.一種核酸分子，其包含編碼融合蛋白的核酸序列，該融合蛋白包含權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的核酸分子所編碼的第一個(gè)多肽以及第二個(gè)多肽。
14.權(quán)利要求13中的核酸分子，其中所述的第二個(gè)多肽融合到第一個(gè)多肽的C端。
15.一種包含SEQ ID No1的6到309核苷酸的土壤桿菌屬的啟動(dòng)子。
16.一種分離的5到100個(gè)核苷酸的核酸探針，它在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQID No1或3的核酸分子或上述核酸分子的互補(bǔ)序列雜交。
17.一種分離的10到40個(gè)核苷酸的核酸引物，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQID No1或3的核酸分子或上述核酸分子的互補(bǔ)序列雜交。
18.一種表達(dá)載體，它包含權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)中的核酸分子，該分子與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控序列聯(lián)結(jié)而起作用。
19.權(quán)利要求18中的載體，其中所述的表達(dá)調(diào)控序列含有aopB啟動(dòng)子。
20.權(quán)利要求18中的載體，其是大腸埃希氏菌中的表達(dá)載體，其中的表達(dá)調(diào)控序列適合于在大腸埃希氏菌中表達(dá)核酸序列。
21.權(quán)利要求18或19中的載體，其是土壤桿菌屬中的表達(dá)載體，其表達(dá)調(diào)控序列適合于在土壤桿菌屬中表達(dá)核酸序列。
22.權(quán)利要求21中的載體，其中所述的土壤桿菌屬細(xì)菌是根癌土壤桿菌。
23.用權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)的核酸分子轉(zhuǎn)化的重組微生物。
24.含有權(quán)利要求18到22中任一項(xiàng)的載體的重組微生物。
25.含有權(quán)利要求19或21中的載體的重組土壤桿菌。
26.權(quán)利要求25中的土壤桿菌，該屬細(xì)菌在其表面展示由權(quán)利要求1到14中的任一種核酸序列所編碼的多肽或融合蛋白。
27.包含以下任何一個(gè)氨基酸序列的多肽(a)SEQ ID No2；(b)包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，和(c)(a)或(b)的變體，它(i)與(a)或(b)中相應(yīng)多肽的氨基酸序列至少有65％相同；而且(ii)如果這個(gè)變體是來(lái)自于革蘭氏陰性菌，那么它是一個(gè)外膜蛋白。
28.權(quán)利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少125個(gè)氨基酸。
29.權(quán)利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少134個(gè)氨基酸。
30.權(quán)利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少172個(gè)氨基酸。
31.權(quán)利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少183個(gè)氨基酸。
32.權(quán)利要求27中的多肽，其中，包含SEQ ID No2N端的至少39個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No2N端的至少207個(gè)氨基酸。
33.包含以下任何一個(gè)氨基酸序列的多肽(a)SEQ ID No4；(b)包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，和(c)(a)或(b)的變體，它(i)與(a)或(b)中相應(yīng)多肽的氨基酸序列至少有65％相同；和，(ii)它在以下條件下是外膜蛋白(1)與細(xì)菌的分泌信號(hào)框內(nèi)連接，并且(2)產(chǎn)生于革蘭氏陰性菌。
34.權(quán)利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少102個(gè)氨基酸。
35.權(quán)利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少111個(gè)氨基酸。
36.權(quán)利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少149個(gè)氨基酸。
37.權(quán)利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少160個(gè)氨基酸。
38.權(quán)利要求33中的多肽，其中，包含SEQ ID No4N端的至少16個(gè)連續(xù)氨基酸的片段包含SEQ ID No4N端的至少184個(gè)氨基酸。
39.一種融合蛋白，其包含權(quán)利要求27到38中任一項(xiàng)的第一個(gè)多肽和第二個(gè)多肽。
40.權(quán)利要求39中的融合蛋白，其中所述的第二個(gè)多肽融合于第一多肽的C端。
41.生產(chǎn)權(quán)利要求27中多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物的步驟，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求1中的核酸分子，該分子與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控序列連結(jié)而起作用。
42.生產(chǎn)權(quán)利要求39中的融合蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)用含有編碼融合蛋白的核酸分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物的步驟，其中的表達(dá)載體與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控序列連結(jié)而起作用。
43.可與權(quán)利要求27到38中的任一種多肽或權(quán)利要求30或40中的融合蛋白的第一個(gè)多肽進(jìn)行特異性反應(yīng)的抗體。
44.權(quán)利要求43中的抗體，其是單克隆抗體。
45.產(chǎn)生可在其表面展示過(guò)客蛋白的微生物的方法，其步驟包括(1)將表達(dá)載體導(dǎo)入到受體微生物中；并且(2)培養(yǎng)從步驟(1)中得到的微生物，以表達(dá)所述蛋白；其中，所述表達(dá)載體包括(a)編碼載體蛋白的核酸，該載體蛋白選自于權(quán)利要求27至38中的任一種多肽或AopB相關(guān)外膜蛋白家族的成員；其中，所述載體蛋白需要適合于用微生物進(jìn)行展示，并且?guī)в性谠撐⑸镏杏泄δ艿募?xì)菌分泌信號(hào)；(b)編碼過(guò)客蛋白的核酸，該核酸要與編碼載體蛋白的核酸在3′端進(jìn)行框內(nèi)連接；和(c)表達(dá)控制序列與編碼載體蛋白的核酸可操作地連接，該表達(dá)調(diào)控序列要適合在該微生物中表達(dá)所述編碼載體蛋白的核酸。
46.權(quán)利要求45中的方法，其中所述的表達(dá)調(diào)控序列包含aopB啟動(dòng)子。
47.權(quán)利要求45中的方法，其中所用的微生物在酸性pH條件下培養(yǎng)。
48.根據(jù)權(quán)利要求45中所述的方法，其中所述的載體蛋白和微生物選自(a)載體蛋白是權(quán)利要求27到38中的任何一個(gè)多肽，并且可用于展示的微生物是土壤桿菌屬。(b)載體蛋白包含RopB多肽N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，并且其用于展示的微生物是根瘤菌屬。(c)載體蛋白包含布魯氏菌屬外膜蛋白序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，其用于展示的微生物是布魯氏菌屬。(d)載體蛋白包含Pap31多肽序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，并且用于其展示的微生物是巴爾通氏體。(e)載體蛋白包含PomA多肽序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，并且用于其展示的微生物是巴斯德氏菌屬(Mannheimia)。(f)載體蛋白包含PPE多肽序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，并且用于其展示的微生物是分枝桿菌屬。(g)載體蛋白包含主要外膜蛋白序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，其用于展示的微生物是嗜血菌屬。(h)載體蛋白包含外膜孔蛋白序列N端的150-220個(gè)連續(xù)的氨基酸，其用于展示的微生物是弧菌屬。
49.權(quán)利要求45到48中任一項(xiàng)所述的方法，其所用的分泌信號(hào)包含SEQ ID No2中的1到23位氨基酸。
50.權(quán)利要求45中所述的方法，其所用的載體蛋白是權(quán)利要求27到38中的任意一種多肽，而且微生物是土壤桿菌屬細(xì)菌。
51.權(quán)利要求50中所述的方法，其所用的土壤桿菌屬細(xì)菌是根癌土壤桿菌。
52.權(quán)利要求45到51中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟(3)分析步驟(2)所培養(yǎng)而得的微生物，以確定過(guò)客蛋白存在于所述微生物表面，并選擇那些在表面帶有過(guò)客蛋白的生物。
53.權(quán)利要求52中所述的方法，其中所采用的分析步驟包含熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。
54.在土壤桿菌屬細(xì)胞表面表達(dá)融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟(1)將載體導(dǎo)入土壤桿菌屬的一種細(xì)菌中，并且(2)培養(yǎng)由第一步而得的細(xì)菌，以表達(dá)融合蛋白；其所用載體包括(a)編碼權(quán)利要求39或40的融合蛋白的核酸序列，其中的融合蛋白含有細(xì)菌的分泌信號(hào)；并且(b)表達(dá)調(diào)控序列與編碼該融合蛋白的核酸序列可操作地連接，該表達(dá)調(diào)控序列要適合在土壤桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)編碼該融合蛋白的核酸。
55.選擇編碼所求特性多肽的核酸的方法，這個(gè)方法包含權(quán)利要求45中的方法，其中的過(guò)客蛋白是具有推定所求特性的眾多的多肽，并且這個(gè)方法進(jìn)一步包含以下步驟(3)檢驗(yàn)由步驟(2)所得到的微生物以確定過(guò)客蛋白是否具有欲求特性；并且(4)選擇和分離由步驟(3)所得到的帶有欲求特性的過(guò)客蛋白的微生物；并且(5)從由步驟(4)而得的生物中分離表達(dá)載體；其中步驟(5)所得到的表達(dá)載體中編碼過(guò)客蛋白的核酸編碼欲求特性的多肽。
56.權(quán)利要求55中所述的方法，所指的過(guò)客蛋白來(lái)自于抗體表達(dá)文庫(kù)。
57.從液體中去除污染物的方法，這個(gè)方法包含權(quán)利要求45中的方法，其中過(guò)客蛋白能結(jié)合污染物，并且這個(gè)方法進(jìn)一步包含以下步驟(3)將含有污染物的液體與由步驟(2)得到的微生物接觸，所用的時(shí)間和條件應(yīng)有利于過(guò)客蛋白與污染物的結(jié)合；和(4)從所述液體中去除微生物。
58.權(quán)利要求57中所述的方法，其中所指的污染物是重金屬，而過(guò)客蛋白是金屬硫蛋白。
59.在哺乳動(dòng)物中激發(fā)免疫反應(yīng)的方法，這個(gè)方法包含權(quán)利要求45中所述的方法，其中的過(guò)客蛋白能激發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)，并且這個(gè)方法進(jìn)一步包含以下步驟(3)在利于有效激發(fā)哺乳動(dòng)物對(duì)過(guò)客蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的時(shí)間和條件下，給藥步驟(2)所得到的微生物。
60.權(quán)利要求59中方法，其中來(lái)自于步驟(2)中的微生物是根癌土壤桿菌，并且被作為活疫苗給藥。
61.固相酶促催化反應(yīng)的方法，這個(gè)方法包含權(quán)利要求45中的方法，其中過(guò)客蛋白能催化反應(yīng)，并且這個(gè)方法進(jìn)一步包含以下步驟(3)在利于有效酶促催化反應(yīng)的時(shí)間和條件下，將催化反應(yīng)的底物與由步驟(2)得到的微生物接觸。
62.權(quán)利要求61中的方法，其中所指的過(guò)客蛋白是堿性磷酸酶。
63.純化一個(gè)化合物的方法，這個(gè)方法包含權(quán)利要求45中所述的方法，其中的過(guò)客蛋白可以與該化合物特異性地結(jié)合，并且這個(gè)方法進(jìn)一步包含以下步驟(3)在利于過(guò)客蛋白與該化合物特異性結(jié)合的時(shí)間和條件下，將由步驟(2)所得到的微生物與含有該化合物的組合物接觸；(4)在利于有效去除非特異性結(jié)合的污染物的時(shí)間和條件下洗滌由步驟(3)而得的微生物；并(5)在利于打斷過(guò)客蛋白與化合物的特異性結(jié)合的時(shí)間和條件下，從由步驟(4)而得的微生物中洗脫化合物。
64.權(quán)利要求63中所述的方法，其中所指的化合物是抗體，而且過(guò)客蛋白是其特異性的抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供了根癌土壤桿菌中一個(gè)被稱為AopB的外膜蛋白、其變體、同系物和片段以及相應(yīng)的DNA分子。本發(fā)明同時(shí)也包括一個(gè)用AopB相關(guān)蛋白作為載體蛋白在細(xì)菌表面展示過(guò)客蛋白的方法。過(guò)客蛋白的展示提供了如活疫苗的發(fā)展、文庫(kù)篩選、蛋白純化、生物去污和全細(xì)胞催化方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1484700SQ01821717
公開(kāi)日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2001年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月2日
發(fā)明者潘申權(quán) 申請(qǐng)人:新加坡國(guó)立大學(xué)