專利名稱：對雌性動物施用核酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及內(nèi)分泌學、醫(yī)學和細胞生物學。更具體而言，本發(fā)明涉及生長和表現(xiàn)的改善；在動物中刺激生長激素的生產(chǎn)，其比正常生長相關的水平更高；和利用在雌性動物中施用編碼生長激素釋放激素的DNA以增強生長。此外，本發(fā)明涉及將增強生長的核苷酸序列應用于肌肉組織，例如由肌肉特異性啟動子調(diào)節(jié)的生長激素釋放激素或類似物，特別是用電穿孔的技術。
背景技術：
生長激素(GH)生產(chǎn)途徑包含一系列其產(chǎn)物是生長所必需的相互依賴的基因。該GH途徑的基因包括(1)配體，如GH和胰島素樣生長因子-I(IGF-I)；(2)轉錄因子如pit-1的前體(prophet)或prop-1和pit-1；(3)激動劑和拮抗劑，分別如生長激素釋放激素(GHRH)和促生長素抑制素；和(4)受體，如GHRH受體(GHRH-R)和GH受體(GH-R)。這些基因在不同器官和組織中表達，包括下丘腦、垂體、肝和骨骼。GH途徑的有效和受調(diào)節(jié)的表達對于最佳線性生長以及糖類、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的穩(wěn)態(tài)很關鍵。GH的合成和從垂體前葉分泌由GHRH刺激并由促生長素抑制素抑制，兩者均為下丘腦激素。GH在控制人和其他脊椎動物的軀體生長中的中心作用，以及調(diào)節(jié)GH從垂體分泌的生理學相關途徑是眾所周知的。GH主要在肝中且也在其他目標器官中增加了IGF-I的生產(chǎn)。反過來，IGF-I和GH反饋到下丘腦和垂體以抑制GHRH和GH的釋放。GH對外周組織具有直接和間接的兩種作用，其直接作用主要由IGF-I介導。在兒童和成年人中均有廣泛的臨床狀況譜，其中線性生長(青春期前的患者)或機體組分都受到損害，且這些狀況響應GH或GHRH治療。在一切情況下GHRH-GH-IGF-I軸都有功能，但由于各種可能的原因不必然以最適敏感性和反應性進行作用。兒童中GH缺乏的主要特征是身材矮小。由在GH軸的不同點的遺傳缺陷可產(chǎn)生相似的表型(Parks等人，1995)，以及非GH缺乏的身材矮小。非GH缺乏具有不同的病因?qū)W，如(1)遺傳疾病，特納(Turner)綜合癥(Jacobs等人，1990；Skuse等人，1999)，軟骨發(fā)育不良(Tanaka等人，1998；Key和Gross，1996)和克羅恩疾病(Savage等人，1999)；和(2)宮內(nèi)生長阻滯(Albanese和Stanhope，1997；Azcona等人，1998)；和(3)慢性腎機能不全(Sohmiya等人，1998；Benfield和Kohaut，1997)。其中GH軸未受影響的病例(即具有正常激素、基因和受體的患者)占所有生長阻滯病例的超過50％。在這些病例中，已顯示GHRH或GH治療是有效的(Gesundheit和Alexander，1995)。從垂體前葉減少GH分泌導致從25歲到衰老過程中骨骼肌質(zhì)量的損失。GHRH-GH-IGF-I軸在衰老過程中和在年長者中經(jīng)歷顯著的變化(D’Costa等人，1993)隨著降低的GH生產(chǎn)率和GH半衰期、IGF-I對GH和GHRH刺激降低的反應性導致骨骼肌質(zhì)量的損失(sacropenia)、骨質(zhì)疏松癥和脂肪增加及瘦體重的降低(Bartke，1998)。前面的研究已顯示在極大數(shù)目的正常年長者人中，血清中GH和IGFs的水平相對于他們青少年時的水平顯著地減少了70-80％(Corpas等人，1993；Iranmanesh等人，1991)。已說明sacropenia的發(fā)展可由GH治療來彌補。然而，因為其成本和頻繁的副作用，這在年長者中仍然是有爭議的治療。重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)提供了治療這些狀況的有用工具。盡管GH替換治療廣泛用于具有生長缺乏的患者并提供了滿意的生長，且對治療的兒童可能具有積極的心理學作用(Rosenbaum和Saigal，1996；，Erling，1999)，但是該治療具有幾個缺點，包括需要不切實際的頻繁施用GH(Monti等人，1997；Heptulla等人，1997)和不合需要的次級效應(Blethen等人，1996；Watkins，1996；Shalet等人，1997；Allen等人，1997)。已經(jīng)很好地確定，作為成熟的肽或截短的分子的頭顱外分泌的GHRH(如與胰島細胞瘤和定位于不同位置的類癌中所看到的)經(jīng)常具有生物學活性并甚至可產(chǎn)生肢端巨大癥(Esch等人，1982；Thorner等人，1984)。將重組的GHRH施用于GH-缺乏的兒童或成年人增加了IGF-I的水平、相對于GHRH的劑量按比例增加了GH的分泌，但仍然引起了對GHRH大劑量的反應(Bercu和Walker，1997)。因而，GHRH施用代表了增加低于正常的GH和IGF-I水平的另一種生理學選擇(Corpas等人，1993)。盡管GHRH蛋白質(zhì)治療導致并刺激了正常的循環(huán)GH分泌而實際上無副作用，但體內(nèi)GHRH短的半衰期需要頻繁的(每天1-3次)靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)(需要高300-倍的劑量)的施用。因而，作為慢性治療，GHRH施用不切實際。然而，頭顱外分泌的GHRH，作為加工的蛋白質(zhì)種類(Tyr1-40或Tyr1-Leu44)或甚至作為更短的截短分子，具有生物學活性(Thorner等人，1984)。重要的是，在血液供應中低水平的GHRH(100pg/ml)可刺激GH分泌(Corpas等人，1993)并使得GHRH成為基因治療性表達的極好的候選物。目前直接質(zhì)粒DNA基因轉移是許多新興基因治療策略的基礎，并且這樣不需要病毒基因或脂質(zhì)顆粒(Muramatsu等人，1998；Aihara和Miyazaki，1998)。骨骼肌是優(yōu)選目標組織，因為肌纖維具有長的壽命且可由在免疫活性宿主中經(jīng)年累月表達的環(huán)狀DNA質(zhì)粒轉導(Davis等人，1993；Tripathy等人，1996)。前面的報道說明人GHRH cDNA在鼠中可通過注射型生肌表達載體而遞送入肌肉，在那里它在2個星期的時期內(nèi)將GH分泌短暫地刺激到適當?shù)某潭?Draghia-Akli等人，1997)。野生型GHRH在人(Frohman等人，1984)和農(nóng)場動物兩者的循環(huán)系統(tǒng)中均具有相對短的半衰期。在血漿中溫育60分鐘后，95％的GHRH(1-44)NH2被降解，而在相似條件下溫育較短的(1-40)OH形式的激素時，60分鐘的溫育后顯示只有77％的肽的降解(Frohman等人，1989)。在基因治療載體中結合編碼特殊蛋白酶-抗性GHRH類似物的cDNA導致具有更長的血清半衰期、增加效能的分子，并在質(zhì)粒注射的動物中提供了更大的GH釋放(Draghia-Akli等人，1999；此處引用作為參考)。經(jīng)由對蛋白酶敏感性氨基酸的氨基酸替代的突變延長了hGHRH分子的血清半衰期。此外，GHRH生物學活性的增強通過使用超活性的類似物而達到，該類似物可增加其對特定受體的結合力(Draghia-Akli等人，1999)。已頒發(fā)的專利陳述了以增加生長激素釋放為目的而施用新型GHRH類似物蛋白質(zhì)(美國專利No.5,847,066；5,846,936；5,792,747；5,776,901；5,696,089；5,486,505；5,137,872；5,084,442；5,036,045；5,023,322；4,839,344；4,410,512；RE33,699)或合成的或天然存在的GHRH肽片段(美國專利No.4,833,166；4,228,158；4,228,156；4,226,857；4,224,316；4,223,021；4,223,020；4,223,019)。已報道了含有如下突變的GHRH類似物(美國專利No.5,846,936)位置1的Tyr變?yōu)镠is；位置2的Ala變?yōu)閂al、Leu或其他；位置8的Asn變?yōu)镚ln、Ser或Thr；位置15的Gly變?yōu)锳la或Leu；位置27的Met變?yōu)镹le或Leu；和位置28的Ser變?yōu)锳sn。作為美國專利申請系列No.60/145,624的主題且在此處引用作為參考的GHRH類似物不含有在美國專利No.5,846,936中報道的活性所必需的所有氨基酸替代。美國專利申請序列No.60/145,624的發(fā)明與美國專利No.5,756,264在2個方面不同。首先，美國專利申請序列No.60/145,624的發(fā)明涉及一種生長激素釋放激素的類似物，該類似物以顯著的修飾而與野生型不同，這些修飾改善了其作為GH促分泌素的功能對蛋白酶的易感性降低和增加的穩(wěn)定性，這將延長其起治療作用的能力，并增加生物學活性，后者將增強起治療作用的能力。美國專利申請系列No.60/145,624的類似物缺乏存在于美國專利No.5,756,264的GHRH類似物中位置8向Gln、Ser或Thr的替代。此外，在美國專利申請序列No.60/145,624的發(fā)明的一個方面，該發(fā)明利用編碼結合唯一的合成啟動子上的GHRH類似物的DNA，該啟動子稱為SPc5-12(Li等人，1999)，它含有來自骨骼α-肌動蛋白的近側血清反應元件(SRE)、多重MEF-2位點、MEF-1位點和TEF-1結合位點，并大大地超過天然生肌啟動子的轉錄能力。這樣的合成啟動子的唯一性是對已頒發(fā)的專利如涉及生肌啟動子及其用途(例如美國專利No.5,374,544)或核酸序列的生肌表達系統(tǒng)(例如美國專利No.5,298,422)的顯著改善。美國專利No.5,061,690通過向懷孕的雌性哺乳動物提供10-20天有效量的hGRF或其一種類似物而直接針對增加出生重量和乳汁生產(chǎn)。對類似物的應用貫穿于泌乳期。然而，介紹的是多重施用，且沒有關于以DNA分子形式施用生長激素釋放激素(或因子)的公開內(nèi)容，如與基因治療技術相關的。美國專利No.5,134,120和5,292,721相似地未提供關于以DNA形式施用生長激素釋放激素的教導。此外，這些專利專門涉及在妊娠的最后2個星期和出生后的3個星期中多重施用重組蛋白質(zhì)GH。同樣，未提供關于任何非野生型的討論，如在本發(fā)明中所提供的。向農(nóng)場動物施用生長激素(GH)在增加了飼養(yǎng)效率同時增強了瘦肉組織積累和/或乳汁生產(chǎn)(Etherton等人，1986；Klindt等人，1998)。許多研究已顯示GH顯著地減少了畜體脂肪量；且隨后產(chǎn)品的質(zhì)量增加了。然而，慢性的GH施用具有實際的和生理學的局限而潛在地減弱其有用性和有效性(Chung等人，1985；Gopinath和Etherton，1989)。根據(jù)實驗，將GH-釋放激素(GHRH)用作另一種生理學選擇。對于大的物種如豬或牛，GH的上游刺激物，GHRH的使用是另一種可選擇的策略，該策略不僅可增加生長性能或乳汁生產(chǎn)，而且更重要的，可增加從實際和代謝角度來看的生產(chǎn)效率(Dubreuil等人，1990；Farmer等人，1992)。然而，目前重組肽的高成本和必需的施用頻率限制了該治療的廣泛應用。這些主要的缺點可通過用一種針對GHRH異位生產(chǎn)的基因治療方法來消除，只要其生產(chǎn)可長期維持。GHRH基因的下丘腦組織特異性表達不是其活性所必需的，這是因為頭顱外分泌的GHRH可具有生物學活性(Faglia等人，1992；Melmed，1991)。一種遞送GHRH的基因治療方法因如下事實而得到支持，即基因、cDNA和天然的和幾個突變的分子在豬、牛和許多其他物種中已有很好表征，且對治療功效的確定簡單而明確。骨骼肌肉組織是目標組織的理想候選物，因為肌內(nèi)注射易于在工業(yè)設施中操作、肌纖維具有長的壽命且可由環(huán)狀DNA質(zhì)粒進行轉導(Bettan等人，2000；Everett等人，2000)。因而，無需再次施用且轉基因可經(jīng)年累月在免疫活性宿主中有效地表達(Wolff等人，1992)。
發(fā)明概述在本發(fā)明的一個實施方案中，有一種改善或增強來自雌性動物的后代的生長的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中的核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代生長的改善或增強。在一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。在另一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。在另外一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。在進一步特定的實施方案中，該生長激素釋放激素為SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。在另外一個特定的實施方案中，該啟動子包含合成的生肌啟動子。在進一步特定的實施方案中，該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個特定的實施方案中，該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合或通過腸胃外途徑而引入到該雌性動物的所述細胞中。在另外一個特定的實施方案中，該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。在進一步特定的實施方案中，該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。在另外一個特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)。在另一個特定的實施方案中，該載體在一次施用中引入該雌性。在另外一個特定的實施方案中，該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。在另一個特定的實施方案中，該配體經(jīng)口施用。在本發(fā)明額外的一個實施方案中，有一種增加來自雌性動物的后代中生長激素水平的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中的核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代中生長激素水平增加。在一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。在另一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。在另外一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。在進一步特定的實施方案中，該生長激素釋放激素為SEQ ID NO1、SEQID NO8或其各自的類似物。在另外一個特定的實施方案中，該啟動子包含合成的生肌啟動子。在進一步特定的實施方案中，該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個特定的實施方案中，該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合或通過腸胃外途徑而引入到雌性動物的細胞中。在另外一個特定的實施方案中，該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。在進一步特定的實施方案中，該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。在另外一個特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)。在另一個特定的實施方案中，該載體在一次施用中引入該雌性。在另外一個特定的實施方案中，該引入是在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。在另一個特定的實施方案中，該配體經(jīng)口施用。在本發(fā)明的另一個實施方案中，有一種增加來自雌性動物的后代的瘦體重的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中的核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代中瘦體重增加。在一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。在另一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。在另外一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。在進一步特定的實施方案中，該生長激素釋放激素為SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。在另外一個特定的實施方案中，該啟動子包含合成的生肌啟動子。在進一步特定的實施方案中，該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個特定的實施方案中，該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合或通過腸胃外途徑而引入到雌性動物的細胞中。在另外一個特定的實施方案中，該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。在進一步特定的實施方案中，該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。在另外一個特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)。在另一個特定的實施方案中，該載體在一次施用中引入該雌性。在另外一個特定的實施方案中，該引入是在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。在另一個特定的實施方案中，該配體經(jīng)口施用。在本發(fā)明的另一個實施方案中，有一種增加來自雌性動物的后代的IGF-I水平的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中的核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代中IGF-I水平增加。在一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。在另一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。在另外一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。在進一步特定的實施方案中，該生長激素釋放激素為SEQ ID NO1、SEQID NO8或其各自的類似物。在另外一個特定的實施方案中，該啟動子包含合成的生肌啟動子。在進一步特定的實施方案中，該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個特定的實施方案中，該載體是通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合或通過腸胃外途徑而引入到雌性動物的細胞中的。在另外一個特定的實施方案中，該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。在進一步特定的實施方案中，該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。在另外一個特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)。在另一個特定的實施方案中，該載體在一次施用中引入該雌性。在另外一個特定的實施方案中，該引入是在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。在另一個特定的實施方案中，該配體經(jīng)口施用。在本發(fā)明額外的一個實施方案中，有一種增加來自雌性動物的后代的飼養(yǎng)效率的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中的核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代中飼養(yǎng)效率增加。在一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。在另一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。在另外一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。在進一步特定的實施方案中，該生長激素釋放激素為SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。在另外一個特定的實施方案中，該啟動子包含合成的生肌啟動子。在進一步特定的實施方案中，該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個特定的實施方案中，該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合或通過腸胃外途徑而引入到雌性動物的細胞中。在另外一個特定的實施方案中，該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。在進一步特定的實施方案中，該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。在另外一個特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)。在另一個特定的實施方案中，該載體在一次施用中引入該雌性。在另外一個特定的實施方案中，該引入是在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。在另一個特定的實施方案中，該配體經(jīng)口施用。在本發(fā)明的另一個實施方案中，有一種增加來自雌性動物的后代的生長速度的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中的核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代中生長速度增加。在一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。在另一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。在另外一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。在進一步特定的實施方案中，該生長激素釋放激素為SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。在另外一個特定的實施方案中，該啟動子包含合成的生肌啟動子。在進一步特定的實施方案中，該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個特定的實施方案中，該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合或通過腸胃外途徑而引入到雌性動物的細胞中。在另外一個特定的實施方案中，該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。在進一步特定的實施方案中，該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。在另外一個特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)。在另一個特定的實施方案中，該載體在一次施用中引入該雌性。在另外一個特定的實施方案中，該引入是在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。在另一個特定的實施方案中，該配體經(jīng)口施用。在本發(fā)明額外的一個實施方案中，有一種增加來自雌性動物的后代的腦下垂體中促生長激素生產(chǎn)細胞對其他的激素生產(chǎn)細胞的比例的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中的核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代中促生長激素生產(chǎn)細胞對其他的激素生產(chǎn)細胞的比例增加。在一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。在另一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。在另外一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。在進一步特定的實施方案中，該生長激素釋放激素為SEQID NO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。在另外一個特定的實施方案中，該啟動子包含合成的生肌啟動子。在進一步特定的實施方案中，該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個特定的實施方案中，該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合或通過腸胃外途徑而引入到雌性動物的細胞中。在另外一個特定的實施方案中，該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。在進一步特定的實施方案中，該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。在另外一個特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)。在另一個特定的實施方案中，該載體在一次施用中引入該雌性。在另外一個特定的實施方案中，該引入是在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。在另一個特定的實施方案中，該配體的經(jīng)口施用。在一個特定的實施方案中，該激素生產(chǎn)細胞選自促腎上腺皮質(zhì)激素細胞、催乳細胞和促性腺激素細胞。在本發(fā)明額外的一個實施方案中，有一種延遲來自雌性動物的后代出生的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中的核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代出生延遲。在一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。在另一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。在另外一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。在進一步特定的實施方案中，該生長激素釋放激素為SEQ ID NO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。在另外一個特定的實施方案中，該啟動子包含合成的生肌啟動子。在進一步特定的實施方案中，該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個特定的實施方案中，該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合或通過腸胃外途徑而引入到雌性動物的細胞中。在另外一個特定的實施方案中，該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。在進一步特定的實施方案中，該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。在另外一個特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)。在另一個特定的實施方案中，該載體在一次施用中引入該雌性。在另外一個特定的實施方案中，該引入是在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。在另一個特定的實施方案中，該配體經(jīng)口施用。在本發(fā)明額外的一個實施方案中，有一種增加動物的乳汁生產(chǎn)的方法，該方法包括將有效量的載體引入到該動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中的核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致動物乳汁生產(chǎn)增加。在一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。在另一個特定的實施方案中，該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。在另外一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。在進一步特定的實施方案中，該生長激素釋放激素為SEQID NO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。在另外一個特定的實施方案中，該啟動子包含合成的生肌啟動子。在進一步特定的實施方案中，該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個特定的實施方案中，該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合或通過腸胃外途徑而引入到雌性動物的細胞中。在另外一個特定的實施方案中，該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。在進一步特定的實施方案中，該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。在另外一個特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)。在另一個特定的實施方案中，該載體在一次施用中引入該雌性。在另外一個特定的實施方案中，該引入是在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生的。在另一個特定的實施方案中，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。在另一個特定的實施方案中，該配體經(jīng)口施用。通過閱讀下面的說明書并參考其中附隨的附圖部分或本發(fā)明目前為了公開的目的而給出的優(yōu)選實施方案的任何實例，本發(fā)明其他的和進一步的目的、特征和優(yōu)勢將顯而易見，并最終更易于理解。
附圖描述

圖1A到1C說明了GHRH超活性的類似物增加了GH促分泌素活性和穩(wěn)定性。圖1A是豬野生型(1-40)OH氨基酸序列和類似物HV-GHRH的比較。圖1B表示不同GHRH種類在豬原代垂體前葉培養(yǎng)物中對豬GH釋放的作用。圖1C說明了在6小時的溫育中發(fā)生于HV-GHRH和野生型豬GHRH的穩(wěn)定性的改變。圖2A到2E說明了在超活性類似物GHRH生肌表達載體的一次注射后2個月中GHRH、GH和IGF-I血清水平的增加。圖2A描述了包含SPc5-12合成啟動子和GH的3’UTR的構建體。作為突變蛋白質(zhì)的模型，使用HV-GHRH構建體并用豬野生型作為正對照進行比較，而用β-半乳糖苷酶構建體作為負對照進行比較。圖2B闡明了用pSP-GHRH注射的豬與用安慰劑注射的對照豬的血清GHRH的相對水平。圖2C說明用重量/血體積增加校正后pSP-GHRH注射的豬與對照豬的血清GHRH的絕對水平。圖2D表示在用pSP-HV-GHRH注射的豬中GH水平的變化。圖2E表示在直接將pSP-GHRH構建體進行肌內(nèi)注射后血漿中IGF-I的水平。圖3A到3C說明生肌GHRH表達載體對豬生長的作用。圖3A表示在2個月中用pSP-GHRH或pSP-HV-GHRH注射的豬中平均重量的變化。圖3B表示用pSP-GHRH注射的豬與對照相比飼料轉變效率的狀況。圖3C是注射后45天，用pSP-HV-GHRH注射的豬和用安慰劑注射的對照豬的比較。圖4說明注射不同量的pSP-HV-GHRH對10日齡的小豬的作用。圖5表示注射不同量的pSP-HV-GHRH對10日齡的小豬的IGF-I水平的作用。圖6闡明了pSP-HV-GHRH注射小豬的時間過程。圖7闡明了與外在卡鉗電極(caliper electrode)的另一種實施方案相比本發(fā)明的注射型電極的優(yōu)選實施方案。頂部是對具有2正方形平板/1.5cm面的外在卡鉗電極的說明。底部是對存在于1cm直徑的陣列中18-26g的長度為2cm針的6-針陣列儀器(固體針)的說明。左面的說明是側視圖而右面的說明是底視圖。圖8說明了對照和實驗的小豬的出生重量。圖9闡明了剛斷奶的實驗和對照小豬的重量。圖10表示與注射的動物混養(yǎng)(cross-fostered)的對照與其同窩出生仔畜比較的重量。圖11說明了來自與對照母豬混養(yǎng)的GHRH-處理的母豬的小豬的重量及與其同窩出生仔畜的比較。圖12闡明了比對照在重量上總的增加(由對照母豬飼養(yǎng))。圖13表示實驗和對照市場重量的比較。圖14闡明了3個星期、10個星期和24個星期的后代的重量。圖15表示在3周齡時每體重的肌肉重量。圖16說明了每后代總重量的垂體重量。圖17表示在后代中的GH、GHRH和PRL的RNA分析，闡明GHRH在宮內(nèi)作為生長因子對垂體起作用。圖18闡明了GH-分泌細胞的DAB染色。圖19說明了3個星期、10個星期和6個月的后代中IGF-I的濃度。
發(fā)明詳述對于本領域的技術人員來說，可在此處公開的本發(fā)明中進行各種替代和修飾而不背離本發(fā)明的范圍和精神是顯而易見的。在說明書中此處所用的“一個(a)”或“一個(an)”可指一個或多個。如此處在權利要求中所用的，當與“由…組成”結合使用時，“一個(a)”或“一個(an)”可指一個或多于一個。如在此處所用的“另一個”指至少第二個或更多。此處所用的術語“動物”指動物界中的任何物種。在優(yōu)選實施方案中，它更特定地指人、野生狀態(tài)的動物、用作寵物的動物(鳥、狗、貓、馬)、用于工作的動物(馬、母牛、狗)和生產(chǎn)食物的動物(雞、母牛、魚)、農(nóng)場動物(豬、馬、母牛、綿羊、雞)或本身是食物的動物(青蛙、雞、魚、螃蟹、龍蝦、小蝦、貽貝、扇貝、山羊、公豬、母牛、羔羊、豬、鴕鳥、鴯鹋、鰻鱺)和其他本領域公知的動物。此處所用的術語“有效量”定義為需要在宿主中產(chǎn)生作用的組合物的量，其中的作用可用幾個本領域技術人員所公知的邊界點來監(jiān)控。在一個特定的實施方案中，這些邊界點是替代標記物。此處所用的術語“飼料轉變效率”定義為與該動物獲得的重量相對于該動物每天所吃的食料的量。此處所用的術語“效率”或“飼養(yǎng)效率”與“飼料轉變效率”是可以互換的。此處所用的術語“生長缺乏”定義為其生長比正常的少的任何健康狀況、醫(yī)療狀況或疾病。該缺乏可為畸變的結果，該畸變直接影響生長激素途徑(如GHRH-GH-IGF-I軸)、間接影響生長激素途徑或根本不影響生長激素途徑。此處所用的術語“生長激素”定義為涉及生長并充當化學信使而在目標細胞中發(fā)揮其作用的激素。此處所用的術語“生長激素釋放激素”定義為促進或刺激生長激素釋放的激素。此處所用的術語“生長激素釋放激素的類似物”定義為在天然存在的氨基酸序列中含有氨基酸突變和/或缺失(無合成的右旋或環(huán)狀氨基酸)但卻并非GHRH分子中天然發(fā)生，且仍然保持其增強生長激素合成和分泌功能的蛋白質(zhì)。此處所用的術語“生長激素促分泌素受體”(GHS-R)定義為小的合成化合物的受體，該化合物直接或間接地與生長激素從腦下垂體中釋放相關。此處所用的術語“瘦體重”定義為動物歸因于非脂肪組織如肌肉的體重。此處所用的術語“生長激素促分泌素受體的配體”定義為充當生長激素促分泌素受體的激動劑的化合物。該配體可為合成的或天然存在的。該配體可為肽、蛋白質(zhì)、糖、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸或其組合。此處所用的術語“生肌的”特定地指肌肉組織。此處所用的術語“新生兒”指緊接在出生之后的動物及所有隨后成熟或生長階段。此處所用的術語“后代”指親代的后裔，其中該后裔是未出生的胎兒或新生兒。此處所用的術語“腸胃外”指除經(jīng)腸道之外將材料引入到動物內(nèi)的機制。在特定的實施方案中，腸胃外包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)或其他。此處所用的術語“藥物可接受的”指化合物，其中該化合物的施用可被受體哺乳動物耐受。此處所用的術語“促分泌素”指可增強下游調(diào)節(jié)的分子的合成和分泌的天然或合成的分子(如GHRH是GH的促分泌素)。此處所用的術語“促生長激素細胞”指生產(chǎn)生長激素的細胞。此處所用的術語“治療有效量”指施用的化合物的量，其中該量在生理學上顯著。一種藥劑如果其存在導致受體動物的生理學發(fā)生技術的改變則為生理學上顯著。例如，在治療生長缺乏中，增加生長的組合物為治療有效；在消耗疾病中可降低損失率或增加生長的組合物為治療有效。此處所用的術語“載體(vector)”指任何可將核酸遞送入細胞或生物體中的載體。例子包括質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)。在一個特定的實施方案中，脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)是可與其他的載體復合以增加目標細胞對質(zhì)粒或病毒載體的攝取的佐劑(載體(carrier))。在一個優(yōu)選的實施方案中，該載體包含啟動子、核苷酸序列，優(yōu)選地編碼生長激素釋放激素或其類似物，和3’非翻譯區(qū)。在另一個優(yōu)選實施方案中，該啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)可操作地相連接以在真核細胞中表達。此處所用的術語“萎縮癥狀”定義為與消耗或慢性萎縮病相關的癥狀或狀況。本申請在主題上與于1999年7月26日提交的美國臨時專利申請No.60/145,624和相應的于2000年7月24日提交的美國非臨時專利申請No.09/624,268相關，此處將二者引用作為參考。為了估計生長激素釋放激素(GHRH)基因治療生肌載體的生長效果，對在妊娠的最后3個月的懷孕的母豬注射了10mg含野生型(pSP-wt-GHRH)或突變的(pSP-HV-GHRH)的GHRH cDNA的載體。在該注射之后進行電穿孔。將未注射/電穿孔的母豬用作對照。來自GHRH注射的母豬的小豬在出生時較大(平均為1.65±0.06kgHV-GHRH，p＜0.00002且1.46±0.05kg wt-GHRH，p＜0.0014，對于對照1.27±0.02kg)。進行混養(yǎng)研究。在斷奶時，來自注射的母豬的小豬比對照大。由注射的母豬哺乳的混養(yǎng)對照顯著地比其同窩出生仔畜大。該優(yōu)點得以保持，且在出生后170天，注射的母豬的后代對于HV-GHRH和wt-GHRH分別為135.7kg和129.3kg，而對照重量平均為125.3kg。對小豬進行了多重生物化學的測量。在來自注射母豬的小豬中總蛋白質(zhì)增加了，且在所有檢驗的時間點血液中尿素的水平降低，這兩個常數(shù)都說明了改善的蛋白質(zhì)代謝。肌酸酐濃度正常，顯示正常的腎功能。葡萄糖和胰島素的水平正常。因而，由用編碼GHRH的質(zhì)粒DNA構建體進行基因治療處理的母豬生產(chǎn)的小豬在維持正常的原態(tài)穩(wěn)定時，在至少出生后170天內(nèi)顯示比正常水平增加的生長模式且更瘦。該增加相等地應歸于注射的母豬乳汁分泌的增加和后代中下丘腦-垂體軸的修飾。該主要實驗的證據(jù)說明質(zhì)粒介導的轉移可用于在避免經(jīng)典蛋白質(zhì)治療所相關連的次生效應的同時，貫穿世代地增強某些動物特征。在本發(fā)明的一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中用到一個核酸序列，該序列在雌性的后代中增加生長、增強生長、增加飼料轉變效率、增加瘦體重、增加IGF-I水平、增加生長速度、增加促生長激素細胞相對其他激素生產(chǎn)細胞的比例、延遲出生或增加乳汁生產(chǎn)。在特定的實施方案中，該核酸序列是生長激素釋放激素、生長激素、IGF-I、催乳激素或其類似物。該雌性可為母親、以前從未懷孕或生產(chǎn)的雌性，或者為替代母親，如通過胎兒移植而受孕的。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案使用具有氨基酸序列SEQ IDNO1或SEQ ID NO8(wt GHRH)的生長激素釋放激素類似物。如在此處所用的，術語“野生型”可為任何動物的GHRH的內(nèi)源形式，或為該激素如豬GHRH的略微修飾的形式。技術人員知道內(nèi)源GHRH具有44個氨基酸，且在末段具有一個酰胺基團，其正確的符號表示為(1-44)NH2-GHRH。在一個特定的實施方案中，使用僅有40個氨基酸(缺乏最后4個氨基酸)的形式，該形式也不含有酰胺基團，可標為(1-40)OH-GHRH。如在此處所用的該形式也稱為野生型，因為它與野生型的序列相比不含有內(nèi)部突變，這與在此處所描述的具有由定點突變而引入內(nèi)部突變的其他形式(如HV)相反。技術人員知道1-40的形式和更短的形式(例如1-32或1-29)天然存在于人和其他哺乳動物中(甚至在不同類型的GHRH分泌腫瘤中)，且這些形式具有與天然(1-44)NH2相當?shù)幕钚?。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使用具有比野生型GHRH增加的穩(wěn)定性的GHRH。在另一個實施方案中，不同種類的GHRH或GHRH的類似物在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本發(fā)明的一個目的中，已知核酸施用的特性時，由DNA編碼的殘基不進行翻譯后修飾。下面的種類在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。美國專利No.4,223,019公開了具有氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y選自D-賴氨酸和D-精氨酸；Z和J獨立地選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；且E和G獨立地選自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸。美國專利No.4,223,020公開了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-COOH的四肽，其中Y和G獨立地選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；且Z和E獨立地選自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸。美國專利No.4,223,021公開了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y和G獨立地選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；Z選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸；E和J獨立地選自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸。美國專利No.4,224,316公開了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的新型的五肽，其中Y和E獨立地選自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；Z和G獨立地選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；且J選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸和賴氨酸。美國專利No.4,226,857公開了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y和G獨立地選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；Z和J獨立地選自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；且E選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和組氨酸。美國專利No.4,228,155公開了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y選自酪氨酸、D-酪氨酸、色氨酸、D-色氨酸、苯丙氨酸和D-苯丙氨酸；Z和E獨立地選自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；G選自賴氨酸和精氨酸；且J選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。美國專利No.4,228,156公開了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-COOH的三肽，其中Y和Z獨立地選自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；且E選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。美國專利No.4,228,158公開了具有下面氨基酸序列NH2-Y-Z-E-G-J-COOH的五肽，其中Y和G獨立地選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；Z和E獨立地選自D-酪氨酸、D-色氨酸和D-苯丙氨酸；且J選自天然氨基酸和其D-構型。美國專利No.4,833,166公開了具有分子式H-Asp-Pro-Val-Asn-Ile-Arg-Ala-Phe-Asp-Asp-Val-Leu-Y的合成肽，其中Y是OH或NH2或其無毒性鹽，和具有分子式H-Val-Glu-Pro-Gly-Ser-Leu-Phe-Leu-Val-Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Pro-Val-His-Asp-Phe-Val-Gln-Gln-Phe-Ala-Gly-Ile-Y的合成肽，其中Y是OH或NH2或其無毒性鹽。Draghia-Akli等人(1997)使用編碼31個氨基酸的信號肽的228-bp的hGHRH片段和最初由Mayo等人(1995)描述的完整成熟肽人GHRH(1-44)OH(Tyr1Leu44)。Guillemin等人(1982)也確定了人胰腺生長激素釋放因子(hpGRF)的序列。本發(fā)明額外的實施方案包括(1)改善后代生長性能的方法；(2)刺激后代中以比與正常生長相關的水平更高的水平生產(chǎn)生長激素的方法；和(3)增強后代生長的方法。所有這些方法包括將質(zhì)粒載體在懷有該后代期間或之前的懷孕期間引入到該后代的母親中的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列如編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO8的核苷酸序列和可操作地在適當距離順序連接的以進行功能性表達的3’非翻譯區(qū)。在一個額外的特定實施方案中，有一種刺激后代以比正常生長相關的水平更高的水平生產(chǎn)生長激素的方法，該方法包含在懷有該后代期間向該后代的母親引入有效量的載體，該載體包含啟動子、編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO8的核苷酸序列和可操作地在適當距離順序連接的以進行功能性表達的3’非翻譯區(qū)。比正常生長相關的水平更高的水平包括具有生長相關的缺乏的動物或具有與群體中其他類似動物類似的生長水平的動物，包括那些無生長相關的缺乏的動物的基本的、固有的生長。在一個優(yōu)選實施方案中，有一種增強動物生長的方法，該方法包含向該動物引入有效量的載體，該載體包含啟動子、編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO8的核苷酸序列和可操作地在適當距離順序連接的以進行功能性表達的3’非翻譯區(qū)。其生長增強的動物可具有或不具有生長缺乏。本發(fā)明的一個目的是增加動物的生長和/或生長速度，其優(yōu)選為來自母親的后代。在一個優(yōu)選實施方案中，動物的生長和/或生長速度受到了長期的影響，如大于幾個星期或大于幾個月。在一個特定的實施方案中，這通過將生長激素釋放激素施用于后代的母親而達到，優(yōu)選以核酸的形式。在一個優(yōu)選實施方案中，該GHRH核酸作為肌肉細胞的附加體而被維持。在一個特定的實施方案中，GHRH的增加通過增加生長激素生產(chǎn)細胞的數(shù)目而影響腦下垂體，并因而改變了其細胞譜系。在一個特定的實施方案中，促生長激素細胞(生長激素生產(chǎn)細胞)的比例相對于垂體內(nèi)其他的激素生產(chǎn)細胞如促腎上腺皮質(zhì)激素細胞、催乳細胞和促性腺激素細胞等而增加。在一個特定的實施方案中，與生長激素生產(chǎn)細胞數(shù)目的增加相關的生長激素的增加反映于IGF-I水平的增加。在另一個特定的實施方案中，生長激素水平的增加與后代瘦體重的增加和生長速度的增加相關。在另一個特定的實施方案中，瘦體重的增加與線性骨骼生長的增加相關。在另外一個特定的實施方案中，后代的飼料轉變效率增加。在另一個特定的實施方案中，后代的出生延遲，且在一個優(yōu)選實施方案中，這與胎兒生長速度改善或增加相關。在一個優(yōu)選實施方案中，該啟動子是合成的生肌啟動子，且hGH 3’非翻譯區(qū)位于3’非翻譯區(qū)。然而，該3’非翻譯區(qū)可來自任何天然或合成的基因。在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，使用合成的啟動子，稱為SPc5-12(Li等人，1999)(SEQ ID NO6)，它含有來自骨骼α-肌動蛋白的近側血清反應元件(SRE)、多重MEF-2位點、MEF-1位點和TEF-1結合位點，并大大地超過天然生肌啟動子的轉錄能力。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所用的啟動子并不由內(nèi)源的細胞裝置或因子顯著地關掉或減少其活性。其他的元件，包括反式作用因子結合位點和增強子可根據(jù)本發(fā)明的實施方案而使用。在另一個實施方案中，使用天然的生肌啟動子，且技術人員知道如何從數(shù)據(jù)庫中獲得這樣的啟動子序列，該數(shù)據(jù)庫包括國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫或NCBI PubMed站點。技術人員知道這些國際互聯(lián)網(wǎng)(world wide web)站點可用于獲得與本發(fā)明相關的序列或相關文獻。在一個特定的實施方案中，在核酸載體如質(zhì)粒中使用hGH3’非翻譯區(qū)(SEQ ID NO7)。在特定的實施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì)。在進一步特定的實施方案中，該載體引入到生肌細胞或肌肉組織內(nèi)。在進一步特定的實施方案中，該動物是人、寵物動物、工作用動物或食用動物。除將該構建體通過質(zhì)粒載體引入到動物中的特定實施方案之外，也可使用本領域中公知的將核酸轉染入動物或其細胞的遞送系統(tǒng)。例如，可使用其他非病毒的或病毒的方法。技術人員認識到DNA或RNA非病毒形式的目標系統(tǒng)需要4個成分1)目的DNA或RNA；2)識別并結合到細胞表面受體或抗原的部分；3)DNA結合部分；和4)使得復合物能夠從細胞表面轉運到胞質(zhì)中的裂解部分。進一步地，脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)可用于遞送治療基因組合以達到相同的作用。潛在的病毒載體包括衍生自如腺病毒(adenovirus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、皰疹病毒(herpes virus)和牛乳頭狀瘤病毒(bovine papilloma virus)等病毒的表達載體。此外，可采用附加體載體。其他DNA載體和轉運蛋白系統(tǒng)為本領域公知。本領域的技術人員認識到衍生自各種細菌質(zhì)粒、反轉錄病毒、腺病毒、皰疹或來自痘苗病毒的表達載體可用于向目標器官、組織或細胞群體遞送核苷酸序列。本領域技術人員所公知的方法可用于構建將表達編碼生長激素釋放激素類似物基因的重組載體。暫時的表達用非復制型的載體可持續(xù)1個月或更長，且如果適當?shù)膹椭圃禽d體系統(tǒng)的一部分時甚至可更長。本發(fā)明的一個目的為生長激素釋放激素的一次施用足夠?qū)τ诙啻稳焉飼r期有效，且提供了增強小豬對市場重量性能的治療，如增加的生長和改變的身體組成。
核酸1.載體術語“載體”用于指載體核酸分子，在其中可插入核酸序列以引入到細胞中，在那里該載體可復制且該核酸序列可表達。該核酸序列可為“外源的”，這意味著它對于向其中引入載體的細胞是外源的，或者該序列與細胞內(nèi)的一個序列同源但在宿主核酸中位于通常不發(fā)現(xiàn)該序列的位置上。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動物病毒和植物病毒)和人工染色體(例如YACs)。本領域的技術人員可很好地訓練以通過標準的重組技術而構建載體，該重組技術描述于Maniatis等人，1988和Ausubel等人，1994，此處將兩者引用作為參考。術語“表達載體”指含有編碼至少部分的能夠轉錄的基因產(chǎn)物的核酸序列的載體。在一個特定的實施方案中，該核酸序列編碼部分或全部的GHRH。在一些情況下，RNA分子然后翻譯為蛋白質(zhì)、多肽或肽。在其他的情況下，這些序列不翻譯，如在反義分子或核酶的生產(chǎn)中。表達載體可含有各種“控制序列”，這指在特殊的宿主生物中可操作地連接的編碼序列的轉錄和可能的翻譯所必需的核酸序列。除支配轉錄和翻譯的控制序列之外，載體和表達載體可含有也提供其他功能并在下文描述的核酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的載體是包含合成的生肌(肌肉特異性的)啟動子、編碼生長激素釋放激素或其類似物的核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)的質(zhì)粒。在另一個實施方案中，該載體是病毒載體，如腺病毒相關病毒、腺病毒或反轉錄病毒。在另一個實施方案中，可使用骨骼α-肌動蛋白啟動子、肌球蛋白輕鏈啟動子、巨細胞病毒啟動子或SV40啟動子。在其他另外的實施方案中，在載體中使用人生長激素、牛生長激素、SV40或骨骼α-肌動蛋白3’非翻譯區(qū)。
a.啟動子和增強子“啟動子”是控制序列，它是核酸序列上的控制轉錄的起始和速度的一個區(qū)域。它可含有在其上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和分子如RNA聚合酶和其他轉錄因子可結合的遺傳元件。短語“可操作地定位的”、“可操作地連接的”、“在控制下”和“在轉錄控制下”指啟動子位于相對核酸序列的正確功能位置和/或方向以控制該序列轉錄的起始和/或表達。啟動子可與或不與“增強子”結合使用，后者指涉及核酸序列的轉錄激活的反式作用調(diào)節(jié)序列。啟動子可為位于編碼區(qū)段和/或外顯子上游的天然編碼序列(naturally-coding sequences)之一。這樣的啟動子可稱為“內(nèi)源的”。類似地，增強子可為天然地與核酸序列相關且位于該序列下游或上游的序列?；蛘?，使編碼的核酸區(qū)段在重組的或異源的啟動子控制之下可獲得某些益處，該啟動子指不是在其天然環(huán)境中與核酸序列正常相關的啟動子。重組的或異源的啟動子也指不是在其天然環(huán)境中與核酸序列正常相關的增強子。這樣的增強子或增強子可包括其他基因的啟動子或增強子和從任何其他原核的、病毒的或真核的細胞分離的啟動子或增強子，以及不是“天然存在”的啟動子或增強子，即含有改變表達的不同轉錄調(diào)節(jié)區(qū)域的不同元件和/或突變。除合成地生產(chǎn)啟動子或增強子的核酸序列之外，該序列也可以用重組克隆和/或核酸擴增技術包括PCRTM連同在此處公開的組合物(參見美國專利4,683,202，美國專利5,928,906，它們各自在此處引用作為參考)來生產(chǎn)。此外，思考也可采用在非核的細胞器如線粒體、葉綠體等中指導序列轉錄和/或表達的控制序列。天然地，采用在所選用于表達的細胞類型、細胞器和生物中可有效地指導DNA區(qū)段表達的啟動子和/或增強子是重要的。那些分子生物學領域的技術人員一般知道用于蛋白質(zhì)表達的啟動子、增強子和細胞類型組合的用途，如參見Sambrook等人(1989)，在此處引用作為參考。所采用的啟動子可為組成型、組織特異性的、誘導型和/或在適當條件下用于指導已引入的DNA區(qū)段高水平表達的，如在重組蛋白質(zhì)和/或肽的大規(guī)模生產(chǎn)中有利的。該啟動子可為異源的或內(nèi)源的。在一個特定的實施方案中，該啟動子是合成的生肌啟動子，如由Li等人(1999)所描述的。對組織特異性啟動子或元件的鑒定及其活性表征的測定為本領域技術人員所公知。這些區(qū)域的例子包括人LIMK2基因(Nomoto等人，1999)、促生長激素細胞受體2基因(Kraus等人，1998)、鼠附睪視黃酸結合基因(Lareyre等人，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等人，1998)、小鼠α2(XI)膠原蛋白(Tsumaki等人，1998)、D1A多巴胺受體基因(Lee等人，1997)胰島素樣生長因子II(Wu等人，1997)、人血小板內(nèi)皮細胞粘著分子-1(Almendro等人，1996)。
b.起始信號和內(nèi)部核糖體結合位點特定的起始信號對于編碼序列的有效表達也是必需的。這些信號包括ATG起始密碼子或臨近的序列?？赡苄枰峁┩庠吹姆g控制信號，包括ATG起始密碼子。本領域的一般技術人員易于能夠確定該情況并提供必需的信號。眾所周知，起始密碼子必須與所需編碼序列的可讀框“同框(in frame)”以保證整個插入物的翻譯。外源的翻譯控制信號和起始密碼子可為天然的或合成的。表達的效率可通過包含適當?shù)霓D錄增強子元件而增強。在本發(fā)明的某些實施方案中，內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)元件的用途被用于產(chǎn)生多基因，或多順反子，信息。IRES元件能夠忽略5’甲基化帽子依賴性翻譯的核糖體掃描模型并在內(nèi)部位點起始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已描述了來自細小核糖核酸病毒(picornavirus)家族的2個成員(polio和腦心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)以及來自哺乳動物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可與異源的可讀框連接。多個可讀框可一起轉錄而生成多順反子信息，各自由一個IRES分隔。利用IRES元件的優(yōu)點，每一可讀框都可接近核糖體以進行有效翻譯。多基因可用單個啟動子/增強子有效表達以轉錄為單一的信息(參見美國專利5,925,565和5,935,819，此處引用作為參考)。
c.多克隆位點載體可包括多克隆位點(MCS)，該位點是含有多個限制性內(nèi)切酶酶切位點的核酸區(qū)域，其中的每一個都可與標準重組技術結合使用以消化載體。(參見Carbonelli等人，1999，Levenson等人，1998和Cocea，1997，此處引用作為參考。)“限制性內(nèi)切酶消化”指用僅在核酸分子的特定位置發(fā)揮功能的酶催化切割核酸分子。許多限制性內(nèi)切酶都有商品。這樣的酶的用途為本領域技術人員廣泛理解。經(jīng)常地，將載體用在MCS內(nèi)切割的限制性內(nèi)切酶進行線性化或片段化以使得外源序列能夠連接載體?！斑B接”指在2個核酸分子片段之間形成磷酸二酯鍵的過程，該片段彼此可相鄰接或不相鄰接。包括限制性內(nèi)切酶和連接反應的技術為重組技術領域的技術人員所公知。
d.剪接位點許多轉錄的真核RNA分子將進行RNA剪接以從初級轉錄物中去除內(nèi)含子。含有基因組真核序列的載體可需要供體和/或受體剪接位點以保證用于蛋白質(zhì)表達的轉錄物的正確加工。(參見Chandler等人，1997，此處引用作為參考。)e.聚腺苷酸化信號在表達中，一般將包括聚腺苷酸化信號以使轉錄物正確地進行聚腺苷酸化。不認為聚腺苷酸化信號的特性對于本發(fā)明的成功實踐是關鍵的和/或可采用任何這樣的序列。優(yōu)選實施方案包括SV40聚腺苷酸化信號和/或牛或人生長激素聚腺苷酸化信號，這些信號是方便的和/或已知在各種目標細胞中發(fā)揮很好的功能。也思考作為表達盒的一個元件是轉錄終止位點。這些元件適合于增強信息水平和/或使從該盒到其他序列的連讀最小化。
f.復制的起點為了在宿主中擴增載體，它可含有一個或多個復制起點位點(通常稱為“ori”)，該位點是在該處起始復制的特定核酸序列?；蛘?，如果宿主細胞是酵母時可采用自主復制序列(ARS)。
g.選擇性和篩選性標記在本發(fā)明某些實施方案中，細胞含有本發(fā)明的核酸構建體，該細胞可通過在表達載體中包括標記而體外或體內(nèi)被鑒定。這樣的標記可賦予細胞可鑒定的改變以使得含有該表達載體的細胞易于鑒定。通常地，選擇性標記為賦予允許選擇的性質(zhì)的標記。正選擇性標記為當其存在時允許其選擇的標記，而負選擇性標記為當其存在時防止其選擇的標記。正選擇性標記的一個例子為藥物抗性標記。通常包含藥物選擇性標記可有助于轉化體的克隆和鑒定，例如，賦予對新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組氨醇抗性的基因是有用的選擇性標記。除賦予允許基于實施條件而區(qū)別轉化體的表型的標記之外，也思考其他類型的標記，包括篩選性標記如GFP，其基礎為比色分析。另外，可使用篩選性酶如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉移酶(CAT)。本領域的技術人員也知道如何采用免疫學標記，可能與FACS分析結合。不認為所用標記是重要的，只要其能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時表達。選擇性和篩選性標記的進一步的實例為本領域技術人員所公知。
2.宿主細胞如在此處所用的，術語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”可互換使用。所有這些術語也包括其后裔，這可為任何或所有后繼世代?？衫斫馑泻笠嵊捎谟幸獾幕驘o意的突變而可能不相同。在表達異源核酸序列的情況下，縮主細胞”指原核或真核細胞，且其包括任何能夠復制載體和/或表達由載體編碼的異源基因的可轉化生物體。宿主細胞可且已經(jīng)用作載體的受體。宿主細胞可被“轉染”或“轉化”，這指外源核酸轉移或引入宿主細胞的過程。轉化的細胞包括原代接受實驗的細胞及其后裔。宿主細胞可衍生自原核生物或真核生物，這依賴于所需結果是復制載體還是表達部分或全部載體編碼的核酸序列。許多細胞系和培養(yǎng)物可用作宿主細胞，且可通過美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得，該保藏所是作為活體培養(yǎng)物和遺傳材料的檔案的組織(www.atcc.org)。適當?shù)乃拗骺捎杀绢I域的技術人員基于載體的主鏈和所需結果來確定。例如，可將質(zhì)粒或粘粒引入到原核生物宿主細胞中以復制許多載體。用作宿主細胞以進行載體復制和/或表達的細菌細胞包括DH5α、JM109和KC8，以及許多商品細菌宿主如SURECompetent Cells和SOLOPACK Gold Cells(STRATAGENE，LaJolla)。另外，細菌細胞如大腸桿菌(E.coli)LE392可用作噬菌體病毒的宿主細胞。用作載體復制和/或表達的真核宿主細胞例子包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。許多來自各種細胞類型和生物體的宿主細胞可用且為本領域技術人員所公知。相似地，病毒載體可與真核或原核宿主細胞結合使用，特別是那些允許載體復制或表達的。一些載體可采用允許其在原核和真核細胞兩者中復制和/或表達的控制序列。本領域的技術人員進一步可理解將所有上述宿主細胞溫育以維持該宿主并允許載體復制的條件。同樣理解和知道允許大規(guī)模生產(chǎn)載體以及由載體編碼的核酸和其相關的多肽、蛋白質(zhì)或肽的技術和條件。
3.表達系統(tǒng)有許多包含至少部分或全部上述組合物的表達系統(tǒng)?；谠松锖?或真核生物的系統(tǒng)可用于本發(fā)明以生產(chǎn)核酸序列或其相關的多肽、蛋白質(zhì)或肽。許多這樣的系統(tǒng)是商品且廣泛可用。昆蟲細胞/桿狀病毒(baculovirus)系統(tǒng)可產(chǎn)生異源核酸片段的高水平蛋白質(zhì)表達，如在美國專利No.5,871,986，4,879,236中所述，此處將兩者引用作為參考，且該系統(tǒng)可以購得，例如為來自INVITROGEN的MAXBAC2.0和來自CLONTECH的BACPACKTMBACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM。其他表達系統(tǒng)的例子包括STRATAGENE的COMPLETECONTROL誘導型哺乳動物表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括合成的蛻皮激素誘導受體，或其pET表達系統(tǒng)，即一種大腸桿菌表達系統(tǒng)。該誘導型表達系統(tǒng)的另一個例子可得自INVITROGEN，它含有T-REXTM(四環(huán)素調(diào)節(jié)的表達)系統(tǒng)，即一種使用全長CMV啟動子的誘導型哺乳動物表達系統(tǒng)。INVITROGEN也提供了一種稱為Pichia methanolicaExpression System的酵母表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)設計為在甲基營養(yǎng)酵母Pichia methanolica中高水平生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。本領域的技術人員可知道如何表達載體如表達構建體以生產(chǎn)核酸序列和其相關的多肽、蛋白質(zhì)或肽。
突變在使用時，突變通過各種標準的突變程序來實現(xiàn)。突變是借此在生物的量和結構中發(fā)生變化的過程。突變可涉及修飾單一基因、一批基因或整個染色體的核苷酸序列。單一基因中的變化可為點突變的結果，該點突變包括DNA序列中去除、添加或替代單個核苷酸堿基，或者該變化可為包括大量核苷酸的插入或刪除的改變的結果。突變可作為如DNA復制忠實性中的錯誤或轉座遺傳因子(轉座子)在基因組中運動的事件的結果而自然地發(fā)生。它們也可在暴露于化學或物理突變劑后而被誘導。這樣的突變誘導劑包括電離輻射、紫外線和多種化學藥劑如烷化劑和多環(huán)芳香烴，所有這些都能夠直接或間接地(一般是伴隨于一些代謝生物轉化之后)與核酸相互作用。由這樣的環(huán)境藥劑誘導的DNA損害在受影響的DNA進行復制或修復時可導致堿基序列的修飾，并因而導致突變。突變也可通過使用特殊的尋靶方法而為定點進行。
定點突變結構引導的位點特異性突變代表了進行蛋白質(zhì)-配體相互作用的剖析和操縱的有力工具(Wells等人，1996，Braisted等人，1996)。該技術通過向所選DNA中引入一或多種核苷酸序列而提供了對序列變體的制備和檢驗。位點特異性突變使用編碼所需突變的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足夠數(shù)目鄰接的未修飾核苷酸。在該途徑中，提供了具有足夠大小和復雜性的引物序列以在橫跨的缺失接點的兩側形成穩(wěn)定的雙鏈體。長度約為17到25個核苷酸的引物為優(yōu)選，該引物在被改變的序列的接點兩側各有約5到10個殘基。該技術一般采用以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。在定點突變中有用的載體包括如M13噬菌體的載體。這些噬菌體載體有商品出售，且其用途對于本領域的技術人員一般是公知的。雙鏈的質(zhì)粒也常規(guī)地用于定點突變中，它省去了將目的基因從噬菌體轉移到質(zhì)粒中的步驟。通常，首先要獲得單鏈的載體，或者將雙鏈載體的兩條鏈熔解，該載體在其序列中包含編碼所需蛋白質(zhì)或遺傳因子的DNA序列。然后將合成制備的具有所需突變序列的寡核苷酸引物與單鏈DNA制備物退火，在選擇雜交條件時考慮錯配的程度。將雜交的產(chǎn)物用DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶I(Klenow片段)處理以完成具有突變的鏈的合成。因而，形成了異源雙鏈，其中一條鏈編碼原來無突變的序列，而第二條鏈具有所需突變。然后將該異源雙鏈載體用于轉化適當?shù)乃拗骷毎绱竽c桿菌細胞，并選擇那些包括具有突變序列排列的重組載體的克隆。對給定蛋白質(zhì)殘基的功能重要性和信息含量的全面信息最好可通過飽和突變而獲得，其中對所有的19個氨基酸替代都進行了檢查。該方法的缺點是多殘基飽和突變的后勤工作是令人沮喪的(Warren等人，1996，Brown等人，1996；Zeng等人，1996；Burton和Barbas，1994；Yelton等人，1995；Jackson等人，1995；Short等人，1995；Wong等人，1996；Hilton等人，1996)。必須研究數(shù)百甚至可能數(shù)千位點特異性突變。然而，改善的技術使得突變的產(chǎn)生和快速篩選更加簡單。也參見美國專利5,798,208和5,830,650對“預排(walk-through)”突變的描述。其他定點突變的方法公開于美國專利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514；5,635,377和5,789,166。
劑量和制劑本發(fā)明的組合物(活性成分；此處為包含啟動子、編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO8的核苷酸序列和可操作地在適當距離順序連續(xù)以進行功能性表達的3’非翻譯區(qū))可被制備并施用以通過任何方法而對各種生長缺乏狀態(tài)發(fā)生作用，其中的方法使活性成分與動物體內(nèi)的藥劑作用位點產(chǎn)生接觸。本發(fā)明的該組合物定義為含有編碼本發(fā)明的化合物的核苷酸序列的載體，它是此處描述的氨基酸序列類似物。該組合物是以足夠的量施用以生成該化合物的治療有效量。本領域的技術人員認識到術語“施用”和“引入”可互換使用。它們作為單獨的治療有效成分或者與治療有效成分組合，可通過可與藥物結合使用的任何常規(guī)方法施用。在一個優(yōu)選實施方案中活性成分單獨或者在如PBS的緩沖液中施用，但可與基于所選施用途徑和標準用藥實踐而選擇的藥物載體一起施用。這樣的藥物組合物可用于人和獸醫(yī)兩者的臨床醫(yī)學中治療或診斷的目的。例如，它們用于對生長相關病癥的治療中，如由生長激素生產(chǎn)異常而導致的垂體侏儒癥。此外，它們也可用于刺激用于肉類生產(chǎn)的蓄養(yǎng)動物的生長或增強其飼料轉變效率、增強乳汁的生產(chǎn)和刺激蛋類的生產(chǎn)。施用的劑量將為活性成分的治療有效量，并當然將依賴于已知的因素而變化，該因子為如特定活性成分的藥物動力學特征及其施用的模式和途徑、動物類型、受者的年齡、受者的性別、受者的生殖狀況、受者的健康、受者的重量、癥狀的性質(zhì)和程度、共存的治療的類型、治療的頻率和所需效果。本發(fā)明要施用的載體的適當劑量將依賴于個別被試者和其他的參數(shù)而有些改變。熟練的從業(yè)者將能夠基于已知的與正常生長相關的生長激素循環(huán)水平和載體的生長激素釋放活性而確定適當?shù)膭┝?。如本領域所公知的，對雌性或母親的治療以生產(chǎn)更大的動物將必須在個體間變化劑量，該劑量依賴于必需的生長激素增加水平的程度。因而，根據(jù)本發(fā)明提供了一種增加后代生長的方法，該方法包括對該后代的雌性或母親施用一定量本發(fā)明的類似物，該量足夠使生長激素增加到比與正常生長相關的水平更高的水平。正常的生長激素水平在個體間有相當大的變化，且對于任何給定的個體，循環(huán)的生長激素的水平在一天的過程中有相當大的變化。也提供了一種通過施用一定量的本發(fā)明的GHRH類似物來增加動物生長速度的方法，其中的量足夠刺激生長激素以比與正常生長相關水平更高的水平生產(chǎn)。
基因治療施用在適當之處，基因治療載體可用本領域公知的途徑根據(jù)各自的施用途徑配制為固體、半固體、液體或氣體形式的制劑。本領域公知的方法可用于預防組合物的釋放和吸收，直到其到達目標器官或者保證組合物的定時釋放。可采用藥物可接受的形式，該形式不使本發(fā)明的組合物無效。在藥物劑量形式中，該組合物可單獨使用或與其他藥物活性化合物適當?shù)芈?lián)合及組合使用。因此，本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)由各種途徑遞送并到達動物身體的各個位點以實現(xiàn)特殊的作用(參見如Rosenfeld等人(1991)；Rosenfeld等人(1991a)；Jaffe等人，1992)。本領域的技術人員將認識到盡管有多于一種的途徑可進行施用，但特定途徑可比其他的途徑提供更直接和更有效的反應。局部或全身遞送可通過包含將制劑應用或滴入體腔、吸入或吹入氣溶膠施用，或者通過包含肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜的、皮下、皮內(nèi)的腸胃外引入以及局部施用而實現(xiàn)。本領域的技術人員認識到不同的遞送方法可用于將載體施用于細胞。例子包括(1)利用物理手段的方法，如電穿孔(電學)、基因槍(物理的力)或應用大量的液體(壓力)；和(2)其中該載體與其他實體如脂質(zhì)體或轉運蛋白分子復合的方法。因此，本發(fā)明提供將治療基因轉移入宿主的方法，該方法包含用任何前述的施用途徑或本領域技術人員公知且適合于特殊應用的其他施用途徑，施用本發(fā)明的載體，優(yōu)選作為組合物的部分。根據(jù)本發(fā)明載體向宿主的有效基因轉移可根據(jù)治療效果來監(jiān)控(如與被治療的特殊疾病相關的一些癥狀的減輕)，或者進一步地通過轉移的基因或該基因在宿主中表達的證據(jù)來監(jiān)控(如用聚合酶鏈反應與測序、Northern或Southern雜交或者轉錄測定以在宿主細胞中探測核酸，或者用免疫印跡分析、抗體介導的探測、mRNA或蛋白質(zhì)半衰期研究或特別指出的測定以探測由轉移的核酸編碼的或由于這樣的轉移而引起的水平和功能受影響的蛋白質(zhì)或多肽)。此處描述的這些方法并不全備，且適合于特定應用的進一步的方法對一般的技術人員而言顯而易見。此外，該組合物的有效量可進一步通過與已知可發(fā)揮所需作用的組合物類比而估計。此外，實際的劑量和時間表可依賴于該組合物否是與其他的藥物組合物組合施用，或依賴于藥代動力學、藥物積累(disposition)和代謝的個體間差異而有變化。類似地，該量可依賴于所使用的特殊細胞系(如基于存在于細胞表面的載體受體的數(shù)目，或所采用的進行基因轉移以在該細胞系中進行復制的特殊載體的能力)而在體外應用中有所變化。此外，每細胞要添加的載體的量很可能根據(jù)插入到載體中的治療基因的長度和穩(wěn)定性以及該序列的特性而有變化，該量是一個需要根據(jù)實驗進行確定的特殊的參數(shù)，且可以由于本發(fā)明的方法所非固有的因素而改變(如與合成有關的成本)。本領域的技術人員易于根據(jù)特殊情況的迫切需要而做任何必需的調(diào)整。下面的實施例是以實例的方式提供，且不意謂著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1GHRH超活性類似物增加GH促分泌素的活性和穩(wěn)定性GHRH在人(Frohman等人，1984)和豬兩者的循環(huán)系統(tǒng)中具有相對短的約12分鐘的半衰期。通過采用延長其生物學半衰期和/或改善其GH促分泌素活性的GHRH類似物，實現(xiàn)增強GH分泌。GHRH突變型通過定點突變來生成。將Gly15替代為Ala15以增加α-螺旋構象和兩親性結構以減少被胰蛋白酶樣酶的切割(Su等人，1991)。具有Ala15替代的GHRH類似物顯示對GHRH受體的4-5倍高的親和力(Campbell等人，1991)。為了用具有自由COOH-末端的分子的稍微更穩(wěn)定的形式中減少由于Met的氧化而導致的生物學活性的喪失(Kubiak等人，1989)，進行了Met27和Ser28到Leu27和Ash28的替代。因而，形成了表示為GHRH-15/27/28的三氨基酸替代突變型。二肽基肽酶IV是主要的血清GHRH降解酶(Walter等人，1980；Martin等人，1993)。更差的二肽酶底物通過采用GHRH15/27/28并然后將Ile2替代為Ala2(GHRH-TI)或Val2(GHRH-TV)，或通過將Tyr1和Ala2轉變?yōu)镠is1和Val2[GHRH-HV(圖1A)；H1V2A15L27N28]而產(chǎn)生。
實施例2DNA構建體在一個特定的實施方案中，在本發(fā)明中使用SEQ IDNO9(pSPc5-12-HV-GHRH)的質(zhì)粒。在另一個特定的實施方案中，使用了一個質(zhì)粒載體，其中該質(zhì)粒包含pVC0289主鏈(SEQ ID NO10)、啟動子如SEQ ID NO6、GHRH cDNA如豬HV-GHRH(突變型HV-GHRH cDNA)和3’UTR如來自人GH(SEQ ID NO7)的。為了檢驗突變的豬GHRH cDNA序列的生物學效能，將質(zhì)粒載體重組為其能夠通過新描述的合成的肌肉啟動子來指導骨骼肌特異性基因表達，該啟動子為SPc5-12，它含有來自骨骼α-肌動蛋白的近側血清反應元件(SRE)、多重MEF-2位點、多重MEF-1位點和TEF-1結合位點(Li等人，1999)。在人GH cDNA 3’非翻譯區(qū)之后，將228-bp的豬GHRH片段通過本領域公知的方法結合入生肌GHRH表達載體中，其中的豬GHRH片段編碼31個氨基酸的信號肽和完整的成熟肽豬GHRH(Tyr1-Gly40)和或GHRH突變型。質(zhì)粒pSPc5-12在pSK-GHRH主鏈的Sac I/BamH I位點(Draghia-Akli等人，1997)包含SPc5-12合成啟動子的360bp的Sac I/BamH I片段(Li等人，1999)。野生型和突變的豬GHRH cDNAs通過用試劑盒改變的位點II體外突變系統(tǒng)(Altered Sites II in vitro MutagenesisSystem)(Promega；Madison，WI)對人GHRH cDNA進行定點突變而獲得。將人GHRH cDNA作為BamH I-Hind III片段亞克隆入pALTERPromega載體的相應位點上，且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行突變。豬野生型cDNA是從人cDNA通過用引物SEQ ID NO25’-AGGCAGCAGGGAGAGAGGAACCAAGAGCAAGGAGCATAATGACTGC-AG-3’來改變?nèi)税被?4和38而獲得的。豬HV突變是用引物SEQ ID NO35’-ACCCTCAGGATGCGGCGGCACGTAGATGCCATCTTCACCAAC-3’來制得。豬15Ala突變是用引物SEQ ID NO45’-CGGAAGGTGCTGGCCCAGCTGTCCGCC-3’來制得。豬27Leu28Asn突變是用引物SEQ ID NO55’-CTGCTCCAGGACATCCTGAACAGGCAGCAGGGAGAG-3’來制得。在突變后，將結果所得的克隆進行測序以證實其正確性，并隨后通過本領域技術人員公知的方法亞克隆入在本實施例中描述的pSK-GHRH的BamH I/HindIII位點。
實施例3細胞培養(yǎng)和轉染實驗同樣成功地在豬垂體前葉培養(yǎng)物和原代雞成肌細胞培養(yǎng)物中進行。然而，圖示說明了豬垂體前葉培養(yǎng)物生成的數(shù)據(jù)。原代雞成肌細胞培養(yǎng)物按如下所述獲得。將雞胚胎組織收獲，解剖而去除皮膚和軟骨并機械地解離。使細胞懸浮液通過一種粗棉布和擦鏡紙，然后以1×108到2×108/100mm塑料培養(yǎng)皿的密度進行平板培養(yǎng)。將仍然存在于懸浮液的細胞群體以2×106到3×106個細胞/膠原蛋白覆蓋的100mm塑料培養(yǎng)皿的密度進行平板培養(yǎng)并在5％的CO2環(huán)境中于37℃進行溫育。然后在轉染前使細胞以1.5×106/100mm平板的密度在最小基本培養(yǎng)基(Minimal Essential Medium)(MEM)中平板培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中補充了10％的熱失活的馬血清(Heat Inactivated Horse Serum)(HIHS)、5％的雞胚胎提取物(CEE)(Gibco BRL；Grand Island，NY)和慶大霉素。進一步詳情參見Draghia-Akli等人，1997和Bergsma等人，1986。豬垂體前葉培養(yǎng)物基本如所述獲得(Tanner等人，1990)。簡要地，垂體組織酶條件下解離，并在塑料皿上平板培養(yǎng)足夠的時間以允許附著。然后在實驗前將該細胞漂洗并暴露于溫育培養(yǎng)基中。詳情參見Tanner等人(1990)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用脂質(zhì)轉染胺(lipofectamine)以每100mm平板4μg質(zhì)粒來轉染細胞。轉染后，將培養(yǎng)基變?yōu)楹?％的HIHS和2％的CEE的MEM以允許細胞分化。在分化后72小時收獲培養(yǎng)基和細胞。轉染的效率通過對照平板的β-半乳糖甘酶組織化學估計為10％。在收獲的前一天，將細胞在漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)中洗滌兩次且將培養(yǎng)基變?yōu)镸EM、0.1％的牛血清白蛋白。條件培養(yǎng)基通過添加0.25體積的1％三氟乙酸和1mM苯甲基磺酰氟，于-80℃冷凍，凍干，在C-18 Sep-Columns(Peninsulalaboratories，Belmont，CA)上純化，再凍干并用于放射性免疫測定或重懸于原代豬垂體前葉培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中。
實施例4
GHRH超活性類似物增加GH促分泌素活性和穩(wěn)定性成骨骼肌細胞(skeletal myoblast)如實施例3那樣用各個構建體進行轉染，且對從條件培養(yǎng)的培養(yǎng)基細胞中純化的GHRH部分在豬垂體前葉細胞培養(yǎng)物中測定生長激素釋放。如圖1B所示，在24小時后收集并用豬特異性GH-放射性免疫測定定量的培養(yǎng)基顯示對于修飾的GHRH種類(GH15/27/28；GHRH-TI；GHRH-TV)比野生型豬GHRH在GH分泌的適當增加總計為20％到50％。4個突變型中只有1個即GHRH-HV在促分泌素活性中具有真正的增加，其中豬GH水平從基線值200ng/ml增加到1600ng/ml(圖1B)。
實施例5HV-GHRH分子的血漿溫育從對照豬中收集集中的豬血漿貯存于-80℃?；瘜W合成的HV-GHRH通過肽合成制備。將豬血漿解凍并離心，置于37℃以允許平衡。將GHRH突變型溶解于血漿樣品中達到100μg/ml的終濃度。緊接在添加GHRH突變型之后，和15、30、60、120和240分鐘之后，取1ml的血漿并用1ml的1M TFA進行酸化。酸化的血漿在C18親和SEP-Pak柱上純化，凍干并用Walters 600多系統(tǒng)遞送系統(tǒng)、Walters智能樣品處理器、717型和Walters光譜監(jiān)控器(spectromonitor)490(Walters Associates，MilliporeCorp.，Milford，MA)通過HPLC進行分析。該探測在214nm進行。在這些時間點降解的肽的百分數(shù)通過整合的峰測量法(integratedpeak measurements)測量。然后野生型GHRH和其類似物GHRH-HV的穩(wěn)定性在豬血漿中通過GHRH肽的溫育，并隨后固相提取和HPLC分析來檢驗。如圖1C所示，95％的野生型GHRH(1-44)NH2在血漿中溫育60分鐘內(nèi)降解。相反，GHRH-HV在豬血漿中的溫育顯示在溫育4到6小時期間至少75％的多肽受到了對酶切割的防護。因而，在相同的條件下，GHRH-HV的主要部分仍然完整，而野生型GHRH則完全降解了，顯示GHRH-HV對血漿蛋白酶穩(wěn)定性的相當高的增加(圖1C)。
實施例6動物研究在GHRH研究中使用了3組，每組5個3-4周齡雜交母豬(barrow)(Yorkshire，Landrace，Hampshire和Duroc)。該動物可無限制地接近水和6％的其體重膳食(24％的蛋白質(zhì)豬食，Producers Cooperative Association，Bryan，TX)而單獨圈養(yǎng)。每隔一天于上午830將動物稱重，并隨后加入飼料。該動物根據(jù)NIH指南、USDA和Animal Welfare Act指南來維持。
實施例7給豬肌內(nèi)注射質(zhì)粒DNA將無內(nèi)毒素的質(zhì)粒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)制劑pSPc5-12-HV-GHRH、pSPc5-12-wt-GHRH和pSPc5-12bgal在PBS(pH7)中稀釋到1mg/ml。使動物相等地分配一次治療。用異氟烷(isoflurane)(濃度2-6％用于誘導而1-3％用于維持)麻醉豬。通過手術程序?qū)㈩i靜脈導管植入動物中以在注射后3、7、14、21、28、45、和65日取血。當麻醉時，將10mg質(zhì)粒直接注射入豬的半腱肌肌肉中。注射后2分鐘，將注射的肌肉置于一套卡鉗之間并用最適的條件為200V/cm以60毫秒的4個脈沖進行電穿孔(Aihara等人，1998)。在注射后65日，處死動物并將內(nèi)部器官和注射的肌肉收集，稱重，于液氮中冷凍并貯存于-80℃。將畜體稱重并用中子活化法進行分析。測量了背部的脂肪。
實施例8pSP-HV-GHRH的肌肉注射在2個月內(nèi)增加豬GHRH、GH和IGF-I的血漿水平有最適蛋白酶抗性的pSP-HV-GHRH載體促進GHRH長時間表達和刺激GH和IGF-I分泌水平的能力被確定。pSP-HV-GHRH以及作為野生型對照的野生型構建體pSP-wt-GHRH和作為安慰劑對照的合成的生肌啟動子大腸桿菌β-半乳糖甘酶表達載體，pSP-βgal的示意圖在圖2A中表示。將3周齡閹割的公豬麻醉，并將頸靜脈導管插入以在不使動物不安的情況下收集血樣。質(zhì)粒表達載體DNA(10mg的pSP-HV-GHRH、pSP-wt-GHRH或pSP-βgal的DNA)直接注射入半腱肌肌肉，然后對肌肉進行電穿孔(參見實施例7)。
實施例9豬GHRH、GH和IGF-I測量豬GHRH用異源的人測定系統(tǒng)(PeninsulaLaboratories，Belmont，CA)進行測量。該測定的靈敏度為1pg/管。血漿中的豬GHRH用特定的雙抗體程序RIA(The PennsylvaniaState University)進行測量。該測定的靈敏度為4ng/管。豬IGF-I用異源的人測定(Diagnostic System Lab.，Webster，TX)進行測量。數(shù)據(jù)用Microsoft Excel統(tǒng)計分析包進行分析。在圖中顯示的值為平均數(shù)±s.e.m。特定的p值通過用Studentst檢驗進行比較而獲得。設置p＜0.05作為統(tǒng)計顯著的水平。在半腱肌肌肉內(nèi)注射了pSP-HV-GHRH的豬體內(nèi)，GHRH水平在注射后7日增加(圖2B)，且在14日為對照水平的150％(652.4±77pg/ml對419.6±13pg/ml)。pSP-HV-GHRH表達活性在60日達到了穩(wěn)定水平，該水平約比注射了安慰劑的對照值水平高2~3倍。由pSP-HV-GHRH注射的豬分泌的血清GHRH的絕對量比注射了安慰劑的對照值(1426.49±10.47ng對266.84±25.45ng)高3倍(圖2C)，其中該絕對量對在0日和60日之間增加的體重進行了校正(血液體積占總體重的8％)。野生型pSP-GHRH注射的動物，注射在半腱肌肌肉內(nèi)，僅在注射后45日開始顯示GHRH水平的適當增加，但在注射后60日有2倍的增加(779.36ng)，其水平足夠引起生物學效應。年輕動物具有隨年齡逐漸降低的高水平GH。對最初注射后7和14天于24小時的期間內(nèi)每隔15分鐘所取的血樣進行了pGH水平的測定，并將該水平外推到pGH含量的總變化。pSP-HV-GHRH注射的豬(圖2D)在注射后7日(δ變差HV＝+1.52，wt＝-0.73對對照＝-3.2ng/ml)和注射后14日(6變差HV＝+1.09，wt＝-4.42對對照＝-6.88ng/ml)顯示其GH含量明顯的增加。增加的全身GH水平的另一個指示為IGF-I水平的增加。豬血清IGF-I水平在pSP-HV-GHRH注射的豬中在注射后約3日開始增加(圖2E)。在21日，這些動物的血清IGF-I水平平均增加約3倍，該水平維持到60日(p＜0.03)。作為比較地，用野生型pSP-GHRH表達載體注射的豬僅在其循環(huán)IGF-I水平中具有40％的增加(p＝0.39)，如圖2E所示。
實施例10生肌GHRH表達載體增強豬的生長在肌內(nèi)注射生肌pSP-GHRH表達載體后分泌入全身循環(huán)的豬GH將閹割的年輕公豬的生長增加了65天。身體組成測量在注射后30和65日于體內(nèi)進行(光密度測定法，K40)或者在死后進行(器官、畜體、身體脂肪，直接解剖并隨后進行中子活化室)。野生型pSP-GHRH注射的動物平均比安慰劑對照重21.5％(37.125kg對29.375kg)，而pSP-HV-GHRH注射的豬增重37.8％(41.775kg；p＝0.014)，如圖3A中所示。當與對照比較時，用GHRH構建體注射的豬的飼料轉變效率也改進了20％(每公斤重量增加對于在pSP-HV-GHRH為0.267kg食物/天，在pSP-wt-GHRH中為0.274kg，對在pSP-βgal注射的豬中為0.334kg)(圖3B)。通過光密度測定法，K40鉀室和中子活化室進行的身體組成研究顯示在GHRH注射的動物中所有身體成分成比例的增加，而沒有臟器腫大(organomegaly)、身體脂肪相關比例和有關的病理學的跡象。安慰劑注射的對照豬和pSP-HV-GHRH注射的豬在45天后的照片如圖3C所示。在表I中所示的pSP-HV-GHRH注射的豬的代謝概況意味著pSP-GHRH和pSP-HV-GHRH各自的血清尿素水平的顯著降低(對照中為9±0.9mg/dl，注射的豬中為8.3±1mg/dl和6.875±0.5mg/dl)(p＝0.006)，顯示降低的氨基酸代謝。血清葡萄糖水平在對照和質(zhì)粒GHRH注射的豬之間是相似的(對照豬中為99.2±4.8mg/dl，pSP-HV-GHRH注射的豬中為104.8±6.9mg/dl，且在野生型pSP-GHRH注射的豬中為97.5±8mg/dl)(p＜0.27)。未發(fā)現(xiàn)其他的代謝變化。
表IGHRH注射的豬和對照的代謝概況(值為mg/ml)。
葡萄糖 尿素肌酸酐 總蛋白質(zhì)對照 99.2±4.8 9±0.9 0.82±0.06 4.6±0.22pSP-wt-GHRH 97.5±8 8.3±1 0.83±0.056 4.76±0.35pSP-HV-GHRH 104.8±6.9 6.875±0.5 0.78±0.04 4.88±0.23實施例11不同水平pSP-HV-GHRH的實驗為了進一步研究pSP-HV-GHRH對小豬生長的作用，將2個小豬的組在出生后10日用新的注射型六針陣列電極(six needle-array electrode)進行pSP-HV-GHRH的注射(3mg、1mg、100微克)。這些電極預先進行了檢驗，且比本領域公知的卡鉗電極效率高10倍。因此，針電極優(yōu)選用于本發(fā)明的方法中。如圖4所示，用100微克質(zhì)粒注射的組顯示了最好的生長曲線，在50日齡后與對照相比具有顯著的統(tǒng)計學差異。在用3mg注射的組中的一個動物發(fā)展了抗體并顯示了顯著降低的生長模式。同樣地，將2個小豬的組在出生后10日用指定的pSP-HV-GHRH劑量進行了注射。IGF-I值在注射后10日開始增加，且在注射后35日用100微克質(zhì)粒注射的豬的IGF-I平均比對照高10.62倍。用1mg注射的豬比對照平均高7.94倍，且用3mg注射的豬比對照值平均高1.16倍。因而，在一個特定的實施方案中，注射了較低劑量的pSP-HV-GHRH。在一個特定的實施方案中使用了約100微克(.1毫克)的質(zhì)粒。在另一個特定的實施方案中注射了約200-300微克。在另外一個實施方案中施用了50-100微克。
實施例12pSP-HV-GHRH的年齡比較為了使用于pSP-HV-GHRH注射的小豬的年齡最優(yōu)化，將2個小豬的組在出生后開始用2mg的pSP-HV-GHRH進行注射。如圖6所示，在出生后14日注射的組顯示了最好的生長曲線，該曲線在每一個時間點上都與對照比較具有顯著的統(tǒng)計學差異。在21日注射的組中的一個動物發(fā)展了抗體并顯示了顯著降低的生長模式。如果處理太早可能有胰島素抗性(即＜約10-14日齡)。在一個特定的實施方案中，該治療在天然GH和IGF-I水平為最低時最有效(約為生活10-14日)，且當GHRH水平為正常高度時可能達不到設想的目標。在一個特定的實施方案中，假設免疫監(jiān)視系統(tǒng)在懷孕期間減少時，與未懷孕的動物相比，則在懷孕的動物中對于修飾的GHRH而生產(chǎn)的抗體數(shù)目的降低。
實施例13特定的實施方案總之，用于注射的最適時間點為出生后14日(在注射后40日平均比對照重8磅(p＜0.04))。用于注射的優(yōu)選劑量為2-5ml體積中100微克質(zhì)粒(在注射后40日平均比對照重6磅(p＜0.02))。在母豬1(時間進程)和母豬3(劑量曲線)的后代中激素和生物化學常數(shù)正常且與重量增加相關(IGF-I、IGF-BP3、胰島素、尿素、葡萄糖、總蛋白質(zhì)、肌酸酐)，而無有害的副作用。前述實驗的身體組成研究顯示HV-GHRH確定了所有身體部分的一致增加(身體組成與對照相似但更大)，而wt-GHRH確定了瘦體重的增加和脂肪的降低。假設生長激素的增加可導致體溫的增加，在一個優(yōu)選實施方案中，母豬在溫度為約62°F約80°F的條件下注射的。
實施例14在第一窩仔之前將Ghrh生肌載體注射給懷孕的母豬為了測定GHRH生肌載體的生長作用，將懷孕的母豬在妊娠的最后3個月用10mg含有GHRH的載體進行注射。在本特定的實施例中，將母豬(～800磅)用10mg的pSP-HV-GHRH載體在其第一次懷孕的妊娠的90日進行注射。遞送方法可為任何本領域中公知的任意一種。在一個特定的實施方案中，除了使用用于電穿孔的卡鉗電極之外，該質(zhì)粒遞送如實施例7(圖7)。該電極有6個針22g，這些針長度為2cm且位于直徑1cm的圓形塑料支持體上。表2說明了在妊娠90日通過電穿孔用pSP-HV-GHRH(p2)進行注射的母豬生產(chǎn)的小豬在時間上的重量(kg)。表3說明了在相同日期未注射的母豬(p3)生產(chǎn)的對照動物的重量(kg)。表4表示pSP-HV-GHRH注射的母豬和未注射的母豬的小豬的身體組成數(shù)據(jù)(脂肪％/體重(BW)/d平均數(shù))。該表代表脂肪對體重的相對比例并顯示注射的母豬的小豬每單位重量的脂肪減少了18.5％。在獲得身體組成數(shù)據(jù)之前將豬p1/2和p2/6處死。小豬的生物化學數(shù)據(jù)與該母豬的第二次懷孕所說明的相似(參見實施例15)。P值在所有時間點上都非常顯著。這些表明顯地顯示在其妊娠期用pSP-HV-GHRH進行注射的母豬生產(chǎn)的小豬顯著地比對照母豬生產(chǎn)的小豬更重。在不限制本發(fā)明的范圍和不給本發(fā)明的界限和范圍加以約束的情況下，本申請猜測注射入肌肉細胞的GHRH被分泌并通過胎盤。作為GHRH對垂體的過度生長和增生作用的結果，釋放GH的垂體細胞的數(shù)目有增加。
實施例15注射的母豬的第二窩仔表5說明了母豬的第二窩仔的重量數(shù)據(jù)，該母豬在其第一次懷孕時用pSP-HV-GHRH進行注射。
表5小豬身體組成隨時間的變化4月27日 5月1日 5/4/2000 5/8/2000 5/11/2000 5/16/2000 5/18/200 5/23/2000 7/13/2000母豬2 第1天第5天 第7天 第11天第14天 第19天 第21天第26天 第77天豬1 2.0973.264.22 5.627 6.505 8.49.1 10.75 36.32豬2 2.2643.512 4.46 5.882 6.799 8.79.4 11.25 37.228豬3 1.7582.783.68 4.817 5.77.58.25 10.25 35.866豬4 1.8952.843 3.62 4.733 5.714 7.17.6 8.932.234豬5 2.3973.458 4.24 5.704 6.692 8.85 9.6 11.35 39.498豬7 2.4573.599 4.68 6.132 7.05 8.99.65 11.55 37.682豬8 1.9072.882 3.58 4.767 5.593 6.95 7.55 9.65 36.32豬9 2.3813.524.23 5.635 6.45 8.25 8.9 10.65 34.504豬10 2.4733.655 4.57 5.935 6.87 8.69.25 10.7 39.952平均 2.1813.2787 4.14222 5.47022 6.374788.138898.81111 10.56111 36.62267STDEV 0.2733 0.3509 0.41817 0.54711 0.559860.757780.81616 0.853222.3808SE0.1933 0.2481 0.29569 0.38686 0.395880.535830.57711 0.603321.68348增長 01.0977 1.96122 3.28922 4.193785.957896.63011 8.3801134.44167總計(kg)19.629 29.509 37.28 49.23257.373 73.25 79.3 95.05 329.604磅 43.183 64.919 82.016108.3104 126.2206 161.15 174.46209.11 725.1288平均日增長 0.322310.44729在第二窩仔的妊娠期間或之后沒有進行GHRH施用。自出生時第二窩仔就較大(在相似的環(huán)境下飼養(yǎng)的其他母豬的小豬在出生時的平均重量為1.71kg；而這些小豬在出生時平均為2.181kg)。在21日，所有特征為該品種和平均水平的窩仔的小豬的重量總計為～130磅(～59kg)，而以前用pSP-HV-GHRH注射的母豬的小豬總計為174磅(～79kg)。該優(yōu)勢得以維持，且在出生后77日該重量與本領域所公知的該品種中最佳情況相比平均大11-15磅(5.5-6kg)/豬。在出生后169日，注射的動物平均比對照大22磅(10kg)，p＜0.0007。母豬僅在注射/電穿孔程序中進行麻醉，且對它們使用了2.2mg/kg劑量的TELAZOL(環(huán)噻乙胺氫氧化物和唑氟氮氫氧化物的混合物)。對于小豬，在估計身體組成時使用了氯胺酮/甲苯噻嗪HCl的組合以進行麻醉，那時小豬必須在二重X-射線光密度測定儀(Dual X-ray Densitometry)(DEXA)機器上靜仰臥約15分鐘。具體地，使用氯胺酮20mg/kg+甲苯噻嗪1mg/kg(正規(guī)的甲苯噻嗪劑量為2mg/kg)。在另一個特定的實施方案中，施用本領域公知的其他麻醉劑，如氯胺酮15mg/kg+乙酰丙嗪0.4mg/kg。在另外一個特定的實施方案中無需對小豬進行麻醉即可采血、注射等。假設豬和一些其他的動物通常對不同類型的麻醉劑敏感且可通過其溫度調(diào)節(jié)過程的主要改變而在麻醉后死亡(低體溫或體溫過高，后者更經(jīng)常)，有時則施用阿托品。阿托品是抗膽堿能藥物，它通常在麻醉前使用并認為它可促進分泌物的干燥和減少必需的麻醉劑的量、在該程序中防止心率紊亂并在麻醉恢復中增加動物的舒適程度，也降低了不利的異常熱發(fā)作的頻率。在特定的實施方案中用0.05mg/kg subq(皮下的)阿托品進行預處理。其他本領域公知的類似藥物可用作阿托品的替換物。對小豬進行了多重的生物化學測量。表6到12提供了涉及這些測量的數(shù)據(jù)。胰島素實驗(表6)在5-25-00進行測量。所有前面檢驗的對照組的平均數(shù)為6.8μU/ml，且實驗小豬的平均數(shù)為4.785μU/ml，無統(tǒng)計學顯著性(p＝0.07)。
表6小豬的胰島素濃度第25天豬14.3827豬24.131豬34.8176豬45.7899豬54.4267豬74.3076豬84.1648豬96.0921豬10 4.9527平均 4.78501STDEV 0.71397SE 0.23799IGF-I測定在5-25-00進行(參見表7)。實驗組的平均數(shù)為145.509ng/ml，且所有前面檢驗的對照組的平均數(shù)為53.08ng/ml。因此，p值非常顯著(p＜0.0001)。假設GH刺激了IGF-I的生產(chǎn)和釋放，則該IGF-I測定GHRH水平增加的指示且在本領域中通常這樣使用。
表7小豬的IGF-I濃度第1天 第10天 第18天 第25天豬1 290.46 118.63 185.01 356.02豬2 265.7 115.62 117.99 172.28豬3 109.27 77.389 200.75 109.99豬4 94.689 36.746 93.795 65.113豬5 155.98 95.946 138.24 179.3豬7 171.41 19.463 213.29 226.43豬8 178.3 101.55 98.478 165.88豬9 104.86 78.872 84.777.214豬10 262.4 131.36 206.23 138.99平均 181.452186.17511148.7203165.6908STDEV74.9141537.6133752.6717587.96496SE 24.9713812.5377917.5572529.32165對于表8，IGF-BP3(IGF-結合蛋白質(zhì)3)免疫放射分析(IRMA)在5-25-00檢驗。IRMA采用了二位點的免疫放射分析(參見Miles LEM，Lipschitz DA，Bieber CP和Cook JD通過二位點的免疫放射分析對血清鐵蛋白的測量。Analyt Biochem 61209-224，1974)IRMA是非競爭性測定，在其中要測量的分析物是在兩個抗體間“被夾合的(sandwiched)”。第一個抗體固定于試管的內(nèi)壁。另一個抗體進行了放射性標記以進行探測。存在于未知的、標準的和對照的樣品中的分析物由兩種抗體結合以形成“三明治(sandwich)”復合物。未結合的材料通過對試管的傾析和洗滌而除去。表8中的測量包含校正因子x50。表8說明了實驗組的平均數(shù)為238.88，而所有前面檢驗的對照組的平均數(shù)為205.44ng/ml。有p＜0.048的統(tǒng)計學顯著性。
表8小豬的IGF-BP3濃度第1天第10天 第18天 第25天 第1天 第10天第18天第25天豬1 7.9841 3.9177.1657 3.5957 399.205 195.85358.285 179.785豬2 7.5463 3.4327 3.3382 4.4706 377.315 171.635 166.91223.53豬3 3.4187 4.9039 6.7961 6.3021 170.935 245.195 339.805 315.105豬4 5.6354 4.2184 3.8551 1.9101 281.77210.92192.755 95.505豬5 4.2824.5592 5.2783 3.8224 214.1 227.96263.915 191.12豬7 3.7328 4.4454 2.9426 4.8232 186.64222.27147.13241.16豬8 5.4265 3.3285 4.1714 7.1258 271.325 166.425 208.57356.29豬9 3.7912 5.6354 3.9117 6.7643 189.56281.77195.585 338.215豬104.7668 5.6099 5.24 3.8474 238.34280.495 262 192.37平均5.17598 4.45004 4.74434 4.74018 258.7989 222.5022 237.2172 237.0089STDEV 1.6520.83658 1.48489 1.70536 82.6 41.8289 74.24472 85.2679SE 0.55067 0.27886 0.49496 0.56845 27.53333 13.94297 24.74824 28.42263表9說明了總蛋白質(zhì)的濃度(g/dl)。實驗組的平均數(shù)為5.3g/dl，而所有前面檢驗的對照組的平均數(shù)為4.02g/dl。有p＜0.0001的非常高的統(tǒng)計學顯著性。
表9小豬的總蛋白質(zhì)濃度第1天第10天 第18天 第25天豬15.7 5.9G.H. 5.5豬25.3 5.6 5.5 5豬35.2 5.3 5.3 5.4豬45.3 5.5 4.9 5.4豬55.8 5.3 55.4豬75.6 5.4 5.3 5.2豬84.5 5G.H. 4豬95.3 5.1 5.3 5.2豬10 6.3 55.2 5.5平均 5.44444 5.34444 5.21429 5.17778STDEV 0.49526 0.29627 0.20354 0.47111SE 0.16509 0.09876 0.06795 0.15704表10說明了肌酸酐的濃度(mg/dl)。實驗組的平均數(shù)為0.936mg/dl，而所有前面檢驗的對照組的平均數(shù)為0.982mg/dl。無統(tǒng)計學顯著性(p＜0.34)，這是正常腎功能的指示。
表10小豬的肌酸酐濃度第1天第10天 第18天 第25天豬10.75 0.96G.H. 1.14豬20.73 1.03 0.98 1.46豬30.69 0.92 0.95 1.1豬40.65 0.94 1.18 1.18豬50.64 0.8 0.91 0.92豬70.72 0.93 1.02 1.12豬80.68 0.9 0.83 1.2豬90.68 0.87 11.07豬10 0.74 1.02 1.02 1.03平均 0.69778 0.93 0.98625 1.13556STDEV 0.0393 0.07124 0.10113 0.14783SE 0.0131 0.02375 0.03371 0.04928表11說明了BUN(血液尿素水平)(mg/dl)。實驗組的平均數(shù)為3.88mg/dl，而所有前面檢驗的對照組的平均數(shù)為8.119mg/dl。有p＜0.0012的顯著的統(tǒng)計學顯著性。
表11小豬的BUN濃度第1天 第10天第18天 第25天豬1 4 3 5 4豬2 4 3 3 6豬3 6 6 5 7豬4 5 3 4 5豬5 3 2 3 3豬7 3 3 3 3豬8 2 3 5 7豬9 3 3 4 4豬103 3 3 4平均3.666673.22222 3.888894.77778STDEV 1.224741.09291 0.927961.56347SE 0.408250.36430.309320.52116表12表示葡萄糖的濃度(mg/dl)。實驗組的平均數(shù)為123.23mg/dl，而所有前面檢驗的對照組的平均數(shù)為122.8mg/dl。無統(tǒng)計學顯著性(p＜0.67)，術語G.H.代表總血細胞溶解；在這些實施例中對生物化學常數(shù)的確定是不可能的。
表12小豬的葡萄糖濃度第1天 第10天 第18天 第25天豬1117115G.H. 115豬2112137130119豬3133138143115豬412512713290豬5115123133120豬7114120123115豬8126123G.H. 116豬9118129124119豬10 142134136112平均 122.4444 127.3333 131.5714 113.4444STDEV 9.988887.889876.900669.15302SE 3.329632.629962.300223.05101如這些表所說明的，IGF、IGF-BP3增加了(作為對GH軸刺激的結果)，尿素和總蛋白質(zhì)分別降低和增加(這是改善的蛋白質(zhì)代謝的信號)，然而胰島素和葡萄糖則維持正常。胰島素和葡萄糖的正常水平是本發(fā)明的一個優(yōu)點，因為經(jīng)典的GH治療產(chǎn)生了具有高血糖的“糖尿病”樣狀況。在本實驗中正常的肌酸酐是用于測量腎功能的參數(shù)，在動物中有時在不適當?shù)拇x條件下腎功能被削弱。因而，在一個特定的實施方案中，由在其中最初用pSP-HV-GHRH注射的母豬懷孕之后的多次懷孕中生產(chǎn)的小豬顯示了比正常水平或未用編碼任何形式的GHRH的DNA注射的母豬所生產(chǎn)的動物增加的生長。豬的懷孕持續(xù)約114天，且容許的哺乳時間允許不多于2次懷孕/年。在一個特定的實施方案中，將編碼GHRH的核酸序列施用于雌性或母親與GH生產(chǎn)細胞約25-50％的增加有關。在另一個實施方案中，非懷孕的母豬在懷孕前進行注射。在另一個實施方案中，代替本發(fā)明pSP-HV-GHRH載體的施用，可使用本領域所公知的其他生長激素釋放激素類似物。例如，使用野生型的GHRH。該實驗以類似于此處提供的教導來進行。在另一個實施方案中，來自小豬的垂體是在處死小豬時收集的并測定垂體含量的變化。即，在小豬達到市場重量(～100kg)時將其處死并收集垂體。該測定包括不同類型激素分泌細胞的垂體相對含量(分泌生長激素、催乳素、促卵泡激素(FSH)等的細胞的相對比例)。
實施例16額外的實驗在一個特定的實施方案中，將更多的母豬如約20只用與實施例14和15中提供的相同或相似的處理來進行注射。對多種的質(zhì)粒量進行檢驗，如從100微克到10毫克，且每一處理使用5只豬的組。將死者與未注射的母豬的后代進行比較。在一個特定的實施方案中，這些實驗在農(nóng)場中進行，因此該數(shù)據(jù)可以文獻記錄標準化。
實施例17最優(yōu)化實驗為了在第一次懷孕時確定最適的注射次數(shù)，使用了懷孕的大鼠。大鼠的妊娠持續(xù)約21天。懷孕的大鼠在妊娠的5日和18日開始進行注射，且其后代在出生后不同的時間點進行檢驗。特定的實驗包括重量、身體組成和不同類型激素分泌細胞的垂體相對含量(分泌生長激素、催乳素、FSH等的細胞的相對比例)。
實施例18增加乳汁生產(chǎn)的方法在本發(fā)明的一個實施方案中，有一種增加乳汁生產(chǎn)的方法(也稱為哺乳)，該方法包括在如下條件下將有效量的載體引入動物細胞的步驟，其中編碼生長激素釋放激素的核苷酸序列得以表達且其中該載體包含啟動子、編碼該生長激素釋放激素的核苷酸序列和可操作地連接以使得該核苷酸序列進行功能性表達的3’非翻譯區(qū)，且其中該載體的引入和表達導致動物中乳汁生產(chǎn)的增加。在一個特定的實施方案中，該動物為人、母牛、豬、山羊或綿羊。通過在此處描述的方法將包含GHRH的載體引入到動物中增加動物乳汁的生產(chǎn)。在一個特定的實施方案中，該動物是雌性或母親或懷孕的雌性。在進一步特定的實施方案中，該雌性或母親的后代由于雌性或母親的乳汁生產(chǎn)的增加而在約最初的2個星期內(nèi)生長較快。如在此處所討論的，乳汁生產(chǎn)的增加是在將編碼GHRH的核酸一次注射動物時發(fā)生。技術人員知道如何測量乳汁生產(chǎn)的增加，如在美國專利No.5,061,690；5,134,120和5,292,721或者在Peel等人，J.Nutr.，1981，1111662中的方法。乳汁樣品是在產(chǎn)小豬(初乳)時和哺乳的13日和20日人工表達的。施用了40IU催產(chǎn)素的肌內(nèi)注射(除初乳收集之外)且盡可能快地對每只母豬的兩個腺擠奶直到?jīng)]有更多的乳汁。將來自兩個腺的樣品充分混合且等分試樣與防腐劑如重鉻酸鉀一起存放于2個小瓶中。將小瓶冷凍直到進行分析。乳汁脂肪、干物質(zhì)和蛋白質(zhì)根據(jù)本領域的標準程序如A.O.A.C.(1980)程序來確定。在一個特定的實施方案中，乳汁乳糖用半自動化的(27型工業(yè)分析儀，YellowSprings Instrument Co.，Inc.，Yellow Springs，Ohio)酶程序(操作程序號OP-025，Monsanto Co.，St.Louis，Mo.)進行分析。在一個特定的實施方案中，每只母豬乳汁的產(chǎn)量在13日和20日通過在如Lewis等人(1978)和Mahan等人(1971)描述的哺育前后以小時間隔稱量豬而確定。需注意在此時防止或考慮尿和排泄損失。在一個特定的實施方案中，最初2個哺育期用于使母豬和窩仔適應且不包括于每日乳汁產(chǎn)量的計算中。乳汁產(chǎn)量通過將在隨后的6小時內(nèi)獲得的產(chǎn)量乘以4而計算。
實施例19其他的實施方案在本發(fā)明的另一個實施方案中，生長激素促分泌素受體(GHS-R)的配體與GHRH核酸的遞送得到相似的結果。技術人員知道許多本領域公知的不同GHS-R配體結構類型，它們均通過GHS-R發(fā)揮作用。例子包括來自Merck的MK-0677(Whitehouse Station，NJ)、GHRP-6(綜述參見Bowers，1998)和內(nèi)源配體ghrelin(Kojima等人，1999；Dieguez和Casanueva，2000)。其他包括hexarelin(Europeptides)、L-692，943(Merck & Co.；Whitehouse Station，NJ)、NN703(Novo Nordisk；Bagsvaerd，丹麥)或任何充當GHS-R受體的拮抗劑的化合物，它們都為技術人員所熟知(參見如Pong等人(1996)；Howard等人(1996)或Smith等人(1997))。技術人員知道GHS-R在GHRH的上游并增加GHRH從腦下垂體中的釋放。在一個特定的實施方案中，GHS-R配體經(jīng)口施用(如通過添加入飼料和飲用水中)，這將放大GHRH導致GH自腦下垂體釋放的作用。在本實施方案中，本發(fā)明的GHRH核酸遞送可得到更多的增強。在不限制本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明者提出很可能的作用機制為額外的GHRH增加pit-1(一種涉及在胚胎發(fā)生過程中垂體前葉GH生產(chǎn)細胞、促生長激素細胞發(fā)育中的轉錄因子)表達。GHS-R的活化也增加pit-1的表達。pit-1的表達也由cAMP增加，且GHS-R配體增加響應于GHRH而產(chǎn)生的cAMP的量。因此，很可能豬在出生時具有增加的促生長激素細胞濃度。因此，豬生產(chǎn)更多的GH。因此，在一個特定的實施方案中，本發(fā)明GHRH核酸的遞送與至少一種GHS-R配體聯(lián)合施用。GHS-R配體以藥物可接受的組合物施用。在說明書中提到的所有專利和出版物都是本發(fā)明相關領域技術人員的水平的指示。所有專利和出版物在此處都引用作為參考，如特定或單獨地引用每個單獨的出版物作為參考。
實施例20施用GHRH對母豬和后代的多重作用在本發(fā)明的一個目的中，在懷孕的動物中異位生產(chǎn)的GHRH例如通過胎盤而傳給后代并在后裔中增強GH的生產(chǎn)，其后代然后顯示增加的生長和改變的身體組成。同時，受注射的母豬顯著生產(chǎn)更多的乳汁。為估計GHRH生肌載體注射大哺乳動物對后代生長的作用和GHRH遞送對母豬哺乳的作用，將6頭懷孕的母豬在妊娠95日用10mg質(zhì)粒DNA pSP-HV-GHRH(n＝4)或pSP-wt-GHRH(n＝2)進行注射。最近，在嚙齒類和大哺乳動物兩者中，利用電穿孔技術以增強質(zhì)粒的體內(nèi)攝入在將肌肉用于異位基因表達中取得了顯著的進展(Bettan等人，2000；Draghia-Akli等人，1999；Mir等人，1999)。在這種情況下，質(zhì)粒注射之后用6-針陣列電極進行電穿孔，且條件如在此處和(Draghia-Akli等人，1999)所描述。將6頭相匹配的母豬用作對照。該動物在24小時內(nèi)相繼生產(chǎn)。在隨后的研究中總共分析了132只小豬。已知在分娩前2星期用以注射給藥的重組GHRH進行的處理在13日和剛斷奶時增加了豬的重量并改善了豬的成活率(Etienne等人，1992)。在這種情況下，GHRH注射的母豬的小豬在出生時顯著較大(平均為1.65±0.06kg HV-GHRH，p＜0.00002和1.46±0.05kg wt-GHRH，p＜0.0014，而對對照1.27±0.02kg)(圖8)。小豬在21日斷奶，并在出生后170日分析屠宰重量。注射的母豬的小豬在剛斷奶時平均增重18％(圖9)。將每一窩仔的一半與對照母豬(來自注射的母豬的小豬)或注射的母豬(來自對照母豬的小豬)混養(yǎng)。有趣的是，與注射的動物混養(yǎng)的對照顯著比其同窩出生仔畜大(達12.2％)，p＜0.02(圖10)。在由GHRH處理的動物混養(yǎng)的對照動物中重量的改變指示注射的母豬顯著增加的乳汁生產(chǎn)。然而，來自GHRH-處理的母豬且由對照母豬混養(yǎng)的小豬傾向于比其同窩出生仔畜小(達5.8％)(圖11)，但該值統(tǒng)計學不顯著，這說明GHRH處理的動物的后代在其下丘腦-垂體軸具有內(nèi)源變化和增加的生長。與對照(用對照母豬飼養(yǎng))相比總的增加如圖12所示。該優(yōu)點可維持到市場重量；在170日該重量對于HV-GHRH和wt-GHRH分別平均為135.7±1.89kg和129.3±2.17kg，而對照重量平均為125.3±1.74kg(圖13)。該重量差異在任何時間點都統(tǒng)計學顯著，p值在0.05和10-5之間。進行了多重生物化學測量(表13a和13b)。作為增加的合成代謝的信號，總蛋白質(zhì)和白蛋白濃度(g/dl)在實驗組中顯示增加?？偟鞍踪|(zhì)增加了8％，而白蛋白增加了7.5％，且在測驗的時間點有微小差異(在出生后的50和170日)(表13a和13b)。
表13a
表13b 肌酸酐濃度(mg/dl)正常(0.936mg/dl相對對照0.982mg/dl，p＜.34)，這是正常腎功能的指示。葡萄糖濃度在所有檢驗的時間點都正常(表14a和14b)。
表14a
表14b 胰島素水平正常。胰島素和葡萄糖的正常水平是優(yōu)勢，因為經(jīng)典的GH治療產(chǎn)生高血糖的“糖尿病”樣的狀況(Pursel等人，1990)。在整個研究中的成活率在受處理的母豬的后代中顯著較高(表15)。在處理的組中發(fā)病率顯著降低。
表15 與用豬重組促生長素(rpST)的注射不同，該注射可導致出血性潰瘍、肝臟和腎臟的空泡形成或甚至母豬的死亡(Smith等人，1991)，GHRH基因治療可很好的被耐受，且在動物中未看到副作用。也注意到該增加的生長在受處理的動物的后代中獲得，而在那里不存在GHRH質(zhì)粒。調(diào)節(jié)的組織/纖維類型特異性的含hGH的質(zhì)粒以前通過轉基因、成肌細胞轉移或脂質(zhì)體介導的靜脈內(nèi)注射而用于在牲畜和GH-缺陷的宿主中進行GH的遞送和穩(wěn)定生產(chǎn)(Dahler等人，1994；Pursel等人，1990；Barr和Leiden，1991)。然而，這些技術具有顯著的缺點使其排除于大規(guī)模操作和/或食用動物之外1)與脂質(zhì)體遞送有關的可能的毒性或免疫反應；2)在轉染成肌細胞方法中需要廣泛的離體操作；和/或3)在轉基因中重要副作用或無效率的危險(Mililer等人，1989；Dhawan等人，1991)。與這些技術相比，質(zhì)粒DNA注射簡單且有效，且無相關于遞送系統(tǒng)或過度表達的并發(fā)癥。此處提供的數(shù)據(jù)顯示增強的生物學效能在GHRH質(zhì)粒注射的大哺乳動物的后代中實現(xiàn)，該效能增加GH生產(chǎn)和分泌的生理水平、降低死亡率和發(fā)病率。受處理的母豬顯示顯著更高的乳汁生產(chǎn)。后代小豬未經(jīng)歷任何治療副作用且具有正常的生物化學概況，也沒有有關的病理或臟器腫大。在生長的顯著增強顯示生肌GHRH載體的異位表達將很可能替代經(jīng)典的治療方式并可以生理上更適當?shù)姆绞絹碡菁H軸。在豬中顯示高度穩(wěn)定性和GH分泌活性的HV-GHRH分子也可用于其他哺乳動物，因為降解GHRH的血清蛋白酶在大多數(shù)動物中相似。下面的段落描述了本實施例的材料與方法。DNA構建體。質(zhì)粒pSPc5-12包含位于pSK-GHRH主鏈SacI/BamH I位點的360bp的SPc5-12合成啟動子的Sac I/BamH I片段(Draghia-Akli等人，1997)。野生型豬GHRH通過對人GHRHcDNA(1-40)OH在位置34Ser變?yōu)锳rg，38Arg變?yōu)镚lu進行定點突變而獲得；突變的豬HV-GHRH DNA通過對人GHRH cDNA(1-40)OH在位置1Tyr變?yōu)镠is，2Ala變?yōu)閂al，15Gly變?yōu)锳la，27Met變?yōu)長eu，28Ser變?yōu)锳sn，34Ser變?yōu)锳rg，38Arg變?yōu)镚lu進行定點突變而獲得(改變位點II體外突變系統(tǒng)(AlteredSites II in vitro Mutagenesis System)，Promega，Madison，WI)，并克隆入pSP-GHRH的BamH I/Hind III位點。該GHRH cDNA之后為人生長激素的3’非翻譯區(qū)，并生成pSPc5-12-wt-GHRH和pSPc5-12-HV-GHRH。對照質(zhì)粒含有在相同的合成啟動子控制之下的大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因以生產(chǎn)pSP-bgal。動物研究。將重量為約365kg的PIC品系22第一窩仔母豬用于這些GHRH研究。該動物在妊娠87日帶到農(nóng)場研究室，且單獨置于單獨產(chǎn)小豬的畜欄中，在那里它們無限制地可接近水和食物而持續(xù)到25天哺乳期的末尾。實驗開始于三月，且第一窩仔在4月出生并一直分析到10月中旬。該農(nóng)場建筑物裝備了冷卻系統(tǒng)，這使得能夠在炎熱天氣中能使最高溫度比外面的溫度低2-5℃。7月、8月和9月的平均最高溫度分別為40.6℃、41.6℃和36.6℃。該動物根據(jù)NIH指南、USDA和Animal Welfare Act指南來維持。豬中質(zhì)粒DNA的肌內(nèi)注射。將無內(nèi)毒素的質(zhì)粒制備物pSPc5-12-HV-GHRH和pSPc5-12-wt-GHRH(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA，美國)在PBS pH＝7.4中稀釋到1mg/ml。每一只母豬分配一次治療。4只母豬用pSPc5-12-HV-GHRH進行注射，2只母豬用pSPc5-12-wt-GHRH進行注射且6只母豬用作對照。在妊娠95日，將動物用2.2mg/kg的telazol進行輕微的麻醉。將總計10mg質(zhì)粒直接注射入豬的左側半腱肌肌肉中。注射后2分鐘，將注射的肌肉用直徑為1cm、22規(guī)格且長度為2cm的6-針陣列的注射型電極進行電穿孔，采用如下條件6脈沖、針間交流電場、200V/cm、60毫秒/脈沖，如所述(Draghia-Akli等人，1999；Aihara和Miyazai，1998)。混養(yǎng)研究。緊接在出生之后將每一窩仔分為2組。使每一窩仔的一半仍然由其母親哺育，而該窩仔的另一半則與不同的組混養(yǎng)(如對照小豬與HV-或wt-注射的動物混養(yǎng)，HV或wt出生的小豬與對照動物混養(yǎng))。每星期記錄重量。膳食。在21日剛斷奶時，用具有1.012％賴氨酸的Nutrena 18％ Medicated Pig Starter(Cargill，Minneapolis，MN)飼養(yǎng)小豬60天。隨后，用具有1.4％賴氨酸Custom Mix PigStarter 24％蛋白質(zhì)飼養(yǎng)豬45天，用具有1.4％賴氨酸Custom Mix22.7％蛋白質(zhì)飼養(yǎng)豬45天，然后用具有1.2％賴氨酸和20％蛋白質(zhì)的Custom Mix(Cargill，Minneapolis，MN)維持豬以進行剩下的研究。生物化學。在出生后50日和170日收集血清，并由獨立的實驗室(Antech Diagnostics，Irvine，CA)進行分析。豬IGF-I RIA。豬的IGF-I由異源的人IGF-I測定進行測量(Diagnostic System Lab.，Webster，TX)。豬胰島素RIA。豬的胰島素由異源的人測定進行測量(Linco Research Inc.；St.Charles，Missouri)。測定的靈敏度為2微U/ml。身體組成數(shù)據(jù)。在整個研究過程中每星期2次以相同的校準比例(鑒定為具有±.2kg的精確性和0.3％的變化系數(shù))測量重量。統(tǒng)計學。數(shù)據(jù)用Microsoft Excel統(tǒng)計分析包進行分析。在圖中顯示的值為平均數(shù)±s.e.m。特定的p值通過用Studentst檢驗進行比較而獲得。設置p＜.05作為統(tǒng)計顯著的水平。
實施例21對用GHRH處理的大鼠的多重作用生長激素(GH)的分泌由天然的GH促分泌素生長激素釋放激素(GHRH)刺激，并由促生長素抑制素(stomatostatin)(SS)抑制，兩者均為下丘腦激素(Thorner等人，1995)。GH脈沖是與促生長素抑制素分泌的減少或取消有關的GHRH分泌的結果。此外，脈沖生成器的機制看來由GH-負反饋來控時。另外，已認識到最初分離自大鼠胃的新肽ghrelin是GH分泌和能量穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)物。Ghrelin是生長激素促分泌素受體的內(nèi)源配體且其體內(nèi)GH-釋放活性依賴于GHRH(Hataya等人，2001)。在健康成年哺乳動物中，GH以高度調(diào)節(jié)的獨特的脈動模式進行釋放，這在24小時內(nèi)發(fā)生4-8次且對其生物學活性極度重要(Argente等人，1996)。分泌的陣發(fā)模式涉及在外周水平對生理學作用的最適的誘導(Veldurs，1998)。GH同種型的表達、加工和/或釋放及它們之間的相對比例在生長和發(fā)育過程中處于不同的控制之下(Araburo，等人，2000)。促生長激素細胞的調(diào)節(jié)和分化也依賴于在垂體本身內(nèi)部的旁分泌過程且涉及生長因子和幾種神經(jīng)肽，如血管活性腸肽(Rawlings等人，1995)、血管緊張肽2、內(nèi)皮縮血管肽(Tomic等人，1999)和活化素(Billesbup等人，1990)。GH和胰島素樣生長因子I(IGF-I)途徑的有效和受調(diào)節(jié)的表達對于最適的線性生長及糖類、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的穩(wěn)態(tài)，以及對于提供正氮平衡是關鍵的(Murray和Shalet，2000)。GHRH、GH、ghrelin、催乳素(PRL)和IGF-I在生理以及病理狀況下對體液和細胞免疫反應的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用(Geffner等人呢，1997；Hattori等人，2001)。GHRH基因的下丘腦組織特異性表達并不為活性所必需的，這是因為頭顱外分泌的GHRH可具有生物學活性(Faglia等人，1992；Melmed，1991)。GH活性的病理性GHRH刺激(不論其來源，從轉基因模型到胰腺腫瘤)可導致腺垂體細胞的增殖、增生和腺瘤(Asa等人，1992；Sano等人，1988)。然而，對接受治療的動物的后代持續(xù)的GHRH處理的長期效作仍然未知。前面已顯示由合成的肌肉特異性啟動子控制的表達質(zhì)粒指導的新的血清蛋白酶抗性的豬GHRH的異位表達在經(jīng)肌內(nèi)注射和體內(nèi)電穿孔遞送后可在豬體內(nèi)引起高的GH和IGF-I水平(Lopez-Calderon等人，1999)。本實施例中描述的實驗目的為估計GHRH，其由質(zhì)粒DNA基因治療遞送以在妊娠最后3個月中處理的動物的后代中增強生長和改變身體組成。在一個特定的實施方案中，在懷孕的動物中異位生產(chǎn)的GHRH通過胎盤而傳給后代，在后裔中確定了垂體的增生并增強了長時間GH生產(chǎn)，這然后將顯示增加的生長和改變的身體組成。為了估計GHRH生肌載體注射哺乳動物對后代的生長作用，將懷孕的大鼠于妊娠16日用30μg的質(zhì)粒DNA pSP-HV-GHRH或pSP-βgal進行注射。在該注射后進行電穿孔以增強質(zhì)粒攝取。所有的動物在妊娠20-22日生產(chǎn)。各組間窩仔的平均后代數(shù)目相似(處理的(T)，n＝10.8個幼仔/窩；對照(C)n＝11.75個幼仔/窩)。使各母親間的幼畜數(shù)目均等化為10個幼畜/母親。在出生后2個星期，處理組的窩仔的平均重量增加了9％T＝31.47±0.52g對于C＝28.86±0.75g，p＜0.014。在剛斷奶時，在T后代中重量顯著增加T雌性(TF)平均為51.97±0.83g對于對照雌性(CF)47.07±4.4g，p＜0.043，且處理的雄性平均為60.89±1.02g對于對照雄性(CM)49.85±4.9g，p＜0.001(圖14)。該優(yōu)勢維持到10周齡，且重量差異在24周變得不顯著。兩個性別在3周齡時均具有肌肉的過度生長，并在腓腸肌(G)和脛骨前肌(TA)肌肉/重量上具有顯著差異(圖15)。TF在整個研究期間維持肌肉的過度生長，而雄性在10周齡后不顯示肌肉過度生長的跡象。該變化可能歸因于雄性成熟時性類固醇的變化，其減弱了生理增加的GH對骨骼肌的作用。在死后的第一分鐘進行解剖并稱重腦下垂體。主要在IF中垂體重量對總體重的比例在出生后達12個星期顯著地增加(圖16)。該垂體重量的增加最可能歸因于促生長激素細胞增生，因為已知GHRH能夠刺激GH從垂體前葉合成和分泌并對促生長激素細胞具有特定的過度生長作用(Morel等人，1999；Murray等人，2000)。這得到了激素的(圖17)和組織學(圖18)證據(jù)的支持。對來自注射的動物的垂體的Northern印跡分析顯示GH和PRL mRNA水平的顯著增加，并結合內(nèi)源大鼠GHRH mRNA水平的減少。利用組織學技術，特定的抗大鼠抗體闡明了促生長激素細胞數(shù)目的增加。增加的全身GHRH和GH水平的指示是血清IGF-I濃度的增加。血清大鼠IGF-I在pSP-HV-GHRH注射的大鼠后代出生后達24個星期內(nèi)都顯著較高，在所有檢驗的時間點都具有p＜0.05(圖19)。將器官(肺、心、肝、腎、胃、腸、腎上腺、生殖腺、腦)收集并稱重。在任何動物中沒有觀察到相關病理。在體內(nèi)基因轉移的非病毒技術中，直接將質(zhì)粒DNA注射入肌肉是簡單、便宜和安全的，但該方法學的應用受到了轉移的DNA表達載體相對低的表達水平的限制。在一個特定的實施方案中，為了獲得基因治療對生長和身體組成的調(diào)節(jié)，必須利用創(chuàng)新的方法，其中目標動物不直接處理，但由于對懷孕的母親的處理而具有增強的生物學特征。如在此處所描述的，質(zhì)粒載體另一個顯著的改善是應用編碼更穩(wěn)定的GHRH類似物HV-GHRH的基因(Draghia-Akli等人，1999)。電基因(electrogene)治療轉移使得基因能夠在所需器官或組織中有效地轉移和表達，且能夠在單一施用后提供長時間的表達。該方法可代表一種不需要病毒基因或顆粒的高效核酸轉移的新方法。對于大的物種如豬或牛，GH上游刺激物，GHRH的使用是一種可選擇的策略，該策略不僅可增加生長性能或乳汁生產(chǎn)，而且更重要的是，從實際和代謝的觀點看可增加生產(chǎn)效率(Dubreuil等人，1990)。然而，重組肽的高成本和必需的施用頻率目前限制了該處理的廣泛應用。這些主要的缺點可通過使用核酸轉移方法以指導GHRH的異位生產(chǎn)而消除，特別是當其生產(chǎn)長期維持時。因而，在將表達突變的生長激素釋放激素(GHRH)cDNA的質(zhì)粒經(jīng)單一的電穿孔注射成年懷孕大鼠的脛骨前肌肌肉中之后，在后代中發(fā)生了增強的動物生長。新生的大鼠(F1)在出生時顯著更大。縱向的重量和身體組成研究顯示了兩個性別間隨年齡的差異。激素的和生物化學的測量與生長模式一致。F1具有更大的腦下垂體、促生長激素細胞增生和增加的GH含量。F1血漿IGF-I水平顯著升高?？傊@些新發(fā)現(xiàn)說明GHRH可用于在基于質(zhì)粒的基因治療之后在世代間增強某些動物特征。下面的段落描述了本實施例中進行的實驗。DNA構建體。質(zhì)粒pSPc5-12包含位于pSK-GHRH主鏈SacI/BamH I位點的360bp SPc5-12合成啟動子(Li等人，1999)的Sac I/BamH I片段(Draghia-Akli等人，1997)。突變的豬GHRHcDNA通過對人GHRH cDNA進行定點突變而獲得(改變位點II體外突變系統(tǒng)(Altered Sites II in vitro Mutagenesis System)，Promega，Madison，WI)。編碼31個氨基酸的信號肽和突變的豬GHRH(1-40)OH的突變的豬GHRH的228-bp片段(外顯子2部分，全部外顯子3和外顯子4的部分)特征在于下面的氨基酸替代Gly15變?yōu)锳la，Met27變?yōu)長eu和Ser28變?yōu)锳sn以及Tyr1到His和Ala2到Val的轉變。將該片段克隆pSK-GHRH的BamH I/Hind III位點。hGH pA是來自人GH基因的3’非翻譯區(qū)和聚腺苷酸信號。質(zhì)粒在大腸桿菌DH5α中生長(Gibco BRL，Carlsbad，CA)。將無內(nèi)毒素的質(zhì)粒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA美國)制備物在PBS，pH7.4中稀釋到1mg/ml。質(zhì)粒的肌內(nèi)注射和電穿孔。將記時懷孕的成年Wistar雌性大鼠在Baylor College of Medicine，Houston，TX的動物研究室中保存并撫養(yǎng)。動物根據(jù)NIH指南、USDA和Animal Welfare Act指南在10小時光照/14小時黑暗的環(huán)境條件下維持，且該規(guī)程得到了Instutional Animal Care and Use Committee的批準。將實驗重復2次。在妊娠的16日，將動物(n＝20組)稱重并將42.8mg/ml的氯胺酮、8.2mg/ml的甲苯噻嗪和0.7mg/ml的乙酰丙嗪的組合以0.5-0.7ml/kg的劑量i.m.施用而麻醉。將大鼠的左脛骨前肌肌肉用100ml PBS中的30mg的pSP-HV-GHRH用0.3cc胰島素注射器(Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)進行注射。對照動物用PBS注射。對于兩個組，該注射之后如所述(Draghia-Akli等人，1999)進行卡鉗電穿孔。簡要地，在注射后2分鐘，將大鼠腿置于2個長度為1cm、26規(guī)格且針之間為1cm的針電極(Genetronics，San Diego，CA)之間且將電脈沖應用于該區(qū)域。在一個方向于100V/cm的電壓應用了3個60-ms的脈沖，然后使電場反轉，并在相反的方向應用另外3個脈沖。該脈沖由T-820 ElectroSquare Porator(Genetronics，San Diego，CA)生成。后代研究。所有注射的大鼠在妊娠20-22日生產(chǎn)。對第一個研究中240個后代和第二個研究中60個后代從出生到5月齡(出生、出生后2、3、6、8、12、16、22周)進行了分析。體重用相同的校正的天平在這些時間點進行記錄。在實驗的末尾，在死后研究了身體組成。收集血液、立即于0℃離心并在分析前貯存于-80℃。將器官(來自注射的和對照動物的心、肝、脾、腎、垂體、腦、腎上腺、骨骼肌--脛骨前肌(TA)、腓腸肌(G)、比目魚肌(S)和趾長伸肌(EDL)、畜體、脂肪)去除，在分析天平上稱重并在液氮中速凍。測量并記錄了脛骨長度。垂體的Northern印跡分析。將垂體速凍并在溶液D中勻漿，然后抽提。將20mg總RNA用DNase I處理、在1.5％瓊脂糖-甲醛凝膠上分離大小并轉移到尼龍膜上。該膜用特定的由隨機引發(fā)而32P-標記的GHRH cDNA探針進行雜交。大鼠IGF-I放射性免疫測定。大鼠IGF-I通過特定的放射性免疫測定(Diagnostic System Laboratories，Webster，Texas)進行測量。該測定的靈敏度為0.8ng/ml；測定內(nèi)和測定間的變化分別為2.4％和4.1％。統(tǒng)計學。在圖中顯示的值為平均數(shù)±s.e.m。特定的p值通過用Students t檢驗或ANOVA分析進行比較而獲得。設置p＜0.05作為統(tǒng)計顯著的水平。
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序列表<110>Schwartz，Robert A.
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gcttatcg 30825100478- 1 -
權利要求
1.改善或增強雌性動物后代生長的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到該雌性動物細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中核苷酸序列表達且其中該載體的引入和表達導致該后代生長的改善或增強。
2.權利要求1的方法，其中該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。
3.權利要求1的方法，其中該雌性動物的細胞包含肌細胞。
4.權利要求1的方法，其中該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。
5.權利要求4的方法，其中該生長激素釋放激素為SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。
6.權利要求1的方法，其中該啟動子包含合成的生肌啟動子。
7.權利要求1的方法，其中該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。
8.權利要求1的方法，其中該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體(carrier)結合、通過腸胃外途徑或者其組合而引入到該雌性動物的該細胞中。
9.權利要求1的方法，其中該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。
10.權利要求1的方法，其中該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。
11.權利要求1的方法，其中該載體是質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或其組合。
12.權利要求1的方法，其中該載體在單次施用中引入該雌性中。
13.權利要求1的方法，其中該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。
14.權利要求1的方法，其進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。
15.權利要求14的方法，其中該配體經(jīng)口施用。
16.增加雌性動物后代體內(nèi)生長激素水平的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到該雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中核苷酸序列表達且其中該載體的引入和表達導致后代體內(nèi)生長激素水平增加。
17.權利要求16的方法，其中該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。
18.權利要求16的方法，其中該雌性動物的細胞包含肌細胞。
19.權利要求16的方法，其中該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。
20.權利要求19的方法，其中該生長激素釋放激素為SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。
21.權利要求16的方法，其中該啟動子包含合成的生肌啟動子。
22.權利要求16的方法，其中該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。
23.權利要求16的方法，其中該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合、通過腸胃外途徑或者其組合而引入到該雌性動物的該細胞中。
24.權利要求16的方法，其中該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。
25.權利要求16的方法，其中該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。
26.權利要求16的方法，其中該載體是質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或其組合。
27.權利要求16的方法，其中該載體在單次施用中引入該雌性中。
28.權利要求16的方法，其中該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。
29.權利要求16的方法，其進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。
30.權利要求29的方法，其中該配體經(jīng)口施用。
31.增加雌性動物后代的瘦體重的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到該雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代瘦體重增加。
32.權利要求31的方法，其中該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。
33.權利要求31的方法，其中該雌性動物的細胞包含肌細胞。
34.權利要求31的方法，其中該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。
35.權利要求34的方法，其中該生長激素釋放激素為SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。
36.權利要求31的方法，其中該啟動子包含合成的生肌啟動子。
37.權利要求31的方法，其中該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。
38.權利要求31的方法，其中該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合、通過腸胃外途徑或者其組合而引入到該雌性動物的該細胞中。
39.權利要求31的方法，其中該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。
40.權利要求31的方法，其中該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。
41.權利要求31的方法，其中該載體是質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或其組合。
42.權利要求31的方法，其中該載體在單次施用中引入該雌性中。
43.權利要求31的方法，其中該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。
44.權利要求31的方法，其進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。
45.權利要求44的方法，其中該配體經(jīng)口施用。
46.增加雌性動物后代的IGF-I水平的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到該雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代IGF-I水平增加。
47.權利要求46的方法，其中該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。
48.權利要求46的方法，其中該雌性動物的細胞包含肌細胞。
49.權利要求46的方法，其中該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。
50.權利要求49的方法，其中該生長激素釋放激素為SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。
51.權利要求46的方法，其中該啟動子包含合成的生肌啟動子。
52.權利要求46的方法，其中該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。
53.權利要求46的方法，其中該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合、通過腸胃外途徑或者其組合而引入到該雌性動物的該細胞中。
54.權利要求46的方法，其中該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。
55.權利要求46的方法，其中該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。
56.權利要求46的方法，其中該載體是質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或其組合。
57.權利要求46的方法，其中該載體在單次施用中引入該雌性中。
58.權利要求46的方法，其中該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。
59.權利要求46的方法，其進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。
60.權利要求59的方法，其中該配體經(jīng)口施用。
61.增加雌性動物后代飼養(yǎng)效率的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到該雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代飼養(yǎng)效率增加。
62.權利要求61的方法，其中該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。
63.權利要求61的方法，其中該雌性動物的細胞包含肌細胞。
64.權利要求61的方法，其中該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。
65.權利要求64的方法，其中該生長激素釋放激素為SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。
66.權利要求61的方法，其中該啟動子包含合成的生肌啟動子。
67.權利要求61的方法，其中該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。
68.權利要求61的方法，其中該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合、通過腸胃外途徑或者其組合而引入到該雌性動物的該細胞中。
69.權利要求61的方法，其中該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。
70.權利要求61的方法，其中該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。
71.權利要求61的方法，其中該載體是質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或其組合。
72.權利要求61的方法，其中該載體在單次施用中引入該雌性中。
73.權利要求61的方法，其中該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。
74.權利要求61的方法，其進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。
75.權利要求74的方法，其中該配體經(jīng)口施用。
76.增加雌性動物后代生長速度的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到該雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代生長速度增加。
77.權利要求76的方法，其中該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。
78.權利要求76的方法，其中該雌性動物的細胞包含肌細胞。
79.權利要求76的方法，其中該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。
80.權利要求79的方法，其中該生長激素釋放激素為SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。
81.權利要求76的方法，其中該啟動子包含合成的生肌啟動子。
82.權利要求76的方法，其中該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。
83.權利要求76的方法，其中該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合、通過腸胃外途徑或者其組合而引入到該雌性動物的該細胞中。
84.權利要求76的方法，其中該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。
85.權利要求76的方法，其中該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。
86.權利要求76的方法，其中該載體是質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或其組合。
87.權利要求76的方法，其中該載體在單次施用中引入該雌性中。
88.權利要求76的方法，其中該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。
89.權利要求76的方法，其進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。
90.權利要求89的方法，其中該配體經(jīng)口施用。
91.增加雌性動物后代的腦下垂體中促生長激素細胞相對其他的激素生產(chǎn)細胞的比例的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到該雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代促生長激素細胞相對其他激素生產(chǎn)細胞的比例增加。
92.權利要求91的方法，其中該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。
93.權利要求91的方法，其中該雌性動物的細胞包含肌細胞。
94.權利要求91的方法，其中該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。
95.權利要求94的方法，其中該生長激素釋放激素為SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。
96.權利要求91的方法，其中該啟動子包含合成的生肌啟動子。
97.權利要求91的方法，其中該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。
98.權利要求91的方法，其中該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合、通過腸胃外途徑或者其組合而引入到該雌性動物的該細胞中。
99.權利要求91的方法，其中該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。
100.權利要求91的方法，其中該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。
101.權利要求91的方法，其中該載體是質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或其組合。
102.權利要求91的方法，其中該載體在單次施用中引入該雌性中。
103.權利要求91的方法，其中該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。
104.權利要求91的方法，其進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。
105.權利要求104的方法，其中該配體經(jīng)口施用。
106.權利要求91的方法，其中所述激素生產(chǎn)細胞選自促腎上腺皮質(zhì)激素細胞、催乳細胞和促性腺激素細胞。
107.延遲雌性動物后代出生的方法，該方法包括在懷有該后代之前或期間將有效量的載體引入到該雌性動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致后代出生延遲。
108.權利要求107的方法，其中該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。
109.權利要求107的方法，其中該雌性動物的細胞包含肌細胞。
110.權利要求107的方法，其中該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。
111.權利要求110的方法，其中該生長激素釋放激素為SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。
112.權利要求107的方法，其中該啟動子包含合成的生肌啟動子。
113.權利要求107的方法，其中該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。
114.權利要求107的方法，其中該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合、通過腸胃外途徑或者其組合而引入到該雌性動物的該細胞中。
115.權利要求107的方法，其中該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。
116.權利要求107的方法，其中該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。
117.權利要求107的方法，其中該載體是質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或其組合。
118.權利要求107的方法，其中該載體在單次施用中引入該雌性中。
119.權利要求107的方法，其中該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。
120.權利要求107的方法，該方法進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。
121.權利要求120的方法，其中該配體經(jīng)口施用。
122.增加動物乳汁生產(chǎn)的方法，包括將有效量的載體引入到該動物的細胞內(nèi)的步驟，其中該載體包含啟動子、核苷酸序列和3’非翻譯區(qū)，所處條件為其中核苷酸序列表達且其中載體的引入和表達導致動物乳汁生產(chǎn)增加。
123.權利要求122的方法，其中該雌性動物的細胞包含二倍體細胞。
124.權利要求122的方法，其中該雌性動物的細胞包含肌肉細胞。
125.權利要求122的方法，其中該核酸序列編碼生長激素釋放激素或其類似物。
126.權利要求125的方法，其中該生長激素釋放激素為SEQ IDNO1、SEQ ID NO8或其各自的類似物。
127.權利要求122的方法，其中該啟動子包含合成的生肌啟動子。
128.權利要求122的方法，其中該3’非翻譯區(qū)包含hGH 3’非翻譯區(qū)。
129.權利要求122的方法，其中該載體通過電穿孔、經(jīng)過病毒載體、與載體結合、通過腸胃外途徑或者其組合而引入到該雌性動物的該細胞中。
130.權利要求122的方法，其中該雌性動物是人、寵物動物、農(nóng)場動物、食用動物或工作用動物。
131.權利要求122的方法，其中該雌性動物是人、豬、母牛、綿羊、山羊或雞。
132.權利要求122的方法，其中該載體是質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)或其組合。
133.權利要求122的方法，其中該載體在單次施用中引入該雌性中。
134.權利要求122的方法，其中該引入在懷有該后代的第3個3月期時發(fā)生。
135.權利要求122的方法，其進一步包含向該雌性施用生長激素促分泌素受體的配體的步驟。
136.權利要求135的方法，其中該配體經(jīng)口施用。
全文摘要
通過用增強生長的有力方法對雌性動物施用核酸序列，如GHRH或類似物來改善生長，優(yōu)選通過腸胃外途徑的施用。由用編碼GHRH的DNA注射的母豬生產(chǎn)的小豬更大，且該作用在隨后的妊娠中得到說明而無需額外施用載體。
文檔編號A61K38/18GK1575301SQ01822008
公開日2005年2月2日 申請日期2001年12月12日 優(yōu)先權日2000年12月12日
發(fā)明者R·J·施瓦茨, R·H·卡彭特, R·德勒吉亞－阿克里, D·R·克恩, R·G·史密斯 申請人:貝勒醫(yī)學院, 阿德維希斯公司