專利名稱：具有葡糖腦苷脂酶活性的雙功能融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基本上由免疫球蛋白(Ig)分子(整個抗體，Ig重鏈或輕鏈或其片段)和具有GCR生物活性的蛋白(該術(shù)語也包括寡肽)(GCR樣蛋白)組成的葡糖腦苷脂酶(GCR)雙功能融合蛋白(GCR融合蛋白)，利用糖脂貯積失調(diào)(例如，戈歇病、法布里病、家族黑矇性白癡)治療為基礎(chǔ)的療法，通過施用雙功能融合蛋白可以進行酶替代治療和/或提高糖脂代謝。
通過選擇性地改變Ig部分的氨基酸序列，可以得到有改良特性，例如，加強的穩(wěn)定性的GCR融合蛋白。另外，可以提供其中使用的GCR和Ig鏈為縮短形式的融合蛋白。
本發(fā)明也涉及包含此GCR融合蛋白的藥物組合物和治療方法和系統(tǒng)以及治療戈歇病或因糖脂貯積失調(diào)引起的其它疾病(例如，法布里病、家族黑矇性白癡)的方法，該方法包括給患有此疾病的對象施用在可藥用載體中含有治療劑量的重組產(chǎn)生的GCR融合蛋白的藥物組合物。
背景技術(shù)：
為了治療由糖脂貯積失調(diào)引起的疾病(象戈歇病、家族黑矇性白癡或法布里病)，代替脾切除術(shù)或骨髓移植而施用外源β葡糖苷酶來嘗試提高罹患此類疾病的生物體內(nèi)的酶量，這在文獻(xiàn)資料中已有描述，其被用于治療溶酶體貯積缺陷。參看，例如De Duve，C.Fed.Proc.第23卷，第1045頁(1964)和Barton，N.W.等.Proc.Natl.Acad.Sci.第87卷，第1913頁(1990)，其中描述了使用β-葡糖苷酶，尤其是GCR治療戈歇病和為了得到治療響應(yīng)所伴隨出現(xiàn)的困難。但是，治療這些疾病所用酶的劑量是每兩周每公斤體重約60單位，這就意味著，治療一個70公斤的患者每年的平均花費大約是380,000美元，而這僅僅是酶的花費。這是由外源酸性β-葡糖苷酶的短細(xì)胞內(nèi)半衰期造成的。
已經(jīng)描述了有相當(dāng)提高的體內(nèi)半衰期和對特異細(xì)胞類型(如腫瘤細(xì)胞)有提高的靶向性的抗體-酶融合蛋白。例如，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2(IL-2)與單克隆抗體重鏈進行了融合，通過分別使用抗體KS1/4和ch14.18分別形成融合蛋白ch14.18-IL-2和KS1/4-IL-2，在這兩個單獨的融合蛋白中所述的抗體重鏈分別與腫瘤抗原上皮細(xì)胞粘附分子(Ep-CAM)或二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯GD2有免疫活性，參看，例如美國專利號5,650,150。
因此，本發(fā)明的目的是找到能有效治療糖脂貯積失調(diào)(如戈歇病、法布里病和泰-薩二氏疾病)的適宜的化合物，它應(yīng)當(dāng)允許高效率的用藥方式和模式，而且比已知的昂貴治療方法便宜并在大多數(shù)患者(尤其是發(fā)展中國家的患者)能負(fù)擔(dān)的價格范圍內(nèi)。本發(fā)明的目的是提供治療戈歇病、法布里病和泰-薩二氏疾病的分子，這些分子可以低劑量用藥、在機體內(nèi)有更長的半衰期而沒有明顯減弱的活性，并且對那些進行糖脂代謝的特異細(xì)胞有更好的靶向性，由此能對這些疾病進行更經(jīng)濟且更有效的治療。
發(fā)明概述目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果將具有GCR生物活性的蛋白與Ig分子(比如整個抗體、Ig重鏈或輕鏈、Ig重鏈片段例如重鏈恒定區(qū)(CH)或Fc或Fab片段)連在一起，則藥效上將有意外的協(xié)同作用并且有延長的半衰期。
融合蛋白和特定融合蛋白的修飾是本領(lǐng)域已知的。例如，融合蛋白能有效地阻斷蛋白水解酶與其自身蛋白骨架的物理接觸，由此阻止降解作用。其他優(yōu)點包括在特定條件下，可提高在特定表達(dá)系統(tǒng)中的產(chǎn)量、使靶蛋白正確折疊、增強穩(wěn)定性、增加循環(huán)時間和治療蛋白的生物學(xué)活性。一個此類修飾是利用免疫球蛋白的Fc區(qū)。抗體包括兩個功能上獨立的部分，稱為“Fab”的可變區(qū)(它與抗原結(jié)合)和稱為“Fc”的恒定區(qū)(它提供與效應(yīng)子功能(例如補體或吞噬細(xì)胞)的連接)。當(dāng)與某些具有特別短半衰期的蛋白融合時，免疫球蛋白的Fc部分可介導(dǎo)長時的血漿半衰期(Capon，等.，Nature第337期第525-531頁(1989)).
使用Fc區(qū)也已構(gòu)建了治療性融合蛋白，其中整合了例如Fc受體結(jié)合、蛋白質(zhì)A結(jié)合、補體固著和胎盤轉(zhuǎn)運等功能，這些功能都來自免疫球蛋白的Fc。例如，已經(jīng)將IgG1抗體的Fc區(qū)域與CD30-L的N末端融合，CD30-L是與CD30受體結(jié)合的分子，而CD30受體表達(dá)在何杰金氏病腫瘤細(xì)胞、退行性淋巴瘤細(xì)胞、T細(xì)胞白血病細(xì)胞以及其他惡性細(xì)胞類型上(美國專利號5,480,981)。此外，在1996年，據(jù)報道，通過表達(dá)包含免疫球蛋白Fc部分與靶蛋白的融合蛋白及之后對靶蛋白進行蛋白酶剪切，可以實現(xiàn)某些非突變靶蛋白的有效表達(dá)和分泌(WO 96/08570,US 5,541,087)。
與Ig多肽鏈融合的適宜GCR樣蛋白可以具有在美國專利號5,879,680中給出的氨基酸序列和相關(guān)DNA序列，或者可以是衍生的截短或突變形式。在美國專利號5,879,680的教導(dǎo)中描述了這些蛋白及其合成方法和條件的范例，但不包括截短和突變形式，其中有關(guān)制備和使用的公開特此以參考文獻(xiàn)的方式整合入此處。
優(yōu)選的截短形式是例如由大約1/3到1/2的天然GCR酶的氨基酸序列組成的那些，其中截短自酶的羧基端起始進行。這些截短蛋白可以通過用適宜的試劑(例如限制酶或類似物)從完整長度蛋白上切下所需的鏈而產(chǎn)生。
在參考的美國專利中描述有鑒定有效的GCR樣蛋白(即，適用作與Ig多肽鏈融合的候選者)以及證明本發(fā)明融合化合物的活性的試驗；因此可以認(rèn)為，為了實踐本發(fā)明，可以容易地鑒定出可用于治療糖脂貯積失調(diào)(例如戈歇病、法布里病和泰-薩二氏疾病)的可選融合蛋白。
本發(fā)明提供了能在動物體內(nèi)水解葡糖腦苷脂的有類GCR活性的新蛋白，該蛋白還具有另外的有利的特性，例如更高的表達(dá)水平、更高的溶解度、更好的組織分布、以及對巨噬細(xì)胞具有更好的靶向性。這些新蛋白包括Ig分子，象整個抗體或其片段(Ig重鏈或輕鏈或重鏈的片段如CH，F(xiàn)c或Fab片段)與GCR樣蛋白的融合蛋白；這些融合蛋白的在GCR樣蛋白或Ig部分中有改變的糖基化的形式；有截短或突變的氨基酸序列并且例如，有降低的親和力(比如對新生兒Fc受體(FcRn))的GCR融合蛋白形式；以及有特定接頭的GCR融合蛋白。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一個目的是提供具有類GCR活性且有改良特性的蛋白，其中所述蛋白是包含Ig分子，象整個抗體、Ig重鏈或輕鏈或重鏈的片段(象CH、Fc或Fab片段)與GCR樣蛋白的融合蛋白，其中所述的Ig部分直接地或間接地(通過接頭分子)與所述GCR樣蛋白共價融合。在優(yōu)選實施方案中，Ig部分通過它的C-末端直接地或間接地(通過接頭分子)與所述GCR樣蛋白(在其N-末端)共價融合，且Ig部分與GCR部分都可以是修飾的或突變的，該融合蛋白選自下組(I)H2N-Ig-GCR-COOH(II)H2N-Ig-L-GCR-COOH15(III)H2N-Ig-GCRm-COOH(IV)H2N-Igm-GCR-COOH(V)H2N-Igm-GCRm-COOH(VI)H2N-Igm-L-GCR-COOH(VII)H2N-Ig-L-GCRm-COOH20(VIII)H2N-Ig-GCRtrunc-COOH(IX)H2N-Ig-L-GCRtrunc-COOH(X)H2N-GCR-Ig-COOH(XI)H2N-GCR-L-Ig-COOH(XII)H2N-GCRm-Ig-COOH25(XIII)H2N-GCR-Igm-COOH(XIV)H2N-GCRm-Igm-COOH(XV)H2N-GCR-L-Igm-COOH(XVI)H2N-GCRm-L-Ig-COOH(XVII)H2N-GCRtrunc-Ig-COOH30(XVIII)H2N-GCRtrunc-L-Ig-COOH這里，Ig是指Ig重鏈或輕鏈或Ig重鏈的片段(例如CH、Fc或Fab片段)。GCR是指來自哺乳動物的天然GCR，優(yōu)選人源的，特別優(yōu)選人溶酶體來源的；同時也包括源自天然來源的工程化重組GCR。
GCRtrunc是指被截短的但其氨基酸序列未被突變的本發(fā)明GCR。截短形式是指具有基本上全部的或僅少許減少的葡糖腦苷脂酶生物學(xué)活性的蛋白片段。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的GCR截短形式是由大約1/3到1/2的在C端縮短的天然葡糖腦苷脂酶氨基酸序列組成的那些。
GCRm是指其氨基酸序列被突變但沒被截短的本發(fā)明GCR。突變的數(shù)量沒有限制，但限于不能使分子的生物活性喪失。在優(yōu)選實施方案中突變程度為5％～30％，在特別優(yōu)選的實施方案中為5％～20％的氨基酸殘基。用本領(lǐng)域已知的方法可以產(chǎn)生有增強GCR生物活性的變體。
根據(jù)本發(fā)明，GCR、GCRm、GCRtrunc可以是糖基化、未糖基化、部分糖基化或在其糖基化的模式上發(fā)生改變的形式。
可以用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過蛋白質(zhì)A柱子來純化GCR融合蛋白。
L是指一連串肽，例如甘氨酸和/或絲氨酸。優(yōu)選地，此肽接頭是長度大約5～25，優(yōu)選10～20個殘基的一連串甘氨酸和絲氨酸肽的混合。特別優(yōu)選的是可蛋白水解切割的接頭，尤其是可以被溶酶體蛋白酶如組織蛋白酶切割的接頭。
在優(yōu)選實施方案中，Ig部分對帶有Fc受體的細(xì)胞具特異性。因此，與GCR連接的優(yōu)選Ig分子片段是Fc區(qū)域。免疫球蛋白的Fc區(qū)域是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的羧基端部分的氨基酸序列。Fc區(qū)在決定免疫球蛋白的生物學(xué)功能方面特別重要，這些生物學(xué)功能稱為效應(yīng)子功能。已知，免疫球蛋白亞類的重鏈包括4或5個結(jié)構(gòu)域IgM和IgE有5個重鏈結(jié)構(gòu)域，IgA、IgD和IgG有4個重鏈結(jié)構(gòu)域。IgA、IgD和IgG的Fc區(qū)是鉸鏈區(qū)-CH2區(qū)-CH3區(qū)的二聚體，在IgM和IgE中它是鉸鏈區(qū)-CH2區(qū)-CH3區(qū)-CH4區(qū)的二聚體(參看W.E.Paul，編，1993，F(xiàn)undamental Immunology，Raven Press，New York)。
如本文中所用，術(shù)語“Fc部分”指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的羧基端部分，或者其類似物或者部分。即，比如，Ig(優(yōu)選IgG)的免疫球蛋白Fc區(qū)，它可以包含至少部份鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。
Fc區(qū)可以在其氨基端通過肽鍵與GCR的羧基端氨基酸連接，或在優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)c區(qū)在其羧基端通過肽鍵與GCR的氨基端氨基酸連接。
在一些情況下，突變Ig分子，特別是融合蛋白的Fc區(qū)中的某些氨基酸是有用的。例如，新生兒Fc受體(FcRn)與IgG結(jié)合可以減弱融合蛋白的臨床效能。
因此，F(xiàn)cm是其氨基酸序列被突變和/或糖基化模式被改變的上面所定義的Fc部分。這些修飾的Fc部分可導(dǎo)致融合蛋白具有改良特性。在本文的上下文中，F(xiàn)cm還包括對FcRn受體有減弱的親和力的修飾的或突變的Fc部分。例如，已知位于Ig重鏈CH2和CH3區(qū)的連接處的IgG組氨酸(殘基310和433)有助于與FcRn受體的pH依賴性結(jié)合(Raghavan，等.，Biochemistry 34(45)第14649-57頁(1995))。另外，Ile 253和His 435及436(Kim等.，Eur.J.Immunol.第34卷第2429-34頁(1994))，還有殘基309(Leu，Val，Gln或Met，在大鼠、小鼠和人IgG中)和311(Gln或Arg，在大鼠、小鼠和人IgG中)(Kabat等.，Sequences of proteins ofimmunological interest，US Department of Health and Human Services，Bethesda，MD，美國(1991))似乎與FcRn受體形成相互作用。因此，本發(fā)明的一個目的是提供有增加的體內(nèi)循環(huán)半衰期的融合蛋白，該蛋白在負(fù)責(zé)與FcRn受體結(jié)合的域中有一個或多個氨基酸的突變、缺失或插入。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，此GCR融合蛋白包含IgG1的Fc部分，其中所述突變是253位不是Ile，309位不是Leu、Val、Gln或Met，310位不是His，311位不是Gln或Arg，433位不是His，435位不是His，436位不是His。根據(jù)本發(fā)明的這些和其它的變體蛋白可以具有與Fc受體增強的結(jié)合，增強的穩(wěn)定性，增加的對正確活性構(gòu)象的采用，增強的藥物動力學(xué)特性，增強的合成或其他有益特征。改善GCR融合蛋白的一個具體方法是使用定點透變技術(shù)。需重點提出的是，現(xiàn)成有大量不同的定點誘變技術(shù)，它們可以用作備選技術(shù)以取得類似的結(jié)果。在這些技術(shù)中進行選擇的策略是分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。類似的，可對目的DNA實施隨機和半隨機誘變的技術(shù)也有很多種。這些技術(shù)也是分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
根據(jù)本發(fā)明的Ig分子和GCR樣蛋白也可以通過接頭分子連接，其中氨基酸接頭的長度可變。本發(fā)明的接頭(L)是如下所定義的接頭分子，其還可以具有蛋白酶切位點。
此肽接頭通常是一連串肽，例如甘氨酸和/或絲氨酸。優(yōu)選地，此肽接頭是長度約5～25個，優(yōu)選10～12個殘基的一連串甘氨酸和絲氨酸肽的混合。特別優(yōu)選的是可蛋白水解切割的接頭；特別是能被溶酶體蛋白酶，象組織蛋白酶切割的接頭。
優(yōu)選使用的氨基酸接頭L包括下列序列1.Ala Ala Ala2.Ala Ala Ala Ala，3.Ala Ala Ala Ala Ala，4.Ser，5.Ser Ser，6.Gly Gly Gly，7.Gly Gly Gly Gly，8.Gly Gly Gly Gly Gly，9.Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly，10.Gly Pro Gly，11.Gly Gly Pro Gly Gly，12.Gly Gly Gly Gly Ser，以及，當(dāng)該接頭具有蛋白酶切位點時，13.Gly Gly Tyr Leu14.Gly Gly Tyr15.Gly Phe Ala Leu16.Gly Pro Arg Leu，和17.1～16亞部分的任何組合。
其它合適的接頭公開于Robinson等.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；95，5929.
如本文所用的，“蛋白水解切割位點”是指可以被蛋白水解酶或其他蛋白水解切割試劑所優(yōu)選切割的氨基酸序列。蛋白水解切割位點包括被蛋白水解酶，尤其是組織蛋白酶或其他溶酶體蛋白酶所識別的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是構(gòu)建其中使用整個抗體的GCR融合蛋白。此融合分子包含抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)以及與特異抗原結(jié)合的表位。例如，GCR可以與抗體重鏈的C-末端融合?？梢杂靡郧八枋龅姆椒▉順?gòu)建編碼全抗體融合蛋白的DNA結(jié)構(gòu)(Gillies等. Hybridoma第10卷第347-356頁)本發(fā)明也涉及編碼如上所述以及權(quán)利要求書中所描述的任一融合蛋白的DNA分子。
作為優(yōu)選實施方案，公開了編碼如上述以及權(quán)利要求書中所限定的融合蛋白的DNA分子，其包含(a)信號/前導(dǎo)序列(b)Ig分子的序列(c)有GCR生物活性的靶蛋白序列。
以上所提到的本發(fā)明的信號序列是編碼引起蛋白質(zhì)跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運的氨基酸序列的多核苷酸。在本發(fā)明中有用的信號序列包括抗體輕鏈信號序列，例如抗體14.18(Gillies等.，Jour.of Immunol.Meth.，125191，(1989))；抗體重鏈信號序列，例如，MOPC141抗體重鏈信號序列(Sakano等，Nature 2865774(1980))；以及本領(lǐng)域已知的任何其他信號序列(參看例如，Watson，Nucleic Acids Research 125145，(1984))。這些文獻(xiàn)都以參考文獻(xiàn)的形式并入此處。本領(lǐng)域已很好地描述了信號序列，已知其典型的包括16到30個氨基酸殘基，也可能包括更多或更少的氨基酸殘基。典型的信號肽由3個區(qū)組成堿性N端區(qū)域、中間疏水區(qū)域和極性較強的C端區(qū)域。中間疏水區(qū)域包括4到12個疏水殘基，在新生多肽的轉(zhuǎn)運中這些殘基使信號肽錨定跨過膜脂雙層。轉(zhuǎn)運開始之后，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中信號肽通常由稱為信號肽酶的細(xì)胞酶切除。
信號肽的潛在切割位點通常遵從“(-3，-1)規(guī)則”。因此，典型的信號肽在其-1和-3位中有小的中性氨基酸殘基，并在此區(qū)域中缺少脯氨酸殘基。信號肽酶將在-1和+1氨基酸間切下這樣的信號肽。因此，DNA編碼的信號序列部分可以在分泌過程中從融合蛋白的氨基端切下。這導(dǎo)致分泌出由Ig區(qū)和靶蛋白組成的融合蛋白。von Heijne(Nucleic Acids Res.，144683，(1986))提供了信號肽序列的詳盡討論。對于在分泌盒(secretioncassette)中的使用，特定信號序列的適宜性可能需要一些常規(guī)試驗來確定；這是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。信號序列也稱作“信號肽”、“前導(dǎo)序列”或“前導(dǎo)肽”，這些術(shù)語中的每一個都與信號序列有相同的意思，可在此處使用。
本發(fā)明也涉及表達(dá)載體，它包含可以啟動靶蛋白，即GCR融合蛋白表達(dá)的所述DNA分子。如本文所用，“載體”指含有能并入寄主細(xì)胞并能與寄主細(xì)胞基因組重組并整入其中或者能像附加體一樣自主復(fù)制的核苷酸序列的任何核酸。此類載體包括線性核酸、質(zhì)粒、噬粒、柯斯質(zhì)粒、RNA載體、病毒載體或類似的。病毒載體的非限定例子包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒。如本文所用，“靶蛋白的表達(dá)”可理解為指DNA序列的轉(zhuǎn)錄，mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯以及折疊成正確有活性構(gòu)象的蛋白產(chǎn)物的分泌。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用適合于表達(dá)本申請限定的融合蛋白的真核宿主細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物宿主細(xì)胞。用所述載體轉(zhuǎn)染這樣的寄主細(xì)胞，及表達(dá)、純化和分離本發(fā)明融合蛋白的方法是本領(lǐng)域所熟知的。
因此，根據(jù)本發(fā)明的方法包括(i)構(gòu)建編碼前體蛋白的DNA，所述前體蛋白包含用于分泌的前導(dǎo)序列，Ig部分，GCR、GCRm或GCRtrunc部分以及任選地位于Ig和GCR部分之間的連接序列；(ii)把所述融合DNA放入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中；(iii)在真核細(xì)胞中表達(dá)所述融合蛋白；和(iv)純化所述分泌的融合蛋白本發(fā)明還涉及藥物組合物，此藥物組合物包含至少一個上面或下面所限定的GCR融合蛋白，優(yōu)選其中IgG的Fc部分在其C-末端氨基酸處通過肽鍵與GCR樣蛋白的N-末端氨基酸相連的融合蛋白，以及可藥用載體、稀釋劑和賦形劑。此藥物組合物可以任選地含有有助于共同治療GCR缺陷病的其他藥物或藥劑。
此藥物組合物可以是用于靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、常位注射、常位輸注，或者通過口、肺、鼻、經(jīng)皮膚給藥的形式或其他用藥形式?？梢酝ㄟ^周期性單位給藥、連續(xù)輸注、蠕動傳遞、快速濃注以及類似的方式來完成給藥。途徑可以包括一般，本發(fā)明包括這樣的藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明蛋白或衍生產(chǎn)物及可藥用稀釋料、防腐劑、增溶劑、乳化劑、輔藥和/或載體。該組合物可以包括具有不同緩沖液內(nèi)容(例如Tris-HCl，乙酸鹽，磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋液；添加劑例如去污劑和增溶劑(例如Tween80，聚山梨醇酯80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(如硫柳汞、苯甲醇)和填補物質(zhì)(如乳糖、甘露醇)。上面和下面提到的術(shù)語“腸胃外的”包括皮下、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、氣管內(nèi)注射和輸注技術(shù)。優(yōu)選腸胃外用藥。
如本文所用的，術(shù)語“可藥用載體或賦形劑”指惰性、無毒的液體填充劑、稀釋劑、溶劑或溶液，其不與活性化合物或患者發(fā)生不良反應(yīng)。適宜的液體載體為本領(lǐng)域熟知，例如無菌水、鹽水、含水的葡萄糖、糖溶液、乙醇、二醇類和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些。這些制劑也可以包含典型用于腸胃外給藥的輔藥或載體。
關(guān)于所述適宜的制劑，需要指出的是，本發(fā)明的融合蛋白可以與任何無毒的有機或無機酸最終形成可藥用鹽，顯示出改變的溶解度。無機酸有，例如，鹽酸、硫酸、磷酸以及酸式金屬鹽(如正磷酸一氫鈉和硫酸氫鉀)。有機酸的例子有，單、雙和三羧酸，如，乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、延胡索酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水楊酸和磺酸。羧基末端氨基酸部分的鹽包括與任何適宜的無機或有機堿形成的無毒羧酸鹽。這些鹽包括，例如，與堿金屬如鈉和鉀，堿土金屬如鈣和鎂，以及有機伯胺、仲胺和叔胺如三烷基胺的鹽。
典型地，用于治療糖脂貯積失調(diào)(象戈歇病、家族黑矇性白癡或法布里病)的GCR融合蛋白劑量是每天每公斤體重0.01mg到25mg，優(yōu)選約0.1到2mg，更優(yōu)選約0.1到1mg。使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的診斷工具能測定有效劑量。通常，在上述范圍內(nèi)，對于給定患者最佳治療容許劑量和給藥速率取決于多種因素，例如所用具體活性材料的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、用藥時間和途徑、清除率或治療目的。通過用藥和觀察所期望的治療結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定有效劑量。在治療過程中劑量也可以變化，開始時使用相對高的劑量，直至出現(xiàn)治療益處為止，而在維持治療益處時使用較低劑量。
本發(fā)明也涉及通過GCR融合蛋白療法，治療各種糖脂貯積失調(diào)(例如戈歇病、家族黑矇性白癡或法布里病)以及與這些疾病有關(guān)的酶的治療方法和治療系統(tǒng)。
所述治療方法就步驟而言包含多種可用于實踐本發(fā)明的形式。例如，GCR融合蛋白可以與另外的藥物和/或添加劑(例如維生素)在混合之后(即同時)給藥或者順序給藥，或可以進行單一藥物治療。另外，所述添加劑和/或其它藥物可以與融合蛋白分開用藥，時間間隔為零至3周，即，第二種活性劑基本上立即在第一種活性劑使用之后使用至在第一種活性劑使用后不超過三周使用。另外，也可以考慮改變順序，即，可以在使用融合蛋白之前使用添加劑和/或其它藥物，或者用相反的順序用藥。
在另一個實施方案，考慮與外科手術(shù)相結(jié)合使用本發(fā)明，所述手術(shù)為例如部分或全部摘除脾臟。在這方面，可以在外科手術(shù)之后使用本發(fā)明方法。作為備選方案，可以在活性劑的給藥間隔期實行外科手術(shù)。此方法的一個例子是將本發(fā)明方法和手術(shù)摘除脾臟相聯(lián)合。
根據(jù)本方法的治療典型地包括以一個或多個給藥周期施用活性劑。例如，當(dāng)進行單獨或同時GCR融合蛋白用藥時，包括單一脂類貯積疾病藥物或前述藥物和添加劑和/或另種藥物的治療組合物可以在一個周期中用藥持續(xù)約2天到約3周。此后，根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)生的判斷，如果需要的話可以重復(fù)此治療周期。類似地，當(dāng)考慮相繼地使用兩個不同藥劑時，用藥時間也典型地覆蓋相同的時期。
兩個周期間的間隔可以在約零到2個月內(nèi)變動。
在另一個實施方案中，本發(fā)明描述了治療戈歇病的方法，包括給患者施用含有一定量的如上所述的GCR融合蛋白的治療組合物作為支持療法聯(lián)合骨髓移植或者外科手術(shù)(去除作為重要糖脂貯積位點的器官，例如脾)，或者通過對患有糖脂貯積失調(diào)的患者進行預(yù)先的酶增加治療來準(zhǔn)備成功的基因治療。
通過酶替換或增加療法對以上疾病之一實施本發(fā)明的支持療法的情況下，融合蛋白的用藥可以與其他操作(即，手術(shù))分開，即所述操作和融合蛋白用藥之間的時間間隔可以為零到3周，即操作后(如骨髓移植后或手術(shù)后)基本上立即至不超過3周開始施用此藥劑，或施用此藥劑后基本上立即至不超過3周開始實行手術(shù)。另外，可以考慮順序的變化，即，融合蛋白可以在骨髓移植或外科手術(shù)之前用藥，或者以相反的順序用藥。
另外，本發(fā)明考慮包含包裝的系統(tǒng)和/或試劑盒，其提供了實施本發(fā)明方法所必需的試劑。因此，本發(fā)明描述了用于治療糖脂貯積失調(diào)的試劑盒，其包括如下包裝，所述包裝包括(a)包含一定量的上述GCR融合蛋白的治療組合物；(b)任選地可用于治療前述疾病的添加劑或支持藥物；和(c)在治療戈歇病、家族黑矇性白癡或法布里病的方法中使用這些藥劑的指導(dǎo)說明書。
本發(fā)明試劑盒中的藥劑典型地被配制成本文所述的治療組合物；因此可以是適合在試劑盒中配給的任何形式。這些形式可以包括液體、粉末、片劑、混懸液以及可用于提供本發(fā)明融合蛋白和任選地支持藥物和/或添加劑的類似制劑。這些藥劑可以提供在適于根據(jù)本發(fā)明方法單獨用藥的單獨容器中，或者備選地可以在包裝中的單一容器內(nèi)以組合在藥物組合物中的形式提供。
包裝中可以包含足夠根據(jù)本文所描述的治療方法進行一次或多次給藥的藥劑量。典型地，包裝中包含足夠滿足本文描述的一個治療周期的量。
本發(fā)明的試劑盒也包含包裝中所含材料的“使用說明書”。說明書涉及根據(jù)本方法治療糖脂貯積失調(diào)時融合蛋白和/或可選擇地支持藥物和/或添加劑的使用。由于這些方法可以根據(jù)疾病階段和類型、患者和疾病的狀況有相當(dāng)大的改變，說明書可以相應(yīng)變化以規(guī)定用藥程序。除了根據(jù)本發(fā)明方法使用融合蛋白的特征外，本發(fā)明不限制說明書的性質(zhì)。
序列信息以下氨基酸序列用于本發(fā)明
SEQ ID NO1人溶酶體GCR氨基酸序列(單字母代碼)MAGSLTGLLL LQAVSWASGA RPCIPKSFGY SSVVCVCNAT YCDSFDPPTFPALGTFSRYE STRSGRRMEL SMGPIQANHT GTGLLLTLQP EQKFQKVKGFGGAMTDAAAL NILALSPPAQ NLLLKSYFSE EGIGYNIIRV PMASCDFSIRTYTYADTPDD FQLHNFSLPE EDTKLKIPLI HRALQLAQRP VSLLASPWTSPTWLKTNGAV NGKGSLKGQP GDIYHQTWAR YFVKFLDAYA EHKLQFWAVTAENEPSAGLL SGYPFQCLGF TPEHQRDFIA RDLGPTLANS THHNVRLLMLDDQRLLLPHWA KVVLTDPEAA KYVHGIAVHW YLDFLAPAKA TLGETHRLFPNTMLFASEAC VGSKFWEQSV RLGSWDRGMQ YSHSIITNLL YHVVGWTDWNLALNPEGGPN WVRNFVDSPI IVDITKDTFY KQPMFYHLGH FSKFIPEGSQRVGLVASQKN DLDAVALMHP DGSAVVVVLN RSSKDVPLTI KDPAVGFLETISPGYSIHTY LWRRQSEQ ID NO2人IgG1 Fc區(qū)-成熟蛋白編碼序列(單字母代碼)EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GKSEO ID NO3人IgG2 Fc區(qū)-成熟蛋白編碼序列(單字母代碼)ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEYKCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK以下的實施例更詳盡地描述本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
實施例1人源Fc-GCR的表達(dá)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從寡核苷酸完全合成編碼GCR成熟形式的序列。
對合成的DNA進行工程化以使其5`端有可與Xmal相容的突出端而在3`端有可與Xhol相容的突出端。
克隆DNA，序列分析證實它編碼沒有突變的成熟GCR蛋白。
表達(dá)載體pdCs-Fc-GCR構(gòu)建如下。根據(jù)Lo等.[Protein Engineering(1998)第11卷第495頁]使含有GCR cDNA的Xmal-Xhol限制性片段與pdCs-Fc載體的Xmal-Xhol片段連接。用由此產(chǎn)生的載體，pdCs-Fc-GCR轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞以表達(dá)Fc-GCR。這個載體表達(dá)人免疫球蛋白γ1鏈Fc區(qū)。
Fc蛋白部分通常還含有糖基化位點。任選地可以用標(biāo)準(zhǔn)方法將這個位點改變?yōu)榉翘腔蛄小?br> 實施例2轉(zhuǎn)染及Fc-GCR融合蛋白的表達(dá)為進行瞬時轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒引入BHK細(xì)胞。用質(zhì)粒DNA與磷酸鈣共沉淀的方法[Sambrook等.(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring，Harbor，NY]或者用Lipofectamine Plus(Lifetechnologies，Gaithersburg，MD)根據(jù)供應(yīng)商的方案通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
為了產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系，在瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞系制備中都使用NS/0細(xì)胞。
為了得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，用電穿孔法把質(zhì)粒DNA引入細(xì)胞。在PBS中洗約5×106個細(xì)胞一次，之后在0.5ml PBS中重懸。然后在冰上于GenePulser Cuvette(0.4cm電極間距，BioRad)中將10μg線性化質(zhì)粒DNA與細(xì)胞一起孵育10分鐘。用Gene Pulser(BioRad，Hercules，CA)進行電穿孔，設(shè)置為0.25V和500microF。讓細(xì)胞在冰上恢復(fù)10分鐘，之后在生長培養(yǎng)基中重懸，然后鋪在96孔板上。通過在有100nM氨甲蝶呤(MTX)存在下生長來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，MTX是在轉(zhuǎn)染后2天引入的。每3天飼喂細(xì)胞2到3次以上，在2到3周后出現(xiàn)抗MTX抗性克隆。用抗Fc ELISA法分析來自克隆的上清液以鑒定高產(chǎn)者。在含有100nM MTX的生長培養(yǎng)基中分離并增殖高產(chǎn)克隆。
將BHK和NS/0細(xì)胞培養(yǎng)在添加有10％胎牛血清、2nM谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的Dulbecco修正Eagle培養(yǎng)基中。
為了通過凝膠電泳進行常規(guī)鑒定，將條件培養(yǎng)基中的Fc融合蛋白俘獲在蛋白質(zhì)A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)上；然后在有或沒有2-巰基乙醇的蛋白樣品緩沖液中煮沸使之洗脫。在SDS凝膠上電泳之后，通過考馬斯染色顯現(xiàn)蛋白條帶。為了純化，在磷酸鈉緩沖液(100mMNaH2PO4，pH3和150mM NaCl)中洗脫結(jié)合在蛋白質(zhì)A Sepharose上的融合蛋白。然后，洗脫物立即用0.1體積的2M Tris-HCl(pH8)中和。
實施例3碳水化合物的表征。
在100mM乙酸鈉(pH6.0)中溶解內(nèi)切糖苷酶H，終濃度為10單位/ml。在50％甘油中提供N-聚糖酶的250單位/ml懸液。將人胎盤酶或者含有GCR活性的癸基-瓊脂糖級分的50μl等分試樣調(diào)整到0.5％SDS/1Mβ-巰基乙醇，然后煮沸2分鐘。然后用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋樣品至200mM乙酸鈉pH6.0(對于內(nèi)切糖苷酶H)或200mM磷酸鈉pH8.5(對于N-聚糖酶)，樣品最終組成為0.1％SDS，0.7％NP-40和0.02M β-巰基乙醇。再次煮沸樣品1分鐘，然后加入內(nèi)切糖苷酶H或N-聚糖酶至終濃度各自為50mu/ml或20U/ml。在37℃消化約16小時。兩個去糖基化反應(yīng)都使用羧肽酶Y作為對照。
實施例4氨基酸序列分析如上所描述將用于氨基酸序列分析的樣品在SDS凝膠上進行電泳分級分離。然后如Matsudaira(J.B.C.26210035，1987)所描述方法把其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。典型地，電泳之后，凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液(0.1M CAPS，10％甲醇，pH11.0)中溫育10分鐘，之后進行電轉(zhuǎn)印(50ma，4小時)。然后，凝膠用HPLC級水洗5分鐘，用0.1％考馬斯藍(lán)R250(50％甲醇中)染色5分鐘，最后用50％甲醇-10％乙酸脫色10分鐘。PVDF膜再次用HPLC級水清洗，在氮流下干燥，在-20℃于密封袋中保存直到用于氨基酸測序。
用Applied Biosystems 470A型氣相測序儀完成氨基酸序列分析。該測序儀裝備有120A型聯(lián)機PTH氨基酸分析儀。不用polybrene預(yù)處理膜條，直接用03R PTH程序測序。切下含有目的蛋白條帶的一片約2×8mm的PVDF膜，置于聚四氟乙烯封條中央，并放入測序儀的柱體中。用這種方法可以將多條PVDF膜堆疊在一起，由此增加可用于測序的蛋白量。與10pmol人胎盤GCR經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)印到PVDF并進行10圈氨基酸測序之后得到的產(chǎn)量相比較，計算出用于重組GCR測序的初始和重復(fù)產(chǎn)量。
用本文中所描述的方法將成熟人胎盤GCR的N-末端氨基酸序列與重組人GCR的N-末端氨基酸序列比較。通過直接化學(xué)測序成熟人和重組GCR而確定的N-末端氨基酸是相同的，這表明重組產(chǎn)生的酶中的信號序列得以正確加工。
實施例5GCR分析為了進行pH分布圖和抑制作用研究，用含有0.15％Triton X-100，2.5μl的β-D-1-14C-葡糖腦苷脂(在50mg/ml牛磺膽酸鈉中7.5mg/ml)和樣品的100mM磷酸鉀緩沖液(總體積為200μl)測量GCR活性。在37℃與環(huán)己烯四醇-B-環(huán)氧化物預(yù)溫育30分鐘。為了測定Km，在pH5.9下，在含有0.15％Triton X-100和0.125％牛磺膽酸鈉的100mM磷酸鉀緩沖液中用人工底物4-甲基傘形酮-β-D-吡喃葡糖苷(4MUGP)分析β-葡糖苷酶活性。并用4MUGP監(jiān)測重組GCR的純化。
應(yīng)理解，本文描述的實施例和實施方案只有舉例說明目的；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于這些提出不同的修飾或變化，這些修飾或變化都將包括在本申請的精神和界限以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
基于本公開，其他用途對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.基本上由免疫球蛋白分子(Ig)或者其片段與非免疫球蛋白分子組成的融合蛋白，其中非免疫球蛋白分子是具有葡糖腦苷脂酶生物活性的蛋白(GCR樣蛋白)。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Ig分子對Fc受體具有特異性。
3.權(quán)利要求1或2的融合蛋白，其中Ig分子以其C末端和GCR樣蛋白的N末端共價連接。
4.權(quán)利要求1到3之任一項的融合蛋白，其中在Ig分子與GCR樣蛋白間融合接頭分子。
5.權(quán)利要求4的融合蛋白，其中接頭分子含有蛋白酶切位點。
6.權(quán)利要求5的融合蛋白，其中蛋白酶切位點對溶酶體蛋白酶具特異性。
7.權(quán)利要求1到6之任一項的融合蛋白，其中GCR樣蛋白是GCR。
8.權(quán)利要求7的融合蛋白，其中GCR是截短的(GCRtrunc)或者突變的(GCRm)。
9.權(quán)利要求7或8的融合蛋白，其中GCR或者GCR樣蛋白有改變的糖基化模式或者是非糖基化的。
10.權(quán)利要求1到9之任一項的融合蛋白，其中Ig分子是Fc部分。
11.權(quán)利要求1到9之任一項的融合蛋白，其中Ig分子是整個抗體。
12.權(quán)利要求1到11之任一項的融合蛋白，其中Ig分子或其片段是人為設(shè)計的。
13.權(quán)利要求12的融合蛋白，其中Ig分子對FcRn受體有減弱的親和力。
14.權(quán)利要求1到13之任一項的融合蛋白，其中融合蛋白內(nèi)的Ig分子是二聚化的。
15.編碼權(quán)利要求1到14之任一項的融合蛋白的DNA序列。
16.編碼根據(jù)權(quán)利要求1到14中至少一項的融合蛋白的DNA分子，其包含(a)信號/前導(dǎo)序列(b)Ig分子(c)有GCR生物活性的靶蛋白序列。
17.包含權(quán)利要求15或16的DNA的表達(dá)載體。
18.適于表達(dá)權(quán)利要求1到14中至少一項所限定的融合蛋白的宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求17的載體。
19.制備權(quán)利要求1到14中至少一項的融合蛋白的方法，所述方法包括(a)構(gòu)建編碼前體蛋白的DNA，所述前體蛋白包含用于分泌的前導(dǎo)序列、Ig分子、GCR、GCRm或GCRtrunc部份以及任選地接頭序列，(b)將所述融合DNA放入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，(c)在真核細(xì)胞中表達(dá)所述融合蛋白，和(d)純化所述分泌的融合蛋白。
20.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1到14之至少一項的融合蛋白及至少一種可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其包含至少一種其它的藥用有效藥物和/或輔藥。
22.權(quán)利要求1到14之任一項的融合蛋白在制備治療糖脂貯積失調(diào)的藥物組合物中的用途。
23.權(quán)利要求22的用途，其中糖脂貯積失調(diào)選自戈歇病、法布里病和泰-薩二氏疾病。
24.治療糖脂貯積失調(diào)的方法，包括給患有所述疾病的患者施用根據(jù)權(quán)利要求16或17的藥物組合物。
25.權(quán)利要求18的方法，其中糖脂貯積失調(diào)選自戈歇病、法布里病和泰-薩二氏疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及基本上由免疫球蛋白(Ig)分子和有葡糖腦苷脂酶生物活性的蛋白組成的新葡糖腦苷脂酶雙功能融合蛋白，通過雙功能融合蛋白的用藥，使用基于治療糖脂貯積失調(diào)(例如戈歇病、法布里病和泰－薩二氏疾病)的療法，其可用于酶替代治療和/或提高糖脂代謝。
文檔編號A61P3/10GK1630720SQ01822079
公開日2005年6月22日 申請日期2001年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月18日
發(fā)明者S·舒馬赫, S·吉利斯 申請人:默克專利有限公司