專利名稱：用于增強粘膜吸收的兩親肝素衍生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療需要抗凝療法的患者地肝素給藥。更具體的說，本發(fā)明涉及促進肝素通過粘膜組織吸收的肝素制劑。
背景技術(shù)：
肝素廣泛用作治療和預(yù)防深度靜脈血栓(DVT)和肺栓塞(PE)的最有效的抗凝藥之一。P.S.Damus等，Heparin-A Generalized View of itsAnticoagulant Action，246 Nature 355-356(1973)；L.Jin等，TheAnticoagulant Activation of Antithrombin by Heparin，94 Proc.Nat′l Acad.Sci.，USA 14683-14688(1997)。肝素療法限于住院患者，因為僅能通過注射給予肝素。R.D.Rosenberg，Biochemistry and Pharmacology ofLow Molecular Weight Heparin，34 Semin.Hematol.，2-8(1997)；G.E.Pineo & R.D.Hull，Unfractionated and Low Molecular-weight Heparin，82 Curr.Concepts Thromb.，587-599(1998)?；颊咴诔鲈簳r通常不采用靜脈內(nèi)或皮下用肝素而改用口服華法林。
然而，肝素作用緩慢，并且經(jīng)歷高度可能性的藥物與藥物相互作用。對口服傳送肝素以治療處于DVT或PE高危中的患者的組合物和方法存在長期需求。
已知肝素因其大小及其高負(fù)電性而不在胃腸道吸收。L.B.Jaques，HeparinsAnionic Polyelectrolyte Drugs，31 Pharmacology Rev.，100-166(1980)。肝素的親水特性使得它難以透入上皮細(xì)胞，這是由于低滲透性和上皮膜的極性頭部基團的排斥力造成的。D.A.Norris等，The Effect ofPhysical Barriers and Properties on the Oral Absorption of Particulates，34 Advanced Drug Delivery Reviews 135-154(1998)。盡管作為氣溶膠給予肝素或?qū)⑵渑c親脂劑或膜增強劑混合不會產(chǎn)生可檢測到的血漿肝素水平，但是近來A.Dalpozzo等New Heparin Complexes Active by Intestinal Absorption.I.Multiple Ion Pairs with Basic Organic Compounds，56 Thromb.Res.，119-124(1989)將N-[8-(2-羥基苯甲?；?氨基]辛酸酯(SNAC)開發(fā)為使肝素從胃腸道吸收的有效促進劑。R.A.Baughman等，Oral Delivery of Anticoagulant Doses of HeparinA Randomized，Double-blind，Controlled Study in Humans，98 Circulation 1610-1615(1998)。
已經(jīng)通過使肝素與疏水劑偶聯(lián)合成了新肝素衍生物以增加肝素的疏水性。Y.Lee，S.H.Kim & Y.Byun，Oral Delivery of New HeparinDerivatives in Rats，17 Pharm.Res.，1259-1264(2000)；Y.Lee，H.T.Moon & Y.Byun，Preparation of Slightly Hydrophobic Heparin DerivativesWhich Can Be Used for Solvent Casting in Polymeric Formulation，92Thromb.Res.，149-156(1998；美國專利申請系列號09/300,173。在這些肝素衍生物中，肝素與脫氧膽酸(DOCA)的結(jié)合物在胃腸道中顯示出最高的吸收。提出了兩種可能性來解釋這些結(jié)果(1)因與疏水化合物結(jié)合而使肝素的疏水性增加，和(2)偶聯(lián)的DOCA與膽汁受體在回腸中的相互作用。
鑒于上述情況，應(yīng)理解提供促進肝素通過粘膜組織吸收的制劑在本領(lǐng)域中是顯著的進步。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個目的是提供促進肝素通過粘膜組織吸收的制劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供促進肝素在口服給藥后通過胃腸粘膜吸收的制劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供促進肝素通過粘膜組織吸收的給藥肝素的方法。
可以通過提供獲得增強的肝素的粘膜吸收的組合物的制備方法而確認(rèn)這些和其它目的，所述的方法包括
(a)將含有與疏水劑共價結(jié)合的肝素的兩親肝素衍生物溶于水相，所述的疏水劑選自膽汁酸類、固醇類、鏈烷酸及其混合物；
(b)使含有溶解的兩親肝素衍生物的水相分散在有機相中，使得形成乳劑；和
(c)將該乳劑干燥以得到所述組合物。
優(yōu)選地，所述的肝素是選自低分子量肝素、高分子量肝素、肝素片段、重組肝素、肝素類似物、含有肝素活性的多糖類及其混合物的成員。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案包括用于獲得增強的肝素粘膜吸收的組合物的制備方法，該方法包括將含有與選自膽汁酸類、固醇類、鏈烷酸及其混合物的疏水劑共價結(jié)合的肝素的兩親肝素衍生物分散在油相中。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案包括用于獲得增強的肝素粘膜吸收的組合物的制備方法，該方法包括
(a)將含有與疏水劑共價結(jié)合的肝素的兩親肝素衍生物溶于水或水/有機共溶劑，所述的疏水劑選自膽汁酸類、固醇類、鏈烷酸及其混合物；
(b)使含有溶解的兩親肝素衍生物的水或水/有機共溶劑分散在油相中；
和
(c)蒸發(fā)水或水/有機共溶劑，使所述的兩親肝素衍生物分散在油相中。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案包括用于獲得增強的肝素粘膜吸收的組合物的制備方法，該方法包括
(a)將含有與選自膽汁酸類、固醇類、鏈烷酸及其混合物的疏水劑共價結(jié)合的肝素的兩親肝素衍生物溶于藥用水性溶劑，使得兩親肝素衍生物在藥用水性溶劑中形成納米顆粒；和
(b)將藥用表面活性劑與所述的納米顆粒在所述的藥用水性溶劑中混合，然后破碎所述的納米顆粒，使得所述的藥用表面活性劑與肝素和疏水劑發(fā)生相互作用，從而使至少一些疏水劑暴露在納米顆粒外部。
優(yōu)選的藥用表面活性劑包括選自陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、陰離子型表面活性劑、兩親型表面活性劑、疏水型表面活性劑及其混合物等的成員。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案包括組合物，它包括多種含有與疏水劑共價結(jié)合的肝素的兩親肝素衍生物，所述的疏水劑選自膽汁酸類、固醇類、鏈烷酸及其混合物，其中使多種所述兩親肝素衍生物的形成為具有外表面的納米顆粒，使得至少一些疏水劑暴露在外表面上。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案包括含有下列組成的混合物的劑型
(a)有效量的組合物，它包括多種含有與疏水劑共價結(jié)合的肝素的兩親肝素衍生物，所述的疏水劑選自膽汁酸類、固醇類、鏈烷酸及其混合物，其中使多種所述兩親肝素衍生物形成為具有外表面的納米顆粒，使得至少一些疏水劑暴露在外表面上；和
(b)藥用載體。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案包括用于治療需要抗凝療法的患者的方法，該方法包括給予有效量的組合物，該組合物包括多種含有與疏水劑共價結(jié)合的肝素的兩親肝素衍生物，所述的疏水劑選自膽汁酸類、固醇類、鏈烷酸及其混合物，其中使多種所述兩親肝素衍生物形成為具有外表面的納米顆粒，使得至少一些疏水劑暴露在外表面上。
附圖簡述


圖1A-C表示在水性環(huán)境(圖1A)、有機環(huán)境(圖1B)和在有表面活性劑存在的情況下(圖1C)中兩親肝素的聚集物或納米顆粒的示意圖。
圖2A和2B表示對小鼠口服給藥肝素-DOCA結(jié)合物后，通過aPTT試驗測定的凝血時間分布圖(圖2A)和通過Fxa試驗測定的濃度分布圖(圖2B)-HMWH，▲-HMWH-DOCA，■-混有游離DOCA的HMWH，●-混有游離DOCA的HMWH-DOCA。
圖3A和3D表示對小鼠口服給藥肝素-DOCA結(jié)合物后，通過aPTT試驗測定的凝血時間分布圖(圖3A)和通過Fxa試驗測定的濃度分布圖(圖3B)-LMWH，▲-LMWH-DOCA，■-混有游離DOCA的LMWH，●-混有游離DOCA的LMWH-DOCA。
圖4A和4B表示通過aPTT測定的混有LMWH-DOCA(圖4A)和LMWH-DOCA(圖4B)的DOCA對凝血時間的劑量作用空心棒-0mg/kg DOCA，實心棒-33mg/kg DOCA，陰影棒-100mg/kg DOCA，節(jié)段棒-200mg/kg DOCA。
圖5A-T表示口服給藥200mg/kg HMWH-DOCA結(jié)合物和200mg/kg DOCA的混合物后，分離自小鼠的蘇木精和伊紅染色的胃腸組織的光學(xué)顯微照片；圖5A-B分別表示0、10、30、60和120分鐘后胃的橫切面；
圖5F-J分別表示0、10、30、60和120分鐘后十二指腸的橫切面；圖5K-O分別表示0、10、30、60和120分鐘后空腸的橫切面；圖5P-T分別表示0、10、30、60和120分鐘后回腸的橫切面；全部顯微照片中的原始放大倍數(shù)均為100x。
圖6A-T表示口服給藥200mg/kg LMWH-DOCA和200mg/kg DOCA的混合物后，分離自小鼠的蘇木精和伊紅染色的胃腸組織的光學(xué)顯微照片；圖6A-E分別表示0、5、10、30和60分鐘后胃的橫切面；圖6F-J分別表示0、5、10、30和60分鐘后十二指腸的橫切面；圖6K-O分別表示0、5、10、30和60分鐘后空腸的橫切面；圖6P-T分別表示0、5、10、30和60分鐘后回腸的橫切面；全部顯微照片中的原始放大倍數(shù)均為100x。
圖7A-T表示口服給藥200mg/kg HMWH-DOCA和200mg/kg DOCA的混合物后，分離自小鼠的胃腸組織中膜或微絨毛的電子顯微照片；圖7A-E分別表示0、10、30、60和120分鐘后胃的橫切面；圖7F-J分別表示0、10、30、60和120分鐘后十二指腸的橫切面；圖7K-O分別表示0、10、30、60和120分鐘后空腸的橫切面；圖7P-T分別表示0、10、30、60和120分鐘后回腸的橫切面；全部顯微照片中的原始放大倍數(shù)均為25,000x。
圖8A-T表示口服給藥200mg/kg LMWH-DOCA和200mg/kg DOCA的混合物后，分離自小鼠的胃腸組織中膜或微絨毛的電子顯微照片；圖8A-E分別表示0、5、10、30和60分鐘后胃的橫切面；圖8F-J分別表示0、5、10、30和60分鐘后十二指腸的橫切面；圖8K-O分別表示0、5、10、30和60分鐘后空腸的橫切面；圖8P-T分別表示0、5、10、30和60分鐘后回腸的橫切面；全部顯微照片中的原始放大倍數(shù)均為25,000x。
圖9表示肝素-DOCA在選擇的油中的凝血時間分布圖-角鯊烯，▲-豆油，■-礦物油，●-橄欖油。
圖10A表示高分子量肝素或高分子量肝素-DOCA在油或緩沖劑中的凝血時間分布圖-PBS緩沖液中的HMWH，▲-橄欖油中的HMWH，■-礦物油中的HMWH-DOCA，●-橄欖油中的HMWH-DOCA。
圖10B表示低分子量肝素或低分子量肝素-DOCA在油或緩沖劑中的凝血時間分布圖-橄欖油中的LMWH(6K)，▲-PBS緩沖液中的LMWH(6K)，■-礦物油中的LMWH(6K)-DOCA，●-橄欖油中的LMWH(6K)-DOCA。
圖11表示在W/O乳劑中乳化后肝素-DOCA在油中的凝血時間分布圖-PBS緩沖液中的HMWH，▲-橄欖油中的HMWH，■-礦物油中的HMWH-DOCA，●-橄欖油中的HMWH-DOCA。
發(fā)明詳述
在公開和描述本發(fā)明用于增強兩親肝素衍生物粘膜吸收的制劑和方法前，應(yīng)理解本發(fā)明并非限于本文公開的特定構(gòu)造、工藝步驟和物質(zhì)，因為這類構(gòu)造、工藝步驟和物質(zhì)可以在一定程度上改變。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語僅用于描述具體的實施方案的目的，而并非用來起限定作用，因為本發(fā)明的范圍僅由后附的權(quán)利要求及其等同范圍來限定。
將本文涉及的用于描述本發(fā)明背景和提供其它對本發(fā)明實施方式的詳細(xì)描述的出版物和其它參考資料引入本文作為參考。提供本文討論的參考文獻僅是因為它們的公開先于本申請申請日。本文中沒有任何內(nèi)容被理解為一種允許，即未授權(quán)本發(fā)明人根據(jù)現(xiàn)有發(fā)明使這公開提前發(fā)生。
必須注意，除非上下文中另有清楚地說明，則本說明書和后附的權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)含義。因此，例如，所謂“膽汁酸”包括這類膽汁酸的兩種或多種的混合物；所謂“鏈烷酸”包括涉及的這類鏈烷酸中的一種或多種；所謂“固醇”包括涉及的兩種或多種固醇的混合物。
在描述和要求保護本發(fā)明的過程中，按照下列定義使用下面的術(shù)語。
本文所用的“含有”、“包括”、“包含”、“特征在于”及其語法上等同的術(shù)語是不排除其它未列舉的成分或方法步驟的包含性或可擴充的術(shù)語。將“含有”解釋為包括更多的限制性術(shù)語“由……組成”和“基本由……組成”。
本文所用的“由……組成”及其語法上的等同含義排除了在權(quán)利要求種未特別指定的任何成分、步驟或組分。
本文所用的“基本由……組成”及其語法上的等同含義將權(quán)利要求的范圍限定在具體物質(zhì)或步驟和本質(zhì)上不影響請求保護的本發(fā)明的基本和新穎的特征或多種特征的那些。
本文所用的“疏水肝素衍生物”、“兩親肝素衍生物”、“疏水肝素”和“兩親肝素”可以互換使用。肝素是極為親水性的物質(zhì)。通過使疏水劑與其結(jié)合增加肝素的疏水性產(chǎn)生了本文中所謂的兩親肝素衍生物或疏水肝素衍生物。各術(shù)語均是合適的，因為與比天然肝素相比肝素衍生物的疏水性增加，且肝素衍生物帶有親水部分和疏水部分而因此是兩親的。
本文所用的“膽汁酸類”指的是類固醇、膽烷酸的天然和合成的衍生物，包括、但不限于膽酸、脫氧膽酸、鵝膽酸、石膽酸、熊膽酸(ursocholixacid)、熊去氧膽酸、異熊去氧膽酸、兔脫氧膽酸(1agodeoxycholic acid)、甘氨膽酸、?；悄懰帷⒏拾泵撗跄懰?、甘氨鵝膽酸、脫氫膽酸、豬膽酸(hyocholic aicd)、豬脫氧膽酸及其混合物等。
本文所用的“固醇類”指的是結(jié)構(gòu)上與類固醇相關(guān)的醇類，包括但不限于膽甾烷醇、糞醇、膽固醇、表膽固醇、麥角固醇、麥角鈣化醇及其混合物等。
本文所用的“鏈烷酸類”指的是約4-20個碳原子的飽和脂肪酸。舉例的鏈烷酸類包括但不限于丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸及其混合物等。
本文所用的“HMWH”指的是高分子量肝素，即具有約12,000或更高平均分子量的肝素。
本文所用的“LMWH”指的是低分子量肝素，即具有小于約12,000且優(yōu)選小于約6,000(LMWH(6K))平均分子量的肝素。
本文所用的“W/O型乳劑”指的是油包水型乳劑。
本文所用的“aPTT”指的是活化的部分組織促凝血酶原激酶的時間，“FXa”指的是因子Xa。
本文所用的“DOCA”指的是脫氧膽酸，“肝素-DOCA”指的是肝素與脫氧膽酸的結(jié)合物。類似地，“HMWH-DOCA”指的是高分子量肝素與脫氧膽酸的結(jié)合物，“LMWH-DOCA”指的是低分子量肝素與脫氧膽酸的結(jié)合物。
本文所用的“藥用”指的是生理上耐受且在對人給藥時一般不會產(chǎn)生過敏或類似不良反應(yīng)，例如胃部部適，頭暈等的物質(zhì)和組合物。優(yōu)選地，本文所用的術(shù)語“藥用”指的是聯(lián)邦或國家政府的管理機關(guān)批準(zhǔn)或美國藥典或其它通常認(rèn)可的藥典中所列的用于動物且更具體的說是用于人的物質(zhì)。
本文所用的“有效量”指的是無毒性但足以以用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理有益/危害比提供所需局部或全身作用和性能的藥物或藥物活性劑的用量。本文所用的兩親肝素衍生物的有效量指的是為提供抗凝活性而選擇的用量。
本文所用的術(shù)語“載體”指的是與組合物一起給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。這類藥用載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些油，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。
本文所用的“片劑類”是含有具有或不具有適宜稀釋劑的藥物物質(zhì)且通過本領(lǐng)域中眾所周知的壓制或模塑方法制備的固體藥物劑型。片劑自本世紀(jì)后半段及其普及性的進展而已被廣泛使用。作為一種劑型片劑因?qū)χ圃焐?例如制劑的簡易性和經(jīng)濟性、穩(wěn)定性和包裝、運送和分發(fā)的便利性)和患者(例如劑量的準(zhǔn)確性、緊密性、可攜帶性、味道的溫和性和給藥的便利性)均能提供優(yōu)點而保持受到歡迎。盡管最常見的片劑為平圓形，但是它們也可以是圓形、橢圓形、橢圓形、圓柱形或三角形。它們可以在大小和重量上明顯不同，這取決于藥物物質(zhì)的含量和所用的給藥方式。將它們分成兩種通常的種類(1)壓制片劑；和(2)模塑片劑或研制片劑。除活性或治療組分或組分外，片劑還含有許多的或惰性物質(zhì)或添加劑。第一組這類添加劑包括那些有助于賦予制劑令人滿意的壓制特性的物質(zhì)，包括稀釋劑、粘合劑和潤滑劑。第二組這類添加劑有助于給予片劑成品其它所需的物理特性，例如崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和增甜劑。
本文所用的“稀釋劑”是為增加制劑體積以使片劑實際大小適合于壓制而添加的惰性物質(zhì)。常用的稀釋劑包括磷酸鈣、硫酸鈣、乳糖、高嶺土、甘露糖醇、氯化鈉、干淀粉、糖粉、硅石等。
本文所用的“粘合劑”是用于賦予粉狀物質(zhì)粘結(jié)性的試劑。粘合劑或有時稱作“成粒劑”賦予片劑粘結(jié)性，它可以確保片劑在壓制后保持完整性，并通過配制所需硬度和大小的顆粒改善自由流動性。常用作粘合劑的物質(zhì)包括淀粉；明膠；糖類，例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糖蜜和乳糖；天然和合成樹膠，例如阿拉伯膠、藻酸鈉、愛爾蘭蘚提取物、panwargum、茄替膠、isapol husk的膠漿(mucilage of isapol husks)、羧甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、Veegum、微晶纖維素、微晶右旋糖、直鏈淀粉和落葉松阿半乳聚糖等。
本文所用的“潤滑劑”是在片劑生產(chǎn)過程中執(zhí)行許多功能的物質(zhì)，所述的功能例如改善片劑成粒的流速，防止片劑物質(zhì)與沖模和沖床表面粘結(jié)，減小顆粒間的摩擦，和有利于片劑從模腔中排出。常用的潤滑劑包括滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸和氫化植物油。優(yōu)選的潤滑劑用量為約0.1％重量—約5％重量。
本文所用的“崩解劑”是有利于給藥后片劑破碎或崩解的物質(zhì)。已經(jīng)將用作崩解劑的物質(zhì)在化學(xué)上分類為淀粉類、粘土類、纖維素類、褐藻膠類或樹膠類。其它崩解劑包括Veegum HV、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、纖維素和木材產(chǎn)品、天然海綿狀物、陽離子交換樹脂類、藻酸、瓜耳膠、柑橘屬果漿、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素等。
本文所用的“著色劑”是賦予片劑更多令人滿意的外觀并且還有助于制造商在其制備過程中控制產(chǎn)品和有助于使用者鑒別產(chǎn)品的試劑。所有經(jīng)批準(zhǔn)鑒定的水溶性FD&C染料、其混合物或其相應(yīng)的色淀可以用于使片劑著色。色淀是通過使水溶性染料吸附在重金屬水合氧化物上所得到的組合，從而產(chǎn)生不溶形式的染料。
本文所用的“調(diào)味劑”在其化學(xué)結(jié)構(gòu)上可以顯著改變，范圍從簡單的酯類、醇類和醛類到碳水化合物和復(fù)合揮發(fā)油。大多數(shù)所有所需類型的合成調(diào)味劑目前均可得到。
本發(fā)明涉及含有肝素衍生物的制劑，其用于提高肝素衍生物經(jīng)粘膜層、主要是在胃腸道以及在鼻部、肺部、直腸和其它粘膜層中的生物利用度。
已經(jīng)提出了三種兩親肝素衍生物的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運機制。一種是根據(jù)兩親肝素衍生物的疏水性使兩親肝素衍生物分配在粘膜層中。另一種是通過兩親肝素衍生物與膽汁酸受體的相互作用、隨后是肝膽循環(huán)、尤其是在胃腸道中。第三種機制在于與肝素聚合物連接的接枝疏水劑可使細(xì)胞膜缺乏定向力，由此提高兩親肝素衍生物經(jīng)粘膜層的滲透性。并不清楚這些提出的機制中的哪一種在胃腸道中起主要作用。然而，已經(jīng)證實接枝疏水劑、尤其是膽汁酸極大促進兩親肝素衍生物在胃腸道中的吸收。
如上所述，可以通過偶聯(lián)疏水劑與粘膜層的相互作用使肝素衍生物經(jīng)口服被吸收。因此，應(yīng)使偶聯(lián)疏水劑暴露于胃腸道中的環(huán)境，使得與粘膜層的相互作用更易于實現(xiàn)。然而，胃腸道是水性環(huán)境，且偶聯(lián)的疏水劑傾向于聚集并形成自組裝的納米顆粒。圖1A中圖解說明了這類納米顆粒的結(jié)構(gòu)。這些兩親肝素衍生物在水性溶液中自組裝的納米顆粒10具有在顆粒的內(nèi)部聚集的偶聯(lián)疏水劑12和位于顆粒外部的親水肝素。在這種構(gòu)型中，難以使這些肝素衍生物通過粘膜層擴散，因為偶聯(lián)的疏水劑不易于與粘膜層發(fā)生相互作用。因此，提供其中這類納米顆粒結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)的制劑將是有利的，即其中偶聯(lián)的疏水劑暴露在顆粒表面上且肝素包含在納米顆粒內(nèi)部(即“反相”)。圖1B圖解說明了這類結(jié)構(gòu)，其中兩親肝素衍生物包含在油相20中，從而產(chǎn)生納米顆粒21，其中肝素聚合物22聚集在顆粒內(nèi)部且疏水部分24與顆粒外部的油相結(jié)合。
在本發(fā)明的一個解釋性實施方案中，將兩親肝素衍生物由油包水型(W/O)乳劑配制成粉末。通過將肝素衍生物溶于水相且然后使含有溶解的肝素衍生物的水相分散在有機相中而成為乳劑來制備這種制劑。在乳劑形成時，與肝素偶聯(lián)的疏水劑暴露于有機相且肝素部分在水相中聚集。然后干燥該乳劑，獲得作為粉末的肝素衍生物，所述粉劑具有所需的結(jié)構(gòu)，即含有暴露在顆粒外部上的疏水劑?？梢詫⑦@種肝素衍生物粉末配制成常用劑型，例如片劑、膠囊等，正如本領(lǐng)域中眾所周知的?？梢越?jīng)口服給藥這類肝素衍生物制劑以通過胃腸道粘膜吸收，也可以通過其它途經(jīng)給藥以通過肺、鼻、口腔、結(jié)腸、直腸和其它粘膜組織吸收。
在本發(fā)明的另一個解釋性實施方案中，可以將兩親肝素衍生物制備成油相中的分散體。通過將肝素衍生物溶于水或水/有機共溶劑、隨后將水或共溶劑分散于油相中來制備這種制劑。最終，蒸發(fā)水或共溶劑并使肝素衍生物分散在油相中。然后將所得的組合物配制成膠囊或其它常用劑型以按照本領(lǐng)域中眾所周知的方法給藥這種油。
在本發(fā)明另一個解釋性實施方案中，將兩親肝素衍生物與表面活性劑混合，所述表面活性劑例如膽汁酸、有機表面活性劑或其它藥用表面活性劑，然后使典型的納米顆粒破碎，使得表面活性劑分子可以與肝素部分和疏水部分發(fā)生相互作用，由此使至少一些疏水部分暴露在顆粒表面上。圖1C圖解說明了這種構(gòu)型，其表示含有肝素部分30和疏水部分32的納米顆粒28，兩者均與表面活性劑分子34結(jié)合。一些疏水部分出現(xiàn)在顆粒外部。
實施例
按照美國系列號09/300,173中公開的方法制備下面實施例中所用的兩親或疏水肝素結(jié)合物，將該文獻的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
實施例1
與游離DOCA一起口服給藥肝素-DOCA結(jié)合物
使飼養(yǎng)在韓國動物中心動物飼養(yǎng)廠的小鼠在給藥前禁食12小時。用乙醚麻醉重25-30g的小鼠，然后通過小心經(jīng)食道進入胃的口腔灌胃器(oral gavage)給藥口服單劑量的肝素-DOCA結(jié)合物。灌胃器由具有鈍端的不銹鋼制成以避免對組織表面產(chǎn)生損害。用碳酸氫鈉緩沖液(pH7.4)制備肝素-DOCA結(jié)合物溶液。在本實驗中使用兩種類型的肝素-DOCA結(jié)合物(a)HMWH-DOCA結(jié)合物，它含有約12,000分子量的肝素，和(b)LMWH-DOCA結(jié)合物，它含有約6,000分子量的肝素。總計給藥的肝素-DOCA結(jié)合物溶液體積為0.4ml(0.2ml肝素-DOCA結(jié)合物溶液+0.2mlDOCA)。口服給藥的肝素-DOCA結(jié)合物的量為50mg/kg、100mg/kg或200mg/kg。在每一取樣時間通過心臟穿刺采集血樣(450μl)并將其與50μl檸檬酸鈉(3.8％溶液)直接混合。立即在4℃下以2500xg將血樣離心10分鐘。分別通過aPTT試驗和Fxa試驗測定凝血時間和肝素-DOCA結(jié)合物在血漿中的濃度。
當(dāng)經(jīng)口服對小鼠分別給藥HMWH、混合了DOCA的HMWH和HMWH-DOCA時，在所有情況中aPTT試驗中的凝血時間不隨時間改變(圖2A)。然而，當(dāng)作為與游離DOCA的混合物給藥HMWH-DOCA時，凝血時間隨時間增加，且在30分鐘時觀察到了HMWH-DOCA的最長凝血時間和峰值血漿濃度(圖2A-B)。當(dāng)分別經(jīng)口服對小鼠給藥LMWH、混合了DOCA的LMWH和LMWH-DOCA時，最長凝血時間約為40秒(圖3A)。然而，當(dāng)作為與游離DOCA的混合物給藥LMWH-DOCA時，LMWH-DOCA的最長凝血時間和峰值血漿濃度分別增加至70秒和4μg/ml(圖3A-B)。
這些結(jié)果證實當(dāng)將兩親肝素衍生物配制成疏水基團位于其聚集物外部上時，兩親肝素衍生物的口服給藥得到改善。如此，疏水基團更易于進入粘膜組織，因而促進兩親肝素衍生物的吸收。
實施例2
游離DOCA對胃腸道中肝素-DOCA結(jié)合物吸收的劑量作用
用碳酸氫鈉緩沖液制備肝素-DOCA結(jié)合物溶液。肝素-DOCA結(jié)合物溶液的總給藥體積為0.4ml(0.2ml肝素-DOCA結(jié)合物溶液+0.2ml DOCA)。肝素-DOCA結(jié)合物的劑量在50-200mg/kg之間改變，且游離DOCA的劑量分別以33、100和200mg/kg改變。在每一時間采集血樣(450μl)并將其與50μl的檸檬酸鈉(3.8％溶液)直接混合。分別通過aPTT試驗和Fxa試驗測定凝血時間和血漿中肝素-DOCA結(jié)合物的濃度。當(dāng)作為與游離DOCA的混合物對小鼠口服給藥肝素-DOCA結(jié)合物(200mg/kg)時，凝血時間隨游離DOCA的劑量增加(圖4A-B)。
實施例3
胃腸道的組織學(xué)評價
如實施例1中所述通過口腔灌胃器對小鼠給藥肝素-DOCA結(jié)合物。在肝素-DOCA結(jié)合物中偶聯(lián)的DOCA對肝素的摩爾比為10；即10個分子的DOCA與1個分子肝素偶聯(lián)，且劑量為200mg/kg(包括200mg/kgDOCA)。在使用混合了游離DOCA的肝素-DOCA結(jié)合物給藥后0.5、1、2和3小時后，用乙醚麻醉小鼠并通過切斷隔膜處死。從小鼠體內(nèi)取出胃、十二指腸、空腸和回腸組織并固定在中性福爾馬林緩沖液中處理。制備尚未給藥肝素-DOCA的胃腸組織作為對照樣品。用乙醇洗滌組織樣本以除去任何水。給樣本灌注染色的硅氧烷并包埋在石蠟中。在-20℃下使用切片機將包埋的樣本切成5μm厚度的切片并置于玻璃載玻片上。然后分別用二甲苯和無水乙醇洗滌每個組織切片以除去石蠟。用蘇木精和伊紅(H & E)按照本領(lǐng)域眾所周知的方法染色制備的5μm厚度切片。
為了通過透射電鏡術(shù)(TEM)進行評價，用1％四氧化鋨的PBS溶液(0.1M，pH7.4)固定胃、十二指腸、空腸和回腸組織，然后通過將醇的濃度從50％逐步改變至100％進行水化。用氧化丙烯浸潤水化的組織并用環(huán)氧類樹脂混合物包埋。將包埋的組織切成約50-60nm厚度的載片。用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對這些載片極輕度地染色1min(1mm)并使用Hitachi7100電子顯微鏡(Tokyo，日本)進行觀察。
在H & E染色結(jié)果中，胃、十二指腸、空腸和回腸的任何部位上沒有例如偶然的上皮細(xì)胞脫落、絨毛融合、粘膜毛細(xì)管充血或病灶損傷這樣的胃腸壁受損的證據(jù)(圖5A-T和6A-T)。這些結(jié)果證實通過破壞胃腸上皮不會使肝素-DOCA結(jié)合物的吸收增加。
圖7A-T和圖8A-T表示將它們暴露于肝素-DOCA結(jié)合物后通過TEM觀察到的微絨毛的形態(tài)。對照樣品顯示出健康緊密的連接，微絨毛和線粒體。1、2和3小時后，所有切片中的細(xì)胞外觀均未顯示出如微絨毛融合、溶解、具有多孔性的細(xì)胞層失定向或細(xì)胞毒性作用的損害。
實施例4
肝素-DOCA顆粒的形態(tài)和表面成分
通過掃描電子鏡檢術(shù)-能量分散電子探針X射線分析(SEM-EDX，JEOLJSM-5800掃描顯微鏡，Tokyo，日本)測定肝素-DOCA結(jié)合物顆粒的表面形態(tài)?；旌系挠坞xDOCA減小了干燥狀態(tài)肝素-DOCA結(jié)合物顆粒表面上硫原子的濃度(表1)。這一結(jié)果證實通過混合游離的DOCA可使肝素-DOCA結(jié)合物中與肝素偶聯(lián)的DOCA部分暴露于水性溶液。
表1
肝素衍生物顆粒的表面成分
實施例5
肝素-DOCA顆粒的表面電荷
按照本領(lǐng)域中眾所周知的程序測定碳酸氫鈉緩沖液中肝素-DOCA顆粒的ζ電勢。肝素-DOCA結(jié)合物的特征在于負(fù)電勢，正如表2中所示。通過與游離DOCA混合而減少了肝素-DOCA結(jié)合物顆粒的負(fù)電勢。這是因這個事實，即通過與與游離DOCA混合，與肝素偶聯(lián)的DOCA部分可以暴露于肝素-DOCA結(jié)合物顆粒表面。
表2
實施例6
通過利用碳酸氫鈉緩沖液的分散體型制劑
首先，將1.5g碳酸氫鈉溶于50ml的PBS緩沖液(pH7.4，I＝0.15)以制備3％碳酸氫鈉緩沖液。對受試動物給藥的緩沖液體積為0.5ml/kg。將肝素-DOCA結(jié)合物與碳酸氫鈉緩沖液混合并使用超聲法分散(80W，3分鐘)。肝素-DOCA結(jié)合物在含水緩沖液中充分分散成納米顆粒。
實施例7
利用DOCA作為表面活性劑的分散體型制劑
將肝素-DOCA結(jié)合物溶于3％碳酸氫鈉緩沖液。然后，將33、100和200mg/kg的DOCA分別溶于蒸餾水，且進行超聲處理。超聲處理后，將DOCA溶液分別與肝素-DOCA結(jié)合物溶液混合并再次超聲處理(80W)3分鐘。將給藥的緩沖液的體積為0.5mg/kg。
實施例8
利用幾種油的分散體型制劑(藥物/油)
根據(jù)小鼠的重量確定肝素-DOCA結(jié)合物的量(劑量200mg/kg，100mg/kg，50mg/kg和20mg/kg)。然后，將肝素-DOCA結(jié)合物粉末分別與豆油、礦物油、橄欖油和角鯊烯混合。隨后以15,000rpm分別將這些分散體勻化10分鐘。當(dāng)經(jīng)口服給藥分散于油中的肝素-DOCA結(jié)合物時，肝素-DOCA在橄欖油或礦物油中的凝血時間顯示高于肝素-DOCA在角鯊烯中的凝血時間，正如圖9中所示。LMWH(6K)-DOCA也顯示出高于LMWH(6K)在橄欖油中的凝血時間。
實施例9
利用W/O型乳化方法的分散體型制劑
首先，通過在80W下超聲處理3分鐘將100mg肝素-DOCA結(jié)合物分散于10ml的水中。然后，分別加入40ml的Tween 20，40，60和80，隨后以8,000rpm進一步勻化10分鐘。在80℃下通過在氮氣沖洗下蒸發(fā)，從所得乳劑中除去水。為了制成進一步精細(xì)的乳劑，在除去水后對所述制劑進行超聲處理(80W，3分鐘)。
實施例10
利用W/O型乳化方法的分散體型制劑
首先，通過在80W下超聲處理3分鐘將100mg肝素-DOCA結(jié)合物分散于10ml的水中。然后，分別加入20ml的Span 20，40，60和80，隨后在相同條件下進一步進行超聲處理。在真空中將所得分散于油中的肝素-DOCA結(jié)合物干燥24小時以除去水。
實施例11
利用凍干乳化法的分散體型制劑
將肝素-DOCA結(jié)合物(5-20％w/v)分散于蒸餾水中。向該分散體中加入Miglyol 812(10-40％)，并以8,000-12,000rpm使用Silverson混合器(Silverson Machines，Waterside，英國)以制備具有良好形態(tài)特性的乳劑。在水性介質(zhì)中分散的肝素-DOCA和Miglyol 812作為乳相出現(xiàn)。接下來，將50ml的2-丙醇用于在-10℃下除去Miglyol 812，共進行20分鐘。然后在減壓條件下將肝素-DOCA結(jié)合物干燥24小時以除去水。將所得乳劑(0.8gm)放入直徑為15mm且長度為6mm的PVE泡罩。將這些PVE泡罩在80W下超聲處理3min(3mm)。
實施例12
通過利用凍干乳化法與表面活性劑的分散體型制劑
將肝素-DOCA結(jié)合物(5-20％w/v)和游離DOCA分散于蒸餾水中。然后向該分散體中加入Miglyol 812(10-40％)并使用Silverson混合器(Silverson Machines，Waterside，英國)以15,000rpm制備乳劑，總計進行15分鐘。接下來，將50ml的2-丙醇用于在-10℃下除去Miglyol 812，共進行20分鐘。然后在減壓條件下將混有游離DOCA的所得肝素-DOCA結(jié)合物干燥24小時以除去水。接下來將這些乳劑(0.8g)分別與豆油、礦物油、橄欖油和角鯊烯混合并以15,000rpm勻化10分鐘。
實施例13
反相肝素-DOCA結(jié)合物粉末的制備
首先，使50mg肝素-DOCA結(jié)合物分散于2ml水中。接下來，加入10ml HCO-60(5％，聚氧乙烯氫化蓖麻油衍生物)，并以8,000rpm勻化10分鐘。收集乳劑并在10℃下使用10ml異丙醇除去HCO-60。在攪拌10分鐘后，過濾乳劑(0.45mm膜過濾器)，并在凍干機上將濾液干燥24小時。當(dāng)將在橄欖油或PBS緩沖液中的未修飾的肝素對小鼠口服給藥作為對照時，凝血時間沒有增加。另一方面，當(dāng)對小鼠口服給藥橄欖油或礦物油中的肝素-DOCA時，凝血時間如圖11中所示增加。
實施例14
利用Sorbital的反相肝素-DOCA結(jié)合物的片劑型制劑
首先，混合sorbital(3個體積)和按照實施例13程序制備的反相肝素-DOCA結(jié)合物粉末。對該混合物稱重并緩慢加入粘合劑(1μl粘合劑溶液/10mg)。為進行該程序，將7.5％聚乙烯吡咯烷酮與25％乙醇用作粘合劑。將粉末和顆粒與粘合劑和1％潤滑劑(硬脂酸鎂)混合。在測定該溶液的濃度后，將其放置在壓力箱(press kit)(400磅)中并施壓。制備片劑并在室溫下干燥。
實施例15
利用Sorbital和DOCA的反相肝素-DOCA結(jié)合物的片劑型制劑
混合sorbital(3個體積)、脫氧膽酸和反相肝素-DOCA結(jié)合物粉末。對該混合物稱重并緩慢加入粘合劑(1ml粘合劑溶液/10mg)。為進行該程序，將7.5％聚乙烯吡咯烷酮與25％乙醇用作粘合劑。將粉末和顆粒與粘合劑和1％潤滑劑(硬脂酸鎂)混合。在測定該溶液的濃度后，將其放置在壓力箱(400磅)中并施壓。制備片劑并在室溫下干燥。
實施例16
利用二相(Biphasic)釋放片法的反相肝素-DOCA結(jié)合物的片劑型制劑
將稀釋劑例如玉米淀粉與反相肝素-DOCA結(jié)合物混合，并加入1％甲基纖維素。然后使用25-目篩過濾該溶液并在40℃下干燥。加入指定量的崩解劑以誘導(dǎo)在胃腸道中快速釋放。將聚乙烯吡咯烷酮和羥基乙酸淀粉鈉(sodium starch glycolate)用作崩解劑。向該制劑中加入少量硬脂酸鎂和膠體二氧化硅并攪拌15分鐘。將幾種不同濃度的羥丙基甲基纖維素(HPMC)與該溶液混合而形成延長釋放層。
實施例17
利用二相釋放片劑法與DOCA(表面活性劑)的反相肝素-DOCA結(jié)合物的片劑型制劑
將稀釋劑和脫氧膽酸與反相肝素-DOCA結(jié)合物混合并加入1％甲基纖維素溶液，所述稀釋劑例如玉米淀粉。然后使用25-目篩過濾該溶液并在40℃下干燥。加入指定量的崩解劑以誘導(dǎo)在胃腸道中快速釋放。將聚乙烯吡咯烷酮和羥基乙酸淀粉鈉用作崩解劑。向該溶液中加入少量硬脂酸鎂和膠體二氧化硅并攪拌15分鐘。將幾種不同濃度的HPMC與該溶液混合以形成延長釋放層。
實施例18
利用成粒法的反相肝素-DOCA結(jié)合物的片劑型制劑
通過0.04或0.027英寸篩過濾反相肝素結(jié)合物(肝素-DOCA)。向該溶液中加入攪拌15min(15mm)的聚乙烯吡咯烷酮(MW1百萬，PVP)和粘合劑且一起混合。攪拌的物質(zhì)和粘合劑占總混合物的3.4％。使用壓制機以50KN的壓力壓制該混合物以形成片劑。
實施例19
填充了粉末的反相肝素-DOCA結(jié)合物明膠膠囊的片劑型制劑
給硬明膠膠囊填充脫氧膽酸和反相肝素-DOCA結(jié)合物。在使用5％(w/w)乙醇溶液密封膠囊后，使用噴霧法給它們再次包衣。將Eudragit E100(丙烯酸聚合物；Rohm Pharm，Darmstadt，德國)，羥丙基甲基纖維素和乙酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素(HPMC-AS)用于包衣。
實施例20
填充了溶液的反相肝素-DOCA結(jié)合物明膠膠囊的片劑型制劑
通過以80W的速度超聲處理3分鐘使反相肝素-DOCA結(jié)合物(100mg)分散于10ml礦物油中。然后，將所得溶液放入明膠膠囊內(nèi)部并密封。
實施例21
通過利用Eudragit L100的反相肝素-DOCA結(jié)合物的腸溶衣制劑
首先，將Eudragit L 100(8w/v％溶液)溶于異丙醇丙酮(1.7∶1 v/v)?；旌戏聪喔嗡?DOCA結(jié)合物和膽汁酸，然后合成片劑并使用腸溶衣包衣?；旌蟂orbital和肝素-DOCA結(jié)合物(1個體積)。將該混合物稱重并向該混合物中緩慢加入粘合劑(1μl粘合劑溶液/10mg)。為了進行該程序，將7.5％聚乙烯吡咯烷酮與25％乙醇用作粘合劑。在測定該溶液的濃度后，將其放入壓力箱(400磅)中并施壓。制備片劑并在室溫下干燥。利用單一溶液，將這些片劑浸漬包衣三次，并在室溫下干燥20分鐘。
實施例22
反相肝素-DOCA結(jié)合物的分散體型制劑
將反相肝素-DOCA結(jié)合物粉末分別與豆油，礦物油，橄欖油和角鯊烯混合。將這些混合物以15,000rpm分別勻化10分鐘。該程序使肝素-DOCA結(jié)合物分散于油中。
權(quán)利要求
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述疏水劑是一種固醇，所述固醇選自膽甾烷醇，糞醇，膽固醇，表膽固醇，麥角固醇，麥角鈣化醇和其混合物。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述疏水劑是含有約4-20個碳原子的鏈烷酸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述鏈烷酸是選自丁酸，戊酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕櫚酸，硬脂酸和其混合物的成員。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所述肝素是選自低分子量肝素，高分子量肝素，肝素片段，重組肝素，肝素類似物，含有肝素活性的多糖類和其混合物的成員。
15.權(quán)利要求8的方法，其中所述油相是一種藥用油。
16.一種用于獲得增強的肝素粘膜吸收的組合物的制備方法，該方法包括
(a)將含有與疏水劑共價結(jié)合的肝素的兩親肝素衍生物溶于水或水/有機共溶劑，所述疏水劑選自膽汁酸類，固醇類，鏈烷酸和其混合物；
(b)使所述含有溶解的兩親肝素衍生物的水或水/有機共溶劑分散在油相中；和
(c)蒸發(fā)所述水或水/有機共溶劑，使所述兩親肝素衍生物分散在所述油相中。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述疏水劑是一種膽汁酸，所述膽汁酸選自膽酸，脫氧膽酸，鵝膽酸，石膽酸，熊膽酸，熊去氧膽酸，異熊去氧膽酸，兔脫氧膽酸，甘氨膽酸，?；悄懰?，甘氨脫氧膽酸，甘氨鵝膽酸，脫氫膽酸，豬膽酸，豬脫氧膽酸和其混合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述膽汁酸是脫氧膽酸。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述疏水劑是一種固醇，所述固醇選自膽甾烷醇，糞醇，膽固醇，表膽固醇，麥角固醇，麥角鈣化醇和其混合物。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述疏水劑是含有約4-20個碳原子的鏈烷酸。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述鏈烷酸是選自丁酸，戊酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕櫚酸，硬脂酸和其混合物的成員。
22.權(quán)利要求16的方法，其中所述肝素是選自低分子量肝素，高分子量
全文摘要
本發(fā)明公開了用于增強肝素粘膜吸收的制劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，將由與疏水劑共價結(jié)合的肝素組成的兩親肝素衍生物溶于水相，然后將水相分散在有機相中，使得形成乳劑，然后干燥該乳劑以獲得粉狀組合物。在另一個實施方案中，將所述的兩親肝素衍生物溶于水或水/有機共溶劑，然后將水或共溶劑分散在油相中，然后蒸發(fā)水或共溶劑，使所述兩親肝素衍生物分散在油相中。在另一個實施方案中，將所述兩親肝素衍生物溶于含水溶劑，將表面活性劑與含水溶劑混合，并使兩親肝素衍生物的納米顆粒破碎，使具有表面活性劑分子的納米顆粒與該納米顆粒外部上疏水劑結(jié)合。還描述了按照這些方法制備的組合物。
文檔編號A61K47/12GK1531436SQ0182323
公開日2004年9月22日 申請日期2001年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月9日
發(fā)明者邊榮魯, 李容圭 申請人:(株)美大富歷壽