專(zhuān)利名稱(chēng)：體內(nèi)原位培植再生干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)和器官再生的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織生理修復(fù)和器官功能性再生的組合物，更具體而言，涉及一種組合物，它能夠通過(guò)誘導(dǎo)體內(nèi)原位多能性再生干細(xì)胞，使之增殖，實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物和/或人體組織的生理性修復(fù)和再生具有完全功能的人體器官。本發(fā)明還涉及該組合物的使用方法和/或其他用途。
背景技術(shù)：
大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物和生物材料方面的技術(shù)進(jìn)步，使組織工程學(xué)行業(yè)正在加速地發(fā)展，這些產(chǎn)品均是在體外，即動(dòng)物或人體的體外產(chǎn)生或合成，然后移植到宿主身上，達(dá)到組織修復(fù)或其它治療的目的。
現(xiàn)代組織工程學(xué)的方法之一是將一種合成的材料移植進(jìn)人體，作為結(jié)構(gòu)性支架，支撐組織的生長(zhǎng)。例如，Etex公司(該公司位于美國(guó)馬里蘭州劍橋)生產(chǎn)的α-BSM合成骨替代物可以應(yīng)用于整形外科、牙科和顱面。α-BSM是一種極小的水晶狀鈣磷酸鹽，它模仿骨骼中礦組合物含量的組成成份和結(jié)構(gòu)。當(dāng)這種材料與鹽混合時(shí)，變?yōu)楹隣?，可注射進(jìn)入空隙中，也可植入體內(nèi)，用作可塑性的油灰。一旦這種材料置入適當(dāng)位置，體溫的升高會(huì)使之變硬。結(jié)果，植入物成了一個(gè)支架，最終被吸收，由新的骨組織替代。
組織工程學(xué)的另一種方法是利用與合成物相反的生物基體，為受損或患病組織的修復(fù)和再生提供基礎(chǔ)。取新鮮的人體尸體皮膚，通過(guò)一定的控制手段，即，除去皮膚以及真皮上的細(xì)胞，但不改變細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜復(fù)合體，可制成非細(xì)胞皮膚基體[參見(jiàn)Wainwiright的文章(1995)，Burns雜志的21期第243-248頁(yè)]。為彌補(bǔ)人體尸體皮膚的匱乏，采用同樣的方法，也可用新鮮的動(dòng)物，如豬皮膚制成非細(xì)胞真皮基質(zhì)[參見(jiàn)Liversey等的文章(1995)，Transplantation雜志601-9]。最近LifeCell公司(位于新澤西州Branchburg)發(fā)明了用化學(xué)方法處理人體皮膚，生產(chǎn)出人體皮膚基質(zhì)。通過(guò)這種化學(xué)方法，可以去除所有的皮膚細(xì)胞，但保留生物活性和結(jié)構(gòu)性皮膚基質(zhì)。有人認(rèn)為，這樣一種結(jié)構(gòu)性、生物化學(xué)性完好無(wú)損的非細(xì)胞基質(zhì)可以提供一種信息的立體式結(jié)構(gòu)排列，在一個(gè)正常的再生反應(yīng)中指導(dǎo)血管再形成和恢復(fù)。非細(xì)胞人皮膚基質(zhì)可用作同種異體移植物，即從捐贈(zèng)者而不是宿主本人身體獲得的移植物。將基質(zhì)在液氮中冷凍，然后破裂成100個(gè)微米小粒，這些直徑很小的非細(xì)胞血管移植物可發(fā)育為冠狀動(dòng)脈分流程序中自體移植血管的替代物。
皮膚的創(chuàng)面愈合代表了組織工程學(xué)的一個(gè)主要目標(biāo)。皮膚創(chuàng)面的修復(fù)涉及了炎性細(xì)胞、血管細(xì)胞、結(jié)締細(xì)胞、組織和上皮細(xì)胞的定期平衡活性。大面積或深度創(chuàng)面的傳統(tǒng)療法采用了所謂的干燥療法，即，使創(chuàng)面置于一個(gè)溫暖干燥的環(huán)境中結(jié)痂。目前所用的方法用臨時(shí)的敷料覆蓋創(chuàng)面，進(jìn)行局部治療，包括使用抗生素(如SD-Ag磺胺嘧啶銀)。附屬發(fā)明，如外科清創(chuàng)，通常用于去除焦痂或已死亡的組織。對(duì)于燒傷創(chuàng)面，切線(xiàn)式切除部分或全層創(chuàng)面的外科方法盡管存在著一些缺陷，如在大面積創(chuàng)面中造成失血，卻仍在廣泛應(yīng)用。采用此種方法時(shí)，先將創(chuàng)床準(zhǔn)備好，隨后用自體移植皮或臨時(shí)敷料覆蓋創(chuàng)面，以促進(jìn)愈合。
自體移植皮取自于宿主，用作病人自身創(chuàng)面的永久性覆蓋物。由于移植皮來(lái)自于病人本身，又植回到病人自身，可以避免與免疫相關(guān)的問(wèn)題。移植皮可取自于病人身上相鄰的未損傷部位，在質(zhì)地、顏色和厚度上力求相近。對(duì)于小面積創(chuàng)面，通過(guò)網(wǎng)孔儀器，擴(kuò)張自體移植皮的面積，可使愈后皮膚達(dá)到很好的質(zhì)量[參見(jiàn)Tanner等(1964)在Plastic Reconstr.Surg.34287-292；Richard等(1993)在Burn Care Rehabil.14690-695]。但是，過(guò)多的網(wǎng)眼通常導(dǎo)致愈后皮膚易于被感染，且呈筐條狀，在外形上不美觀(guān)。研究人員還開(kāi)發(fā)了一些替代方法，如Meek島移植皮或三明治移植皮，它比網(wǎng)眼皮膚更容易處理，使自體皮大大擴(kuò)展[參見(jiàn)Meek(1954)Am.J.Surg雜志96557-558以及Kreis等(1994)Burns雜志10(增補(bǔ)1)S39-S42]。
但是，自體移植方法在治療大面積創(chuàng)面病人時(shí)面臨著不少的困難和限制。人們意識(shí)到，在治療深度燒傷或大面積創(chuàng)面時(shí)，利用病人的自體皮供皮區(qū)無(wú)法使創(chuàng)面快速地完全封閉。在這樣的病人身上很難再找到適合的健康皮膚供皮區(qū)，從同一供皮區(qū)取皮存在時(shí)間限制，通常在同一區(qū)域再次取皮需要等上幾個(gè)星期，為的是等供皮區(qū)的愈合。這樣，“主”創(chuàng)面，即原來(lái)需要治療的創(chuàng)面就會(huì)延誤愈合，增加了出現(xiàn)并發(fā)癥的危險(xiǎn)。更嚴(yán)重的是，采集自體皮實(shí)際上是在正常的健康皮膚上產(chǎn)生了第二次創(chuàng)面，增加了感染的危險(xiǎn)和體液/電解質(zhì)的失衡。此外，從同一供皮區(qū)重復(fù)取皮會(huì)導(dǎo)致外形缺陷或形成疤痕，因而造成病人容貌畸形。
為了找到以上所述的自體同源分層移植皮的替代物，人們利用復(fù)合自體同源—同種異體的皮膚置換法開(kāi)發(fā)了兩步走程序。這種移植皮由皮膚異體皮(除去了表皮，用作病人的真皮替代物)和用病人自身的角質(zhì)細(xì)胞在體外重組的自體表皮組成[參見(jiàn)Cuono等(1986)，Lancet雜志，171123-1124；Compton等(1986)Lab.Invest.60600-612]。這種自體表皮通常在體外組建，方法由Rheinwald和Green創(chuàng)立[參見(jiàn)(1975)Cell雜志6331-344]。這種技術(shù)方法是用胰島素和嗜熱菌蛋白酶消融一小塊健康皮膚活組織，以便從表皮的基底層中分離出角質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)在體外培養(yǎng)自體角質(zhì)細(xì)胞，可獲得大量細(xì)胞，生成足夠多的表皮，用于移植。
這種兩步走的方法有不少限制，第一，在實(shí)驗(yàn)室生長(zhǎng)培養(yǎng)表皮層至少需要3周，這將會(huì)延誤創(chuàng)面覆蓋。為了獲得治療成功，在整個(gè)表皮層生產(chǎn)和創(chuàng)床的移植過(guò)程中均要求具備非常尖端的實(shí)驗(yàn)室以及訓(xùn)練有素的醫(yī)生。在缺乏這些條件的實(shí)驗(yàn)室和人力資源的地區(qū)，如戰(zhàn)場(chǎng)和發(fā)展中國(guó)家的鄉(xiāng)村地區(qū)，這種限制顯得尤為突出。第二，這種重建的表皮層需要移植到一個(gè)干凈的創(chuàng)床上，因?yàn)樗鼈儗?duì)細(xì)菌感染和殘存的殺菌劑非常敏感。因此，正確準(zhǔn)備創(chuàng)床對(duì)于這些脆弱的表皮層的存活至關(guān)重要。更值得注意的是，盡管表皮層可以依附在真皮上，但相對(duì)于天然皮膚而言，這兩層的連接是人工的。由于表皮下的真皮室的再生是一個(gè)冗長(zhǎng)的過(guò)程，因此至少在三年內(nèi)皮膚很脆弱，且經(jīng)常出現(xiàn)水泡。此外，愈合皮膚的外觀(guān)不如分層皮片移植的效果好。
為了給培養(yǎng)的表皮層提供皮膚結(jié)構(gòu)，促進(jìn)移植皮的存活，同種異體皮被用來(lái)覆蓋創(chuàng)面。清創(chuàng)后，將同種尸體異體皮覆蓋于創(chuàng)面，切除異種表皮，保留創(chuàng)面上的異體真皮。然后，在切除了表皮的尸體異體皮上移植培養(yǎng)的表皮層。尸體異體皮是無(wú)生命的，因此其抗原性大大降低。
為了克服由于培養(yǎng)自體表皮層的時(shí)間長(zhǎng)而耽擱移植的相關(guān)問(wèn)題，在臨床和實(shí)驗(yàn)中對(duì)異體培養(yǎng)表皮層進(jìn)行了試驗(yàn)。遺憾的是，盡管異體皮不含Langerhans細(xì)胞，小鼠身上進(jìn)行的移植約兩周后還是出現(xiàn)了排斥反應(yīng)[參見(jiàn)Rouabhia，Transplantation雜志，56259-264]。
異種移植皮，即，其它動(dòng)物的組織，也可用來(lái)覆蓋大面積創(chuàng)面。豬的皮膚由于與人皮膚最接近，因而是最常用的異種移植皮來(lái)源。消毒(即離子放射)以及冷凍—干燥方法可以降低豬移植皮的抗原性，以及增加抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的能力。異種移植皮最常用作II度燒傷的臨時(shí)覆蓋物，特別是用在早期切痂后[參見(jiàn)Pellet等(1984)Burn WoundCoverings，Wise DL主編，Boca Raton，CRC出版社，佛羅里達(dá)州，185-114]。
為了利于培養(yǎng)的表皮皮片移植后能夠存活，以及預(yù)防異種組織的排斥，研究人員研制了人造真皮基質(zhì)用以覆蓋創(chuàng)面。它們可用來(lái)促進(jìn)大面積切除全厚皮層創(chuàng)面的覆蓋、控制體液丟失和預(yù)防感染。這樣的人造真皮基質(zhì)包括1)由尼龍或polyglactic酸網(wǎng)眼組成的合成網(wǎng)眼，成纖維細(xì)胞可在上面進(jìn)行培養(yǎng)[參見(jiàn)Rennekampff等(1996)雜志J.Surg.Res.62288-295]；2)由成纖維細(xì)胞和牛膠原混合而成的膠原膠凍[參見(jiàn)Yanna等(1981)雜志Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs 2719-23]；以?xún)龈傻哪z原基質(zhì)為基礎(chǔ)的膠原海綿，成纖維細(xì)胞可在上面培養(yǎng)和遷移[參見(jiàn)Bell等(1979)雜志Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761274-1278及Bell等(1981)雜志J.Invest.Dermatol.81 S2-S10]；膠原膜[參見(jiàn)Ruszczak等(1998)雜志Ellipse 1433-44]；以膠原基質(zhì)為基礎(chǔ)在體外重建的類(lèi)皮膚產(chǎn)品[參見(jiàn)Sabolinski(1996)雜志Biomaterials 17311-320]。
異種皮移植方法在創(chuàng)面臨床治療上有一些局限性，尤其是在免疫原性和生物相容性方面。移植宿主與器官異種移植產(chǎn)生反應(yīng)的自然抗體水平與所用的異種動(dòng)物的動(dòng)物種類(lèi)史距離成正比增加。在器官移植中，這些抗體的出現(xiàn)導(dǎo)致過(guò)急性排斥(一般發(fā)生在血管再形成后的幾分鐘和幾小時(shí)內(nèi))，以及移植組織的丟失。
為了提供大量的角質(zhì)細(xì)胞在體外重建自體或異種表皮層，人們投入了大量的精力進(jìn)行人體角質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。形成表皮基底層的角質(zhì)細(xì)胞具有增殖能力，因此它們有規(guī)律地經(jīng)過(guò)有絲分裂、分化和向上移動(dòng)，取代在環(huán)境中不斷脫落的末端分化的角質(zhì)化細(xì)胞。表皮依賴(lài)于角化干細(xì)胞的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面愈合。干細(xì)胞最基本的、重要的也是必不可少的特性是具有廣泛的自我維持能力，至少在長(zhǎng)達(dá)有機(jī)體的一個(gè)生命周期內(nèi)，它可以增殖性地自我更新[參見(jiàn)Lajtha(1979)雜志Differentiation 1423-34]。因此，干細(xì)胞可以分裂生成短暫擴(kuò)充細(xì)胞，其進(jìn)而分化為一種或多種專(zhuān)門(mén)類(lèi)型的細(xì)胞。
角質(zhì)干細(xì)胞和短暫擴(kuò)充細(xì)胞位于表皮基底層和毛發(fā)基體[參見(jiàn)Lavker等(1983)雜志J.Invest.Dermatol.81121s-127s；Rochat等(1994)雜志Cell 761063-1073]。在制備移植用的表皮皮片時(shí)，在培養(yǎng)物中培養(yǎng)基底角質(zhì)細(xì)胞，生成大量的子代。在培養(yǎng)環(huán)境中維持這些干細(xì)胞是有較大難度的。對(duì)角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的質(zhì)量必須仔細(xì)監(jiān)控，如直接證實(shí)培養(yǎng)物中完全克隆是否出現(xiàn)，角質(zhì)細(xì)胞參照細(xì)胞系的定期克隆分析，包括克隆形成能力和生長(zhǎng)潛力，以及監(jiān)控失敗克隆的百分比等等。不當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件會(huì)不可逆地加速克隆改變，迅速導(dǎo)致干細(xì)胞的消失，使培養(yǎng)的自體移植皮或異體移植皮移植無(wú)效。
除了角化干細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)中也培養(yǎng)其它類(lèi)型的干細(xì)胞，以期提供足夠數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行組織修復(fù)或用于其它治療。在適當(dāng)?shù)臈l件下也可培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞(ES)。Thomson等展示了來(lái)自哺乳動(dòng)物胚囊的內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞可以在組織培養(yǎng)中得以維持，在這樣的條件下，它們可以無(wú)限期地增殖為多能性干細(xì)胞[參見(jiàn)Thomson等(1998)Science 2821145-1147]。從胚囊的內(nèi)細(xì)胞群分離出原始胚囊，接種于成纖維細(xì)胞層，在其間形成內(nèi)細(xì)胞群衍生的細(xì)胞群。取出內(nèi)細(xì)胞群衍生的細(xì)胞團(tuán)，將其分散為游離細(xì)胞，再重新接種于胚胎滋養(yǎng)層。選擇具有簡(jiǎn)潔形態(tài)、含高核仁/細(xì)胞質(zhì)比率細(xì)胞的克隆，以及突核仁，而后培養(yǎng)所選克隆的細(xì)胞。用這種方法，建立了primate胚胎干細(xì)胞系。據(jù)觀(guān)察，在體外經(jīng)4～5個(gè)月的未分化增殖，這些細(xì)胞仍保留了發(fā)育潛力，形成胚胎滋養(yǎng)層和所有三個(gè)胚胎胚層的派生物，包括內(nèi)臟上皮(內(nèi)胚層)；軟內(nèi)、骨骼、平滑肌以及紋狀肌(中胚層)；以及神經(jīng)上皮、胚胎神經(jīng)中樞和復(fù)層鱗狀上皮(外胚層)。因此，可以想像，這些胚胎干細(xì)胞可以在適宜的條件下培養(yǎng)和調(diào)控，哄誘多能干細(xì)胞分化成某一特定類(lèi)型的細(xì)胞，以及/或在體外形成各種器官。這些細(xì)胞和器官有望用作移植物，治療各種疾病和取代功能不全的身體部位。
體外胚胎發(fā)育過(guò)程具有不知預(yù)知性，是可望不可及的。胚胎干細(xì)胞分化成一種特定類(lèi)型的細(xì)胞或器官的條件難以捉摸。研究人員發(fā)現(xiàn)，要維持培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞的相對(duì)未分化的、多能性狀態(tài)，它們就必須表達(dá)固有的轉(zhuǎn)錄因子Oct4，并基本接收來(lái)自細(xì)胞活素白血病抑組合物(LIF)的外來(lái)信號(hào)[參見(jiàn)Nichols等(1998)雜志Cell 95379-391]。當(dāng)LIF撤出時(shí)，培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞會(huì)自動(dòng)地聚合成一大堆各種類(lèi)型的組織。盡管在這些細(xì)胞中基因表達(dá)的程序有些類(lèi)似于發(fā)育動(dòng)物的典型分化路徑，但這些程序的引發(fā)是混亂無(wú)序的。
在臨床上利用體外培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行成功的器官再生面臨著諸多障礙。體外培養(yǎng)的干細(xì)胞一旦被移植到患病部位，就必須被指引分化為某一特定部位的顯型。因此為了指導(dǎo)體外組織條件的設(shè)計(jì)，對(duì)這個(gè)過(guò)程所需信號(hào)需要進(jìn)行完全的譯解。一些研究人中獲得的實(shí)驗(yàn)資料在技術(shù)上顯示，盡管通過(guò)在培養(yǎng)基中添加白血病抑制劑，可實(shí)現(xiàn)多能人間葉細(xì)胞、小鼠神經(jīng)干細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)，但小鼠胚胎干細(xì)胞在體外和體內(nèi)呈隨機(jī)性分化。技術(shù)上的進(jìn)步將有可能使小鼠胚胎干細(xì)胞(ESCs)在體外被誘導(dǎo)分化為多能性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前驅(qū)，并把它們移植入髓磷脂不足的大鼠腦中。但是，當(dāng)人們將這些從特定的組織中采集來(lái)的或從體外胚胎干細(xì)胞中分化而成的多能性干細(xì)胞植入受傷的成體組織時(shí)，它們是否能成為特定部位的組織呢？這個(gè)問(wèn)題還是未能得到解答。
迄今為止，為了通過(guò)在體外培養(yǎng)干細(xì)胞來(lái)修復(fù)受損的組織和功能不良的器官，已經(jīng)投入了大量的財(cái)力和人力。但是，利用這種方法，至今尚未見(jiàn)一例成功地再生具有完全功能的人體器官的報(bào)告。例如，用體外培養(yǎng)的角質(zhì)干細(xì)胞治療創(chuàng)面僅僅可以封閉創(chuàng)面，卻不能完全恢復(fù)皮膚的生理結(jié)構(gòu)和功能。因此，迫切地需要發(fā)明新的方法，摒棄上述的策略，為人類(lèi)健康提供更多的益處。
發(fā)明概述為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明為動(dòng)物、特別是人類(lèi)提供了一種藥學(xué)或營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面的新組合物。該組合物能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、組織修復(fù)和器官再生，尤其是在體內(nèi)條件下更是如此。具體而言，一方面該組合物含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其重量百分比至少是0.01％。優(yōu)選的甾醇混合物的含量為0.01重量％～20重量％，1重量％～10重量％更佳，2重量％～6重量％最佳。
另一方面，適于口服的組合物含有溶解在食用油中的甾醇化合物，甾醇的含量范圍為0.01％～20重量％。
根據(jù)這一具體情況，進(jìn)一步而言，該組合物可以含蜂蠟，優(yōu)選的含量范圍在1％～20重量％之間，2％～10％更佳，3％～6％最佳。
該組合物也可選用含蜂膠，優(yōu)選的含量范圍在0.1％～30重量％之間，1％～20％更佳，5％～10％為最佳。
該組合物可以是含有少量的水，按重量計(jì)算，含少于0.5％水為好，最好是少于0.1％。
當(dāng)用于口服時(shí)，本發(fā)明組合物的配伍中用了藥學(xué)上可接受的、公知的載體。這些載體可使該組合物配制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、乳劑、親脂性和親水性懸浮液、液體、膠狀、糖漿、漿劑、懸浮液以及類(lèi)似物，病人可通過(guò)口服吸收。
具體而言，本發(fā)明組合物適于用膠囊劑型。用于口服的膠囊形式包括由白明膠制成的填充膠囊，以及柔軟的密封膠囊，由白明膠和可塑劑如甘油山梨(糖)醇構(gòu)成。本發(fā)明組合物更適合包含在軟膠囊內(nèi)，它可以在適當(dāng)?shù)囊后w，如，脂肪油或液體聚乙烯乙二醇中溶解。此外，還可添加穩(wěn)定劑。
用于口服的本發(fā)明組合物還可選擇將其與一種固體賦形劑混合制成，可輾成混合物，而后加工顆粒物，需要的話(huà)，還可加入適當(dāng)?shù)妮o助劑后，制成片劑或糖衣核。
另一方面，本發(fā)明還提供了用于臨床腸道外應(yīng)用/注射用的組合物，該組合物含溶解于注射用油中的甾醇化合物量至少為0.01重量％。按重量計(jì)算，優(yōu)選的甾醇化合物的含量范圍為0.01％～20％，1％～10％更佳，2％～6％為最佳。
可注射用油優(yōu)選是經(jīng)加工后適于人體臨床注射用的蔬菜油，更優(yōu)選的是玉米油、花生油、棉籽油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油或豆油，其中豆油或芝麻油為最佳選擇。
另一方面，本發(fā)明還提供了另一種胃腸外應(yīng)用/注射用的組合物，它的組成包括臨床上公知的含油相的脂肪乳化劑，以及可溶性的，至少0.01重量％溶于油脂中的甾醇化合物。優(yōu)選的甾醇化合物的含量范圍為0.01％～20重量％，1％～10％更佳，2％～6％最佳。
臨床公知的脂肪乳化劑至少由一種蔬菜油組成，選用玉米油、花生油、棉籽油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油或豆油為好。在本發(fā)明中可使用的，臨床公知的脂肪乳化劑包括如，LIPOSYN，SOYACAL，INTRALIPID，TRAVEMULSION。本發(fā)明的配方本質(zhì)上最好是不含外源性清潔劑。
根據(jù)以上的具體情況，甾醇化合物可選用動(dòng)物甾醇或植物甾醇(也稱(chēng)植物甾醇類(lèi))。動(dòng)物甾醇，如膽固醇以及所有天然或合成的，異構(gòu)體及以其衍生物。甾醇化合物更優(yōu)選使用豆甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、角甾醇，γ-谷甾醇，菜籽甾醇，α-菠菜甾醇，24-去氫膽固醇、多孔甾醇，胡蘿卜甙以及所有天然或合成的，異構(gòu)體形式及以其衍生物。甾醇化合物最好是由豆甾醇、β-谷甾醇和菜子甾醇混合組成，在此統(tǒng)稱(chēng)為“谷甾醇”。
不言而喻，對(duì)甾醇化合物的改變，即，包括側(cè)鏈修飾改變等也落入本發(fā)明的范圍。而且，本發(fā)明也不限于構(gòu)成一種甾醇組合物的任何特定組合。
甾醇化合物也可選擇溶解于藥學(xué)上可接受的、水易混合性的、非脂肪酸溶劑中，作為胃腸外用藥。這種溶劑包括，但不限于，N-甲基吡咯烷酮(NMP)；1，2-丙二醇；醋酸乙酯；二甲亞砜；二甲乙酰胺；苯甲醇；2-吡咯烷酮；苯甲酸芐酯；C2-6鏈烷醇；2-乙氧基乙醇；烷化酯，如醋酸乙氧乙酯，醋酸甲酯，醋酸乙酯，乙二醇乙醚，或乙二醇甲醚；(s)-(-)乳酸乙酯；丙酮；丙三醇(甘油)；烷化酮，如甲基乙基酮或二甲砜；四氫氟喃；環(huán)烷化酰胺，如caprolactam；dycylmethylsulfoxide；油酸；芳族胺如N，N-二乙基-m-甲苯甲酰胺；或1-十二烷基氮雜庚-2-酮。
在這種溶劑中也可聯(lián)合使用增溶劑，使甾醇在溶液中更易溶解。在本發(fā)明中可用的增溶劑包括，但不限于甘油三醋酸酯、聚乙二醇(如PEG300，PEG400，或與3350混合)、吐溫(如吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫65，或吐溫80)，poloxamers(如Poloxamer124，Poloxamer188，Poloxamer237，Poloxamer338，或Poloxamer407)，聚氧乙烯醚(polyoxyethylene ethers)如聚氧2十六烷基醚(Polyoxyl 2 cetyl ether)，聚氧10十六烷基醚(Polyoxyl 10 cetyl ether)，聚氧20十六烷基醚(Polyoxyl 20 cetylether)，聚氧4月桂基醚(Polyoxyl 4 lauryl ether)，聚氧23月桂基醚(Polyoxyl 23 lauryether)，聚氧2油基醚(Polyoxyl 2 oleyle ether)，聚氧10油基醚(Polyoxyl 10 oleyl ether)，聚氧20油基醚(Polyoxyl 20 oleyle ether)，聚氧2硬脂酰醚(Polyoxyl 2 stearyl ether)，聚氧10硬脂酰醚(Polyoxyl 10 steary ether)，聚氧20硬脂酰醚(Polyoxyl 20 stearylether)，聚氧100硬脂酰醚(polyoxyl 100 stearyl ether)，聚氧硬脂酸鹽(polyoxylstearates)(如聚氧30硬脂酸鹽(Polyoxyl 30 stearate)，聚氧40硬脂酸鹽(Polyoxyl 40 stearate)，聚氧50硬脂酸鹽(Polyoxyl 50 stearate)，聚氧100硬脂酸鹽(Polyoxyl 100 stearate))，聚乙氧基化硬脂酸鹽(polyethoxylated stearates)(如聚乙氧基化12羥基硬脂酸鹽(polyethoxylated 12-hydroxy stearate)，以及丁酸甘油酯。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一方面，本發(fā)明組合物最好將藥學(xué)上可接受的增溶劑排除在外。另一方面，本發(fā)明組合物最好也將聚乙氧基化蓖麻油排除在外。
根據(jù)以上任何一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)一步而言，本發(fā)明組合物可以進(jìn)一步含有黃芩甙，優(yōu)選含量范圍為0.001％～2重量％，0.2％～1重量％更優(yōu)選，0.5％～1重量％最佳。
同時(shí)，根據(jù)以上任何一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明組合物還可以含有黃柏內(nèi)酯，其優(yōu)選含量范圍為0.001％～2重量％，0.2％～1重量％更優(yōu)選，0.5％～1重量％最佳。
本發(fā)明組合物也可選擇地含有黃小蘗堿(obabenine)，其優(yōu)選含量范圍為0.001％～2重量％，0.002％～0.5重量％更優(yōu)選，0.003％～0.1重量％最佳。
同樣，本發(fā)明組合物也可選擇地含有黃連素，優(yōu)選的含量范圍為0.001％～2重量％，0.002％～0.5重量％更優(yōu)選，0.003％～0.1重量％最佳。
同樣，本發(fā)明組合物還可選擇性地含有罌粟殼堿，優(yōu)選的含量范圍為0.001％～2重量％，0.002％～0.5重量％更優(yōu)選，0.003％～0.1重量％最佳。
同樣，本發(fā)明組合物還可選擇性地含有各種氨基酸，最好是含所有18種天然氨基酸，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持。氨基酸可以是化學(xué)合成的，也可以是來(lái)自天然的。例如，全套天然氨基酸可以通過(guò)油或酒精提取地龍獲得，地龍富含蛋白質(zhì)/氨基酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了修復(fù)受損組織或器官的方法。方法包括將一種藥學(xué)上可接受的組合物應(yīng)用于組織或器官受損或患病的哺乳動(dòng)物，該組合物含有溶解在油脂中的甾醇類(lèi)混合物，其重量百分比至少是0.01％，從而可以充分地恢復(fù)組織或器官的生理結(jié)構(gòu)和功能。優(yōu)選的甾醇化合物的重量百分比含量范圍為0.01％～20％，1％～10％更佳，2％～6％最佳。藥學(xué)上可接受的組合物可以是上述任何一種發(fā)明組合物。
本發(fā)明提供了配制適于動(dòng)物腸胃外應(yīng)用的穩(wěn)定和無(wú)毒組合物的方法。這個(gè)方法具體是，將一種臨床上可接受的含油相的脂肪乳劑和足夠量的甾醇化合物充分混合，形成一個(gè)組合物，其含量重量百分比優(yōu)選在0.01％～20％，0.2％～15％更佳，3％～6％最佳。許多熟知的方法都可以達(dá)到充分混合，例如，用超聲波降解或?qū)⒔M合物反復(fù)通過(guò)一個(gè)，如注謝針等小孔。
以上所述的發(fā)明組合物可以有很多單一或聯(lián)合給藥途徑，包括口服、外用、腸胃外、經(jīng)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)皮膚、舌下、肌肉內(nèi)、直腸、經(jīng)口腔、鼻內(nèi)、經(jīng)吸入、陰道、眼內(nèi)、經(jīng)局部傳輸(如通過(guò)導(dǎo)管或固定模)、皮下、脂肪內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)，或鞘內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物更適于通過(guò)各種給藥途徑局部應(yīng)用到受損或患病的組織/器官部位，這些給藥方法包括經(jīng)皮膚、肌肉內(nèi)、用導(dǎo)管或固定模、經(jīng)腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)以及陰道。本發(fā)明組合物也可以慢速釋放劑型單獨(dú)或聯(lián)合給藥。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物最好是通過(guò)直接和局部地給藥應(yīng)用于患病或受損器官的組織。例如，由溶解于可注射油中的甾醇組成的發(fā)明組合物可以直接注射進(jìn)心肌，它可以直接被這些組織的細(xì)胞所吸收，而無(wú)需經(jīng)過(guò)血管。
另外，其它用于疏水藥品組合物的傳輸系統(tǒng)也可選擇性地用于本發(fā)明組合物。脂質(zhì)體和乳劑是人們熟知的疏水性藥品的傳輸載體。采用長(zhǎng)期循環(huán)，即側(cè)去迂回脂質(zhì)體為更為優(yōu)選。本發(fā)明組合物還可選擇性地應(yīng)用于靶標(biāo)藥品傳輸系統(tǒng)，如涂有抗體的脂質(zhì)體中，其靶標(biāo)是需修復(fù)或再生的組織/器官，如特定腫瘤的抗體。這些脂質(zhì)體將被相關(guān)部位選擇性地作為靶標(biāo)并吸收。
同樣，本發(fā)明組合物還可選擇使用一種持續(xù)不變的釋放傳輸系統(tǒng)，如含治療成份的固體疏水性聚合物的半滲透基質(zhì)。
通過(guò)各種體內(nèi)和體外的給藥途徑，上述所述的本發(fā)明組合物和方法在生物學(xué)和藥學(xué)上具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。
值得注意的是，本發(fā)明組合物也適用作體外細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基或體外的組織和/或器官的重建。
從形態(tài)學(xué)上而言，本發(fā)明組合物和方法可用來(lái)激發(fā)休眠的成體干細(xì)胞(ASCs)，或誘導(dǎo)成體組織細(xì)胞在體內(nèi)和/或體外轉(zhuǎn)變?yōu)槌审w干細(xì)胞。進(jìn)一步而言，這些發(fā)明組合物可用于誘導(dǎo)細(xì)胞的特定組織形態(tài)形成，使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，從而可導(dǎo)致細(xì)胞反分化，即，一個(gè)分化的細(xì)胞復(fù)原為未分化細(xì)胞(干細(xì)胞)。此外，它們也可用來(lái)抑制細(xì)菌毒素，這大概是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)和功能以及改變細(xì)菌細(xì)胞循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)明組合物可用于激活各種酶如致活酶和磷酸酯酶，以及信號(hào)分子如在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中起著重要作用的cAMP，從而支持了細(xì)胞生長(zhǎng)和維持各種類(lèi)型細(xì)胞的平衡，以確保修復(fù)和再生具有生理功能的組織和器官。
在細(xì)胞間，本發(fā)明組合物可用于促進(jìn)同種或不同種細(xì)胞的特定組織聯(lián)結(jié)，這可能是通過(guò)各種細(xì)胞粘連分子(CAM)如連結(jié)蛋白和cadherin的表達(dá)和激活的刺激，以形成各種生理性連接來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
在組織水平上，本發(fā)明組合物可通過(guò)促進(jìn)組織間生理連接的形成，用于促進(jìn)組的特定器官組裝。
作為人體和動(dòng)物用藥，本發(fā)明組合物可用來(lái)治療由損傷、疾病和衰老引起的各種身體狀況。正如臨床上所示，本發(fā)明所披露的方法是通過(guò)原位培養(yǎng)再生的干細(xì)胞，進(jìn)行新器官的再生或克隆。
本發(fā)明還涉及一種在體外培養(yǎng)真核生物，尤其是培養(yǎng)哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的方法，該方法包括將一種組織細(xì)胞與含至少0.01重量％的溶于油脂中的甾醇化合物的組合物相接觸；所述的組織細(xì)胞生成組織干細(xì)胞；所述的組織干細(xì)胞經(jīng)進(jìn)一步誘導(dǎo)調(diào)節(jié)后分化成各種組織干細(xì)胞；經(jīng)過(guò)對(duì)所述的各種組織干細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞結(jié)合形成相應(yīng)的成體組織與器官。
所述的組合物還含有0.001％～99.9重量％的選自黃芩苷，黃柏內(nèi)酯，黃連素，地龍油脂提取物，罌粟殼油脂提取物或其混合物。所述的組合物中的甾醇化合物含量是0.01％～20重量％。
另外，本發(fā)明還涉及一種真核生物，尤其是培養(yǎng)動(dòng)物的干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基中含有脂溶性甾醇化合物，其含量是0.0l重量％～20重量％。其中所述甾醇化合物是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。所述甾醇化合物可以是選自一種豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。
再者，培養(yǎng)基中加入的甾醇化合物也可以是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明提供一種抗消化道潰瘍藥物組合物，它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量是0.01重量％～20重量％。所述油脂是動(dòng)物油或植物油。植物油可以選自玉米油、花生油、棉子油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油和豆油。
該組合物中所述甾醇化合物可以是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。其甾醇化合物可以是選自一種豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。特別是甾醇化合物可以是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
另外一種促毛發(fā)再生藥物組合物，它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。優(yōu)選的是所述甾醇化合物的含量是0.01～20重量％。所述油脂是動(dòng)物油或植物油。所述植物油選自玉米油、花生油、棉子油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油和豆油。而且該甾醇化合物可以是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。甾醇化合物可以選自一種豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇，特別是所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
另外本發(fā)明還提供一種抑制或殺滅細(xì)菌與病毒的藥物組合物，它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。優(yōu)選的是所述甾醇化合物的含量是0.01～20重量％。該油脂是動(dòng)物油或植物油。植物油可以選自玉米油、花生油、棉子油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油和豆油。所述甾醇化合物可以選自一種豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。另外，甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
本發(fā)明還涉及一種由重要是油脂和蜂蠟構(gòu)成的壞死組織清除劑，所述的油脂中的含有至少是0.01重量％甾醇化合物，蜂蠟的含量是1～20重量％。其中優(yōu)選的甾醇化合物的含量是0.01～20重量％，更優(yōu)選的的為1～10重量％。油脂可以包括動(dòng)物油或植物油。植物油可以選自玉米油、花生油、棉子油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油和豆油。所述甾醇化合物可以是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。這種甾醇化合物可以選自一種豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。而甾醇化合物也可以是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。清除劑中可以含有黃小蘗堿(obabenine)，其含量范圍為0.001重量％～2重量％。


圖1為本發(fā)明揭示的活體組織中體內(nèi)原位干細(xì)胞培養(yǎng)組織修復(fù)與器官再生的基本原理圖。
圖2為本發(fā)明方法所包括的八大相關(guān)技術(shù)的說(shuō)明圖。
圖3A和圖3B為本發(fā)明組合物成功地治愈胃潰瘍的動(dòng)物模型。
圖4為顯示局部使用本發(fā)明的組合物用于人頭皮上，禿發(fā)人毛發(fā)再生的比較圖。
圖5A顯示，在傷后第1天，表皮凝固性壞死和真皮淺層膠原纖維變性。
圖5A-C顯示了在深I(lǐng)I度燒傷傷后第10天細(xì)胞和組織發(fā)生的改變。
圖5B顯示傷后第6天，通過(guò)使用發(fā)明組合物進(jìn)行治療后，壞死組織被完全液化排除的狀況。
圖6所示，在傷口愈合階段，在創(chuàng)面內(nèi)有大量的組織干細(xì)胞活躍地繁殖。
圖7所示圖6在高倍放大后，可以觀(guān)察到再生的干細(xì)胞間的特殊連接。
圖8示出組織干細(xì)胞依據(jù)在胚胎階段就已經(jīng)確定的遺傳程序，有方向性地分化成各類(lèi)細(xì)胞。圖中可見(jiàn)各種細(xì)胞向它們的同族組織起源的位置強(qiáng)烈地移動(dòng)。
圖9所示高倍放大后，可以觀(guān)察到成纖維細(xì)胞的合成代謝。
圖10顯示在沒(méi)有本發(fā)明組合物存在的情況下，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，并表現(xiàn)出與變形細(xì)胞相似的形態(tài)。
圖10B顯示培養(yǎng)于本發(fā)明組合物中的成纖維細(xì)胞保持典型的成熟成纖維細(xì)胞的形態(tài)。
圖11顯示在傷后第20天，大部分傷口被復(fù)層鱗狀上皮覆蓋，而且大部分附件開(kāi)始在真皮內(nèi)形成。
圖12顯示在傷后第22天，再生出具有正常結(jié)構(gòu)皮膚。
圖13顯示在電子顯微鏡下，可以見(jiàn)到真皮和表皮之間的連接。
圖14顯示在電子顯微鏡下，膠原纖維在新生皮膚內(nèi)按正常三維結(jié)構(gòu)的順序排列的情況。
圖15A-D顯示了在試管內(nèi)培養(yǎng)大鼠皮膚細(xì)胞，在加入和未加入本發(fā)明組合物的不同結(jié)果。其中，圖15A顯示在10天之內(nèi)兩組細(xì)胞都健康地生長(zhǎng)的狀況；圖15B顯示兩組細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)發(fā)生的變化。圖15C顯示在第49天，在對(duì)照組有更多的細(xì)胞死亡，在治療組細(xì)胞仍然繼續(xù)旺盛地增殖狀況。圖15D顯示在治療組，細(xì)胞仍然強(qiáng)勁地生長(zhǎng)，幾乎接近融合。
圖16A-C顯示了在試管內(nèi)培養(yǎng)大鼠毛囊干細(xì)胞，在加入和未加入本發(fā)明組合物的不同結(jié)果。
圖17A-C顯示了在試管內(nèi)培養(yǎng)大鼠皮膚，在加入和未加入本發(fā)明組合物的不同結(jié)果。
圖18顯示一位20歲女性病人被汽油火焰燒傷雙下肢，燒傷總面積(TBSA)35％的情況。
圖19顯示圖18所示的女性病人觀(guān)察燒傷創(chuàng)面組織切片鏡下所見(jiàn)。
圖20A-C顯示圖18所示的女性病人用特異的小鼠抗人角蛋白19型的單克隆抗體(McAb)對(duì)正常和燒傷皮膚進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查的結(jié)果。
圖20D-F顯示圖18所示的女性病人燒傷后7天(圖20D)和14天(圖20E)至燒傷后21天(圖20F)的狀況。
圖21和22所示圖18所示的女性病人進(jìn)入再生狀態(tài)的皮膚組織切片在顯微鏡下檢查，可見(jiàn)增生活躍的新生上皮組織、膠原纖維和皮膚胚胎基(EB)。
圖23顯示圖18所示的女性病人新的人體器官能夠在體原位再生，而且再生的器官無(wú)論在細(xì)胞水平還是組織水平都具有正常的結(jié)構(gòu)和功能。
圖24進(jìn)一步顯示傷后30天，該從病人身上取到的新生皮膚組織切片。
圖25顯示采用本發(fā)明的方法和組合物治療后30天，皮膚組織切片。
圖26顯示再生的新皮膚中，膠原纖維的粗細(xì)和空間排列均正常，直徑0.1μm～0.5μm，有明暗相間的周期性(64nm)橫紋。
圖27A和B顯示在病人傷后30天對(duì)從新皮膚上取到的切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。
圖28與圖29顯示病人傷后20天，愈合中的創(chuàng)面組織切片在電子顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。
圖29顯示燒傷后20天，愈合中的創(chuàng)面組織切片在電子顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果，可見(jiàn)上皮細(xì)胞與基底膜之間的半橋粒連接。
圖30和31顯示另外一個(gè)面部全厚皮壞死燒傷病人身創(chuàng)面組織切片在電子顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。
圖32為組織切片在電子顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果，它顯示在機(jī)體遭受創(chuàng)傷發(fā)生反應(yīng)時(shí)，或(和)在本發(fā)明組合物所含活性成分的刺激下，殘存而尚有活力皮下脂肪組織中的間充質(zhì)細(xì)胞被活化，并轉(zhuǎn)化為成體干細(xì)胞(ASCs)。
圖33A和B為組織切片在電子顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果，它顯示這些源于它們的母系器官的組織干細(xì)胞來(lái)相互聯(lián)接，遵循在胚胎期間就已經(jīng)確立的基因程序，以一種器官特殊方式相互聯(lián)合。
圖34為組織切片在電子顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果，它顯示了血管和神經(jīng)的器官特殊聯(lián)合。
圖35為組織切片在電子顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果，它顯示在使用本發(fā)明的技術(shù)而提供的條件下，而進(jìn)行的皮膚再生過(guò)程期間毛囊的形成。
圖36為組織切片在電子顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果，它顯示皮膚附件包括血管、神經(jīng)和各種腺體都被再生，并且聚合在一起形成新生皮膚。
圖37為蜂蠟中形成的含油滴的鴿巢樣結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖38顯示蜂蠟中形成的含油滴的鴿巢樣結(jié)構(gòu)電子顯微鏡鴿巢樣三維結(jié)構(gòu)，每個(gè)單獨(dú)的油滴包含在鴿巢樣結(jié)構(gòu)里面。
圖39為壞死皮膚液化與排除的說(shuō)明圖，其中涉及蜂蠟形成的鴿巢樣結(jié)構(gòu)內(nèi)的油滴的釋放。
圖40為壞死皮膚液化與排除的說(shuō)明圖，其中為接觸傷口的蜂蠟鴿巢樣三維結(jié)構(gòu)被體溫加熱后分解，油滴被釋放。釋放的油滴滲透如創(chuàng)面組織內(nèi)將壞死組織顆粒包被在其中(步驟1)。
圖41為壞死皮膚液化與排除的說(shuō)明圖，其中被油滴包被的壞死組織開(kāi)始細(xì)胞的液化說(shuō)明圖。其結(jié)果各種細(xì)胞內(nèi)的酶被釋放出來(lái)(步驟2)。
圖42為壞死皮膚液化與排除的說(shuō)明圖，其中釋放的細(xì)胞酶進(jìn)一步分解被油滴包被的壞死組織顆粒(步驟3)。
圖43為壞死皮膚液化與排除的說(shuō)明圖，其中為通過(guò)分解的壞死組織顆粒與油滴之間的腐化和皂化反應(yīng)，固體的壞死組織顆粒被液化(步驟4)。
圖44為壞死皮膚液化與排除的說(shuō)明圖，其中通過(guò)液化組織的脂化反應(yīng)，有效成分被油滴內(nèi)的脂肪酸酯化，可以被排出創(chuàng)面(步驟5)。
圖45為壞死皮膚液化與排除的說(shuō)明圖，其中，隨著發(fā)明物的蜂蠟鴿巢樣三維結(jié)構(gòu)逐步崩潰，更多的含有有效成分的油滴被一起釋放到創(chuàng)面內(nèi)，去包繞剩下的壞死組織顆粒。同時(shí)，由于液化的壞死組織與殘存的活組織不相容，使得這些壞死組織伴隨著網(wǎng)狀框架結(jié)構(gòu)的崩潰而滲出(步驟6)。
圖46為在生理性濕潤(rùn)環(huán)境中殘存組織的“呼吸”功能說(shuō)明圖。
圖47為本發(fā)明的組合物治療組與對(duì)照組暴露于外界空氣中的兔的燒傷創(chuàng)面發(fā)生活躍的水分蒸發(fā)的比較。
圖48為本發(fā)明的組合物治療組與傳統(tǒng)干性療法(如熱烘干燥暴露療法)治療的創(chuàng)面的水分蒸發(fā)量比較。
圖49為本發(fā)明的組合物治療組與凡士林的創(chuàng)面的蒸發(fā)量治療的創(chuàng)面的水分蒸發(fā)量比較。
圖50A為顯微鏡圖片，應(yīng)用本發(fā)明的組合物治療的兔的燒傷創(chuàng)面是濕潤(rùn)的，且在48小時(shí)內(nèi)由表及里逐漸被液化狀況。顯微鏡下可見(jiàn)，應(yīng)用干燥療法治療的創(chuàng)面，在壞死組織和活組織之間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
圖50B為應(yīng)用本發(fā)明組合物治療的創(chuàng)面，顯微圖片，可見(jiàn)在壞死組織和活組織連接處僅出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度腫脹和微血管充血。
圖51A為干燥療法處理創(chuàng)面后壞死組織和活組織之間炎細(xì)胞浸潤(rùn)的顯微圖片。
圖51B為應(yīng)用本發(fā)明組合物治療的創(chuàng)面的顯微圖片，可見(jiàn)在壞死組織和活組織連接處僅出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度腫脹和微血管充血。
圖51C為顯微鏡圖片，在凡士林治療的創(chuàng)面上，炎性細(xì)胞在燒傷后48小時(shí)出現(xiàn)組織空泡和浸潤(rùn)。
圖52為應(yīng)用本發(fā)明組合物治療的兔的創(chuàng)面愈合時(shí)間與未接受任何治療的對(duì)照組的比較表。
圖53A-C為顯微鏡圖片，顯示在一含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的破傷風(fēng)桿菌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。其中，圖53A顯示破傷風(fēng)桿菌細(xì)胞的正常形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)桿狀。圖53B顯示培養(yǎng)于含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基的破傷風(fēng)桿菌的第一、二代呈一長(zhǎng)桿狀或細(xì)絲狀。圖53C顯示破傷風(fēng)桿菌的第三、四代在長(zhǎng)度上呈現(xiàn)出很大的改變，有較多芽孢形成一呈鼓槌狀，以及少許長(zhǎng)桿狀或細(xì)絲狀。
圖54A-C為顯微鏡圖片，顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的脆弱類(lèi)桿菌的形態(tài)改變。其中，圖54A顯示脆弱類(lèi)桿菌的正常形態(tài)為中等大小桿菌。圖54B顯示其在含有此發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的第三、四代出現(xiàn)長(zhǎng)短不一的桿菌，并且有細(xì)菌聚集融合。圖54C脆弱類(lèi)桿菌的第五、六代近似小球形，并有許多細(xì)菌聚集融合成不規(guī)則的圓球形。
圖55A和B為顯微鏡圖片，顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的痤瘡丙酸桿菌的形態(tài)改變。其中，圖55A顯示正常的痤瘡丙酸桿菌的形態(tài)是細(xì)短桿狀。圖55B顯示培養(yǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的痤瘡丙酸桿菌的第三、四代呈長(zhǎng)度不等，大小不一的桿狀或細(xì)絲狀。
圖56A-C為顯微鏡圖片，顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的白色念珠菌的形態(tài)改變。其中圖56A顯示白色念珠菌的正常形態(tài)。圖56B顯示白色念珠菌的第三、四代在含有此發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上出現(xiàn)大小不等的圓球形，可見(jiàn)到一些棒狀菌體和少許芽生孢子。圖56C顯示白色念珠菌的第五、六代出現(xiàn)棒狀或長(zhǎng)桿狀，可見(jiàn)長(zhǎng)短不等的細(xì)菌絲，芽生孢子較少見(jiàn)。
圖56D和E顯示白色念珠菌的芽管試驗(yàn)結(jié)果。白色念珠菌正常的芽管產(chǎn)生率是90％。圖56E顯示生長(zhǎng)在含有本發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的白色念珠菌形態(tài)。
圖57A和B為顯微鏡圖片，顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的變形桿菌的形態(tài)改變。其中圖57A顯示變形桿菌的正常形態(tài)。而圖57B表示生長(zhǎng)在含有本發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的變形桿菌的形態(tài)。
圖58A和B為顯微鏡圖片，顯示生長(zhǎng)在含有本發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的大腸桿菌的形態(tài)改變。其中圖58A顯示大腸桿菌的正常形態(tài)。圖58B顯示生長(zhǎng)在含有本發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的大腸桿菌形態(tài)。
圖59A和B顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的綠膿桿菌的形態(tài)變異。
圖59A顯示綠膿桿菌的正常形態(tài)。圖59B顯示生長(zhǎng)在含有本發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的綠膿桿菌的形態(tài)。
圖60為本發(fā)明組合物對(duì)金黃色葡萄球菌血漿凝固酶的作用。
圖61本發(fā)明組合物的不同含量金黃色葡萄球細(xì)菌血漿凝固酶作用比較。
圖62為本發(fā)明組合物對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌增殖影響。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明為動(dòng)物、特別是人類(lèi)的生理性組織修復(fù)和功能性器官再生提供了新方法和新組合物。這項(xiàng)創(chuàng)新性的新發(fā)明在概念上和實(shí)踐上均具有多面性，著重于通過(guò)體內(nèi)再生干細(xì)胞的誘導(dǎo)和增殖實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)和器官再生的技術(shù)。
利用皮膚——人體最大的器官作模型，發(fā)明人已經(jīng)在臨床上展示了損傷或丟失的人體組織和器官可在原位再生，即在體內(nèi)原來(lái)的存在部位再生。例如，大面積深度燒傷病人，其皮膚的大部分被嚴(yán)重?fù)p傷，功能不全，康復(fù)后創(chuàng)面愈合不留疤痕，皮膚包括其附件的正常功能均可恢復(fù)。
相比之下，當(dāng)前在組織修復(fù)和器官再生領(lǐng)域采用的方法主要集中于體外，即人類(lèi)身體外的組織工程移植。正如在本發(fā)明的背景一章中回顧的，人們已投入大量的努力，對(duì)人體或其它動(dòng)物身上來(lái)的自體和/或異體組織進(jìn)行設(shè)計(jì)，以便將它們移植入人體，修復(fù)或替代功能不全的器官。利用這種方法，雖然已經(jīng)取得了一定的成功，但在臨床效果以及材料和人力的費(fèi)用上存在著嚴(yán)重的制約。更值得注意的是，迄今為止在臨床尚沒(méi)有證據(jù)表明，利用這種方法可以使再生的器官完全恢復(fù)生理功能。例如，大面積深度燒傷病人經(jīng)這種方法治療，愈后留下疤痕，容顏盡毀，更由于皮膚功能的全部或部分喪失導(dǎo)致殘疾。
發(fā)明人認(rèn)為，利用本發(fā)明提供的方法和組合物，首次通過(guò)人類(lèi)的治療介入可以再生完全功能性的器官。構(gòu)成器官的各種組織可以生理性地再生或修復(fù)，即它們的生理結(jié)構(gòu)和功能達(dá)到完全恢復(fù)。與此形成對(duì)比的是，用其它方法治療的創(chuàng)面，通常在大多數(shù)情況下是病理性愈合，即皮膚的功能異?；蛳魅酢Ｈ庋塾^(guān)察這種功能不全表現(xiàn)為形成疤痕，在顯微鏡下觀(guān)察，可發(fā)現(xiàn)皮膚質(zhì)地、顏色、血管分化、神經(jīng)供應(yīng)、反射比和生物化學(xué)屬性均發(fā)生了改變。1. 成體組織修復(fù)和器官再生的基本原則本發(fā)明揭示了成體組織在體內(nèi)原位修復(fù)和再生的基本原則，如圖1所示。1)總原則從總體而論，如果給完全發(fā)育的成體提供一個(gè)再生的環(huán)境，它有能力修復(fù)受損的組織和再生器官。如圖1所示，作為對(duì)創(chuàng)傷或其它類(lèi)型損傷的應(yīng)答，損傷器官的殘存成活細(xì)胞可被激活，并自己轉(zhuǎn)化為成體干細(xì)胞(ASCs)，即胚胎干細(xì)胞的對(duì)應(yīng)物。成體干細(xì)胞的這種誘導(dǎo)使它們可以提供器官再生所需的大量多種類(lèi)型的細(xì)胞。
但是，這些新生的干細(xì)胞相當(dāng)脆弱，各種環(huán)境因素產(chǎn)生的細(xì)胞毒素以及細(xì)胞對(duì)損傷的失控反應(yīng)，都易引起這些干細(xì)胞的死亡。如圖1所示，在本發(fā)明組合物提供的適宜的培養(yǎng)條件下，這些成體干細(xì)胞遵循胚胎發(fā)育階段就已被遺傳性程序化的指令，進(jìn)行增殖、發(fā)育成各種多能性組織干細(xì)胞。這種多能性功能組織干細(xì)胞的生成確保各種類(lèi)型的細(xì)胞的足量供應(yīng)，這些細(xì)胞是形成生理性功能組織所需要的。
參見(jiàn)圖1，在本發(fā)明組合物提供的最適宜的培養(yǎng)條件下，這些組織干細(xì)胞增生擴(kuò)散、分化成特定類(lèi)型組織的特定類(lèi)型細(xì)胞。特定類(lèi)型的分化細(xì)胞通過(guò)特定組織的細(xì)胞粘連彼此相互聯(lián)系，形成新生組織。這種特定組織細(xì)胞的聯(lián)系方式在此統(tǒng)稱(chēng)為“細(xì)胞連接”。然后，再生的新組織通過(guò)形成特定器官的組織與組織連接，并模仿發(fā)育期胎兒的組織組裝過(guò)程，組合成為新生器官。在成體中這種特定器官的組織連接方式在此統(tǒng)稱(chēng)為“組織組合”。
最后，在重組的器官中的新生組織在本發(fā)明組合的調(diào)控下，發(fā)育成熟為單個(gè)的、具有功能性的組織，具有生理性平衡的細(xì)胞種類(lèi)和數(shù)量。同時(shí)，這些組織通過(guò)有生命的器官網(wǎng)中的組織交流，經(jīng)歷進(jìn)一步的重塑，并最終形成完全功能性的、成熟的器官(圖1)。
遵循上述描述的再生途徑，受損或丟失的組織可以修復(fù)，重獲它們的生理結(jié)構(gòu)和功能。正如用人體皮膚作模型的舉例所示，本發(fā)明方法治療皮膚嚴(yán)重?fù)p傷的病人時(shí)，不必經(jīng)皮膚移植，愈合即可恢復(fù)全新的皮膚，皮膚包括各種皮膚附件的生理結(jié)構(gòu)和功能均不會(huì)丟失。
本發(fā)明人相信，在適宜的發(fā)育條件下，通過(guò)體內(nèi)原位培養(yǎng)再生的干細(xì)胞的方法，可以再生受損的器官，并使之完全恢復(fù)其生理結(jié)構(gòu)和功能。在本發(fā)明提供的內(nèi)源性和外源性材料的調(diào)控下，這個(gè)再生過(guò)程在體內(nèi)自然發(fā)生。從根本上而言，成功的器官再生依賴(lài)于生理性正確的特定組織的多細(xì)胞粘連、特定器官的多組織組裝和活體內(nèi)多器官的自我平衡性和免疫性相容的共存。2)“干細(xì)胞”的重新定義基于這一基本原則和臨床中在器官再生方面的成功應(yīng)用，對(duì)干細(xì)胞的含義在本發(fā)明中有了重新的定義。
傳統(tǒng)的定義中，干細(xì)胞應(yīng)具備下列屬性1)它不是自身末端分化，即不處于分化的最末端；2)它可以不受限制地，或至少在動(dòng)物的生命期內(nèi)進(jìn)行分裂；3)當(dāng)它分裂時(shí)，每一個(gè)子細(xì)胞既可保持為干細(xì)胞狀態(tài)，也可開(kāi)始不可逆的末端分化的進(jìn)程。[參見(jiàn)細(xì)胞分子生物學(xué)，Molecular Biology of the Cell，Alberts等主編，第三版(1994)，1155-1156頁(yè)，Garland Publishing公司，紐約和倫敦]根據(jù)這一定義，從人體組織中分離出來(lái)的干細(xì)胞，例如從人體胚泡的內(nèi)細(xì)胞群分離出來(lái)的胚胎干細(xì)胞，即使完全是從一個(gè)活人身上分離出來(lái)，而后在體外的培養(yǎng)基中存在，它們?nèi)耘f是干細(xì)胞。這些所謂的干細(xì)胞，雖然可以不受限制地分裂和分化成各種類(lèi)型的組織細(xì)胞，卻未能顯示具有再生一個(gè)完全功能性的人體器官的能力，更不用說(shuō)在體外再生一個(gè)活人。
為避免與傳統(tǒng)的干細(xì)胞定義混淆，本發(fā)明將干細(xì)胞稱(chēng)為“再生干細(xì)胞”。這個(gè)再生細(xì)胞具有以下特征(1)它存在于活體內(nèi)；(2)它受身體的生理控制和調(diào)節(jié)；(3)它與身體的組織和器官共存；(4)它在活體內(nèi)可不斷地進(jìn)行細(xì)胞分裂；(5)它具有修復(fù)組織、再生器官、恢復(fù)再生器官的生理結(jié)構(gòu)和功能的能力。3)體內(nèi)的自然再生人體有著巨大的再生能力。具有細(xì)胞更新高比率的組織，如血液和上皮在整個(gè)生命過(guò)程中都不斷地再生。其它組織，如肝臟、骨骼、肌肉、血管和腎上腺皮層當(dāng)受到損傷時(shí)會(huì)出現(xiàn)再生。肝臟通過(guò)補(bǔ)償性的增生進(jìn)行再生，而其它組織可能是通過(guò)增大間葉細(xì)胞派生的組織再生，激活儲(chǔ)備干細(xì)胞或祖細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)再生，或是在再生的組織中實(shí)現(xiàn)再生。例如，造血細(xì)胞，如T細(xì)胞，B細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，以及紅血球均由骨髓中的造血干細(xì)胞再生而來(lái)。如果手指被切除了末梢到末端的指關(guān)節(jié)，指尖仍可再生。但是，無(wú)論是骨骼還是肌肉都不能越過(guò)間隙再生，而且其它器官如皮膚、胰腺、心臟和脊髓受到損傷后，愈后常會(huì)留下瘢痕組織。
本發(fā)明中披露的獨(dú)特而新穎的方法的焦點(diǎn)是，利用身體本身固有的能力進(jìn)行自我修復(fù)和再生。在適宜的生理?xiàng)l件下，如浸泡在溫暖的無(wú)菌羊水中，胎兒可以自然愈合創(chuàng)面，不會(huì)留下疤痕，也不會(huì)失去功能。遺憾的是，完全發(fā)育的人類(lèi)卻是生存在一個(gè)完全不同的、更為敵對(duì)的環(huán)境中。在外在的和內(nèi)在的條件下，自然的成體創(chuàng)面愈合和生長(zhǎng)經(jīng)歷一個(gè)稍微不同的軌跡，最終往往留下疤痕，出現(xiàn)器官功能不全。這種自然愈合過(guò)程完全是被動(dòng)的，不受治療方法的控制，是一個(gè)混亂無(wú)序的細(xì)胞增殖、分化和再生組織重建的過(guò)程。4)在原則應(yīng)用中發(fā)展的方法論本發(fā)明提供了積極地控制組織修復(fù)和器官再生整個(gè)過(guò)程的方法和組合物。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞——生命的最小單位受到刺激，進(jìn)行增殖、分化和彼此結(jié)合，生理性地修復(fù)受損組織或再生被各種情況，如創(chuàng)面和疾病破壞的組織。這些初生的組織然后連結(jié)在一起，形成具有完全功能的器官。
為了在成人身上實(shí)現(xiàn)這種結(jié)果，就需要一個(gè)特殊的、積極的人類(lèi)介入療法。在本發(fā)明中展示的這種措施的總指導(dǎo)原則是1)對(duì)于損傷或損壞的組織，應(yīng)最大限度地保留殘存組織中的成活細(xì)胞；2)應(yīng)盡快去除壞死細(xì)胞或組織；3)在一個(gè)模仿再生細(xì)胞自身原始生理?xiàng)l件內(nèi)應(yīng)激活和增殖再生細(xì)胞；4)對(duì)再生器官應(yīng)用細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的調(diào)節(jié)劑，以指導(dǎo)組織的正確生理修復(fù)。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法論包括以下八大技術(shù)，如圖2所示。a)成體干細(xì)胞(ASCs)的激活和調(diào)節(jié)多能性成體干細(xì)胞在體原位的產(chǎn)生依賴(lài)于a)激活體眠的組織干細(xì)胞，如上皮干細(xì)胞，它們可能存在于毛囊的隆突部位；b)誘導(dǎo)完全已分化的細(xì)胞進(jìn)行反向分化，將其轉(zhuǎn)變?yōu)锳SCs。b)ASCs在體內(nèi)原位的培養(yǎng)在生理的濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng)脆弱的初生ASCs，使之快速生長(zhǎng)和定向分化。c)液化壞死組織的排出和滲出去除皮膚創(chuàng)面的壞死組織時(shí)，不采用傳統(tǒng)的清創(chuàng)方法，即侵入性的外科切除，而是用本發(fā)明組合物對(duì)其由表入里地液化，從創(chuàng)面自動(dòng)滲出壞死組織，從而大大降低了對(duì)殘存的成活組織產(chǎn)生物理或化學(xué)損傷的危險(xiǎn)。d)外源性培養(yǎng)基中的組織原位培養(yǎng)本發(fā)明提供外源性培養(yǎng)基，使ASCs和分化的細(xì)胞在其間迅速生長(zhǎng)、結(jié)合和移動(dòng)，從而生理性地修復(fù)損傷的組織或再生丟失的組織。e)非殺菌方式抑制細(xì)菌毒性不采取外用抗生素殺死細(xì)菌細(xì)胞的方式抑制引起創(chuàng)面感染的細(xì)菌毒性，而是允許細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行遺傳性復(fù)制，然后在本發(fā)明組合物提供的環(huán)境下改變其形態(tài)，從而降低毒素產(chǎn)生，因此可以大大降低因身體對(duì)細(xì)菌毒素的免疫反應(yīng)而引起的炎癥。f)皮膚再生的生理濕潤(rùn)環(huán)境的產(chǎn)生創(chuàng)面的過(guò)度干燥會(huì)導(dǎo)致結(jié)痂和損害成活組織。用本發(fā)明組合物可預(yù)防創(chuàng)面的水份蒸發(fā)，但與用凡士林作敷料相比，又不會(huì)引起創(chuàng)面的過(guò)度潮濕。g)創(chuàng)面與外界環(huán)境的微觀(guān)隔離在創(chuàng)面應(yīng)用本發(fā)明組合物可在創(chuàng)面形成一層透明膜，它將創(chuàng)面與外界環(huán)境隔離開(kāi)，但又可以使?fàn)I養(yǎng)組合物和氧滲透到底下的組織中。這種半滲透性的膜酷似羊膜，它所包繞的環(huán)境是一個(gè)相對(duì)無(wú)菌的環(huán)境，適于里面組織的再生。從而組織根據(jù)一個(gè)類(lèi)似于胚胎發(fā)育的系統(tǒng)，獲得再生和重建，形成一個(gè)完全功能性的器官。h)再生所需的氧和營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)各種營(yíng)養(yǎng)組合物，如全套天然氨基酸、多糖、脂肪酸和磷酸鹽經(jīng)外源性提供。細(xì)胞生長(zhǎng)所需的氧可通過(guò)這層膜滲透到底下的組織。同時(shí)，細(xì)菌和其它環(huán)境污染物與進(jìn)行創(chuàng)面愈合的組織被隔離開(kāi)。5)本發(fā)明方法學(xué)與其它方法在技術(shù)的對(duì)比目前臨床上使用的替代損壞的器官和組織的方法是器官移植和植入仿生裝置。器官移植的主要缺點(diǎn)是供體短缺和免抑制疫力的副作用。仿生裝置值入的缺點(diǎn)是無(wú)法生產(chǎn)出與天生組織一樣的耐久力、強(qiáng)度、形式、功能和生物相容性的人造材料。
在二十世紀(jì)九十年代出現(xiàn)的再生醫(yī)學(xué)，目前尚處于試驗(yàn)階段，它著重于兩個(gè)主要策略力求在移植部位形成新的組織的細(xì)胞移植和植入體外組建的生物人造組織。
細(xì)胞移植包括干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和增殖，而后將它們或它們分化的產(chǎn)品移植到器官受損的位置。雖然生育學(xué)的進(jìn)步已使細(xì)胞移植有望應(yīng)用于臨床，但仍存在多種實(shí)際的限制，而且臨床結(jié)果在生理學(xué)和美學(xué)上也不盡如人意。這種方法的其中之一限制是難以在眾多的組織中鑒別和分離多能性干細(xì)胞。盡管最近已經(jīng)培養(yǎng)了多能性人體胚胎干細(xì)胞(ESC)系，ESCs的定向分化仍舊是個(gè)謎。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得來(lái)的結(jié)果雖然很鼓舞人心，但仍不能在機(jī)能上轉(zhuǎn)化為人們依賴(lài)的人體療法。例如，體外神經(jīng)干細(xì)胞派生出來(lái)的小鼠神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以及在體外來(lái)自ESCs的心肌細(xì)胞，當(dāng)注射入成體腦部和心臟時(shí)，它們會(huì)分別與周?chē)M織結(jié)合。多能人類(lèi)神經(jīng)干細(xì)胞注射進(jìn)正在發(fā)育的小鼠腦部時(shí)，它們會(huì)在整個(gè)腦部移動(dòng)，并在特定部位分化。
利用體外培養(yǎng)的干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)器官的成功再生，還面臨許多的障礙。體外培養(yǎng)的干細(xì)胞一旦移植入患病區(qū)域，它們必須被引導(dǎo)向特定顯型分化。這就必須完全譯解這個(gè)過(guò)程所需的信號(hào)，以便指導(dǎo)設(shè)計(jì)體外組織培養(yǎng)條件。一些研究人員在技術(shù)上得到的試驗(yàn)資料表明，盡管通過(guò)在培養(yǎng)基中添加白血病抑制因子，可實(shí)現(xiàn)多能性人間葉細(xì)胞、小鼠神經(jīng)干細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)，但小鼠ESCs在體內(nèi)和體外均隨機(jī)性分化。技術(shù)上的進(jìn)步將有可能使小鼠胚胎干細(xì)胞(ESCs)在體外被誘導(dǎo)分化為多能性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前驅(qū)，并把它們移植入髓磷脂不足的大鼠腦中。但是，當(dāng)人們將這些從特定的組織中采集來(lái)的或從體外胚胎干細(xì)胞中分化而來(lái)的多能性干細(xì)胞植入受傷的成體組織時(shí)，它們是否能成為特定部位的組織呢，這個(gè)問(wèn)題還是未能得到解答。
移植產(chǎn)生的免疫排斥是細(xì)胞移植中另一個(gè)主要問(wèn)題。由于異源細(xì)胞可用于一些實(shí)例中(如，來(lái)自骨髓的間葉干細(xì)胞)，大多數(shù)移植的細(xì)胞將是異源的。研究人員已試圖采用遺傳改變和細(xì)胞生物的策略，以促進(jìn)異體或異種移植宿主的耐受性，如將二倍體的體細(xì)胞置于去除細(xì)胞核的人體或其它哺乳動(dòng)物的受精卵中，用由此產(chǎn)生的胚囊產(chǎn)生干細(xì)胞，這些方法引起了對(duì)生物倫理的關(guān)注，這是一個(gè)更為棘手的問(wèn)題。
植入在體外組建的人造生物組織也面臨不少障礙。例如，合成仿生植入物所用的支架材料即是一大挑戰(zhàn)，因?yàn)榉律踩胛镄枰芯_的地形學(xué)、表面屬性、生長(zhǎng)和分化的信號(hào)，以利于細(xì)胞移動(dòng)、粘連、增殖和分化，以及具有塑成各種組織和器官形狀的可塑性。當(dāng)前正在使用或試驗(yàn)的人造生物材料包括各種陶瓷、聚亞安酯人造橡膠、聚酯、聚酐以及聚磷腈。這些材料為細(xì)胞提供了機(jī)械支撐、移動(dòng)渠道以及粘連的表面。
與上述簡(jiǎn)述的技術(shù)背景相對(duì)立的是，本發(fā)明提供了成體組織修復(fù)和器官再生的一種創(chuàng)新性方法。該方法與目前這一領(lǐng)域的研究人員所采用的流行的體外干細(xì)胞培養(yǎng)方法形成強(qiáng)烈對(duì)比，它關(guān)注于成體干細(xì)胞在體內(nèi)原位的激活和培養(yǎng)。通過(guò)利用身體本身固有的自我修復(fù)和再生能力，該方法為身體的自然再生提供了一個(gè)適宜的條件，這是一個(gè)模仿健康胎兒發(fā)育所需的再生環(huán)境。本發(fā)明提供的組合物可激活休眠的干細(xì)胞進(jìn)行增殖，或誘導(dǎo)成體組織細(xì)胞轉(zhuǎn)變化再生干細(xì)胞，以及維持這些干細(xì)胞的活躍增殖以及定向地分化為體內(nèi)原位再生所需的所有細(xì)胞?；钚猿煞莸男屡浞揭泊龠M(jìn)形成一個(gè)生理濕潤(rùn)的、營(yíng)養(yǎng)的和自我平衡的環(huán)境，以確保組織和器官的修復(fù)和再生，使之完全恢復(fù)它們的生理結(jié)構(gòu)和功能。
正如此說(shuō)明書(shū)的后一部分所示，這種方法已成功地應(yīng)用于臨床，治療器官丟失或功能不全的病人，如深度燒傷病人、慢性潰瘍病人、創(chuàng)傷病人、腸道潰瘍病人和患禿發(fā)癥的人。經(jīng)此方法治療后，病人愈后組織得到修復(fù)，器官再生，其生理性結(jié)構(gòu)和功能均無(wú)本質(zhì)的損失。6)在再生醫(yī)學(xué)中原則的應(yīng)用在本發(fā)明闡述的基本原則和方法的指導(dǎo)下，人們可以預(yù)想到本發(fā)明在細(xì)胞生育學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)藥學(xué)實(shí)踐中有廣泛的應(yīng)用，而且它已經(jīng)在動(dòng)物模型和人體治療上顯示了成功。
根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床試驗(yàn)收集到的強(qiáng)有力的證據(jù)，發(fā)明人相信，只要提供適宜的再生環(huán)境，作為對(duì)組織修復(fù)信號(hào)，即創(chuàng)面的反應(yīng)，人體內(nèi)任何器官的組織細(xì)胞均可被激活，生成再生干細(xì)胞。與早期妊娠階段胎兒的無(wú)疤合創(chuàng)面愈合不同，實(shí)現(xiàn)完全發(fā)育的成體的生理性組織修復(fù)和功能性器官再生的唯一途徑，是通過(guò)體內(nèi)原位提供外源性培養(yǎng)基，刺激并維持成體干細(xì)胞的快速增殖和定向分化，并確保各種器官特定組織的正確組裝，而不致在結(jié)構(gòu)和功能上出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性的丟失。
發(fā)明人相信，盡管很難標(biāo)定和分離多能性成體干細(xì)胞(ASCs)，但可以通過(guò)體內(nèi)原位激活休眠的組織干細(xì)胞以及/或誘導(dǎo)成體組織細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)锳SCs(圖1)得以產(chǎn)生成體干細(xì)胞。最近在干細(xì)胞研究方面的新進(jìn)展以及本發(fā)明中闡述的基本原則應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)所取得的資料均佐證了這一觀(guān)點(diǎn)。
最近，在肝臟、胰腺以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均發(fā)現(xiàn)了ASCs。從骨髓中分離出了間葉干細(xì)胞，而且有證據(jù)表明類(lèi)似的細(xì)胞甚至可能存在于整個(gè)身體組織的結(jié)締組織室。研究人員曾大范圍地搜索了ASCs的位置，并推測(cè)它們可能存在于特定的小生境中。正如在“實(shí)施例”中詳細(xì)所述的那樣，在全厚皮層燒傷后，利用本發(fā)明方法提供的適宜環(huán)境，可以誘導(dǎo)真皮層的脂肪層中的間葉細(xì)胞產(chǎn)生再生的ASCs，實(shí)現(xiàn)皮膚再生。
不論各種ASCs的精確位置在哪里，本發(fā)明所提供的方法和組合物均可用于激活體內(nèi)ASCs，在體內(nèi)原位修復(fù)損傷組織和再生功能不全的器官。可以預(yù)見(jiàn)，這種創(chuàng)新性的方法可以用來(lái)恢復(fù)哺乳動(dòng)物，尤其是人類(lèi)體內(nèi)的任何組織和任何器官的生理結(jié)構(gòu)和功能。以下將描述數(shù)個(gè)應(yīng)用例。a)通過(guò)體內(nèi)原位培養(yǎng)表皮干細(xì)胞再生或更新皮膚皮膚為動(dòng)物的最大器官，由外表皮、真皮及皮下組織構(gòu)成，正常的有生理功能的皮膚具有三層相互作用而結(jié)構(gòu)上各有特色的組織。
表皮是一種不斷地在更新、分層的鱗狀上皮組織，表皮的大部分細(xì)胞為角質(zhì)細(xì)胞排列成層，表示它們的不同分化階段，外層為角質(zhì)層，作為屏障保護(hù)身體與外界環(huán)境隔開(kāi)，并有助于維持內(nèi)部環(huán)境。
真皮為皮膚的結(jié)締組織的基質(zhì)，使皮膚具有結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，可以保護(hù)身體不受損傷、貯存水分，并與表皮相互作用，真皮乳突反映表皮的形狀輪廓，即在表皮下面的交替的皮脊及皮谷。
皮膚是有完整功能的器官，由神經(jīng)、血管、毛囊及分泌腺所組成為皮膚附件。皮膚的各種組成部分有不同的功能，包括保護(hù)身體不受外界的損害，阻止水分丟失，吸收及阻擋輻射調(diào)節(jié)體溫、感光及免疫監(jiān)督。
血管及淋巴管在皮膚中起重要作用，可以提供營(yíng)養(yǎng)，調(diào)節(jié)體溫及血壓，皮膚血管床的種類(lèi)取決于它們灌注的皮膚的種類(lèi)、皮膚附件的類(lèi)型和數(shù)量以及真皮與皮下組織的厚度。
皮膚神經(jīng)包含有感覺(jué)及交感(自主)神經(jīng)、交感神經(jīng)運(yùn)動(dòng)纖維在真皮中與感覺(jué)神經(jīng)纖維混合，最終延引分枝到汗腺、血管及立毛肌中，感光纖維與專(zhuān)門(mén)化的小體末端器官為觸摸、疼痛、癢以及物理和化學(xué)的刺激的受體，人類(lèi)感覺(jué)皮質(zhì)的大部分從面部以及手的皮膚接收感覺(jué)信息。
分泌腺為皮膚附件，包括頂分泌腺、外分泌腺、混合腺、頰腺及皮脂腺。各種類(lèi)型的腺體有其獨(dú)特的形態(tài)特征與功能。所有這些皮膚附件均來(lái)自胚胎的表皮。
毛發(fā)為復(fù)合的角蛋白圓錐物，其中有緊密的鱗覆的皮質(zhì)鱗片環(huán)狀圍繞物，毛發(fā)可分為(1)毫毛細(xì)，無(wú)髓鞘，無(wú)色素，較短；(2)終毛粗，較長(zhǎng)，大多有色素，有髓鞘。還有中間狀態(tài)的毛發(fā)，所有胎兒的毛發(fā)均稱(chēng)胎毛。
毛囊為主要的表皮附件，它與表皮都是從同一個(gè)胚胎源衍生而來(lái)的，位于皮膚的表面，毛囊是由一個(gè)外根鞘(ORS)與表皮相鄰，和一個(gè)內(nèi)根鞘(IRS)和毛干本身組成。正處于活躍地分裂中的細(xì)胞能產(chǎn)生內(nèi)根鞘及毛干，稱(chēng)為基質(zhì)細(xì)胞。在毛囊球中有專(zhuān)門(mén)化的間質(zhì)細(xì)胞袋，稱(chēng)為真皮乳突，是一群過(guò)渡性的分裂中的上皮細(xì)胞。
成年人毛囊的下段經(jīng)歷活潑生長(zhǎng)期(毛發(fā)生長(zhǎng)初期)和破壞期(毛發(fā)生長(zhǎng)中期/毛發(fā)生長(zhǎng)終期)。隨著基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力的耗盡，毛囊退化，把真皮乳突拖上毛囊的永久性的上皮部分稱(chēng)為隆突，隆突被認(rèn)為是公知的毛囊干細(xì)胞之家。接受到真皮乳突傳出的刺激，隆突中的一個(gè)或每個(gè)細(xì)胞作為反應(yīng)可再生毛囊。
皮下組織也稱(chēng)脂層，有一層脂肪，皮膚組織的主要功能是調(diào)節(jié)溫度，緩沖機(jī)械創(chuàng)傷，保持身體外形，填充空間，而最重要的則是作為備用的能量來(lái)源，皮下組織包括三層脂肪層由結(jié)締組織鞘(網(wǎng)眼皮retinocula cutis)將它們分隔開(kāi)。
真皮分為乳突層和網(wǎng)狀層，前者外形與表皮一樣，后者從乳突底部延伸到皮下組織，真皮乳突含有很多III型膠原，這些膠原由半徑很小的纖維組成小的纖維束(寬度1-10μm)。網(wǎng)狀層真皮主要由I型膠原組成，這類(lèi)膠原由大直徑的纖維織成大的纖維束(寬度大于40μm)。
在顯微鏡下，膠原纖維束排列成正交結(jié)構(gòu)，即，每層與其上一層和下一層均成正角。
無(wú)疤痕的胎兒創(chuàng)傷愈合的組織學(xué)特點(diǎn)是，真皮附件中及周?chē)∪獾脑偕?。但是，人們普遍認(rèn)為，深度部分真皮燒傷或全厚皮層燒傷的成人，愈合只能是疤痕性的再生，而且附件的結(jié)構(gòu)及功能也受到實(shí)質(zhì)性的損失。
皮膚生成疤痕是正常結(jié)構(gòu)外觀(guān)的破壞，由于皮膚結(jié)構(gòu)、顏色、血管供應(yīng)、神經(jīng)供應(yīng)、反射能力、生化特性的改變，造成了愈合部位或凸起或凹陷[參見(jiàn)Ferguson等(1996)Plast，Reconstru Surg 97854]。從組織學(xué)方面來(lái)說(shuō)，疤痕是組織微觀(guān)結(jié)構(gòu)的改變，其膠原沉積和組列不同于周?chē)磽p傷的組織。
將外源性生長(zhǎng)因子用于傷口局部，在實(shí)驗(yàn)室里可以提高傷口修復(fù)的速率。但是，在傷口部位應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子的療法，在臨床上已被證實(shí)效果不盡如人意。TGF-β不能改善傷口愈合，已獲FDA批準(zhǔn)上市的PDGF-BB只對(duì)慢性傷口愈口有一點(diǎn)點(diǎn)好處。更令人失望的是，這一點(diǎn)點(diǎn)好處還只是在徹底清創(chuàng)和重量下卸的情況下，由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生操作才能取得。
人體的慢性創(chuàng)傷的環(huán)境不能在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中復(fù)制，臨床醫(yī)生想用外源性的生長(zhǎng)因子治療傷口，卻面臨著與蛋白質(zhì)到人體的傳輸相關(guān)的各種挑戰(zhàn)。例如加進(jìn)去的外源性生長(zhǎng)因子會(huì)很快就被蛋白溶解酶和氧化劑所破壞，另一挑戰(zhàn)是慢性傷口中的成纖維細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子往往沒(méi)有反應(yīng)。
正如本說(shuō)明后面的部分中所述，本發(fā)明提供了一種創(chuàng)新的方法，使動(dòng)物特別是人體通過(guò)在體內(nèi)原位培育再生性干細(xì)胞而完成組織修復(fù)或器官再生。例如，深度大面積燒傷通過(guò)原位成體干細(xì)胞的誘導(dǎo)可以再生新的皮膚，這種干細(xì)胞發(fā)育成為胚胎表皮干細(xì)胞和各種再生皮膚所需的其他組織干細(xì)胞。再生的皮膚保持正常的結(jié)構(gòu)和功能而且具有全套附件，這些“奇跡般”的臨床成果表明本發(fā)明的方法學(xué)可以用來(lái)再生各種組織和器官。
一方面，本發(fā)明的方法可以用來(lái)生理性地修復(fù)損傷的皮膚而不留疤痕，如深I(lǐng)I度燒傷(或部分真皮燒傷)，表皮基底層已被破壞，真皮也嚴(yán)重受損，但是一部分真皮還在皮膚存活，本方法也可用來(lái)再生皮膚，修復(fù)表皮、真皮和各種皮膚附件的結(jié)構(gòu)和功能。例如，一位病人表皮和真皮均被火燒傷或化學(xué)燒傷，即淺III度或全厚皮層燒傷，可采用本方法治療，愈合皮膚包括附件的生理功能均沒(méi)有實(shí)質(zhì)性喪失。
此外，本發(fā)明的方法可用于再生其他類(lèi)型的創(chuàng)傷，包括但不限于創(chuàng)傷、手術(shù)傷口及感染創(chuàng)口；體表潰瘍包括但不僅限于慢性潰瘍、糖尿病潰瘍、褥瘡潰瘍和下肢血管疾病以及其他由于血流不暢引起的不愈傷口；由細(xì)菌或病毒感染造成的傷口及/或糜爛，如陰道炎、宮頸糜爛、牙齦炎；由于靜脈擴(kuò)張及/或擴(kuò)大造成的傷口，如痔瘡；由風(fēng)寒造成的凍傷及皮膚皸裂。采用本發(fā)明提供的組合物，這些傷口均可生理性愈合而沒(méi)有畸形或殘廢。
為了在皮膚上實(shí)現(xiàn)這些功能性效果，本發(fā)明組合物用于損傷皮膚的原位，通過(guò)激活再生性干細(xì)胞、特定組織的細(xì)胞粘連和再生性組織的特定組，產(chǎn)生治療作用。
再生性皮膚干細(xì)胞可存在于皮膚的存活組織中，例如損傷皮膚可通過(guò)激活處于表皮基底層的表皮干細(xì)胞得到修復(fù)，本發(fā)明組合物可用以促進(jìn)損傷的表皮的生理性愈合而不形成疤痕。
此外，本發(fā)明組合物可用作化妝品，提高皮膚美觀(guān)。例如，通過(guò)化學(xué)的傳輸媒介如微脂?；蛴停蛭锢淼姆椒ㄈ绯晜鬏?，將該組合物導(dǎo)入基底層。對(duì)于由于內(nèi)部或外部因素如痤瘡、黑色斑及皺紋所造成的不規(guī)則的皮膚表面及/或顏色異常，可用化學(xué)方法(例如乙醇酸或酶)或物理方法(熱或光能)除去部分或整個(gè)皮膚表面，然后將本發(fā)明組合物用于有存活真皮的皮膚上，殘存基底層的表皮干細(xì)胞或皮膚其它組織中的再生性干細(xì)胞可以被激活，促進(jìn)皮膚再生，使皮膚看上去更年輕，而不產(chǎn)生疤痕。
例如，在各種皮膚組織，如毛囊中的再生性干細(xì)胞可被刺激起來(lái)。一系列實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體的資料表明，毛囊隆突是表皮和毛囊干細(xì)胞的聚集地，隆突細(xì)胞有很長(zhǎng)的細(xì)胞外周[Morris Potten(1994)Cell Prolif27279-289]，而且在培養(yǎng)基中可以培養(yǎng)出最佳的毛囊角質(zhì)細(xì)胞(Yang J.Invest Dermatol 101652-659)。皮膚的其它組織，如血管及外分泌腺也聚集有再生性干細(xì)胞，他們可以被激活并分化成為各種修復(fù)皮膚和再生表皮所需的細(xì)胞。
對(duì)于真皮和表皮都完全損毀和/或損失功能的皮膚，本發(fā)明組合物可用以激活或誘導(dǎo)皮下組織中的再生性干細(xì)胞如軟組織中的間質(zhì)細(xì)胞。
當(dāng)皮膚的全部組成部分，即表皮、真皮、皮下組織完全被破壞和/或損失功能時(shí)，本發(fā)明組合物可以用來(lái)激活肌肉層的結(jié)締組織中來(lái)的再生性干細(xì)胞以及骨髓中的間質(zhì)于細(xì)胞。
必須指出，本發(fā)明的方法及組合物也可以用來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的反分化，即把分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌审w干細(xì)胞，然后，作為再生性干細(xì)胞參與組織修復(fù)和器官再生的過(guò)程。b)恢復(fù)組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的平衡以預(yù)防和治療癌癥本發(fā)明描述的方法可用于預(yù)防和治療各種癌癥，癌癥通常被視為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞之間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂的結(jié)果，一旦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的平衡失去了，就會(huì)發(fā)生惡性病變。微環(huán)境的因子如基質(zhì)組成成分的降解，以及宿主和腫瘤間的相互作用都是惡性細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的不可少的條件。
本發(fā)明表明，采用本發(fā)明的組合物和方法，組織內(nèi)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的平衡是可以恢復(fù)的，而且不會(huì)失去生理功能。本發(fā)明組合物可以調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的信息交換，通過(guò)刺激各種細(xì)胞膜蛋白質(zhì)如聯(lián)接蛋白和Cadherin介導(dǎo)的交叉對(duì)話(huà)，結(jié)果使細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和遷移得到協(xié)調(diào)的調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的組合物可通過(guò)促進(jìn)宿主細(xì)胞與前期癌細(xì)胞或癌細(xì)胞的間隙接合點(diǎn)的生長(zhǎng)而恢復(fù)組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的平衡，間隙接合點(diǎn)是一種特殊類(lèi)型的細(xì)胞之間的接合，在大部分動(dòng)物細(xì)胞中都有。兩個(gè)相鄰的細(xì)胞相互作用，通過(guò)細(xì)胞膜蛋白質(zhì)聯(lián)接蛋白而進(jìn)行。聯(lián)接蛋白形成間隙接合點(diǎn)，6個(gè)相同的聯(lián)接蛋白形成一個(gè)聯(lián)接蛋白，兩個(gè)聯(lián)接蛋白相連跨過(guò)細(xì)胞的間隙形成連續(xù)的水通道，把兩個(gè)細(xì)胞連接起來(lái)。每個(gè)間隙接合點(diǎn)是一簇均勻的膜內(nèi)的粒子與漿膜的細(xì)胞漿折斷面的結(jié)合。每個(gè)膜內(nèi)粒子對(duì)應(yīng)于一個(gè)聯(lián)接蛋白，間隙接合點(diǎn)使細(xì)胞之間的小分子，可以有通道，與各種生命過(guò)程如發(fā)育、細(xì)胞代謝及細(xì)胞生長(zhǎng)控制有關(guān)。
大部分聯(lián)接蛋白轉(zhuǎn)移后被磷酸化，主要是作用在絲氨酸等氨基酸部位上，聯(lián)接蛋白是各種蛋白質(zhì)激酶的靶子，其中有些酶已確認(rèn)，為蛋白質(zhì)激酶C，促有絲分裂原激活的蛋白質(zhì)激酶以及v-Src酶氨酸蛋白質(zhì)激酶。磷酸化與許多連接過(guò)程的調(diào)節(jié)有關(guān)，如交換、組合/折離、降解以及間隙接合通道的控制。
此外，另一種細(xì)胞膜蛋白Cadherin也對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞粘連和遷移起著重要的作用，在蛋白質(zhì)酶氨酸激酶(PTK)變形的細(xì)胞中Cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞的粘連作用受到干擾，而Cadherin本身則不是PTK的良好培養(yǎng)基；它們的細(xì)胞質(zhì)結(jié)合伴侶Armcatenins卻是PTK的優(yōu)良底物，因此，可以作為介導(dǎo)PTK誘發(fā)的Caderin行為的癥變的良好候選物。例如β-catenin與經(jīng)典的cadherin的細(xì)胞質(zhì)區(qū)結(jié)合，并可以調(diào)節(jié)吸著作用并/或作為cadherin與肌纖維蛋白細(xì)胞骨骼的橋梁。
本發(fā)明組合物很可能可以激活這些激酶，這些激酶然后把聯(lián)接蛋白和Cadherin的細(xì)胞結(jié)合伴侶為Caterins磷酸化。通過(guò)這些蛋白質(zhì)的磷酸化以及細(xì)胞與細(xì)胞的粘連作用，腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間的信息交換通道得以修復(fù)。腫瘤與宿主的連接修復(fù)后，腫瘤細(xì)胞受到了宿主的調(diào)控，在宿主的調(diào)控之下，腫瘤細(xì)胞可以發(fā)生凋亡(程序控制的細(xì)胞死亡)，或分化成為非致腫瘤的細(xì)胞，這樣，組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的平衡得到恢復(fù)，可以預(yù)防或抑制腫瘤的惡變。
一方面，本發(fā)明的方法可用以治療或預(yù)防過(guò)度增生性的疾病或前期癌變，影響到皮膚的上皮細(xì)胞如牛皮癬或其他皮膚病，包括過(guò)度增生性、前期癌變或紫外線(xiàn)誘發(fā)的皮膚疾病。
本發(fā)明的方法進(jìn)而也可用于預(yù)防皮膚癌或減少皮膚癌發(fā)展的可能性，以及降低由于日照導(dǎo)致的光老化的嚴(yán)重程度。
另一方面，本發(fā)明的方法可用于治療和預(yù)防過(guò)度增生性疾病或前期癌變，它影響了內(nèi)部器官的上皮細(xì)胞如胃腸道器官，口服本發(fā)明的組合物或局部注射可以恢復(fù)這些器官的內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定平衡，重建在前期癌變細(xì)胞與宿主健康細(xì)胞的細(xì)胞與細(xì)胞間的交叉對(duì)話(huà)。
此外，本發(fā)明的方法也可以用于治療上、下胃腸道的癌癥，例如上胃腸道癌，包括但不僅限于(1)由過(guò)量使用酒精、堿攝入、弛緩不能、吸煙、接觸硝胺類(lèi)化合物Barrett’s粘膜、胼胝形成、霉菌毒素、變形病毒的感染如人乳頭瘤病毒(HPV)、單純皰疹病毒(HSV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)及Epson-Barr病毒(EBV)普文二氏綜合癥等引起的食道癌；(2)由于胃酸缺乏、幽門(mén)螺旋菌感染、過(guò)去的胃切除手術(shù)以及BillrothII操作引起的胃癌；(3)由吸煙、接觸β-萘胺、聯(lián)苯胺及慢性胰腺炎引起的胰腺癌；(4)由乙肝病毒、慢性肝病如慢性活動(dòng)性肝炎及肝硬變、接觸霉菌毒素、電離輻射、甾體激素及硬化物引起的肝癌，以及(5)由于硬化性膽管類(lèi)，寄生蟲(chóng)感染及甾體激素引起的膽管癌。下胃腸里的癌癥包括大腸癌如結(jié)腸直腸癌，原發(fā)性淋巴瘤、黑瘤、大腸肉瘤。腺癌占大腸癌的90％以上，類(lèi)癌瘤占結(jié)腸直腸以上的其它腫瘤的大部分。c)預(yù)防和治療胃腸道疾病本發(fā)明組合物以及方法可用以激活或誘導(dǎo)胃腸道組織中的再生性干細(xì)胞，以修復(fù)在胃腸道中的器官的黏膜的損傷及疾患。
在小腸的內(nèi)襯中，細(xì)胞排列成單層的上皮組織，這種上皮組織覆蓋在絨毛的表皮向腸膜突出。分泌黏液的杯狀細(xì)胞散布在上皮組織的吸附性刷狀緣細(xì)胞中，上皮組織還襯著隱窩，這些隱窩向下伸向下面的結(jié)締組織，每個(gè)隱窩由250個(gè)上皮細(xì)胞組成，其中包括上皮干細(xì)胞，這些多功能性干細(xì)胞位于隱窩的底部或其附近[參見(jiàn)Loeffleretal(1993)J.Theer Biol 160471-491]。腸上皮干細(xì)胞能對(duì)間質(zhì)的生存或分化的指令作出反應(yīng)。在正常情況下，這些細(xì)胞循環(huán)周期緩慢，很像毛囊干細(xì)胞，其中有些轉(zhuǎn)變快速但暫時(shí)性地增殖性細(xì)胞，它們移動(dòng)到中段，隨后分化為吸收性的刷狀緣腸細(xì)胞或分泌黏液的杯狀細(xì)胞或絨毛的腸內(nèi)分泌細(xì)胞，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的平衡，分化了的細(xì)胞隨后死亡并從絨毛上脫落進(jìn)入腸腔。
與此相關(guān)，本發(fā)明提供的組合物可以治療人體消化道疾患，即給病人的消化道使用一種含溶解于油中的甾醇化合物的組合物，其中甾醇化合物含量的重量百分比為0.01％-20％，最好是選用食用油，而且組合物含有蜂蠟，其含量的重量百分比為1％-20％。
消化道疾病可能是由于人體消化道器官或營(yíng)養(yǎng)通道包括口、食道、胃及大小腸的損傷或紊亂所造成，消化道紊亂包括胃潰瘍、腸道類(lèi)疾病及其他損傷。
胃腸道紊亂的一個(gè)通常的原因是幽門(mén)螺桿菌感染，這些感染可引起活動(dòng)性的慢性胃炎及頻發(fā)的有關(guān)病癥，如十二指腸潰瘍、胃潰瘍、MALT淋巴瘤或Menetrier’s綜合癥，消滅或抑制幽門(mén)螺桿菌可以減少十二指腸和胃潰瘍的復(fù)發(fā)。
持久性的胃炎與幽門(mén)螺桿菌感染有關(guān)，往往在胃粘膜上出現(xiàn)相似于腸道的特點(diǎn)，這種情況稱(chēng)為腸(樣)組織變形(IM)，可能是胃癌風(fēng)險(xiǎn)加大的信號(hào)，在全球是第二大因癌致死的病癥。
IM的病因尚不清楚，可能是一種突變性的適應(yīng)作用，或是對(duì)幽門(mén)螺桿菌的防御作用，有人推測(cè)變形的粘膜可能產(chǎn)生粘液或其他組合物創(chuàng)造一種對(duì)抗幽門(mén)螺桿菌的環(huán)境，因此，對(duì)幽門(mén)螺桿菌進(jìn)行普遍治療應(yīng)當(dāng)可以降低胃癌的發(fā)病率。
本發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明的組合物可以有效地修復(fù)損傷的粘膜，在胃腸中，特別是在胃中提供再生的條件，在胃腸道中使用本組合物后，藥物與胃粘膜混合，形成保護(hù)膜，其中含有粘蛋白，可將粘膜與食物以及胃中的其他組合物的進(jìn)一步刺激隔開(kāi)，在這種情況下，組合物中的甾醇化合物及其他有效成分被釋放出來(lái)激活再生性干細(xì)胞，促進(jìn)粘膜加快修復(fù)。此外，本發(fā)明組合物也可以通過(guò)使細(xì)菌的形態(tài)改變有效地抑制幽門(mén)螺桿菌的毒性，通過(guò)健康的胃腸道的再生，有利于幽門(mén)螺桿菌的潰瘍狀況得到改善，間接地抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。
本發(fā)明的組合物可用于治療幽門(mén)螺桿菌及與之有關(guān)的的疾病(如潰瘍、胃癌、非潰瘍性消化不良、胃炎及食管疾病和胃-食管回流病)。本組合物可用于治療這些疾病是因?yàn)樗鼘?duì)胃腸道有總體的保護(hù)作用，而且它還能促進(jìn)粘膜完整性的維護(hù)。
該組合物可用來(lái)抑制幽門(mén)螺桿菌有粘膜上吸著或形成菌落，可以用來(lái)促進(jìn)與幽門(mén)螺桿菌感染有關(guān)的損傷組織的愈合，在這一方面，很重要的是本組合物要加到融合的腸上皮細(xì)胞的受損的單層上，以激活隱窩中上皮干細(xì)胞，增加上皮細(xì)胞移入傷口的速率。
正如本組合物可用來(lái)保護(hù)胃腸道或營(yíng)養(yǎng)通道如腸一樣，它也可用于保護(hù)口腔及食管免受因放療和化療造成的損傷。
本組合物也可用來(lái)保護(hù)及/或治療通常由酒精或藥物造成的損傷。d)促進(jìn)頭發(fā)生長(zhǎng)并治療禿發(fā)本發(fā)明組合物也可用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)或恢復(fù)毛囊及其周?chē)慕M織如血管、皮脂腺的生理功能。
毛發(fā)是絲狀角質(zhì)結(jié)構(gòu)，由上皮衍生而成，毛發(fā)分為二大類(lèi)毫毛，特點(diǎn)是短、窄、覆蓋于大部分體表；終毛，其特點(diǎn)是厚、長(zhǎng)、往往色素較深。終毛包括頭皮、眉毛、睫毛、青春期后腋窩及趾骨的毛、多數(shù)男性面部及身上的毛。
每根毛發(fā)由毛干及根組成，毛干則由專(zhuān)門(mén)的角質(zhì)細(xì)胞組成，毛根位于毛囊中，可以深入到皮下組織或在真皮淺表處，毛囊由于表皮相連的外根鞘(ORS)和內(nèi)根鞘(IRS)組成，活躍分裂的細(xì)胞生成內(nèi)根鞘及毛干，稱(chēng)為基質(zhì)細(xì)胞。根的近端擴(kuò)張形成毛球，由一個(gè)錐形管狀的上表乳突使之凹入深表，毛球包括了芽的基質(zhì)和生角區(qū)，毛球中有一個(gè)專(zhuān)門(mén)化的間質(zhì)細(xì)胞袋，稱(chēng)為真皮乳突，為一群暫時(shí)性的分裂中的上皮細(xì)胞。這群多功能細(xì)胞覆蓋表皮乳突，具有絲分裂的能力，能產(chǎn)生毛發(fā)及其周?chē)膬?nèi)根鞘。有絲分裂產(chǎn)生的細(xì)胞，在頂端移動(dòng)，沿幾種不同的途徑分化。
成人毛囊中的下段，經(jīng)歷活躍生長(zhǎng)期(毛發(fā)生長(zhǎng)初期)和破壞期(毛發(fā)生長(zhǎng)中期/毛發(fā)生長(zhǎng)終期)。隨著基質(zhì)細(xì)胞的增殖能力耗盡，毛囊退化，把真皮乳突的細(xì)胞袋拖到永久性的毛囊上皮部位去，稱(chēng)為隆突。隆突被認(rèn)為是公知的毛囊干細(xì)胞的家。對(duì)真皮乳突的刺激作出反應(yīng)，一個(gè)或多個(gè)隆突的干細(xì)胞再生成為毛囊。
毛囊的發(fā)育依賴(lài)于真皮與表皮之間的一系列信息傳遞。在胚胎發(fā)育期，由于表皮與間質(zhì)之間的相互作用形成毛囊。毛囊的真皮組件(即真皮乳突和真皮鞘)，是從一群間質(zhì)細(xì)胞衍生而來(lái)的。毛囊的啟動(dòng)及發(fā)育源于真皮生纖維細(xì)胞及表皮的角質(zhì)細(xì)胞的聚集。表皮細(xì)胞增殖，滲透到真皮中成為塞子，隨后，表皮衍生的細(xì)胞包圍真皮的聚集體，把它引入組織袋中，即真皮乳突中。一般認(rèn)為毛囊及真皮乳突，是胚胎生長(zhǎng)時(shí)形成的，在產(chǎn)后并沒(méi)有明顯發(fā)育。
毛發(fā)生長(zhǎng)受毛囊基質(zhì)細(xì)胞的增殖的影響，有三個(gè)不同分期再生期毛發(fā)活躍生長(zhǎng)；退化期毛囊活性下降；靜止期細(xì)胞不再增殖。在典型的人的頭皮中，再生期可延續(xù)幾年，而退化期只有幾周，靜止期則有數(shù)月[參見(jiàn)Bertolino etal(1993)“Bialogy of HairFolicle”in Dermatology in General Medicine，pp.289-93.Fitzpatrick et al.，eds.McGraw-Hill]。這個(gè)更新循環(huán)時(shí)間根據(jù)動(dòng)物種類(lèi)和動(dòng)物內(nèi)不同部位而有所不同。靜止期過(guò)后，毛發(fā)脫落，另一周期開(kāi)始，毛發(fā)生長(zhǎng)的不同期中表皮、真皮及脂肪層的厚度也在變化。而且終毛在再生期伴有黑素生成，因?yàn)槊抑械暮谒丶?xì)胞產(chǎn)生黑素，進(jìn)入毛干中[參見(jiàn)Denileako etal 1996 Mol.Med Today 2460-67]。
這些周期受多種因素的影響。例如不同的生長(zhǎng)因子，如甾體激素，真皮.表皮的相互作用，真皮的血管供應(yīng)，神經(jīng)、外胚層因子及免疫系統(tǒng)均參與其中[參見(jiàn)Stern etal(1996)Dermatol Clin 14167-96及l(fā)indler etal(1997)Am.J.Pathal 1511601-17]。
禿發(fā)分為幾種，原因各異。禿頭位于頭頂及前部是很常見(jiàn)的男性型禿頭，禿頭也可以累及整個(gè)頭部為全禿。不同的禿發(fā)分為(1)全禿全部頭皮無(wú)毛發(fā)，即頭皮全禿但身體其他部位的毛發(fā)正常；(2)全身脫毛不僅是頭皮，而且整個(gè)身體無(wú)毛；(3)斑形脫發(fā)是局部脫發(fā)，對(duì)婦女來(lái)說(shuō)，脫發(fā)通常發(fā)生在生育小孩之后或停止服用避孕藥之后；(4)化療引起的脫發(fā)，往往是暫時(shí)性的；(5)放療引起的禿發(fā)往往是永久性的，因?yàn)槊沂茌椛?，發(fā)生了不可逆性的損傷；(6)男性型禿發(fā)(也稱(chēng)禿頂)為常見(jiàn)的男性禿發(fā)，位于頭頂前部及頂部，是遺傳因素造成的。
禿毛為哺乳動(dòng)物的自然過(guò)程，在健康成人，尤其是男人中極為常見(jiàn)，禿發(fā)也可由化學(xué)和物理的因素所引起(如抗癌化療)，也可能由于年齡增長(zhǎng)和某些特殊的疾病所引起。典型的禿發(fā)是由于毛發(fā)更新周期紊亂，首先是周期頻率加快，毛囊從再生期很快進(jìn)入靜止期。正常情況下，人頭上大約有150,000根頭發(fā)，約10％是處在靜止期。在皮膚上的禿毛，顯然是較多的毛囊是處在靜止期，最后毛囊退化，這個(gè)過(guò)程表現(xiàn)為毛發(fā)不斷變細(xì)，這是毛發(fā)的第一個(gè)質(zhì)量變化(即絨毛多而終毛少)，最后在這個(gè)皮膚區(qū)里的毛的數(shù)量減少。
除了脫發(fā)，在極少數(shù)的情況下也會(huì)有不正常的毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)重，如過(guò)度依賴(lài)雄性激素導(dǎo)致的婦女多毛病以及與雄性激素?zé)o關(guān)的多毛癥(Bertolino等(1993)″Disordersof Eidermal 35 Appendages and related disorders″in Dematology in General Medicine，pp671-95，F(xiàn)itzpatrick等主編，McGraw-Hill，這種情況對(duì)患者個(gè)人來(lái)說(shuō)會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的社會(huì)后果。
禿發(fā)、多毛癥及其他毛發(fā)生長(zhǎng)紊亂很普遍，開(kāi)發(fā)有效的化妝品和臨床治療劑有很大的意義。但是，盡管有這種需求，有效的預(yù)防和治療的方法仍然很缺，例如對(duì)許多禿發(fā)病人(如接受化療的病人和老年人等)不能得到有效的治療，如可用毛發(fā)移植手術(shù)。但外科手術(shù)最多的也只是治療方法的一部分，電刺激曾被建議用來(lái)促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)(見(jiàn)US Patent No 5,800,477及其中引用的文獻(xiàn))，但這些方法的療效尚有問(wèn)題。e)組織修復(fù)與其他器官的再生本發(fā)明的組合物也可通過(guò)體內(nèi)和原位培育再生性干細(xì)胞，用于修復(fù)組織或再生身體的其他器官，包括不僅限于心臟、腎、肺、肝、胰、眼、腦、動(dòng)脈、神經(jīng)及骨。例如本組合物可局部注射于心肌，以直接激活/誘導(dǎo)心臟的成體干細(xì)胞(ASCs)，以治療各種心臟病及心血管病，并在心臟發(fā)作后再生心臟。該組合物也可局部應(yīng)用于肝臟，以激活/誘導(dǎo)肝臟干細(xì)胞，使由于不同原因，如飲酒過(guò)多而受損的肝臟得以修復(fù)。所述的組合物還可以用于肺部以再生其中的組織，如肺泡。
本組合物還可用于修復(fù)受損的腎小球及其他引起慢性腎衰竭的小球疾病。在腎中，小球結(jié)構(gòu)很小(直徑100-200μm)散布在腎皮質(zhì)中(3×104-1×106小球/腎)，因此，常規(guī)方法如移植法難于找到耙子，直接注射本組合物可充分刺激小球，以激活/誘導(dǎo)其中的再生性干細(xì)胞。
此外，本組合物及方法通過(guò)激活或誘導(dǎo)再生性干細(xì)胞，可以治療其它由于損失或減少可更新細(xì)胞群引起的疾患，包括血液病及涉及免疫功能損傷或損失的疾病，也可以用來(lái)刺激分化細(xì)胞的生長(zhǎng)，并維持生理平衡，包括現(xiàn)有的分化細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)其表型，以及將老化的表型逆轉(zhuǎn)為年輕的表型。這對(duì)于治療組織疾患特別有用，即由于代謝功能減退或喪失，細(xì)胞衰老或靜止而損失功能的疾病，如老化細(xì)胞及/或骨質(zhì)疏松及神經(jīng)退化疾病，包括早老性癡呆癥。2、本組合物的細(xì)胞及分子的作用機(jī)理本發(fā)明提供一種新型的組合物及方法以修復(fù)組織并再生器官，當(dāng)前主要的學(xué)派思想認(rèn)為，完全的組織再生只能通過(guò)體外重組的自體皮或異體皮移植實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的基本概念正好與此相反，認(rèn)為一個(gè)完全發(fā)育的成人，其嚴(yán)重受損的組織和/或器官，具有本能，可以適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中對(duì)內(nèi)在的或外來(lái)的信號(hào)作出反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)和器官再生。這種再生環(huán)境，必須有外源的組合物來(lái)支持，以促進(jìn)器官再生而不實(shí)質(zhì)性地?fù)p失生理結(jié)構(gòu)和功能。應(yīng)用本發(fā)明組合物在體內(nèi)并原位創(chuàng)造一種環(huán)境，使器官按照胚胎發(fā)育過(guò)程自然地再生，恢復(fù)其生理結(jié)構(gòu)及功能。
本發(fā)明人認(rèn)為細(xì)胞作為生命的最小單位，其活性在生理性的組織修復(fù)及器官再生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。盡管許多生長(zhǎng)因子都參與了這個(gè)過(guò)程，但最終必須把細(xì)胞活性整體地調(diào)節(jié)好，才能獲得內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的平衡再生，組織修復(fù)和器官再生只通過(guò)調(diào)控信號(hào)或某些生長(zhǎng)因子，可能會(huì)導(dǎo)致生理結(jié)構(gòu)與功能的不完全恢復(fù)。因?yàn)樯木?xì)的平衡是身體通過(guò)自己調(diào)節(jié)其細(xì)胞的復(fù)雜活性來(lái)保持的，而不是只由一些生長(zhǎng)因子來(lái)控制的。
如前所述，本發(fā)明人揭示了在成體組織修復(fù)及器官再生，作為對(duì)內(nèi)源性的和外源性的信號(hào)的反應(yīng)的基本原理，在再生條件下，采用本發(fā)明的方法，在進(jìn)行自然再生的器官中，可以觀(guān)察到細(xì)胞的新奇的反應(yīng)和細(xì)胞間的相互作用。這些現(xiàn)象也只有在應(yīng)用本發(fā)明組合物時(shí)，才能觀(guān)察到，例如，深I(lǐng)I度燒傷在對(duì)照組中或在用常規(guī)的SD-Ag(磺胺嘧啶銀)治療組中，都是有疤痕愈合。對(duì)淺III度燒傷則需植皮。用傳統(tǒng)方法治療的創(chuàng)面，細(xì)胞與組織間的相互作用是混亂無(wú)序的，導(dǎo)致愈合后皮膚有畸形疤痕、殘廢和功能障礙。為了使損傷的成體組織及器官能恢復(fù)正常的生理結(jié)構(gòu)及功能，必須施加外源性的組合物于該部位，以提供再生環(huán)境，調(diào)節(jié)在體內(nèi)及原位的細(xì)胞的活性。
本組合物的每一成分在再生過(guò)程中各自發(fā)揮它的作用。本發(fā)明人不希望被理論所約束，在本發(fā)明中提出合理的分子和細(xì)胞水平的作用機(jī)理是基于(1)了解胚胎發(fā)育以及在胚胎及成人之間的創(chuàng)傷愈合過(guò)程的差別；(2)有效成分的物理、化學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)特性；(3)本組合物調(diào)節(jié)下，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、組織修復(fù)及器官再生的臨床前和臨床的觀(guān)察。1)人體胚胎發(fā)育人類(lèi)同其他各細(xì)胞的動(dòng)植物一樣，是一種有序的細(xì)胞的克隆，含有相同的染色體組，但專(zhuān)門(mén)化的途徑不同，雖然最后的結(jié)構(gòu)可能是很復(fù)雜的，但人的生命就是由這些有限的細(xì)胞活動(dòng)即細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和死亡的技能所生成的。人體細(xì)胞通過(guò)啟動(dòng)及關(guān)閉特殊蛋白質(zhì)的合成而進(jìn)行分化，人染色體組內(nèi)在程序控制這一過(guò)程，并受不同環(huán)境因素的影響，細(xì)胞產(chǎn)生分子信號(hào)影響相鄰的細(xì)胞，并對(duì)相鄰細(xì)胞傳來(lái)的信號(hào)作出反應(yīng)。通常認(rèn)為在每個(gè)細(xì)胞中，相同的重復(fù)的染色體組決定著細(xì)胞對(duì)不同刺激的反應(yīng)的規(guī)則，并指導(dǎo)錯(cuò)綜復(fù)雜的各細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。通過(guò)這種發(fā)育過(guò)程，胚胎發(fā)育成為成人的器官。
受精卵是一個(gè)大細(xì)胞，不斷進(jìn)行有絲分裂成為許多小細(xì)胞稱(chēng)為裂球，其總質(zhì)量沒(méi)有變。這一過(guò)程叫做卵細(xì)胞分裂。在這一階段DNA自制及有絲分裂是高速度的，分裂的胚胎幾乎完全取決于RNA、蛋白質(zhì)、膜及其他組合物在卵中儲(chǔ)備。分裂期之后，細(xì)胞分裂速度減慢，胚胎染色體組的轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，這種變化稱(chēng)為囊胚中間過(guò)渡。開(kāi)始時(shí)，胚胎細(xì)胞不僅是機(jī)械地結(jié)合在一起，而且是由能通過(guò)離子和小分子的間隙連接點(diǎn)結(jié)合起來(lái)的，這一特點(diǎn)使信息能夠很有效地傳遞，有助于細(xì)胞行為的相互協(xié)調(diào)，同時(shí)胚胎的最外邊的裂球之間緊密連接形成一個(gè)密封區(qū)，將胚胎的內(nèi)部與外部媒介隔開(kāi)，大約在16個(gè)細(xì)胞期，Na+開(kāi)始穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胚胎內(nèi)部，細(xì)胞間的空隙因?yàn)樾纬闪藵B透區(qū)梯度所以水分也隨著進(jìn)入。結(jié)果，使細(xì)胞間的裂縫在胚胎深處擴(kuò)大形成空腔，稱(chēng)為囊腔，在這一階段，胚胎叫做囊胚。
構(gòu)成囊胚的外層的細(xì)胞變成一個(gè)上皮層，為原腸胚形成的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)提供舞臺(tái)，這一戲劇性的過(guò)程，把簡(jiǎn)單的細(xì)胞空球轉(zhuǎn)變?yōu)楦鲗拥慕Y(jié)構(gòu)。囊胚的多層結(jié)構(gòu)分內(nèi)、外、中三層，中央腸管把早期胚胎的外層細(xì)胞卷入內(nèi)部而形成囊胚的內(nèi)層。
因原腸胚形成的三層結(jié)構(gòu)，最內(nèi)部為原始腸管，是內(nèi)胚層；最外面為外部上皮，是外胚層；這兩層之間有一個(gè)由間質(zhì)細(xì)胞組成的松散的組織層，是中胚層，胚胎的這種三層結(jié)構(gòu)，大體上相當(dāng)于成人的腸在內(nèi)部，表皮在外部，而結(jié)締組織及肌肉在中間的結(jié)構(gòu)。
哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的早期是高度調(diào)控的，每個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)都由其與相鄰細(xì)胞的相互作用來(lái)決定。發(fā)育的環(huán)境不正常時(shí)，胚胎細(xì)胞失去控制。例如正常的早期小鼠胚胎被移植到成年小鼠的腎或睪丸中時(shí)，它的組成很快就紊亂了。正常的細(xì)胞增殖中斷，結(jié)果是一種稀奇古怪的東西生長(zhǎng)，稱(chēng)為畸胎瘤?；チ鍪且蝗何蓙y的細(xì)胞，包括各種分化的組織，如皮膚、骨頭、腺的上皮，這些分化的細(xì)胞與未分化的干細(xì)胞混在一起，繼續(xù)分裂生成更多的分化的組織。
胚胎干細(xì)胞非常能適應(yīng)環(huán)境的信號(hào)，以指導(dǎo)他們?cè)诓煌只緩街凶鞒鲞x擇。在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中，胚胎干細(xì)胞能啟動(dòng)或關(guān)閉發(fā)育時(shí)鐘——驅(qū)使細(xì)胞從胚胎向成熟態(tài)發(fā)展的過(guò)程，例如性質(zhì)相似的干細(xì)胞，可以從正常的內(nèi)層細(xì)胞群在培養(yǎng)基中衍生而來(lái)，他們繁殖以后細(xì)胞就分散開(kāi)來(lái)，一旦分散，有些細(xì)胞在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境里可以繼續(xù)無(wú)限制的分裂而不改變其特性，所生成的干細(xì)胞系可以無(wú)限制的分裂而不分化。培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子或cytokine即白血病抑制因子(LIF)的存在對(duì)這些發(fā)育過(guò)程是至關(guān)重要的[Nichols等(1998)Cell 95379-39及Niwa等(1998)Genes Dev 12到122048-2060]。將LIF移去后，培養(yǎng)基中的胚胎干細(xì)胞即自動(dòng)聚集成為類(lèi)胚胎的組合物，可以分化成為許多細(xì)胞譜系，包括跳動(dòng)的心肌細(xì)胞、血島、神經(jīng)元、色素細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及生脂肪細(xì)胞[Bradley(1990)Curr.Opin.Cell Biol.21013-1017]。但啟動(dòng)這些發(fā)育程序是混亂無(wú)序的。生成的則是混雜的組織“百寶囊”(Fuchs等(2000)Cell100143-155)這種在培養(yǎng)基中，無(wú)序的不可控制的胚胎干細(xì)胞體外發(fā)育，對(duì)一些試圖體外再生器官，然后移植給病人以恢復(fù)生理結(jié)構(gòu)及功能的人們來(lái)說(shuō)，是一種挑戰(zhàn)。要從胚胎干細(xì)胞在體外重建功能完全的器官，是一項(xiàng)極大的挑戰(zhàn)，就是要從“銀河”般的環(huán)境信號(hào)中，挑選出一個(gè)“星座”的信號(hào)，可以選擇性地“誘導(dǎo)”胚胎干細(xì)胞放棄一切其他途徑，而走向特定譜系的發(fā)育途徑。曾經(jīng)試圖用各種方法從胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生“純”的特殊類(lèi)型的細(xì)胞，例如能表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)前身的標(biāo)志的，純多功能祖先細(xì)胞群，可以從小鼠胚胎干細(xì)胞獲得[Brustle等(1999)Science 285754-756]。整個(gè)過(guò)程是煞費(fèi)苦心的，培育的胚胎干細(xì)胞聚集體連續(xù)地在培養(yǎng)基中繁殖。培養(yǎng)基上(1)首先只含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF2)；(2)然后是FGF2與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)混合；(3)最后是FGF2與血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)混合。結(jié)果，這些多功能的干細(xì)胞用“設(shè)計(jì)者的雞尾酒”含多種生長(zhǎng)因子的混合液浸泡，可以在培養(yǎng)基里維持許多代。能產(chǎn)生純的特定的一種組織類(lèi)型的細(xì)胞群，這些成果雖然是顯著而無(wú)序的，但并沒(méi)有達(dá)到體外再生器官的目標(biāo)。必須認(rèn)識(shí)到單一類(lèi)型的細(xì)胞群并非組織。要重建生理性的活組織細(xì)胞，至少需要有二種類(lèi)型的細(xì)胞，這些細(xì)胞必須能通過(guò)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在生理環(huán)境中進(jìn)行交叉談話(huà)。盡管使用了生長(zhǎng)因子調(diào)成的“雞尾酒”做了大量工作，在這些信號(hào)解譯之前，和還沒(méi)有像身體自己所有的合適的生理環(huán)境的情況下，要在體外重建功能齊全的器官，很可能要失敗。
與之相反，本發(fā)明在臨床表明，嚴(yán)重受損的人體器官可以在體內(nèi)和原位再生，而無(wú)需移植。是采用本發(fā)明的組合物和方法的一個(gè)重要的貢獻(xiàn)因素在于，成人干細(xì)胞被誘導(dǎo)并繁殖以提供各種類(lèi)型的再生性細(xì)胞，以再建各種組織，因?yàn)檫@些再生性細(xì)胞在體內(nèi)并原位生長(zhǎng)，而不是移到體外。它們的生長(zhǎng)和分化遵循胚胎發(fā)育時(shí)就設(shè)定了的基因程序。但是這些再生性成人干細(xì)胞是處在和胎兒完全不同的、惡劣的環(huán)境之中，這些干細(xì)胞的命運(yùn)，不僅受內(nèi)在的調(diào)節(jié)機(jī)理所控制，還受到外來(lái)的干擾，如細(xì)菌感染及空氣污染物等。因此，必須提供外來(lái)的組合物以促進(jìn)成人干細(xì)胞的繁殖，生成大量再生所需的組織細(xì)胞，而且成人干細(xì)胞的分化應(yīng)該由一個(gè)有利的、模擬胚胎發(fā)育的環(huán)境來(lái)調(diào)控，相同或不同的類(lèi)型的細(xì)胞之間的相互作用也應(yīng)該加以調(diào)控，以促進(jìn)組織專(zhuān)一性的回歸和粘著。這樣，組織間的相互作用可以促進(jìn)再生的組織按照器官的專(zhuān)一性來(lái)組合，成為在體內(nèi)的功能器官。
采用燒傷皮膚愈合作為成體器官再生模型，本發(fā)明人試驗(yàn)了本發(fā)明組合物對(duì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化的影響，以及對(duì)特殊的細(xì)胞-細(xì)胞，細(xì)胞-組織以及組織-組織間的相互作用。此外，還在體外模型中觀(guān)察了本組合物的這些作用。2)表皮干細(xì)胞要替換本身不會(huì)分裂的分化了的細(xì)胞，就需要干細(xì)胞，在皮膚的最外層(表皮)的細(xì)胞，分化到了最終，不能再分裂以補(bǔ)充死亡的角化細(xì)胞。表皮干細(xì)胞位于基底層，表皮與真皮的交接處，能不斷分裂產(chǎn)生子細(xì)胞，再分化成為各種角化細(xì)胞以更新皮膚。
表皮是多層的上皮，主要由角化細(xì)胞所組成，角化細(xì)胞具有特殊活性，可以合成絲蛋白的中間體稱(chēng)為角蛋白，角化細(xì)胞根據(jù)分化的不同階段表達(dá)各種不同類(lèi)型的角蛋白，如角蛋白-1、-9、-10和-16，特別是角蛋白-19(K-19)是在胎兒表皮的基底細(xì)胞層中和人胚胎毛發(fā)發(fā)育期的隆突中發(fā)現(xiàn)的[Dale等(1985)J.Cell Biol.1011257-1269；Moll等(1982)Differentiation 23170-178；Akiyama等(2000)J.Invest Dermatol.114321-327]。表達(dá)K-19的角化細(xì)胞已被認(rèn)為是公知的表皮干細(xì)胞。
從表皮干細(xì)胞分化的角化細(xì)胞，其每一層的外觀(guān)都不一樣。最內(nèi)層連接下面的基底板，為基底細(xì)胞，能有絲分裂，生成更多的上皮細(xì)胞；基底細(xì)胞上面為幾層較大的帶刺的細(xì)胞，它們的大量橋粒為角蛋白絲提供了停泊之地；有刺的細(xì)胞之外是薄的顆粒細(xì)胞層，它標(biāo)明了代謝活躍的內(nèi)層與外層之間的界線(xiàn)，外層含有死亡的細(xì)胞，這細(xì)胞的細(xì)胞器都已消失，變成扁平鱗狀或鱗屑，填以縱密的角蛋白。
當(dāng)一些基底細(xì)胞正在分裂，使基底層的細(xì)胞數(shù)量增加時(shí)，其他類(lèi)型的角化細(xì)胞溜出基底細(xì)胞層，進(jìn)入帶刺細(xì)胞層。當(dāng)他們到達(dá)顆粒層，細(xì)胞核和胞漿中的細(xì)胞器丟失，轉(zhuǎn)變成角質(zhì)層中的角化的鱗屑。最后，這些鱗屑從皮膚表面脫落。通常細(xì)胞從皮膚的基底層由表皮干細(xì)胞生出到身體的表面脫落的時(shí)間，根據(jù)身體的部位為2周到4周不一。
原則上，表皮干細(xì)胞可生成二種起初是相似的子細(xì)胞，但隨后，環(huán)境使它們命運(yùn)不同為了保證新的皮膚細(xì)胞的供應(yīng)，每個(gè)自我與日俱增新的皮表補(bǔ)釘必須在每一代的細(xì)胞里至少有一個(gè)“永生的”細(xì)胞。其后代在遙遠(yuǎn)的將來(lái)的皮膚補(bǔ)釘中仍然存在。根據(jù)情況，干細(xì)胞的生產(chǎn)可能增多，例如當(dāng)一處表皮補(bǔ)釘破壞時(shí)，損傷處被周?chē)慕】档谋砥ぜ?xì)胞修復(fù)，這些表皮細(xì)胞移動(dòng)并增殖，以覆蓋裸露的區(qū)域，在這個(gè)過(guò)程中，形成了一個(gè)新的自我更新的表皮補(bǔ)釘，表明另一些干細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生，以補(bǔ)償損失。
為了產(chǎn)生更多干細(xì)胞，干細(xì)胞的子細(xì)胞可能也是干細(xì)胞而不進(jìn)入向終端分化的路途。這些干細(xì)胞的命運(yùn)由情況來(lái)決定，一種可能的決定因素是與基底板或創(chuàng)口的暴露的結(jié)締組織接觸，失去這種接觸則啟動(dòng)終端分化，保持接觸則保存干細(xì)胞的潛能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞之外的基質(zhì)的接觸，對(duì)細(xì)胞的命運(yùn)有重要影響。如果細(xì)胞保持懸浮而不下沉到培養(yǎng)皿底部，它們就全部停止分裂和分化。而且還發(fā)現(xiàn)，在正常生理?xiàng)l件下，角化細(xì)胞占據(jù)纖維結(jié)合蛋白受體。把細(xì)胞留在基底板里以保持他們作為干細(xì)胞，如果受體丟失或失活，則細(xì)胞就從基底層被排放出去，確認(rèn)他們要分化。其他原因造成細(xì)胞從基底層放出導(dǎo)致丟失受體，使細(xì)胞在未成熟時(shí)就分化了。
細(xì)胞之間，細(xì)胞與組織之間的生理的相互作用，對(duì)于干細(xì)胞保持非分化狀態(tài)更為重要。正如在本描述后面所顯示的，在干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的體內(nèi)模型中，成人干細(xì)胞被激活，在一種組織專(zhuān)一性的方式下，相互作用，定向地分化成為皮膚的全部組織包括附件所需的各種類(lèi)型的細(xì)胞。這些專(zhuān)一性的相互作用在深度及大面積燒傷皮膚，接受本發(fā)明組合物治療的傷口愈合的過(guò)程中已被觀(guān)察到。在后面還要提到在體外模型中，如果沒(méi)有本發(fā)明組合物推動(dòng)細(xì)胞-細(xì)胞間的適當(dāng)?shù)南嗷プ饔茫笫竺揖筒荒苓M(jìn)行克隆繁殖，形成皮膚組織。3)成人傷口愈合成人傷口愈合是復(fù)雜的過(guò)程，經(jīng)歷三個(gè)階段凝結(jié)、發(fā)炎、增殖及重塑。
首先，起初的凝結(jié)過(guò)程涉及血小板與纖維蛋白及膠原的接觸，纖維蛋白突出層的沉積，對(duì)傷口愈合第一個(gè)刺激是最通常的損傷-誘致，花生油烯酸介導(dǎo)的組織補(bǔ)體的激活，這種刺激將分葉核粒細(xì)胞吸引到損傷區(qū)域，作為一種對(duì)感染的防御。如果血管在損傷時(shí)已經(jīng)破裂，內(nèi)皮下的膠原蛋白被暴露于血小板，結(jié)果啟動(dòng)了凝血機(jī)制。被激活的血小板開(kāi)始釋放生化介體引起血管收縮，從而減少失血。血小板也與受損組織相互作用，引起凝血酶釋放，使可溶的循環(huán)的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，依次構(gòu)成捕集器和激活血小板，最終形成整體的止血“栓子”。當(dāng)這些激活的血小板脫粒，它們的α-顆粒釋放各種細(xì)胞活素和生長(zhǎng)因子，它們是炎性細(xì)胞如中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞的廣泛的化學(xué)引劑(趨化性)，和作用于非炎性細(xì)胞纖維原細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的分裂素，它們被涉及到下面的傷口愈合。纖維蛋白凝塊也作為支架，在其之上和通過(guò)它這些細(xì)胞能夠增殖和移動(dòng)。另外，被激活的血小板參與傷口愈合的合成需要的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的調(diào)節(jié)，例如由血小板分泌的細(xì)胞活素和生長(zhǎng)因子包括血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和β2(TGF-β1和TGF-β2)、血小板衍化上皮生長(zhǎng)因子(PDEGF)、血小板激活因子(PAF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、粘連蛋白、5-羥色胺。
第二，炎性期開(kāi)始于凝結(jié)啟動(dòng)的幾小時(shí)之內(nèi)。這一過(guò)程是一個(gè)對(duì)感染抵抗和新生細(xì)胞與損傷組織之間的橋梁。在此期間，炎性細(xì)胞被吸引到損傷區(qū)域并激活。在凝結(jié)(或止血)的末期，一旦出血停止，隨之而來(lái)的就是血管擴(kuò)展和毛細(xì)血管通透性增加。
急性炎癥的特征，中性白細(xì)胞，然后巨噬細(xì)胞移動(dòng)到傷口。這些炎性細(xì)胞吞噬細(xì)菌和清除損傷組織。發(fā)展下去是慢性炎癥，在那里淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)傷口。然后轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，它被認(rèn)為是成人傷口愈合的主要協(xié)調(diào)因子。
中性白細(xì)胞吞噬污染傷口的細(xì)菌和消化纖維蛋白基體，為新組織作準(zhǔn)備。它們也分泌血管擴(kuò)張介子和細(xì)胞活素，它們激活成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞，并將巨噬細(xì)胞吸引到損傷部位。巨噬細(xì)胞吞噬潛在的病原體，清除傷口，分泌細(xì)胞活素和生長(zhǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF-a)、白細(xì)胞間素-1(IL-1)和干擾素-gamma(IFN-γ)。這些化學(xué)訊號(hào)也刺激成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的滲透、增殖和移動(dòng)，導(dǎo)致血管生成。
隨后，成纖維細(xì)胞進(jìn)入傷口將業(yè)已存在的纖維基體替換為氨基葡萄糖和蛋白聚糖。愈合中的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)同樣含有許多糖蛋白，包括纖維合成素和tenascin。纖維合成素促進(jìn)酶解物粘附，tenascin通過(guò)對(duì)抗纖維合成素促進(jìn)酶解物的移動(dòng)。
更進(jìn)一步，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞將溶解的氧分子轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化物，這對(duì)抵御傷口感染，也對(duì)發(fā)出的有氧信號(hào)進(jìn)一步促進(jìn)生長(zhǎng)因子的生成是重要的。
第三，在接下來(lái)的日子里，多種多樣的細(xì)胞在加大增殖并移動(dòng)到傷口，包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞(即角化細(xì)胞)和構(gòu)成血管的內(nèi)皮細(xì)胞。在遷移和增殖過(guò)程中，這些細(xì)胞被補(bǔ)充到愈合中的傷口經(jīng)歷快速的有絲分裂，變?yōu)樽罱K定型的疤痕的結(jié)構(gòu)。
在此期間，一個(gè)稱(chēng)之為上皮化的過(guò)程出現(xiàn)，使得傷口邊緣重新上皮化。在上皮化過(guò)程期間，一個(gè)以角質(zhì)化細(xì)胞為主構(gòu)成的上皮覆蓋開(kāi)始遷移，并且經(jīng)歷層化和分化來(lái)重建表皮的屏障功能。這一過(guò)程也促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的生成、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞活素的表達(dá)以及通過(guò)生長(zhǎng)因子(如角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的釋放生成血管。角化細(xì)胞通過(guò)釋放成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)促進(jìn)血管形成。它們也分泌發(fā)揮化學(xué)吸引和有絲分裂作用的TGF-α，以及涉及到基體生成的PDGF。成纖維細(xì)胞的進(jìn)一步遷移和增殖導(dǎo)致膠原蛋白沉積代替蛋白聚糖。另外，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖建立了新生血管化，即血管形成。
一旦單層角化細(xì)胞覆蓋了傷口表面，增殖和合成活動(dòng)減速，遷移停止，在分化和層化的幫助下建立一個(gè)帶有基礎(chǔ)薄層的新分層表皮。
雖然疤痕在這一階段開(kāi)始形成。但是底部結(jié)締組織的收縮有助于新表皮的形成。結(jié)締組織通過(guò)將傷口的邊緣拉到一起而使傷口封閉。當(dāng)結(jié)締組織沒(méi)有收縮而是持續(xù)堆積時(shí)就形成更大的疤痕。另外，當(dāng)傷口暴露于干燥空氣中，無(wú)力支撐上面的細(xì)胞時(shí)，就形成了結(jié)痂。常規(guī)干性療法治療的成人傷口，都是以攣縮疤痕和嚴(yán)重的毀容的方式愈合。
最后，當(dāng)增殖和遷移活動(dòng)開(kāi)始減慢時(shí)，組織的重塑就開(kāi)始了。這一階段涉及到細(xì)胞外蛋白和蛋白聚糖的合成，以及膠原蛋白的溶解和合成之間的平衡。雖然巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞也參與到這一過(guò)程，但是在增殖和遷移占主導(dǎo)地位的細(xì)胞類(lèi)型包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。這一過(guò)程依賴(lài)于有效新陳代謝基體的特性、氧含量和生長(zhǎng)因子。重塑可以持續(xù)幾個(gè)星期、幾個(gè)月、甚至幾年的時(shí)間。在此期間，成纖維細(xì)胞是主導(dǎo)的活動(dòng)細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兣c新基體的沉積、重建組織的連續(xù)性和決定疤痕形成的程度有關(guān)。因此，成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化應(yīng)該被特殊加以調(diào)節(jié)，以便預(yù)防它們過(guò)度的膠原蛋白沉積活動(dòng)。
在傷口愈合的過(guò)程中，生長(zhǎng)因子已經(jīng)被涉足到各種活動(dòng)中，如有絲分裂發(fā)生、motogenesis、血管形成、趨化性、游走和重建。尤其是因?yàn)門(mén)GF-β直接與纖維化有關(guān)，所以對(duì)它做的研究最多。它是由許多參與炎性反應(yīng)的細(xì)胞包括血小板、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的，并且被包含在愈合的幾乎所有階段。據(jù)了解，它的作用包括化學(xué)吸引炎性細(xì)胞、增加膠原沉積、抑制蝕原酶、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分、阻斷纖維蛋白溶酶原抑制因子和促進(jìn)血管形成[參見(jiàn)Chang等(1995)Aesth.Plast.Surg.19237-241]。消除由于減少過(guò)量的血管形成、炎性細(xì)胞滲透和其它生長(zhǎng)因子的過(guò)度調(diào)節(jié)而造成的結(jié)果的影響。
令人失望的是提高TGF-β的水平，并不一定意味著與疤痕質(zhì)量的改善有關(guān)聯(lián)。使用外源的TGF-β的結(jié)果是提高炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的水平、膠原的沉積和纖維[參見(jiàn)Shah等(1992)Lancer339213-214]。因此，生長(zhǎng)因子的平衡在傷口的愈合方面可以起到至關(guān)重要的作用。
目前，這一領(lǐng)域中的流行的觀(guān)點(diǎn)是成年人的創(chuàng)面愈合必須是疤痕愈合，因?yàn)樵诔扇松砩希罢！钡难仔詡谟鲜菫榱私档透腥镜奈ｋU(xiǎn)而犧牲愈合的質(zhì)量。正如本項(xiàng)發(fā)明證明那樣，成年人大面積深度燒傷無(wú)疤痕愈合這一事實(shí)，將這個(gè)教條改變了。細(xì)胞在細(xì)胞和組織水平上的動(dòng)態(tài)改變這一令人注目的臨床證據(jù)，說(shuō)明了在利用本項(xiàng)發(fā)明方法提供的環(huán)境下，成年創(chuàng)面愈合過(guò)程類(lèi)似于胚胎無(wú)疤痕傷口愈合。4)胎兒傷口無(wú)疤痕愈合與成年人本能的和自發(fā)的傷口愈合相比較，胎兒創(chuàng)傷愈合在炎性反應(yīng)和生長(zhǎng)因子方面有著明顯的不同。在胎兒傷口愈合內(nèi)內(nèi)源性免疫球蛋白浸潤(rùn)程度低。[參見(jiàn)Longaker et al.(1990)J.Pediatr Surg.2563-69]。這種中性白細(xì)胞浸潤(rùn)的降低并不是因?yàn)榕咛](méi)有能力生成中性白細(xì)胞。更進(jìn)一步，在發(fā)育更為成熟的胚胎內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集的增加與疤痕的增加有著直接的關(guān)系[參見(jiàn)Hopkinson et al.(1994)J.Cell.Sci.1071159-1167]。
在胚胎愈合和成體愈合中，生長(zhǎng)因子的形象是有差別的。在胚胎傷口內(nèi)通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)可測(cè)量到微量的TGF-β和基本FGF[見(jiàn)于Whitby and Ferguson(1991)Dev.Biol.147207-215]。同時(shí)PDGFs在胚胎傷口和成體傷口的最初階段內(nèi)都存在，但在胚胎傷口消失得更快。這可以被解釋為與胚胎傷口內(nèi)輕度巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。雖然，生長(zhǎng)因子脫粒的缺乏能夠解釋炎性細(xì)胞聚集的降低。這可以進(jìn)一步導(dǎo)致其它生長(zhǎng)因子在胚胎傷口處于較低的水平。另外，浸泡在溫暖無(wú)菌的羊水中，胎兒有可能在這樣一個(gè)生理濕潤(rùn)和隔離的環(huán)境下愈合傷口，并且不留疤痕，不喪失功能。5)利用本發(fā)明方法提供的條件實(shí)現(xiàn)的傷口愈合成人以完整的器官發(fā)育的形式完成傷口的愈合，是在與胎兒相比更為惡劣的環(huán)境下進(jìn)行的。傷口對(duì)于在創(chuàng)面上機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷產(chǎn)生的“正?！毖仔苑从?，外源的因素如細(xì)菌引起的感染和進(jìn)一步的炎性反映等負(fù)面影響，是敏感的。如上討論過(guò)的，在創(chuàng)傷治療方面流行的思維模式認(rèn)為成人傷口的愈合必須是疤痕愈合，因?yàn)樵诔扇松砩希罢！钡难仔詡谟鲜菫榱私档透腥镜奈ｋU(xiǎn)而犧牲愈合的質(zhì)量。目前的這項(xiàng)發(fā)明改變了這一教條，它展示了如果外界提供適當(dāng)?shù)臈l件，那么成體擁有的內(nèi)在的自我修復(fù)和再生的能力就會(huì)完全發(fā)揮出來(lái)，對(duì)損傷產(chǎn)生反應(yīng)，傷口的愈合過(guò)程能夠模擬妊娠早期胚胎傷口愈合的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)嚴(yán)重皮膚損傷的無(wú)疤痕愈合。
發(fā)明人利用皮膚，這一人體最大的器官，作為組織修復(fù)和再生的模型，展示了成人的皮膚能夠通過(guò)原位培植具有再生能力的成體干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)再生復(fù)制，而且不丟失它的結(jié)構(gòu)和功能，包括皮膚附件。在使用本項(xiàng)發(fā)明所包含的技術(shù)的情況下控制著傷口愈合過(guò)程中的細(xì)胞和組織內(nèi)動(dòng)態(tài)變化。
圖5A-C顯示了在深I(lǐng)I度燒傷后第10天細(xì)胞和組織發(fā)生的改變。如圖5A顯示，在傷后第1天，表皮凝固性壞死和真皮淺層膠原纖維變性。在這一階段，成體細(xì)胞對(duì)損傷作出反應(yīng)，開(kāi)始激活和誘導(dǎo)(將在這一段的下一部分介紹)。傷后第6天，通過(guò)使用發(fā)明的成分進(jìn)行的治療，壞死組織被完全液化排除(圖5B)。因?yàn)閴乃澜M織是用液化的方法而不是外科的方法排除的，所以殘存的活組織被保留下來(lái)，避免了由于外科手術(shù)而引起的二次傷害。在這種條件下活組織內(nèi)成體組織細(xì)胞被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為成體干細(xì)胞，然后它們發(fā)育皮膚再生所需要的成各種組織干細(xì)胞，如血管、毛囊、膠原纖維、間質(zhì)組織和神經(jīng)。正如圖5C所顯示的，在傷后第10天，創(chuàng)面上有非?；钴S的再生出現(xiàn)。如圖6所示，在傷口愈合階段，在創(chuàng)面內(nèi)有大量的組織干細(xì)胞活躍地繁殖。在高倍放大后，可以觀(guān)察到再生的干細(xì)胞間的特殊連接(圖7)。
這些組織干細(xì)胞依據(jù)在胚胎階段就已經(jīng)確定的遺傳程序，有方向性地分化成各類(lèi)細(xì)胞。如圖8所示，各種細(xì)胞向它們的同族組織起源的位置強(qiáng)烈地移動(dòng)。比如，屬于真皮層的細(xì)胞向下移動(dòng)(灰色尖頭所指示的)，而表皮細(xì)胞則向上移動(dòng)(黑色尖頭所指示的)。高倍放大后，可以觀(guān)察到成纖維細(xì)胞的合成代謝(圖9)。成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面的愈合方面起著重要的作用，產(chǎn)生保持皮膚結(jié)構(gòu)的膠原。然而，在本能的、自發(fā)的創(chuàng)面愈合或在常規(guī)方法的治療下產(chǎn)生的愈合期間，由于對(duì)感染作出的反應(yīng)而增加的生長(zhǎng)因子，使成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)比正常的情況下更為活躍。成纖維細(xì)胞的增殖導(dǎo)致產(chǎn)生過(guò)量的膠原，它們聚集在一起形成紊亂的纖維，當(dāng)然也就會(huì)在傷口封閉后形成疤痕。
相比之下，使用這里介紹的方法，創(chuàng)傷皮膚的再生在深I(lǐng)I度燒傷上沒(méi)有疤痕形成，在III度燒傷上僅留下平滑的、柔軟的疤痕。發(fā)明人相信成纖維細(xì)胞的增長(zhǎng)可以被控制，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的比例會(huì)被保持在一個(gè)生理水平。使用本發(fā)明組合物治療的傷口，成纖維細(xì)胞的膠原的沉積和成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的比例被控制在一個(gè)生理水平，可能的原因是本發(fā)明組合物促進(jìn)成纖維細(xì)胞成熟。試管內(nèi)進(jìn)行的大鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，在沒(méi)有本發(fā)明組合物存在的情況下，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，并表現(xiàn)出與變形細(xì)胞相似的形態(tài)(圖10A)，這與臨床的結(jié)果是相吻合的。相比之下，培養(yǎng)于本發(fā)明組合物中的成纖維細(xì)胞保持典型的成熟成纖維細(xì)胞的形態(tài)(圖10B)。
在傷后第20天，大部分傷口被復(fù)層鱗狀上皮覆蓋，而且大部分附件開(kāi)始在真皮內(nèi)形成(圖11)。同時(shí)，細(xì)胞代謝廢物也從新生成的表皮上不斷地滲出。
在傷后第22天，再生出具有正常結(jié)構(gòu)皮膚(圖12)。在高倍放大的電子顯微鏡下，可以見(jiàn)到真皮和表皮之間的連接是完全自然的(圖13)。還有，膠原纖維在新生皮膚內(nèi)按正常三維結(jié)構(gòu)的順序排列(圖14)。
在試管內(nèi)進(jìn)行的動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也證明本發(fā)明組合物具有促進(jìn)哺乳動(dòng)物已分化細(xì)胞和干細(xì)胞的增殖以及組織特殊粘連獨(dú)特的活性，借以保持器官結(jié)構(gòu)的完整性。這與臨床上本發(fā)明組合物在燒傷病人康復(fù)期間對(duì)細(xì)胞和組織產(chǎn)生的效果是一致的。
圖15A-D顯示了在試管內(nèi)培養(yǎng)大鼠皮膚細(xì)胞，在加入和未加入本發(fā)明組合物的不同結(jié)果。在10天之內(nèi)兩組細(xì)胞都健康地生長(zhǎng)(圖15A)。但是，緊接下去兩組細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)發(fā)生了急劇的變化。在對(duì)照組，在30天時(shí)細(xì)胞開(kāi)始死亡；但在治療組，細(xì)胞仍然存活并保持著正常的形態(tài)(圖15B)。在第49天，在對(duì)照組有更多的細(xì)胞死亡，在治療組細(xì)胞仍然繼續(xù)旺盛地增殖(圖15C)。在第70天，在對(duì)照組的細(xì)胞全部死亡。與之截然相反，在治療組，細(xì)胞仍然強(qiáng)勁地生長(zhǎng)，幾乎接近融合(圖15D)。在為期6個(gè)月的觀(guān)察期間，治療組的細(xì)胞一直保持著增殖，沒(méi)有顯示出不正常的形態(tài)。
這一結(jié)果顯示本發(fā)明組合物是有能力促進(jìn)初級(jí)細(xì)胞的生長(zhǎng)，據(jù)推測(cè)是通過(guò)將皮膚初級(jí)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有持續(xù)增殖潛能的表皮干細(xì)胞。這與使用本發(fā)明組合物，在人體治療上取得的對(duì)成體細(xì)胞的效果是一致的。
圖16A-C顯示了在試管內(nèi)培養(yǎng)大鼠毛囊干細(xì)胞，在加入和未加入本發(fā)明組合物的不同結(jié)果。如右列的圖16顯示，對(duì)照組的干細(xì)胞存活著，但以單個(gè)細(xì)胞的形式生長(zhǎng)。相反，在治療組干細(xì)胞增殖并相互粘連形成細(xì)胞團(tuán)(左列的圖16)。在第41天有許多細(xì)胞團(tuán)形成，表現(xiàn)出類(lèi)似組織的形態(tài)；在對(duì)照組，干細(xì)胞也增殖，但是保持著分散狀態(tài)，沒(méi)有形成任何細(xì)胞團(tuán)。
這些結(jié)果證明本發(fā)明組合物不僅有能力促進(jìn)增殖，同時(shí)也促進(jìn)干細(xì)胞的特殊組織粘連。這也與使用本發(fā)明組合物，在人體治療上取得的對(duì)成體細(xì)胞的效果是一致的。
圖17A-C顯示了在試管內(nèi)培養(yǎng)大鼠皮膚，在加入和未加入本發(fā)明組合物的不同結(jié)果。如右列的圖17顯示，在對(duì)照組有細(xì)胞的游走和分散。相反，在治療組幾乎沒(méi)有細(xì)胞的游走和分散，新生成的細(xì)胞保持著與皮塊的粘連(左列的圖16顯示)。在第44天，治療組持續(xù)增殖并與皮塊聯(lián)成一體，在顯微鏡下顯示出明顯的分界線(xiàn)。相反，在對(duì)照組，持續(xù)從皮塊上脫落，在培養(yǎng)中分散。
這些結(jié)果證明本發(fā)明組合物有能力促進(jìn)細(xì)胞與其母系組織的粘連，并保持一個(gè)正常皮膚結(jié)構(gòu)的完整性。這也與使用本發(fā)明組合物，在人體治療上取得的對(duì)成體細(xì)胞的效果是一致的。
為了監(jiān)測(cè)成體器官原位再生過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的動(dòng)態(tài)變化，利用深度燒傷的創(chuàng)面愈合為臨床模型，展示了用本項(xiàng)發(fā)明的方法進(jìn)行治療時(shí)，成體細(xì)胞如何對(duì)內(nèi)源和外源因素產(chǎn)生反應(yīng)。
如下面顯示的，本項(xiàng)發(fā)明第一次證明在有利于生理性組織修復(fù)和器官再生的條件下，在成人身上胚胎表皮干細(xì)胞被誘導(dǎo)和激活，能夠增殖。這些條件是通過(guò)應(yīng)用本項(xiàng)發(fā)明揭開(kāi)的技術(shù)和組合物所提供的。
在治療淺III度燒傷的成年病人的過(guò)程中，需要再生不同皮膚組織的再生干細(xì)胞在本發(fā)明的組合物成分所提供的最適條件下被激活。在這些再生性細(xì)胞中，采用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)，特異性地檢測(cè)了表達(dá)角蛋白19型標(biāo)記物的胚胎性表皮干細(xì)胞，即K-19角化細(xì)胞。而且在該病人皮膚再生的不同時(shí)相點(diǎn)，連續(xù)監(jiān)測(cè)了表達(dá)K-19再生細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。
一位20歲女性病人被汽油火焰燒傷雙下肢，燒傷總面積(TBSA)35％(圖18)。病理檢查證實(shí)為15％的深I(lǐng)I度和20％的淺III度燒傷。顯微鏡下觀(guān)察燒傷創(chuàng)面組織切片，表明全層皮膚細(xì)胞壞死，真皮膠原纖維變性、結(jié)構(gòu)紊亂，微循環(huán)瘀滯(圖19)。
用特異的小鼠抗人角蛋白19型的單克隆抗體(McAb)對(duì)正常和燒傷皮膚進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查。觀(guān)察結(jié)果表明，該例病人的正常皮膚表皮可見(jiàn)很少量角蛋白19型陽(yáng)性細(xì)胞(圖20A)。相對(duì)應(yīng)的，燒傷創(chuàng)面皮膚在傷后24小時(shí)K-19染色陽(yáng)性的表皮再生干細(xì)胞數(shù)量就中等程度增加(圖20B)。燒傷后4天，在汗腺、毛細(xì)血管和毛囊周?chē)梢?jiàn)開(kāi)始增多的潛在表皮干細(xì)胞(圖20C)。進(jìn)入再生狀態(tài)的皮膚組織切片在顯微鏡下檢查，可見(jiàn)增生活躍的新生上皮組織、膠原纖維和皮膚胚胎基(EB)(圖21和22)。
燒傷后7天(圖20D)和14天(圖20E)表皮再生干細(xì)胞繼續(xù)增多，并達(dá)到峰值。至燒傷后21天(圖20F)和28天，再生干細(xì)胞數(shù)量又減至一定的水平。
傷后20天，愈合中的創(chuàng)面組織切片在電子顯微鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)上皮細(xì)胞與基底膜之間的半橋粒連接(圖29)。更進(jìn)一步，棘狀細(xì)胞之間的橋粒連接也形成了(圖28)。
傷后30天，該從病人身上取到的新生皮膚組織切片，在電子顯微鏡下觀(guān)察顯示，采用本發(fā)明的方法治療，使再生的皮膚恢復(fù)了正常的生理結(jié)構(gòu)(圖24)。而且再生的新皮膚中，膠原纖維的粗細(xì)和空間排列均正常，直徑0.1μm～0.5μm，有明暗相間的周期性(64nm)橫紋(圖26)。嗜銀染色切片顯示，采用本發(fā)明的方法和組合物治療后30天，表皮基層基底膜再生活躍(圖25)。
為確認(rèn)新皮膚是病人自體再生的而不是外源性的，在病人傷后30天對(duì)從新皮膚上取到的切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。對(duì)用AE3染色的組織切片進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其為AE3陽(yáng)性的鱗狀上皮，表明皮膚是自身再生的表明取該的(圖27A)。再生皮膚進(jìn)行和與此相一致，AE1染色的組織切片顯示AE1腺上皮蛋白呈陰性(圖27B)。這些結(jié)果首次證實(shí)，新的人體器官能夠在體原位再生，而且再生的器官無(wú)論在細(xì)胞水平還是組織水平都具有正常的結(jié)構(gòu)和功能(圖23)。
在深I(lǐng)I度(深度部分真皮燒傷)或者更深的燒傷創(chuàng)面，存在于表皮基底層的表皮干細(xì)胞已經(jīng)完全毀損。更有意義和更具挑戰(zhàn)性的是在淺III度燒傷(全厚皮燒傷)，表皮和真皮都全層被破壞，只有皮下組織和脂肪層尚健在。用常規(guī)方法即干性療法和植皮治療全厚皮燒傷燒傷，結(jié)果傷口封閉帶有毀容疤痕和實(shí)質(zhì)上的皮膚附件的功能喪失。
然而，正如上述，雙下肢遭受深I(lǐng)I度和III度燒傷的成年病人，其皮膚能夠再生痊愈，沒(méi)有它的實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的喪失。那么，組成這一再生器官的組織細(xì)胞的來(lái)源在哪里呢？在這里，本發(fā)明通過(guò)臨床實(shí)踐為該問(wèn)題作了回答，臨床治療研究的結(jié)果證實(shí)，如果不是全部的話(huà)，至少部分表皮細(xì)胞來(lái)源于再生表皮干細(xì)胞。如圖20B-G所示，當(dāng)肌體處于活躍的組織修復(fù)和皮膚再生時(shí)，這些干細(xì)胞呈K-19陽(yáng)性細(xì)胞。這些再生表皮干細(xì)胞增殖、分化，形成能合成不同角蛋白(如9型角蛋白、16型角蛋白)的特殊類(lèi)型的角化細(xì)胞，這些角化細(xì)胞向上移動(dòng)直達(dá)表皮。這些細(xì)胞可以繼續(xù)向上移動(dòng)，進(jìn)一步分化為能合成較硬角蛋白(如1型角蛋白、10型角蛋白)的角化細(xì)胞，這些是成熟表皮細(xì)胞所含的典型角蛋白。
不過(guò)應(yīng)該注意的是，這里只有用K-19作為檢測(cè)標(biāo)記物的標(biāo)記細(xì)胞是再生表皮干細(xì)胞。其它組織如血管、毛囊、膠原纖維、間質(zhì)組織和神經(jīng)等的再生干細(xì)胞也肯定同時(shí)被活化、增殖、分化，形成各種組織細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)一個(gè)具有完整功能的器官在體原位再生。
下一個(gè)需要回答的問(wèn)題是“再生細(xì)胞來(lái)自何處？”在正常的生理?xiàng)l件下，有些細(xì)胞長(zhǎng)期停滯于細(xì)胞周期的G0期或G1期，在條件變得有利的情況下才出現(xiàn)增殖活動(dòng)。有些細(xì)胞可在有機(jī)體的整個(gè)生命過(guò)程中持續(xù)進(jìn)行分裂活動(dòng)，連續(xù)不斷地提供干細(xì)胞。干細(xì)胞分裂后的部分子細(xì)胞分化為執(zhí)行一定特殊機(jī)能的成熟細(xì)胞，另一部分子細(xì)胞則一直保持連續(xù)增殖能力。為了保持正常皮膚的完整性，皮膚表皮基底層干細(xì)胞可不斷進(jìn)行分裂增殖。新生的細(xì)胞向上方表皮方向移動(dòng)。在到達(dá)棘層深部時(shí)可再分裂二或三次，然后失去細(xì)胞分裂增殖能力。
如上所述，在深I(lǐng)I度和III度燒傷，創(chuàng)面的表皮和真皮深層均已經(jīng)被損壞，表皮基底層的干細(xì)胞也全部毀損。根據(jù)在細(xì)胞和組織水平觀(guān)察到的這種創(chuàng)面的愈合過(guò)程，發(fā)明人認(rèn)為，皮下組織中毛囊、汗腺和毛細(xì)血管等周?chē)臍埓娑杏谢钚缘拈g充質(zhì)細(xì)胞是大部分(如果不是全部的話(huà))再生干細(xì)胞的來(lái)源，包括多功能表皮干細(xì)胞。
這一理論得到了從另外一個(gè)面部全厚皮壞死燒傷病人身上獲得的資料的支持(圖30)。如圖31所示。
在機(jī)體遭受創(chuàng)傷發(fā)生反應(yīng)時(shí)，或(和)在本發(fā)明組合物所含活性成分的刺激下，殘存而尚有活力皮下脂肪組織中的間充質(zhì)細(xì)胞被活化，并轉(zhuǎn)化為成體干細(xì)胞(ASCs)。這些成體干細(xì)胞是多能性的，在本發(fā)明組合物提供的再生條件下，這些成體干細(xì)胞可向不同方向定向分化，生成形成各種組織的組織干細(xì)胞，如真皮、表皮、血管、毛囊、膠原纖維、間質(zhì)組織和神經(jīng)等(圖32)。這些源于它們的母系器官的組織干細(xì)胞來(lái)相互聯(lián)接，遵循在胚胎期間就已經(jīng)確立的基因程序，以一種器官特殊方式相互聯(lián)合(圖33A和B)。
這些特殊的組織干細(xì)胞在本發(fā)明組合物提供的再生條件下進(jìn)行原位培養(yǎng)生成子代干細(xì)胞，部分子代干細(xì)胞被誘導(dǎo)可進(jìn)行組織特異性分化，形成各種組織細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)原位再生一個(gè)具有完整功能的器官。這些細(xì)胞通過(guò)形成它們母系器官所具有的特殊的和典型的連接實(shí)現(xiàn)相互之間的聯(lián)合(例如，圖28顯示的兩個(gè)棘狀細(xì)胞之間的橋粒連接)，這樣導(dǎo)致新生組織的再生。圖34顯示了血管和神經(jīng)的器官特殊聯(lián)合；以及圖35顯示的在使用本發(fā)明的技術(shù)而提供的條件下，而進(jìn)行的皮膚再生過(guò)程期間毛囊的形成。再生的新生組織被培養(yǎng)在本項(xiàng)發(fā)明的組合物提供的有利條件下，通過(guò)形成它們的母系器官具有的特殊的、典型的連接相互聯(lián)系在一起，如圖29所顯示的上皮細(xì)胞與基底板之間的半橋粒連接。然后，這些新生組織以器官特有的方式聚合在一起構(gòu)成新的器官。如圖36所示，皮膚附件包括血管、神經(jīng)和各種腺體都被再生，并且聚合在一起形成新生皮膚。最終，新生器官內(nèi)的組織逐漸發(fā)育成熟，形成與之對(duì)應(yīng)的成體組織，從而構(gòu)成再生的、全功能的器官。通過(guò)在生命體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與組織和組織與組織之間的聯(lián)系，組織和器官能夠被再生并修復(fù)它們的生理結(jié)構(gòu)與功能。例如，在上面證明的，一位身體丟失了明顯的大部分表皮和真皮的成年人，能夠重新恢復(fù)新的、具有正常結(jié)構(gòu)和功能的皮膚(圖25)。
這些發(fā)現(xiàn)和發(fā)明具有重大的理論意義和實(shí)踐意義。首先，它們首次表明，通過(guò)在體內(nèi)原位干細(xì)胞的培養(yǎng)，成體組織和器官可以實(shí)現(xiàn)修復(fù)和再生，恢復(fù)全部的生理功能?？茖W(xué)家們和醫(yī)師們都一直夢(mèng)想著實(shí)現(xiàn)這樣美妙的結(jié)果，卻從來(lái)沒(méi)有在臨床上實(shí)現(xiàn)。發(fā)明人認(rèn)為，通過(guò)移植體外培養(yǎng)的干細(xì)胞，盡管在修復(fù)損傷的表皮和真皮方面取得了一定的成就，但這樣的創(chuàng)面愈合并非生理性的。換言之，利用移植方法修復(fù)的皮膚留下了畸形的瘢痕，失去了皮膚附件如毛囊、頂泌和分泌性汗腺等的生理功能。在顯微鏡下，只有本發(fā)明中，創(chuàng)面的愈合表現(xiàn)為同一組織的細(xì)胞間連接和相鄰組織間(如表皮和真皮)的連接在結(jié)構(gòu)和功能上達(dá)到了完全生理性的恢復(fù)。相比之下，利用其它方法修復(fù)的組織間的連接是病理性的重建，失去了原有自然的結(jié)構(gòu)和功能。
其次，這是第一次在完全發(fā)育成熟的人體中，在自身組織修復(fù)和器官再生過(guò)程中，多能性胚胎干細(xì)胞被誘導(dǎo)或激活。如上所述，利用本發(fā)明的方法引導(dǎo)的創(chuàng)面生理性愈合過(guò)程中，創(chuàng)面中大量的再生干細(xì)胞表達(dá)為K-19型。眾所周知，19型角蛋白在胎兒表皮的基底細(xì)胞層和人體胎兒的發(fā)育毛發(fā)中表達(dá)。因此，在體內(nèi)原位培養(yǎng)這些胚胎干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)成體組織的修復(fù)和器官的再生，不僅是醫(yī)學(xué)上的創(chuàng)新，而且對(duì)發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)具有深遠(yuǎn)的影響。4.用于組織修復(fù)和器官再生的組合物配方及用藥方式本發(fā)明為動(dòng)物、特別是人類(lèi)提供了一種藥學(xué)或營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面的新的藥用組合物。
在一方面，該組合物能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、組織修復(fù)和器官再生，尤其是在體內(nèi)條件下。需要注明的是，這些成分可以被作為試管內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基或在體外重建組織和/或器官。
該組合物含有溶解在油脂中的甾醇類(lèi)混化合物，其重量百分比至少是0.01％。優(yōu)選的甾醇化合物的含量重量百分比為0.01％～20％，1％～10％更佳，2％～6％最佳。
甾醇化合物可以是一種動(dòng)物性甾醇或一種植物性甾醇(也稱(chēng)植物甾醇)。例如，動(dòng)物性甾醇包括膽固醇以及它的所有天然的或合成的異構(gòu)體和衍生物。甾醇化合物更好的選擇是選用豆甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、角甾醇，γ-谷甾醇，菜籽甾醇，α-菠菜甾醇，24-去氫膽固醇、多孔甾醇，胡蘿卜甙以及所有天然或合成的同質(zhì)異構(gòu)形式及以上述的派生物。甾醇化合物最好是由豆甾醇、β-谷甾醇和菜子甾醇混合組成，在此統(tǒng)稱(chēng)為“谷甾醇”。
雖然不希望受到有關(guān)甾醇在組織修復(fù)和器官再生中的作用機(jī)理的理論限制，發(fā)明人認(rèn)為，甾醇化合物在通過(guò)改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)方面發(fā)揮重要作用。如結(jié)果顯示，很多細(xì)胞膜有關(guān)的蛋白如激酶和磷酸酶可以被激活來(lái)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。也許休眠的干細(xì)胞由于細(xì)胞膜形態(tài)的改變而被激活。更進(jìn)一步，不同的成體組織細(xì)胞也會(huì)被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為一個(gè)無(wú)區(qū)別型即進(jìn)入被稱(chēng)作“反分化”的過(guò)程。隨著細(xì)胞膜滲透性的改變，其它分裂素和調(diào)節(jié)分子可以更容易被細(xì)胞膜接受，模擬一個(gè)廣譜的細(xì)胞生長(zhǎng)，以滿(mǎn)足生理性組織修復(fù)和功能性器官的再生的需要。細(xì)胞連粘分子(CAMs)的表達(dá)和磷酸化可以被模仿，具推測(cè)是由于在形態(tài)形成過(guò)程中的細(xì)胞膜約束蛋白的激活，從而進(jìn)一步提高同族細(xì)胞的協(xié)作形成特定的組織，同族組織的聚合在體內(nèi)形成全功能的器官。
進(jìn)一步而言，該組合物還包含蜂蠟，其含量按重量計(jì)算，范圍在1％～20％之間，2％～10％更佳，3％～6％最佳。
蜂蠟很久以來(lái)就被用作賦形劑來(lái)生產(chǎn)外用藥。在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，蜂蠟具有解毒、生肌、定痛。治急心痛，下痢膿血，久瀉不止，胎動(dòng)下血，瘡癰內(nèi)攻，久潰不斂，水火燙傷。(《中國(guó)中藥大詞典》，上?？萍汲霭嫔?，1986，2581頁(yè))。
蜂蠟的組成可以被分為4類(lèi)即脂類(lèi)、游離酸類(lèi)、游離醇類(lèi)和烴類(lèi)。蜂蠟也含有微量的揮發(fā)油和色素。在脂類(lèi)里包括軟脂酸蜂花酯、蠟酸蜂花酯和蜂花生油酸蜂花酯。在游離酸類(lèi)中有蠟酸、廿四酸、褐煤酸、蜂花酸、葉虱酸、落花生油酸、新蠟酸。在游離醇類(lèi)中有正廿八醇、蜂花醇。在烴類(lèi)中有廿五烷、廿七烷、廿九烷卅一烷，和稱(chēng)作蜂花烯的石蠟。一種芳香性有色組合物，名為蟲(chóng)蠟素，也被在蜂蠟中發(fā)現(xiàn)。
蜂蠟在發(fā)明的成分中為溶解在游內(nèi)的甾醇提供支持結(jié)構(gòu)。在下面說(shuō)明書(shū)詳細(xì)描述部分，蜂蠟?zāi)苄纬渗澇矘尤S結(jié)構(gòu)，其中包含溶有甾醇的油滴。當(dāng)以軟膠囊服用一個(gè)口服劑量時(shí)，蜂蠟?zāi)茉谖改c粘膜上形成一層保護(hù)膜，并且鴿巢樣三維結(jié)構(gòu)以逐漸瓦解的方式將其內(nèi)包含的油滴會(huì)按時(shí)釋放到損傷區(qū)域。
該組合物也可選擇性地含有蜂膠，含量按重量計(jì)算，范圍在0.1％～30％之間，1％～20％更佳，5％～10％為最佳。
眾所周知，蜂膠是一種粘性的、橡膠樣組合物，它被用來(lái)構(gòu)筑蜂巢。完整的蜂膠內(nèi)含各種微量成分以單一混合物形式存在，其中松香、蜂蠟、揮發(fā)油和花粉是主要成分，也有其它成分如黃酮類(lèi)似物和苯酚羧基酸。天然蜂膠幾乎不溶于水，并有特殊的氣味。蜂膠可以用有機(jī)溶劑如乙醇、乙醚和三氯甲烷從蜂巢中提取。
該組合物可以含有少量的水，按重量計(jì)算，含少于0.5％水為好，最好是少于0.1％。
當(dāng)用于口服時(shí)，本發(fā)明組合物的配伍中用了藥學(xué)上可接受的、在技術(shù)上眾所周知的載體。這些載體可使復(fù)合物配制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、乳劑、親脂性和親水性懸浮液、液體、膠狀、糖漿、漿劑、懸浮液以及類(lèi)似物，病人可通過(guò)口服吸收。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物選擇了膠囊劑型。用于口服的膠囊形式包括由白明膠制成的填充膠囊，以及柔軟的密封膠囊，由白明膠和可塑劑如甘油或山梨(糖)醇構(gòu)成。這種填充膠囊能夠?qū)⒂行С煞峙c填裝物如乳糖，包裝劑如淀粉，和/或潤(rùn)滑劑如滑石或鎂硬脂酸鹽，和隨機(jī)的穩(wěn)定劑一起包裹在內(nèi)。膠囊本發(fā)明組合物更適宜含在軟膠囊內(nèi)。它可以在適當(dāng)?shù)囊后w被溶解或被懸浮，如脂肪油或液體聚乙烯乙二醇中溶解。此外，還可添加穩(wěn)定劑。所有口服的成品應(yīng)該是符合口服的劑量。
用于口服的本發(fā)明組合物還可選擇將本發(fā)明組合物與一種固體賦形劑混合制成，可輾成混合物，而后加工顆粒組合物，如希望的話(huà)，還可加入適當(dāng)?shù)妮o助劑后，制成片劑或糖衣核。合適的賦形劑是，特別是，填裝物如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖；纖維素備制，例如，玉米淀粉、小麥粉、米粉、土豆淀粉、白明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、和/或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如果需要，一些磨碎劑可以被添加進(jìn)去，如交環(huán)聚乙烯吡咯酮、藿香或褐藻酸或鹽，比如褐藻酸鈉。
糖丸要有適當(dāng)?shù)耐繉印榱诉@個(gè)目的，可以使用濃縮糖溶液，其中可以選擇性地含有阿拉伯樹(shù)脂、滑石、聚乙烯吡咯酮、聚羰乙烯凝膠體、聚乙烯乙二醇、和/或二氧化鈦、漆溶液和適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或混合溶劑。藥片或糖衣可以加上染料或色素，用于確認(rèn)或標(biāo)記有效混合物的劑量的不同的組合。
應(yīng)用于口腔時(shí)，本發(fā)明組合物可以按照常規(guī)制成片劑或糖錠。
用于吸入，本發(fā)明組合物將根據(jù)本發(fā)明從壓力容器或噴霧器以氣霧顆粒飛沫形式方便地釋放出來(lái)，使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟乙烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適當(dāng)?shù)臍怏w，或自由推進(jìn)、干粉吸入器。在加壓氣霧顆粒的情況下，劑量單位是通過(guò)一個(gè)刻度閥門(mén)控制的。膠囊和藥筒的，例如在吸入器和吹入器內(nèi)使用的白明膠可以被制作成混有合成物的粉末，和如以乳糖或淀粉為基質(zhì)的適當(dāng)?shù)姆勰?br> 另一方面，本發(fā)明組合物還提供了另一種藥物形式，它含有藥理上合適的成分，其組成包括溶于注射油中的甾醇化合物，含量按重量計(jì)算，至少為0.01％。優(yōu)選的甾醇化合物的含量范圍為0.01％～20重量％，1％～10重量％更佳，2％～6重量％為最佳。
可注射油選用經(jīng)加工后適于人體臨床注射用的蔬菜油，玉米油、花生油、棉籽油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油或豆油更佳，優(yōu)選為豆油。列舉的加工植物油被記載在美國(guó)專(zhuān)利3,798,246號(hào)(使用二氧化硅凝膠體與一種洗提有機(jī)溶劑化合)和4,101,673號(hào)(使用二氧化硅凝膠體或硅酸)，以及4,588,745號(hào)中；和Min等人(1972)J.Am.Oil Chem.Soc.49675-677，和Singleton等人(1966)J.Am.Oil Chem.Soc.43592-595中。植物油可以通過(guò)氧化硅凝膠體或酸黏土去除異味，然后再過(guò)濾。
例如，注射用油可以是通過(guò)使用美國(guó)專(zhuān)利4,588,745號(hào)中描述的方法，從植物油中得到的甘油三酯。這種可用于注射的油是一種甘油三酯，酯內(nèi)的每一個(gè)脂肪酸含有12到20個(gè)碳原子；基于原料油，它含有更多的游離脂肪酸；含有減量的三亞油酸；含有減量的甘油二酯和減量的維生素E。
另一方面，本發(fā)明還提供了另一種胃腸外應(yīng)用/注射用的組合物，它的組分包括臨床上認(rèn)可的含油相的脂肪乳化劑，以及溶解于油相中的甾醇化合物，甾醇化合物的含量按重量計(jì)算為0.01％～20％。
應(yīng)該知道的是，甾醇混合物的修飾即包含側(cè)鏈也在本發(fā)明所涉及的范圍內(nèi)。本發(fā)明不受任何特別配制的多種甾醇混合物的限制。換言之，任何單獨(dú)的甾醇化合物或是與其它甾醇化合物根據(jù)最終的形式的自然特性，以不同的比率按要求配制，這些都在這項(xiàng)發(fā)明所涉及的范圍內(nèi)。
本發(fā)明中使用的甾醇化合物從各種天然來(lái)源中獲取。例如，植物甾醇類(lèi)可以從加工過(guò)的植物油(包括水生植物)中獲取，如玉米油、小麥籽油、大豆提取物、大米提取物、米糠油、油菜籽油、芝麻油、和其它植物油、和魚(yú)油。沒(méi)有限制上述組合物的一般性，現(xiàn)在知道甾醇化合物還有其它來(lái)源如海洋動(dòng)物，從中可以制備本發(fā)明組合物。例如，甾醇化合物可以從植物油泥中使用溶劑，如甲醇，被制備出來(lái)。另外可選擇的方法是從林業(yè)的副產(chǎn)品高油樹(shù)脂或肥皂中被提取。
公知的脂肪乳化劑至少由一種蔬菜油組成，選用玉米油、花生油、棉籽油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油或豆油為好。在本發(fā)明中可用的臨床上公知的脂肪乳化劑包括如，Liposyn、Soyacal，Intralipid、Travemusion。本發(fā)明的配方在本質(zhì)上最好是不含外源性清潔劑。
為了制備胃腸外應(yīng)用的混合物，要求使用商業(yè)上和臨床上認(rèn)可的油相脂肪乳化劑。這些脂肪乳化劑以INTRALIPID(Kabi-Vitrum of Emoryvill，Calif.And Stockholm，Sweden)；LIPOSYN(Abbott Laboratories，North Chicago，III.)；SOYACAL(AlphaTherapeutic Corp.，555 Valley Blvd.，Los Angeles，Calif.)；和TRAVEMULSION(Travenol Labs，Inc.，1 Baxter Parkway，Deerfield，III.)等為代表。這些在臨床使用的商業(yè)脂肪乳化劑是被認(rèn)可的，并且具有2年或2年以上的存放有效期。這些實(shí)用的，帶有注冊(cè)商標(biāo)的脂肪乳化劑一般含有10-20重量％的植物油，雖然紅花油和其它植物油也可相對(duì)適用，但常用的還是豆油。
甾醇化合物也可選擇溶解于藥學(xué)上可接受的、水易混合性的、非脂肪酸溶劑中，作胃腸道用藥。這種溶液劑包括，但不限于，N-甲基吡咯烷酮(NMP)；丙烯乙二醇；乙酸乙酯；二甲基亞砜；二甲乙酰胺；苯甲醇；2-吡咯烷酮；苯甲酸芐酯；C2-6鏈烷醇；2-乙氧基乙醇；烷化酯，如醋酸乙氧乙酯、醋酸甲酯、醋酸乙酯、乙二醇乙醚、或乙二醇甲醚；(s)-(-)乳酸乙酯；丙酮；丙三醇(甘油)；烷化酮，如甲基乙基酮或二甲砜；四氫氟喃；環(huán)烷化酰胺，如己內(nèi)酰胺；癸甲基亞砜；油酸；芳香胺如N，N-二乙基-m-2-甲甲酰胺；或1-dodecylazacycloheptan-2-one。
在這種溶劑中也可聯(lián)合使用增溶劑，使甾醇在溶液中更易溶解。該溶劑是典型雙性的-這些分子具有雙重特性，既是極性的又是無(wú)極性的-在這種溶液具有增加那些不溶或微溶組合物的溶解度，在分散劑中。這些溶劑經(jīng)常具有表面活性劑的特性。它們的功能可以是增進(jìn)溶解物在溶液中的溶解度，而不僅僅是一個(gè)溶劑，雖然在例外的情況下，一個(gè)單獨(dú)的化合物同時(shí)具有溶解和溶劑的特征。在本發(fā)明中可用的增溶劑包括，但不限于在這種溶劑中也可聯(lián)合使用增溶劑，使甾醇在溶液中更易溶解。在本發(fā)明中可用的增溶劑包括，但不限于甘油三醋酸酯、聚乙二醇(如PEG300，PEG400，或與3350混合)、吐溫(如吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫65，或吐溫80)，poloxamers(如Poloxamer 124，Poloxamer 188，Poloxamer 237，Poloxamer 338，或Poloxamer 407)，聚氧乙烯醚(polyoxyethylene ethers)如聚氧2十六烷基醚(Polyoxyl2 cetyl ether)，聚氧10十六烷基醚(Polyoxyl 10 cetyl ether)，聚氧20十六烷基醚(Polyoxyl 20 cetyl ether)，聚氧4月桂基醚(Polyoxyl 4 lauryl ether)，聚氧23月桂基醚(Polyoxyl 23 laury ether)，聚氧2油基醚(Polyoxyl 2 oleyle ether)，聚氧10油基醚(Polyoxyl 10 oleyl ether)，聚氧20油基醚(Polyoxyl 20 oleyle ether)，聚氧2硬脂酰醚(Polyoxyl 2 stearyl ether)，聚氧10硬脂酰醚(Polyoxyl 10 steary ether)，聚氧20硬脂酰醚(Polyoxyl 20 stearyl ether)，聚氧100硬脂酰醚(polyoxyl 100 stearyl ether)，聚氧硬脂酸鹽(polyoxylstearates)(如聚氧30硬脂酸鹽(Polyoxyl 30 stearate)，聚氧40硬脂酸鹽(Polyoxyl 40 stearate)，聚氧50硬脂酸鹽(Polyoxyl 50 stearate)，聚氧100硬脂酸鹽(Polyoxyl 100 stearate))，聚乙氧基化硬脂酸鹽(polyethoxylatedstearates)(如聚乙氧基化12羥基硬脂酸鹽(polyethoxylated 12-hydroxy stearate)以及丁酸甘油酯。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明組合物最好排除藥學(xué)上可接受的增溶劑。在另一實(shí)施方案里，本發(fā)明組合物最好排除聚乙氧基化蓖麻油(polyoxyethylatedcastor oil)。
本發(fā)明組合物可進(jìn)一步含黃芩甙，按重量計(jì)算，優(yōu)選的含量范圍為0.001％～2％，0.2％～1％更佳，0.5％～1％最佳。黃芩甙可對(duì)損傷或疾病組織具有抗炎作用，有助于為器官再生提供一個(gè)低炎性環(huán)境，模仿與在妊娠早期胚胎傷口無(wú)疤痕愈合相似的環(huán)境。黃芩甙可以抑止細(xì)胞膜多聚糖受體和促進(jìn)細(xì)胞的粘連。
黃芩甙可以從黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)中提取，可以使用油、酒精或其它有機(jī)溶劑，優(yōu)選使用100℃的油，更優(yōu)選的溫度是在120-200℃之間，最優(yōu)選的溫度是在160-180℃。更優(yōu)選的是使用黃芩的根，可以從同屬植物中的一種或幾種被獲取，唇形科的粘毛黃芩、滇黃芩、甘肅黃芩、薄葉黃芩、麗江黃芩和川黃芩。《中國(guó)中藥大詞典》，上?？萍汲霭嫔?，1986，2017-2021頁(yè)。
本發(fā)明組合物還可以含黃柏內(nèi)酯(檸檬苦酸)，按重量計(jì)算，優(yōu)選的含量范圍為0.001％～2％，0.2％～1％更佳，0.5％～1％最佳。黃柏內(nèi)酯可以從黃柏中提取(Phellodendronamurense Rupr)，可以使用油、酒精或其它有機(jī)溶劑，優(yōu)選使用100℃的油，更優(yōu)選的溫度是在120-200℃之間，最優(yōu)選的溫度是在160-180℃。另外黃柏內(nèi)酯也可以使用乙醇從黃柏中提取。更優(yōu)選的是使用黃柏的樹(shù)皮，可以從同屬植物中的一種或幾種被獲取，黃皮樹(shù)、禿葉黃皮樹(shù)峨嵋黃皮樹(shù)、云南黃皮樹(shù)、鐮刀葉和黃皮樹(shù)?！吨袊?guó)中藥大詞典》，上?？萍汲霭嫔?，1986，2031-2035頁(yè)。
本發(fā)明組合物也可選擇含有黃小蘗堿(obabenine)，按重量計(jì)算，優(yōu)選含量范圍為0.00 1％～2％，0.002％～0.5％更佳，0.003％～0.1％最佳。
黃小蘗堿可以從黃芩、黃柏和/或黃連(Coptis chinensis Franch)中提取，可以使用油、酒精或其它有機(jī)溶劑。黃連的根適于使用。黃連可以從同屬植物中的一種或幾種被獲取，毛莨科的三角葉黃連、峨嵋黃連、云南黃連?！吨袊?guó)中藥大詞典》，上?？萍汲霭嫔?，1986，2022-2030頁(yè)同樣，本發(fā)明組合物也可選擇性地含有黃連素，按重量計(jì)算，優(yōu)選含量范圍為0.001％～2％，0.002％～0.5％更佳，0.003％～0.1％最佳。
同樣，本發(fā)明組合物還可選擇含罌粟殼堿，按重量計(jì)算，優(yōu)選含量范圍為0.001％～2％，0.002％～0.5％更佳，0.003％～0.1％最佳。
黃小蘗堿、黃連素和罌粟殼堿單獨(dú)或聯(lián)合可以通過(guò)抑制平滑肌痙攣達(dá)到消除損傷組織疼痛目的。
本發(fā)明組合物還可選擇含各種氨基酸，最好是所有天然的18種氨基酸，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持。氨基酸可以是化學(xué)合成的，也可以是來(lái)自天然的。例如，天然氨基酸的完整譜系可以通過(guò)油或酒精提取地龍獲得，地龍富含蛋白質(zhì)/氨基酸。本發(fā)明組合物可進(jìn)一步含有基礎(chǔ)核酸如腺嘌呤、胞啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物在制備修復(fù)受損組織或器官藥物中的應(yīng)用。這種應(yīng)用是，將一種藥學(xué)上可接受的組合物應(yīng)用于組織或器官受損或患病的哺乳動(dòng)物，該組合物含一種甾醇化合物，可在至少0.01％含量(按重量計(jì)算)的油中溶解，以便充分地恢復(fù)組織或器官的生理結(jié)構(gòu)和功能。優(yōu)選的甾醇化合物的含量范圍為0.01％～20重量％，1％～10％更佳，2％～6％最佳。藥學(xué)上可接受的組合物可以是上述任何一種發(fā)明組合物。
本發(fā)明提供了配制適于非腸胃應(yīng)用于動(dòng)物的穩(wěn)定和無(wú)毒組合物的方法。這個(gè)方法具體是，將一種臨床上可接受的含油相的脂肪乳劑和足夠量的甾醇化合物充分混合，形成一個(gè)組合物，含量按重量計(jì)甾醇優(yōu)選為占0.01％～20％，0.2％～15％，1％～10％更佳，3％～6％最佳。許多公知的方法都可以達(dá)到充分混合，如，用超聲波降解或通過(guò)反復(fù)通過(guò)一個(gè)如注射針的小孔來(lái)完成。本發(fā)明組合物適于非腸胃應(yīng)用，通過(guò)注射即藥丸注射或持續(xù)灌注。注射的劑型可以制作成單位劑量即在安瓿中或加入防腐劑的多劑量容器內(nèi)。本組合物可以采用如下形式如油的或水的載體的懸浮體、溶液或乳劑，可以包含劑型方面的因素如懸浮的、穩(wěn)定的和/或分散的因素。
另一方面，本組合物可以通過(guò)新的作用機(jī)理來(lái)減輕動(dòng)物身上的疼痛。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)平滑肌痙攣的可逆抑制能夠減輕各種原因引起的疼痛，如外傷和燒傷。在一個(gè)試管試驗(yàn)中，小鼠的小腸被斬?cái)嗪螅⒓辞谐?段1cm長(zhǎng)的片段，然后浸泡在生理鹽水中。小腸片段的收縮率是平均6次/分鐘。在生理鹽水中加入本發(fā)明組合物后，小腸片段的收縮逐漸降低，最后停止?？墒牵?dāng)這些小腸片段重新浸泡在不含本發(fā)明組合物的普通生理鹽水中后，收縮重新出現(xiàn)。本發(fā)明組合物也能夠抑制位于真皮層靠近基底層與毛囊相連的立毛肌的收縮。在臨床上，使用本發(fā)明組合物，有效地減輕了外傷和燒傷病人的疼痛。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明組合物用于止痛，它包含有生物堿，它們是從含有那可托靈、罌粟堿、黃連堿、黃柏堿、黃小蘗堿、黃連素、蚯吲素和它們的化合物的品系中挑選出來(lái)的。例如，有那可托靈和罌粟堿可以用乙醇、油或其它溶劑從干的罌粟莢殼中提取出來(lái)。黃連堿可以用乙醇、油或其它溶劑從黃連根中提取出來(lái)。黃柏堿和黃連素可以用乙醇、油或其它溶劑從黃柏樹(shù)皮中提取出來(lái)。黃小蘗堿可以用乙醇、油或其它溶劑從黃連、黃柏和/或黃芩中提取出來(lái)。蚯吲素可以用乙醇、油或其它溶劑從黃連根中提取出來(lái)。
具體來(lái)說(shuō)，該組合物中含有的生物堿適于從黃連、黃柏和黃芩中提取。本組合物還可以進(jìn)一步包含從罌粟莢殼中提取的那可托靈。
本發(fā)明組合物可以用來(lái)減輕身體各部位的疼痛。例如，它可以被用作外用藥，通過(guò)抑制或松弛受傷真皮內(nèi)的立毛肌的收縮，減輕由外傷、淤傷、燒傷和各種傷害引起的疼痛。它也可以在內(nèi)臟器官內(nèi)被局部使用，通過(guò)抑制或松弛平滑肌的收縮，減輕由感染、外傷和其它原因引起的疼痛。
本發(fā)明組合物可以有很多單一或聯(lián)合給藥途徑，包括口服、外用、經(jīng)非腸胃、經(jīng)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)皮膚、舌下、肌肉內(nèi)、直腸、經(jīng)口腔、鼻內(nèi)、經(jīng)吸入、陰道、眼內(nèi)、經(jīng)局部傳輸(如通過(guò)導(dǎo)管或固定模)、皮下、脂肪內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)，或鞘內(nèi)。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明組合物更適于通過(guò)各種給藥途徑局部應(yīng)用到受損或患病的組織/器官部位，這些給藥方法包括經(jīng)皮膚、肌肉內(nèi)、用導(dǎo)管或固定模、經(jīng)腥膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)以及陰道。本發(fā)明組合物也可以慢速釋放劑型單獨(dú)或聯(lián)合給藥。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明的組合物可以用來(lái)制備美容化妝品，它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。甾醇化合物的優(yōu)選含量是0.01-20重量％。
本發(fā)明的組合物也可以用來(lái)制備一種漱口液，漱口液含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01～20重量％.
本發(fā)明的組合物也可以用來(lái)制備一種牙膏或者牙粉，其特征在于含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01～20重量％。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明組合物最好是通過(guò)直接和局部地給藥應(yīng)用于患病或受損器官的組織。例如，由溶于可注射油中的甾醇組成的發(fā)明組合物可以直接注射進(jìn)心肌，它可以直接被這些組織的細(xì)胞所吸收，而無(wú)需經(jīng)過(guò)血管。
作為選擇，其它用于疏水藥品組合物的傳輸系統(tǒng)也可用于本發(fā)明組合物。脂質(zhì)體和乳劑是人們熟知的疏水性藥品的傳輸載體。采用遠(yuǎn)距離循環(huán)，即側(cè)去迂回脂質(zhì)體為適宜。這樣的脂質(zhì)體在Woodle等美國(guó)專(zhuān)利No.5,013,556條中被常規(guī)地記述，其中的學(xué)說(shuō)被按引用結(jié)合。
本發(fā)明組合物還可選擇應(yīng)用于靶標(biāo)藥品傳輸系統(tǒng)，如涂有抗體的脂質(zhì)體中，其靶標(biāo)是需修復(fù)或再生的組織/器官，如特定腫瘤的抗體。該脂質(zhì)體將被相關(guān)部位選擇性地作為靶標(biāo)和吸收(即腫瘤細(xì)胞)。
同樣，本發(fā)明組合物還可選擇使用一種持續(xù)不變的釋放傳輸系統(tǒng)，如含治療成份的固體疏水性聚合物的半滲透基質(zhì)。各種類(lèi)型的釋放傳輸組合物已經(jīng)被建立，這方面的成熟技術(shù)也被廣泛知曉。釋放傳輸膠囊，依賴(lài)于它們的化學(xué)天然特性，在7天到100天以上的時(shí)間內(nèi)釋放本發(fā)明組合物。
通過(guò)各種體內(nèi)和體外的各種給藥途徑，上述所述的本發(fā)明組合物和方法在生物學(xué)和藥學(xué)上具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。
從形態(tài)學(xué)角度，本發(fā)明組合物和方法可以被用來(lái)激活或在體內(nèi)或體外休眠的成體干細(xì)胞(ASCs)，誘導(dǎo)成體組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化為ASCs。更進(jìn)一步講，本發(fā)明組合物可以用于將細(xì)胞的組織特殊形態(tài)分化誘導(dǎo)為細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的改變，這可以導(dǎo)致特殊細(xì)胞形態(tài)的消失，即分化的細(xì)胞返祖成未分化細(xì)胞(干細(xì)胞)。另外，它們也能被用作抑制細(xì)菌毒性，據(jù)推測(cè)是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，以及改變細(xì)菌的細(xì)胞循環(huán)。
在細(xì)胞內(nèi)的，本發(fā)明組合物可以被用來(lái)激活各種酶如激酶和磷酸酶，以及信號(hào)分子如環(huán)腺苷酸，在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中發(fā)揮重要作用，從而支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和保持各種細(xì)胞類(lèi)型的平衡，以保證生理功能的組織和器官的修復(fù)和再生。
細(xì)胞內(nèi)的，本發(fā)明組合物可以被用來(lái)促進(jìn)同類(lèi)細(xì)胞和非同類(lèi)細(xì)胞之間特殊組織連接的形成，據(jù)推測(cè)是通過(guò)激活各種粘連分子(CAM)的表達(dá)和活性，如構(gòu)成各種生理連接的連接蛋白和cadherin。
在組織水平，本發(fā)明組合物可以被用來(lái)促進(jìn)組織的特殊器官組合，通過(guò)促進(jìn)這些組織之間的生理連接。
在人類(lèi)醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)，本發(fā)明組合物可以被用來(lái)治療各種由受傷、疾病和老化引起的疾病。如臨床結(jié)果顯示，本發(fā)明揭示的方法學(xué)被用于通過(guò)原位再生干細(xì)胞培植，即在器官原來(lái)所處的位置，再生或復(fù)制一個(gè)新的器官。這樣的一個(gè)全新的方法使再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)生了革命，使人類(lèi)健康受益，改善生活質(zhì)量。5.對(duì)殘存活細(xì)胞造成最小傷害的清除壞死組織的組合物和方法本發(fā)明也提供造成最小傷害的清除壞死組織的組合物和方法，以保存疾病或損傷組織或器官內(nèi)的殘存活細(xì)胞。
在疾病或損傷組織內(nèi)，細(xì)胞對(duì)于各種來(lái)源于微環(huán)境的信號(hào)產(chǎn)生一系列生物化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)常是以細(xì)胞死亡為結(jié)局。細(xì)胞有兩種死亡方式壞死和凋亡。壞死是細(xì)胞被物理性力量，如對(duì)組織熱學(xué)的、銳器的和外源性化學(xué)的損傷，后常見(jiàn)的死亡方式。凋亡或程序化的細(xì)胞死亡，換句話(huà)說(shuō)，是一種由它們的內(nèi)在的自毀基因程序控制的，對(duì)如化療和凋亡調(diào)節(jié)蛋白的表現(xiàn)作出的反應(yīng)。
不管細(xì)胞的死亡方式，組織內(nèi)死亡的細(xì)胞需要被清除以便促進(jìn)組織的再生。如果壞死細(xì)胞留在疾病或損傷部位，來(lái)源于這些細(xì)胞的各種生物化學(xué)產(chǎn)物將引發(fā)身體的炎性反應(yīng)，這會(huì)阻礙組織的再生和加重對(duì)殘存活細(xì)胞的損害。
與常規(guī)的結(jié)痂和壞死組織的外科清創(chuàng)方法相反，本發(fā)明提供一種全新的方法來(lái)解決許多醫(yī)生在治療創(chuàng)傷和潰瘍時(shí)所遇到的這個(gè)問(wèn)題。傳統(tǒng)的外科清創(chuàng)經(jīng)常導(dǎo)致殘存活組織的二次外科損傷，根據(jù)本發(fā)明這對(duì)組織和器官的再生是不利的。用蛋白酶進(jìn)行的酶法清創(chuàng)普遍對(duì)存活細(xì)胞有細(xì)胞毒害作用。
根據(jù)本發(fā)明，壞死組織通過(guò)液化排出的方式被從傷口清除。為了取得這一效果，新組合物具有獨(dú)有的三維物理結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物中含有蜂蠟，在低于25℃的條件下形成鴿巢樣的三維框架結(jié)構(gòu)，油滴被包裹在蜂蠟鴿巢中。
更進(jìn)一步講，本發(fā)明的組合物還可以包含1重量％～20重量％的蜂蠟，優(yōu)選為2重量％～15重量％，5重量％～10重量％最好。
發(fā)明人已經(jīng)通過(guò)發(fā)掘蜂蠟和油的不同熱學(xué)-物理學(xué)特性設(shè)計(jì)出了類(lèi)似鴿巢樣三維結(jié)構(gòu)。采用公知的技術(shù)，將蜂蠟加熱70-80℃時(shí)溶化。下一步，將溶化的蜂蠟與油混合，如動(dòng)物或植物油(如豆油、芝麻油和玉米油)，然后開(kāi)始逐漸冷卻的環(huán)境溫度(也就是20-25℃)。因?yàn)榉湎灡扔屠鋮s得快，變硬的蜂蠟形成小“鴿巢”內(nèi)包有油滴的三維框架結(jié)構(gòu)。圖37描繪出了蜂蠟形成的鴿巢樣結(jié)構(gòu)內(nèi)含油滴。理想情況下，油滴分別包含在各自的鴿巢內(nèi)，相互之間沒(méi)有接觸。鴿巢的尺寸在5～50μm較好，10～30μm更好，15～20μm最好。
圖38顯示電子顯微鏡下具體的成分大約10％的蜂蠟。如圖38所示蜂蠟實(shí)質(zhì)上形成了鴿巢樣三維結(jié)構(gòu)，每個(gè)單獨(dú)的油滴包含在里面。
為了維持結(jié)構(gòu)的完整性，成分中可以含有極少量的水，水的重量低于1％較好，低于0.1％更好，低于0.01％最好。
發(fā)明物所獨(dú)有的結(jié)構(gòu)在使用它液化清除壞死組織時(shí)發(fā)揮著重要作用。當(dāng)發(fā)明物被涂抹到損壞組織如燒傷病人的創(chuàng)面，蜂蠟形成的鴿巢內(nèi)的油滴的釋放(圖39)，引發(fā)一系列生物化學(xué)反應(yīng)。由于并不希望被反應(yīng)的精確分子機(jī)制所束縛，發(fā)明人相信在創(chuàng)面上油滴和壞死組織之間至少發(fā)生五種生物化學(xué)反應(yīng)，包括水化、酶解、腐化、皂化和脂化。
第一步，當(dāng)發(fā)明物用于傷口創(chuàng)面上時(shí)，接觸傷口蜂蠟鴿巢樣三維結(jié)構(gòu)被體溫加熱后分解，油滴被釋放(圖40)。釋放的油滴滲透如創(chuàng)面組織內(nèi)將壞死組織顆粒包繞在其中。
第二步，被油滴包繞的壞死組織開(kāi)始細(xì)胞的水化(圖41)，結(jié)果各種細(xì)胞內(nèi)的酶被釋放出來(lái)。
第三步，釋放的細(xì)胞酶進(jìn)一步分解被油滴包繞的壞死組織顆粒。
第四步，通過(guò)分解的壞死組織顆粒與油滴之間的腐化和皂化反應(yīng)，固體的壞死組織顆粒被液化。
第五步，通過(guò)液化組織的脂化反應(yīng)，有效成分被油滴內(nèi)的脂肪酸脂化，可以被排出創(chuàng)面(圖44)。
最后，隨著發(fā)明物的蜂蠟鴿巢樣三維結(jié)構(gòu)逐步崩潰，更多的含有有效成分的油滴被一起釋放到創(chuàng)面內(nèi)，去包繞剩下的壞死組織顆粒。同時(shí)，由于液化的壞死組織與殘存的活組織不相容，使得這些壞死組織伴隨著網(wǎng)狀框架結(jié)構(gòu)的崩潰而滲出(圖45)。
根據(jù)這一發(fā)明組合物的作用機(jī)制，通過(guò)傳統(tǒng)方法(如外科清創(chuàng)術(shù))很難清除的固體壞死組織能被轉(zhuǎn)變成自動(dòng)排出創(chuàng)面的液體，對(duì)活組織不造成損傷。
這個(gè)非侵入性方法在某些方面是非常有益的。首先，壞死組織被迅速清除，從而防止身體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。第二，隨著壞死組織被有效地清除，促使細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境被破壞，這樣就有力地減少了細(xì)菌感染的危險(xiǎn)。
尤其重要的是，當(dāng)壞死組織被完全清除時(shí)，殘留的活組織未被藥油所封閉，相反，殘留的活組織被形成于這些組織表面的一層幾乎透明的膜保護(hù)起來(lái)。如圖46所描述的，在皮膚活組織表面形成一層透明的蛋白膜，通過(guò)這種蛋白膜，組合物中的活性成分能滲透入活組織，同時(shí)代謝產(chǎn)物和其他排泄物能得到引流，從而促進(jìn)再生。這種膜能起使再生活躍的脆弱的肉芽組織與惡劣的外界環(huán)境隔離開(kāi)的保護(hù)層的作用。在某種程度上，它可作為表皮的替代物，防止皮膚中的活組織免于外界環(huán)境的侵襲。如圖46所述，這種膜具有“呼吸”功能，能使代謝產(chǎn)物自動(dòng)引流，以及促進(jìn)再生的細(xì)胞和組織吸收營(yíng)養(yǎng)組合物和氧氣。
另外，這種由蜂蠟組成的將植物精制油液溶含其中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，使創(chuàng)面置于生理性濕潤(rùn)環(huán)境中。這種微小的立體框架結(jié)構(gòu)將創(chuàng)面與外界環(huán)境隔離，防止創(chuàng)面過(guò)度干燥，還促進(jìn)藥膜下面的活組織進(jìn)行有效地“呼吸”。如圖47所述，暴露于外界空氣中的兔的燒傷創(chuàng)面發(fā)生活躍的水分蒸發(fā)，造成傷口過(guò)度干燥。相反，經(jīng)這種發(fā)明的組合物(IC)治療的傷口的蒸發(fā)量則很低，并在生理上保持一較低水平。與自身對(duì)照組相類(lèi)似，應(yīng)用傳統(tǒng)干性療法(如熱烘干燥暴露療法)治療的創(chuàng)面的水分蒸發(fā)量就比應(yīng)用此組合物治療的創(chuàng)面的水分蒸發(fā)量高(圖48)。
重要的是，當(dāng)使創(chuàng)面置于生理性濕潤(rùn)環(huán)境時(shí)，這種發(fā)明的組合物不會(huì)象凡士林那樣導(dǎo)致組織過(guò)度浸漬。如圖49中所做的比較，覆蓋有凡士林的創(chuàng)面的蒸發(fā)量被抑制在比覆蓋有IC的創(chuàng)面低兩倍的水平。在生理上，如圖50A和B所做的比較，應(yīng)用IC治療的兔的燒傷創(chuàng)面是濕潤(rùn)的，且在48小時(shí)內(nèi)由表及里逐漸被液化(圖50A)。相反，覆蓋有凡士林的兔的燒傷創(chuàng)面出現(xiàn)浸漬，呈現(xiàn)出組織脫落的跡象；而且創(chuàng)面周?chē)恼Ｆつw也發(fā)生過(guò)度浸漬。顯微鏡下可見(jiàn)，應(yīng)用干燥療法治療的創(chuàng)面，在壞死組織和活組織之間有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖51A)。相反，應(yīng)用此獨(dú)創(chuàng)組合物治療的創(chuàng)面，在壞死組織和活組織連接處僅出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度腫脹和微血管充血(圖51B)。在凡士林治療的創(chuàng)面上，炎性細(xì)胞在燒傷后48小時(shí)出現(xiàn)組織空泡和浸潤(rùn)(圖51C)。同樣如圖52的表中所示，應(yīng)用IC治療的兔的創(chuàng)面愈合時(shí)間(15天)比未接受任何治療的對(duì)照組(20天)更快。這些結(jié)果證實(shí)，這種具有三維立體結(jié)構(gòu)的獨(dú)創(chuàng)組合物具有作為保護(hù)層取代皮膚和維持皮膚生理性濕潤(rùn)環(huán)境的能力。
需要強(qiáng)調(diào)的是，此藥物除了采用將精制油液溶含其中的網(wǎng)狀框架結(jié)構(gòu)的蜂蠟外還有用其他原料組成的藥物成分也包含在此次申報(bào)的發(fā)明中。
這種創(chuàng)新性組合物可作為大量各種藥品、nutraceuticals和化妝品的基質(zhì)。許多活性成分可溶解或懸浮于藥油中，然后這些油液被溶含在蜂蠟形成的網(wǎng)狀框架中。合成的劑型可局部、口服、通過(guò)吸入或其他適當(dāng)?shù)慕o藥方法來(lái)用藥。6.通過(guò)非殺菌性方式抑制細(xì)菌毒性本發(fā)明還提供了能夠抑制廣譜細(xì)菌毒性的成分和方法。與應(yīng)用抗菌素和含酒精的消毒劑的傳統(tǒng)療法相比，本發(fā)明的抑菌模式完全不同。通常，應(yīng)用此獨(dú)創(chuàng)的組合物后，細(xì)菌細(xì)胞沒(méi)有立即死亡。相反，細(xì)菌細(xì)胞仍然具有遺傳復(fù)制的能力，并且，細(xì)菌的毒性還由于此獨(dú)創(chuàng)組合物干擾細(xì)菌細(xì)胞分裂產(chǎn)生的毒素而得到有力地抑制。根據(jù)廣泛的細(xì)胞生物學(xué)和顯微鏡研究結(jié)果，這種抑制作用是通過(guò)調(diào)整細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以及通過(guò)改變細(xì)胞生長(zhǎng)的生態(tài)學(xué)而實(shí)現(xiàn)的。
細(xì)菌細(xì)胞是屬于多數(shù)自然界環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的形成最簡(jiǎn)單的有機(jī)體的原核細(xì)胞。典型的細(xì)菌細(xì)胞呈球形或桿狀，一般有幾微米長(zhǎng)，細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)相當(dāng)簡(jiǎn)單。在被稱(chēng)為細(xì)胞壁的保護(hù)層的下面，細(xì)胞膜包繞著單一的含有DNA、RNA、蛋白質(zhì)和小分子的細(xì)胞質(zhì)。
遵循一種被稱(chēng)為二分裂的細(xì)胞復(fù)制方式，細(xì)菌可迅速?gòu)?fù)制。在最理想的條件下，單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞每20分鐘分裂一次，從而在不到11個(gè)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生50億個(gè)細(xì)胞。某種類(lèi)型的細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生靶向受感染的宿主動(dòng)物的免疫應(yīng)答的細(xì)菌毒素對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致炎癥和器官損傷。如果不能及時(shí)地控制細(xì)菌感染，就能導(dǎo)致嚴(yán)重的器官損傷，甚至有時(shí)造成受感染的宿主死亡。
最普遍的抑菌方法是應(yīng)用抗菌素的殺菌作用。為了預(yù)防細(xì)菌感染，許多抗菌素是由真菌類(lèi)制成。幾乎所有已知的抗菌素是通過(guò)在基因復(fù)制階段干擾細(xì)菌的細(xì)胞周期發(fā)揮它們的殺菌作用。例如，利福霉素在DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的階段抑制細(xì)菌的基因復(fù)制。利福霉素能通過(guò)結(jié)合RNA聚合酶阻斷RNA鏈的起始。然而，多數(shù)抗菌素在基因復(fù)制的翻譯階段干擾細(xì)菌生長(zhǎng)。這些抗菌素與細(xì)菌核糖體的不同區(qū)域相結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)合成過(guò)程中不同的步驟。例如，鏈霉素阻止翻譯起始復(fù)合體向延長(zhǎng)核糖體的鏈的轉(zhuǎn)換，還造成錯(cuò)編密碼。四環(huán)素阻斷氨?；鵷RNA與核糖體A端的連接。在蛋白質(zhì)合成的多肽鏈延長(zhǎng)期間，多肽鏈羧基的末端被從位于小核糖體亞基的P端的tRNA分子上分開(kāi)，且被一肽鍵連接到A端與tRNA分子相連的氨基酸上。這種蛋白質(zhì)合成的中心反應(yīng)被肽酰轉(zhuǎn)移酶所催化。氯霉素能阻斷肽酰轉(zhuǎn)移酶對(duì)核糖體的作用。當(dāng)核糖體準(zhǔn)確地沿著mRNA分子向前移動(dòng)三個(gè)核苷時(shí)，A端的新肽酰tRNA被移位到P端。這個(gè)步驟需要能量，且被在某一核糖體成分內(nèi)被GTP分子的水解所誘導(dǎo)而發(fā)生的一系列構(gòu)象的改變推動(dòng)。紅霉素能阻礙這種作用于核糖體的移位。這些藥物利用原核和真核核糖體之間結(jié)構(gòu)和功能的不同來(lái)有選擇地干擾原核核糖體的功能。
然而，一些抗生素能在基因翻譯階段作用于原核生物，例如細(xì)菌，真核生物，如哺乳動(dòng)物。例如，嘌呤霉素能通過(guò)添加到生長(zhǎng)鏈端造成新生多肽鏈不成熟的釋放。另一方面，放射菌素D通過(guò)結(jié)合DNA和為了抑制RNA合成阻礙RNA聚合酶的運(yùn)動(dòng)來(lái)干擾基因轉(zhuǎn)錄。另一種殺滅細(xì)菌的普遍方法是在治療表面上(如創(chuàng)面)應(yīng)用酒精，例如乙醇或異丙醇。酒精對(duì)于殺滅細(xì)菌非常有效，這可能是通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞壁的完全分解而直接導(dǎo)致壞死細(xì)胞死亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，這些酒精性試劑在殺死細(xì)胞方面沒(méi)有選擇性，且會(huì)過(guò)于刺激以至于損傷創(chuàng)面新生的脆弱的再生細(xì)胞。7.在體外促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)的成分本發(fā)明也為在體外培養(yǎng)真核細(xì)胞(如人類(lèi)細(xì)胞)提供了方法和組合物。在一種實(shí)施方案中，組織培養(yǎng)基用來(lái)在體外促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或維持滋養(yǎng)特殊的細(xì)胞系或細(xì)胞類(lèi)型。
在一種實(shí)施方案中，為培養(yǎng)真核生物細(xì)胞尤其是在體外培養(yǎng)動(dòng)物的干細(xì)胞提供一種組合物。這種組合物含有溶解于有機(jī)溶劑中的含量至少為0.01重量％的甾醇類(lèi)化合物。這種甾醇類(lèi)化合物優(yōu)選的含量范圍是0.01％～20重量％，較優(yōu)選的為0.01％～10％，最佳含量為1％～5％?？梢赃x擇的是，這種甾醇類(lèi)化合物在培養(yǎng)基內(nèi)可與脂質(zhì)相結(jié)合，被傳遞到培養(yǎng)細(xì)胞中。
本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)真核生物，尤其是在體外培養(yǎng)動(dòng)物的干細(xì)胞的細(xì)胞方法。該方法包括將細(xì)胞或組織培養(yǎng)物與含有含量為至少0.01重量％的甾醇類(lèi)化合物的組合物相接觸。甾醇類(lèi)化合物優(yōu)選的含量范圍是0.01％～20重量％，較優(yōu)選的含量為0.5％～10％，最佳含量為1％～5％。
這種組合物和方法可用于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而不發(fā)生突變或基因改變，尤其是，培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞可無(wú)限分裂，且可防止發(fā)生分化。
這些組合物和方法還可把變異的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)用來(lái)確定初級(jí)細(xì)胞系。原代培養(yǎng)物事先取自一有機(jī)體的組織，有或沒(méi)有初始的細(xì)胞分離分級(jí)步驟。在多數(shù)情況下，原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞能被從培養(yǎng)皿中移除，用來(lái)形成大量中級(jí)培養(yǎng)物；這些細(xì)胞可用這種方法重復(fù)傳代培養(yǎng)數(shù)周或數(shù)月。這樣的細(xì)胞經(jīng)常顯示出許多屬于它們的起源物的不同特性纖維原細(xì)胞持續(xù)分泌膠原蛋白；起源于胚胎骨骼肌的細(xì)胞在培養(yǎng)皿中相融合以形成大的自主收縮的肌纖維；神經(jīng)細(xì)胞伸展具有電興奮性的神經(jīng)軸突，以及和其他的神經(jīng)細(xì)胞形成神經(jīng)突觸；上皮細(xì)胞形成具有完整的上皮細(xì)胞所擁有的許多特性的大面積細(xì)胞層。然而，在正常條件下原代培養(yǎng)物通常在50代之后就死亡。正如對(duì)生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明的組合物的培養(yǎng)基中小鼠皮膚進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的(實(shí)施例1，圖15A-D)，細(xì)胞能夠增殖，而不表現(xiàn)出任何異?；蜣D(zhuǎn)化的顯型。
這種組合物能以一定的量被添加到常規(guī)的組織培養(yǎng)基中，以適合于生長(zhǎng)某種特殊的細(xì)胞或組織類(lèi)型的數(shù)量。盡管組織培養(yǎng)基含有特定數(shù)量的小分子，例如鹽、葡萄糖、氨基酸和維生素，但是多數(shù)培養(yǎng)基內(nèi)還含有界定不明確的大分子混合物，有馬血清或胎牛血清或雞胚的天然提取物?；瘜W(xué)上確定的不含血清的培養(yǎng)基包括利于細(xì)胞在培養(yǎng)基內(nèi)生存和增殖的各種生長(zhǎng)因子。這類(lèi)培養(yǎng)基還包括攜帶鐵到細(xì)胞的運(yùn)鐵蛋白。其他蛋白質(zhì)信號(hào)分子對(duì)于特殊細(xì)胞類(lèi)型的生存、發(fā)育和增殖是必不可少的。
這種發(fā)明組合物可促進(jìn)某些或所有的某個(gè)適合于培植哺乳動(dòng)物細(xì)胞的典型培養(yǎng)基的成分的功能。以下列舉了這些組織培養(yǎng)試劑的種類(lèi)，當(dāng)然并不僅限于這些，1)氨基酸，如精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸；2)維生素，如生物素、膽堿、葉酸、煙堿、泛酸、維生素B6、維生素B1和核黃素；3)鹽，如NaCl，Kcl，NaHPO4，NaHCO3，CaCl2和MgCl2；4)蛋白質(zhì)，如胰島素、運(yùn)鐵蛋白、特殊的生長(zhǎng)因子；5)其他葡萄糖、青霉素、鏈霉素、酚紅和全血清。實(shí)施例以下實(shí)施例1-3表示哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞在含本發(fā)明組合物的培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)狀況。
在以下的實(shí)施例中，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明獨(dú)創(chuàng)的組合物對(duì)于促進(jìn)正常分化的哺乳類(lèi)動(dòng)物和哺乳類(lèi)動(dòng)物的干細(xì)胞的增殖和組織特異性附著具有獨(dú)特的作用，同時(shí)還保持皮膚結(jié)構(gòu)的完整性。皮膚組織細(xì)胞，毛囊干細(xì)胞和皮片均取樣自大鼠或小鼠，且在體外進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞或者組織被分成兩組對(duì)照組在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)(完全的MEM)，治療組在加入此獨(dú)創(chuàng)組合物的常規(guī)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)施例1小鼠皮膚細(xì)胞培養(yǎng)將小鼠致死后立即采取其新鮮皮膚，并在6孔培養(yǎng)皿(大約104個(gè)細(xì)胞/ml，7ml/池)中的MEM中進(jìn)行培養(yǎng)。三天后，可見(jiàn)這些細(xì)胞生長(zhǎng)正常，在培養(yǎng)的第八天，這些細(xì)胞黏附于細(xì)胞培養(yǎng)皿的基底層。在治療組中加入該組合物約3g，本發(fā)明組合物由約0.01％的谷甾醇，約0.3％的黃芩素和約0.2％的黃連素組成，以上組合物均被混合在芝麻油中。在對(duì)照組中加入2ml的MEM。將兩組生長(zhǎng)培養(yǎng)基每4-5天更換一次，每2-3天記錄培養(yǎng)物的顯微鏡下表現(xiàn)。
圖15A-D顯示對(duì)于小鼠皮膚細(xì)胞培養(yǎng)物在有本發(fā)明組合物存在，或沒(méi)有的情況下的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。右欄圖片取自對(duì)照組，左欄的來(lái)自治療組。第十天，兩組的細(xì)胞可見(jiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖15A)。然而，兩組細(xì)胞的生存率和生長(zhǎng)狀態(tài)出現(xiàn)顯著改變。在對(duì)照組，細(xì)胞開(kāi)始在第30天死亡，治療組的細(xì)胞仍然存活，且保持了正常的形態(tài)(圖15B)。在第49天，更多對(duì)照組細(xì)胞死亡，治療組的細(xì)胞繼續(xù)保持活躍增殖(圖15C)。在第70天，對(duì)照組的所有細(xì)胞都死亡了。與之明顯不同的是，治療組的細(xì)胞仍然生長(zhǎng)有力且?guī)缀跞诤?圖15D)。在為期六個(gè)月的觀(guān)察期內(nèi)，治療組的細(xì)胞始終增殖，且沒(méi)有出現(xiàn)不正常的形態(tài)改變。
這些結(jié)果證實(shí)，這種發(fā)明的組合物具有促進(jìn)原代細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的能力，據(jù)推測(cè)是通過(guò)將原代皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有潛在的持續(xù)增殖能力的表皮干細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這與對(duì)用本發(fā)明組合物治療的成體細(xì)胞的作用是一致的。
實(shí)施例2 大鼠毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)將大鼠致死后立即從毛囊的隆突部采取大鼠的毛囊干細(xì)胞，在含有24孔MEM/5％FCS培養(yǎng)皿(每孔有2ml)中進(jìn)行培養(yǎng)。5天后，可見(jiàn)這些細(xì)胞生長(zhǎng)良好，且黏附于細(xì)胞培養(yǎng)皿的基底部。治療組中加入約1g本發(fā)明組合物，該組合物含有溶于綿子油中豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇，含量為6重量％，1ml的MEM被加入對(duì)照組。對(duì)培養(yǎng)物觀(guān)察了41天，記錄了培養(yǎng)物的顯微鏡表現(xiàn)。
圖16A-C顯示大鼠的毛囊干細(xì)胞在含有或不含本發(fā)明組合物的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。右欄圖片顯示對(duì)照組，左欄來(lái)自治療組。如圖16右欄所示，對(duì)照組的干細(xì)胞存活了，但是呈單獨(dú)生長(zhǎng)。相反，治療組的干細(xì)胞發(fā)生增殖，并且開(kāi)始互相融合形成克隆(見(jiàn)圖16左欄)。第41天，治療組形成了許多克隆，出現(xiàn)類(lèi)似組織的形態(tài)。然而，對(duì)照組的細(xì)胞盡管也增殖了，但是仍然分散開(kāi)，未形成任何克隆。
這些結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明組合物不僅具有促進(jìn)繁殖的能力，還促進(jìn)干細(xì)胞組織特異性黏附力。這與用此組合物治療的成體細(xì)胞所產(chǎn)生的作用是一致的。實(shí)施例3 小鼠皮膚組織培養(yǎng)將小鼠致死后立即采取其新鮮皮膚，分切成片狀，培養(yǎng)在MEM培養(yǎng)皿和6池MEM/15％FCS培養(yǎng)皿中(5ml/池含有3片皮膚)。4天后，這些皮片附著于細(xì)胞培養(yǎng)皿基底部。在治療組加入了約6g本發(fā)明組合物，該組合物溶于大豆油中的1重量％的α-菠菜甾醇和0.001重量％黃小蘗堿。在對(duì)照組加入了6mlMEM。對(duì)這些培養(yǎng)物觀(guān)察了44天，記錄了培養(yǎng)物的顯微鏡下表現(xiàn)。
圖17A-B顯示小鼠皮膚組織在有或無(wú)該組合物的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。右欄圖片來(lái)自對(duì)照組，左欄來(lái)自治療組如圖17的右欄圖片所示，對(duì)照組內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞遷移和分散，相反，治療組的細(xì)胞遷移和擴(kuò)散少見(jiàn)，且新生的細(xì)胞仍然附著于皮片(圖16左欄)。第44天，治療組的細(xì)胞繼續(xù)增殖，與皮片融合，且顯微鏡下可見(jiàn)清晰的邊緣。相反，細(xì)胞持續(xù)從皮片轉(zhuǎn)移，在培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散。
這些結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明組合物具有促進(jìn)細(xì)胞與其同類(lèi)組織融合及維持正常皮膚結(jié)構(gòu)的完整的能力。這與應(yīng)用該組合物治療的人類(lèi)成體細(xì)胞的作用是一致的。
實(shí)施例4 表皮干細(xì)胞在體內(nèi)和原位的誘導(dǎo)與繁殖以下實(shí)施例首次證實(shí)，胚胎表皮干細(xì)胞被誘導(dǎo)和激活，能夠在有利于組織的生理學(xué)修復(fù)和器官再生的條件下在成人體內(nèi)繁殖。這樣的再生條件是通過(guò)應(yīng)用這種方法和本發(fā)明組合物完成的。此外，這些胚胎表皮干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化是在對(duì)應(yīng)用該方法和組合物治療產(chǎn)生反應(yīng)的經(jīng)歷皮膚再生的皮膚上檢測(cè)到的。
在對(duì)一患有淺III度燒傷的成年人的治療期間，需要用來(lái)再生各種皮膚組織的再生性干細(xì)胞被含有本發(fā)明組合物提供的理想條件所激活。在這些再生的細(xì)胞之間，表達(dá)標(biāo)記物角蛋白19型的胚胎表皮干細(xì)胞是通過(guò)應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)特別檢測(cè)到的。表達(dá)再生細(xì)胞的19型角蛋白的動(dòng)態(tài)變化也在這位患者的皮膚再生期間在不同的時(shí)間檢測(cè)到的。
該患者使用本發(fā)明的組合物中含有占組合物總重量20％重量的溶于玉米油當(dāng)中的豆甾醇進(jìn)行治療。該組合物中黃芩苷的含量為2重量％。
一位20歲女性的四肢被汽油燒傷，面積為35％TBSA(圖18)。病理學(xué)分析顯示有15％的深度部分真皮燒傷和20％淺全厚皮層燒傷。取自燒傷創(chuàng)面的部分組織的顯微鏡檢查顯示全厚層皮膚細(xì)胞壞死、退化和真皮內(nèi)膠原蛋白纖維的結(jié)構(gòu)紊亂以及微循環(huán)阻滯。(圖19)。
受傷區(qū)域的皮膚和組織分別在第24小時(shí)和第4、7、14、21和28天采取自患者燒傷后，并把它們保存在試管內(nèi)與液氮冷凍，然后被包埋入Tissue-Tek OCT化合物中并和液氮冷凍。10μm厚的切片是在可進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)的冷凍箱內(nèi)制得的。
應(yīng)用一生物素-抗生物素蛋白DCS系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行非直接免疫熒光染色。冷凍切片與10％的馬血清的溫度保持在4℃恒溫下20分鐘，然后加入小鼠抗人角蛋白19型單克隆抗體(第一種抗體)的1∶20的稀釋溶液。這些切片再次被保持在4℃的恒溫一整晚。用磷酸鹽緩沖液沖洗后，在切片中加入5μg/ml的生物素化的馬抗小鼠IgG抗體(第二種抗體)(產(chǎn)自美國(guó)加利福尼亞州Burlingame Vector實(shí)驗(yàn)室)，然后在4℃恒溫下保存一個(gè)小時(shí)。這些切片被沖洗和放置在含有10％PBS和1％的對(duì)苯二胺的甘油中。作為對(duì)照組的正常皮膚的切片以同種方式進(jìn)行染色，但不加入第一種抗體。標(biāo)本在Olympus反射熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，用ASA400柯達(dá)膠卷照相。
此例是應(yīng)用特殊的小鼠抗人角蛋白19型單克隆抗體治療來(lái)對(duì)正常的和燒傷皮膚進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查。結(jié)果揭示了在這位患者的正常表皮中，少數(shù)細(xì)胞呈角蛋白19陽(yáng)性(圖20A)。相反，燒傷后24小時(shí)，創(chuàng)面的皮膚中存在中等數(shù)量的角蛋白19染色呈陽(yáng)性的再生的表皮干細(xì)胞(圖20B)。燒傷后4小時(shí)，汗腺、毛細(xì)血管和毛囊周?chē)偕谋砥じ杉?xì)胞的數(shù)量升高(圖20C)。再生皮膚的切片的顯微鏡檢查顯示，膠原纖維和皮膚胚胎基底部的新生上皮組織增生活躍(圖21和22)。
在第7天(圖20D)和第14天(圖20E)，表皮干細(xì)胞繼續(xù)增多，在此期間達(dá)到最高峰。直到第21天(圖20F)和第28天，再生的干細(xì)胞的數(shù)量降低到一低水平。
燒傷后第20天，采取自愈合的創(chuàng)面的切片的顯微鏡檢查顯示，上皮細(xì)胞和基底膜之間形成了半橋粒連接(圖29)。此外，棘狀細(xì)胞之間也形成了橋粒連接(圖28)。
燒傷后30天，采取自患者的新生皮膚的切片的電子顯微鏡檢查顯示，通過(guò)應(yīng)用此呈報(bào)的發(fā)明技術(shù)再生的皮膚保持了自身正常的生理結(jié)構(gòu)(圖24)。同樣，再生的新皮膚的膠原纖維的大小和立體排列都是正常的，大小是0.1-0.5μm，具有典型的明岸相間的周期橫紋(63nm)(圖26)。切片的嗜銀染色顯示，應(yīng)用別人發(fā)明的方法和組合物治療30天后，上皮基底層的基底膜增生活躍(圖25)。
為了確定皮膚是再生自患者自體而不是來(lái)自其他外在來(lái)源，在患者燒傷后30天采取其再生皮膚的切片以進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用AE3染色的切片的免疫組織化學(xué)分析可見(jiàn)鱗狀上皮的陽(yáng)性蛋白，表示皮膚自發(fā)的自我再生(圖27A)。與此相一致地，用AE1染色的切片顯示了腺上皮陰性蛋白(圖27B)。這些結(jié)果首次證實(shí)，人類(lèi)一新器官可在體內(nèi)和原位復(fù)制，且在細(xì)胞和組織水平保持正常的生理結(jié)構(gòu)和功能(圖23)。
在深I(lǐng)I度(深度部分皮層燒傷)或更差的燒傷創(chuàng)面上，位于表皮基底層的表皮干細(xì)胞受損。更有趣且富有挑戰(zhàn)性的是，淺III度(全厚層燒傷)的燒傷創(chuàng)面上，完整的表皮和真皮和皮下組織受損，皮膚的脂肪層仍然存活。應(yīng)用干性療法和皮膚移植等傳統(tǒng)療法對(duì)全厚層燒傷的治療可導(dǎo)致傷口疤痕愈合和皮膚附屬物的正常功能喪失。然而，如上所示，患有深I(lǐng)I度和III度燒傷的成人的皮膚可以再生修復(fù)且不喪失皮膚結(jié)構(gòu)和功能。構(gòu)成再生器官的組織是哪些細(xì)胞來(lái)源組成的呢？本發(fā)明通過(guò)臨床上證明至少部分(如果不是全部)的表皮細(xì)胞起源于再生性表皮干細(xì)胞提供了問(wèn)題的答案。如圖20B-G所示，這些干細(xì)胞染色呈角蛋白19型陽(yáng)性反應(yīng)，此時(shí)身體的組織修復(fù)和皮膚再生活躍。這些再生性表皮干細(xì)胞增殖和分化以產(chǎn)生特殊類(lèi)型的能合成其他類(lèi)型角蛋白的角化細(xì)胞，例如，角蛋白9型和角蛋白16型，它們可向上往表皮方向移動(dòng)。這些分化的細(xì)胞繼續(xù)向上、向前分化以產(chǎn)生具有合成更強(qiáng)的角蛋白的角化細(xì)胞的能力，例如角蛋白1型和角蛋白10型，它們是成熟的表皮細(xì)胞的典型角蛋白。
然而，還需要強(qiáng)調(diào)的是，只有再生性表皮干細(xì)胞通過(guò)應(yīng)用作為探測(cè)標(biāo)記物的角蛋白19型得到標(biāo)記。其他組織的再生性干細(xì)胞，如血管、毛囊、膠原纖維、間質(zhì)組織和神經(jīng)也被激活，在體內(nèi)和原位增殖分化以產(chǎn)生某個(gè)功能完善的器官再生所需的所有細(xì)胞(圖6和11)。
另一個(gè)問(wèn)題是“這些再生性細(xì)胞來(lái)自哪里？”在正常的生理?xiàng)l件下，某些細(xì)胞長(zhǎng)期處于細(xì)胞周期的G0和G1期，且它們的增殖僅僅在這些條件變的有利的情況下才開(kāi)始。然而，某些細(xì)胞的增殖持續(xù)貫穿與人體生命的始終，這樣，就需要干細(xì)胞的持續(xù)供應(yīng)。部分干細(xì)胞的子代細(xì)胞分化成熟，特化的細(xì)胞和它們的一部分保持增殖能力。在正常的未損傷的皮膚，表皮基底層的干細(xì)胞具有持續(xù)增殖的能力。新增殖的細(xì)胞向上朝表皮方向移動(dòng)。當(dāng)?shù)竭_(dá)棘層的深部區(qū)域時(shí)，增殖出現(xiàn)兩到三次，然后就喪失它們的增殖能力。
如上所討論的，在深I(lǐng)I度和III度燒傷創(chuàng)面上，表皮和真皮的深層受損，表皮基底層的干細(xì)胞也受損?；趯?duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程在細(xì)胞和組織水平的觀(guān)察，發(fā)明者相信，位于皮下組織毛囊、汗腺和毛細(xì)血管周?chē)鷼埓娴拈g葉細(xì)胞(圖31)可提供多數(shù)(如果不是全部)再生性干細(xì)胞，包括多潛能的表皮干細(xì)胞。在殘留的活組織內(nèi)的間葉細(xì)胞被激活而因?yàn)閷?duì)身體受傷和/或通過(guò)此發(fā)明組合物內(nèi)的活性成分的刺激產(chǎn)生反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成成體干細(xì)胞(ASCs)。這些成體干細(xì)胞是多潛能的，且在由此發(fā)明組合物提供的再生條件下，成體干細(xì)胞能被誘導(dǎo)直接分化成各種組織干細(xì)胞，例如真皮、表皮、血管、毛囊、膠原纖維、間質(zhì)組織和神經(jīng)。這些特化的組織干細(xì)胞是由此發(fā)明組合物提供的再生環(huán)境中培植以產(chǎn)生子代干細(xì)胞，它們的一部分被誘導(dǎo)，組織特異性地在體內(nèi)或原位分化成某個(gè)功能器官再生所需要的各種細(xì)胞。
例如，提供各種類(lèi)型角化細(xì)胞的表皮干細(xì)胞可能起源于間葉細(xì)胞。對(duì)損傷的反應(yīng)以及在由此發(fā)明組合物所提供的再生環(huán)境下，受損區(qū)域殘留的活組織內(nèi)的間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌审w干細(xì)胞，它們的一部分然后直接分化成再生性表皮干細(xì)胞。這種表皮干細(xì)胞能合成特殊的細(xì)胞角蛋白19型，這樣就能通過(guò)免疫分子化學(xué)方法得到確定。此時(shí)，通過(guò)應(yīng)用抗人角蛋白19型單克隆抗體，在深I(lǐng)I度和淺III度燒傷創(chuàng)面的皮下組織中，可明確地檢測(cè)到再生性表皮干細(xì)胞。
如上顯示，在使用本發(fā)明的方法治療之后，表達(dá)再生性干細(xì)胞的K-19的數(shù)量隨著傷口的逐漸愈合而增加，達(dá)到一個(gè)高峰值，然后當(dāng)幾乎所有組織再生后數(shù)量下降。這些結(jié)果顯示，即使對(duì)于一個(gè)導(dǎo)致表皮和真皮全層破壞的III度燒傷，通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的方法提供的條件，再生的表皮干細(xì)胞仍然能夠從殘存的活組織中被激活和誘導(dǎo)。
在創(chuàng)面上使用本發(fā)明組合物，并且實(shí)施合理的臨床管理，人體再生的干細(xì)胞會(huì)被激活和增殖以確保健康皮膚的自發(fā)的、生理性再生，實(shí)現(xiàn)深I(lǐng)I度燒傷的無(wú)疤痕性愈合，和在淺III度燒傷僅形成平滑柔軟的疤痕。
上述結(jié)果表明，胚胎表皮干細(xì)胞(K-19角質(zhì)形成細(xì)胞)因?qū)齻麆?chuàng)面的反應(yīng)而被誘導(dǎo)或激活，并且在本發(fā)明的組合物提供的再生環(huán)境下增殖。這些干細(xì)胞的數(shù)量在皮膚再生的過(guò)程中發(fā)生急劇的改變，首次揭示了在外界提供的有利條件下，通過(guò)激活和增殖自體干細(xì)胞，成人身體是如何在體內(nèi)和原位引導(dǎo)自身組織修復(fù)和器官再生的。這些再生干細(xì)胞被認(rèn)為是表皮細(xì)胞的來(lái)源，即使不是全部，也是皮膚再生所必需的。
更進(jìn)一步，基于在組織和細(xì)胞水平的臨床觀(guān)察，發(fā)明者相信成體干細(xì)胞產(chǎn)生組織干細(xì)胞之后，一種特殊組織類(lèi)型的組織干細(xì)胞(例如表皮干細(xì)胞)被誘導(dǎo)生成可再生成它們同源組織所需要的各種類(lèi)型的細(xì)胞(例如各種類(lèi)型的角化細(xì)胞，如K-1、K-9、K-10和K-16)。這些細(xì)胞通過(guò)形成特有的、具有同源組織特征的連接而相互傳遞信息(如圖28顯示的兩個(gè)棘狀細(xì)胞之間的橋粒連接)，從而導(dǎo)致新生組織的再生。再生的新生組織在本項(xiàng)發(fā)明的合成物提供的有利條件下被培植，通過(guò)形成特有的、具有同源組織特征的連接而相互傳遞信息，例如圖29顯示的上皮細(xì)胞與基底膜之間的半橋粒連接。此外，這些新生的組織以器官特異性的形式聚合在一起構(gòu)成一個(gè)新生器官。最后，新生器官中的組織發(fā)育成熟為它們相應(yīng)的成體組織，構(gòu)成再生的、全能的器官。通過(guò)這些在生命體內(nèi)的細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-組織和組織-組織之間的聯(lián)合，組織和器官能夠重建它們生理結(jié)構(gòu)和功能的情況下再生。例如，在上面所證實(shí)的，一個(gè)損失了她身體非常大面積的表皮和真皮的成人，能重新被具有正常結(jié)構(gòu)和功能的新皮膚覆蓋(圖23和24)。
這些發(fā)現(xiàn)和發(fā)明在理論上和實(shí)踐中都具有重要的意義。首先，它們第一次揭示了通過(guò)原位培植干細(xì)胞，成體組織和器官能夠在保留完整的生理功能的情況下再生修復(fù)。這個(gè)成果是從事這一領(lǐng)域工作的科學(xué)家和醫(yī)生們夢(mèng)寐以求的，但是在此之前從未在臨床上實(shí)現(xiàn)。發(fā)明者相信即使移植體外培植的干細(xì)胞在修復(fù)受損表皮和真皮方面取得了可喜的、有限的成功，但是，這種創(chuàng)面的愈合不是生理性的。換句話(huà)說(shuō)，使用這種移植方法修復(fù)皮膚可導(dǎo)致毀容性疤痕和皮膚附屬器(如毛囊、頂漿分泌的和外分泌腺的汗腺)生理功能的喪失。顯微鏡下，只有本項(xiàng)申報(bào)的發(fā)明證實(shí)，同一組織中細(xì)胞之間和相鄰組織之間(例如表皮和真皮)的連接能夠?qū)崿F(xiàn)完全的結(jié)構(gòu)和功能上的生理性重建。與之相反，使用這一領(lǐng)域中的其它方法，組織間的連接重建呈病理性，表現(xiàn)出不正常的結(jié)構(gòu)和功能。
其次，這是第一次在一個(gè)發(fā)育完全的人體內(nèi)，在其自身組織修復(fù)和器官再生期間，多潛能的胚胎干細(xì)胞被誘導(dǎo)和激活，如上所示，使用本項(xiàng)發(fā)明的方法，在創(chuàng)面生理性愈合過(guò)程中，創(chuàng)面中大量的再生干細(xì)胞表達(dá)角蛋白19型。眾所周知，19型角蛋白在胎兒表皮基底層細(xì)胞和在人類(lèi)胎兒生長(zhǎng)的毛發(fā)的隆突部位被表達(dá)。在體內(nèi)和原位培植這些胚胎干細(xì)胞，用于成體組織修復(fù)和器官再生，不僅是一項(xiàng)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，而且對(duì)發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)有著深遠(yuǎn)的影響。
實(shí)施例5 胃腸道組織的干細(xì)胞分化本發(fā)明組合物以及方法可用以激活或誘導(dǎo)胃腸道組織中的再生性干細(xì)胞，以修復(fù)在胃腸道中的器官的黏膜的損傷及疾患。本發(fā)明提供的組合物可以治療人體消化道疾患，本實(shí)施例中給大鼠消化道使用一種含溶解于油中的甾醇化合物的組合物，其中甾醇化合物，β-谷甾醇，含量的重量百分比為20％，其油脂為花生油。得到的結(jié)果如圖3治愈的胃潰瘍的動(dòng)物模型。
本發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明的組合物可以有效地修復(fù)損傷的粘膜，在胃腸中，特別是在胃中提供再生的條件，在胃腸道中使用本組合物后，藥物與胃粘膜混合，形成保護(hù)膜，其中含有粘蛋白，可將粘膜與食物以及胃中的其他組合物的進(jìn)一步刺激隔開(kāi)，在這種情況下，組合物中的甾醇化合物及其他有效成分被釋放出來(lái)激活再生性干細(xì)胞，促進(jìn)粘膜加快修復(fù)，此外，本發(fā)明組合物也可以通過(guò)使細(xì)菌的形態(tài)改變有效地抑制幽門(mén)螺桿菌的毒性，通過(guò)健康的胃腸道的再生，有利于幽門(mén)螺桿菌的潰瘍狀況得到改善，間接地抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。
實(shí)施例6 激活毛囊干細(xì)胞頭皮上局部涂覆使用本發(fā)明的組合物，該組合物包括10重量％豆甾醇，1重量％的黃柏內(nèi)酯(檸檬苦酸)。采用現(xiàn)有技術(shù)的方法將其溶于橄欖油中。如圖4所示，可使禿發(fā)男人毛發(fā)再生。本發(fā)明人認(rèn)為，本組合物有效地激活毛囊干細(xì)胞，這種干細(xì)胞可能存在于毛囊隆突之中。再生性干細(xì)胞的增殖和分化為形成強(qiáng)壯健康的毛干提供了足夠的毛發(fā)細(xì)胞實(shí)施例7 抑制和/或殺滅細(xì)菌與病毒的藥物組合物與應(yīng)用抗生素和消毒劑傳統(tǒng)的方法相比，本發(fā)明披露了通過(guò)非殺菌性作用機(jī)制抑制細(xì)菌毒性的新的組合物及其使用方法。這種發(fā)明組合物提供的獨(dú)特成分中含有溶解在含量至少為0.01％油脂中的動(dòng)物甾醇類(lèi)或脂溶性植物甾醇類(lèi)。。本實(shí)施例中，使用現(xiàn)有技術(shù)的方法加工成的組合物中，含有溶解在動(dòng)物脂肪，例如牛脂肪中的，按重量計(jì)算，0.2重量％的鏈甾醇。
雖然不希望被通過(guò)這種發(fā)明的組合物抑制細(xì)菌毒性的作用機(jī)制所局限，發(fā)明者在本發(fā)明中提出，某種動(dòng)物甾醇類(lèi)或植物甾醇類(lèi)一旦與細(xì)菌的細(xì)胞膜相結(jié)合，就可能改變細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變。細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生對(duì)細(xì)菌造成嚴(yán)重的生物物理學(xué)和生物化學(xué)改變，這種改變可能是通過(guò)抑制細(xì)胞分裂和細(xì)菌毒素的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)的。
大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持這一假設(shè)。在含有各種細(xì)菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌包括破傷風(fēng)桿菌、脆弱類(lèi)桿菌、痤瘡丙酸桿菌、變形桿菌屬、大腸桿菌和綠膿桿菌。
圖53A-C顯示在一含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的破傷風(fēng)桿菌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。圖53A顯示破傷風(fēng)桿菌細(xì)胞的正常形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)桿狀。培養(yǎng)于含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基的破傷風(fēng)桿菌的第一、二代呈一長(zhǎng)桿狀或細(xì)絲狀(圖53B)。破傷風(fēng)桿菌的第三、四代在長(zhǎng)度上呈現(xiàn)出很大的改變，有較多芽孢形成一呈鼓槌狀，以及少許長(zhǎng)桿狀或細(xì)絲狀(圖53C)。
圖54A-C顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的脆弱類(lèi)桿菌的形態(tài)改變。圖54A顯示脆弱類(lèi)桿菌的正常形態(tài)為中等大小桿菌。其在含有此發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的第三、四代出現(xiàn)長(zhǎng)短不一的桿菌，并且有細(xì)菌聚集融合(圖54B)。脆弱類(lèi)桿菌的第五、六代近似小球形，并有許多細(xì)菌聚集融合成不規(guī)則的圓球形(圖54C)。
圖55A和B顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的痤瘡丙酸桿菌的形態(tài)改變。圖55A顯示正常的痤瘡丙酸桿菌的形態(tài)是細(xì)短桿狀。相反，培養(yǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的痤瘡丙酸桿菌的第三、四代呈長(zhǎng)度不等，大小不一的桿狀或細(xì)絲狀(圖55B)。
圖56A-C顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的白色念珠菌的形態(tài)改變。圖56A顯示白色念珠菌的正常形態(tài)是卵圓形，可見(jiàn)較多的芽生孢子。白色念珠菌的第三、四代在含有此發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上出現(xiàn)大小不等的圓球形，可見(jiàn)到一些棒狀菌體和少許芽生孢子(圖56B)。白色念珠菌的第五、六代出現(xiàn)棒狀或長(zhǎng)桿狀，可見(jiàn)長(zhǎng)短不等的細(xì)菌絲，芽生孢子較少見(jiàn)(圖56C)。
圖56D和E顯示白色念珠菌的芽管試驗(yàn)結(jié)果。白色念珠菌正常的芽管產(chǎn)生率是90％。相反，生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的白色念珠菌的第五、六代的芽管產(chǎn)生率僅約為0.5-2％(圖56E)。
圖57A和B顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的變形桿菌的形態(tài)改變。圖57A顯示變形桿菌的正常形態(tài)是細(xì)短桿狀。相反，生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的變形桿菌的第一、二代呈更長(zhǎng)，更大的桿狀或長(zhǎng)細(xì)絲狀(圖57B)。
圖58A和B顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的大腸桿菌的形態(tài)改變。圖58A顯示大腸桿菌的正常形態(tài)是短桿狀。相反，生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的大腸桿菌的第五、六代呈更長(zhǎng)，更大的桿狀或長(zhǎng)細(xì)絲狀(圖58B)。
圖59A和B顯示生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的綠膿桿菌的形態(tài)變異。圖59A顯示綠膿桿菌的正常形態(tài)是短桿狀。相反，生長(zhǎng)在含有這種發(fā)明組合物的培養(yǎng)基上的綠膿桿菌的第五、六代呈各種更長(zhǎng)的的桿狀或長(zhǎng)細(xì)絲狀(圖59B)。
這些結(jié)果確定了這種發(fā)明組合物具有在不造成細(xì)胞直接死亡的情況下使細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生變異的能力。這些細(xì)胞仍持續(xù)發(fā)生遺傳復(fù)制，顯然還可以改變細(xì)菌的侵襲力。這種作用模式與那些利用抗生素逐漸在轉(zhuǎn)錄和翻譯階段抑制遺傳復(fù)制的方式截然不同。
為了證實(shí)本發(fā)明組合物不僅導(dǎo)致細(xì)菌的形態(tài)變異還改變它的毒性，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)以測(cè)試這種組合物對(duì)于金黃色葡萄球菌的血漿凝固酶的影響。如圖60的表格所示，對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)物具有高度的酶活性，含有許多大菌落的液體清澈。相反，生長(zhǎng)在含有本發(fā)明組合物的培養(yǎng)基中的細(xì)胞的酶活性被逐漸減弱。傳代至第七、八代，在渾濁的培養(yǎng)物中出現(xiàn)較少的小菌落。如圖61所示，顯示對(duì)于的不同含量的本發(fā)明組合物，細(xì)菌有一個(gè)不同的劑量反應(yīng)。含量較低時(shí)，細(xì)菌需要用較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)降低血漿凝固酶的活性。
本發(fā)明組合物對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的增殖的影響已經(jīng)得到確定。如圖62所示，這兩種類(lèi)型的細(xì)菌傳代至第十代后，細(xì)菌總數(shù)減少了20-30倍。
盡管細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有顯著減少，但是應(yīng)用這種發(fā)明的組合物治療后，細(xì)菌的侵襲力被明顯減弱了。同樣如圖62所示，動(dòng)物的病理學(xué)檢查顯示了這種差別。在對(duì)照組動(dòng)物的皮下組織中，出現(xiàn)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和化膿，表明有金黃色葡萄球菌的完全感染。相反，在被細(xì)菌感染的動(dòng)物的皮下組織和橫紋肌中，存在沒(méi)有化膿現(xiàn)象的少許炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。
如上所述，這種在植物油中含有甾醇類(lèi)的發(fā)明組合物不僅能夠使細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生明顯變異，還能殺滅細(xì)菌，顯著地削弱細(xì)菌的毒性和侵襲力。同樣，在對(duì)此含有甾醇類(lèi)的組合物進(jìn)行的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中，細(xì)菌對(duì)創(chuàng)面的毒性顯著地得到抑制，而再生的新的動(dòng)物細(xì)胞能與細(xì)菌共同生存，且可迅速生長(zhǎng)以保證體內(nèi)的組織迅速修復(fù)和器官再生。
發(fā)明者相信，不同的細(xì)菌細(xì)胞對(duì)于甾醇類(lèi)與細(xì)菌的細(xì)胞膜相結(jié)合有不同的反應(yīng)。膜的成分和流動(dòng)性的差別可能導(dǎo)致真核細(xì)胞和原核細(xì)胞之間在形態(tài)變異和細(xì)胞周期方面的不同反應(yīng)。
在原核細(xì)胞(例如細(xì)菌)中，DNA的分裂和細(xì)胞質(zhì)的分裂直接相結(jié)合。當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，雙份拷貝的染色體被連接在細(xì)胞膜的特殊區(qū)域，以及被細(xì)胞膜間的生長(zhǎng)逐漸分隔。分離發(fā)生在這兩個(gè)附著物上，這樣每一個(gè)子代細(xì)胞獲得一個(gè)染色體。
革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)有兩層細(xì)胞膜內(nèi)膜和外膜。內(nèi)、外液體雙分子膜之間有高度多孔滲水的、堅(jiān)固的由蛋白質(zhì)和構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖的肽聚酶；在外膜肽聚酶與脂蛋白相結(jié)合，填充入周質(zhì)的間隙內(nèi)。這個(gè)間隙還含有各種可溶性蛋白質(zhì)分子。革蘭氏陽(yáng)性菌(如葡萄球菌和鏈球菌)有單層細(xì)胞膜，但是有較厚的細(xì)胞壁。它們的單層膜和革蘭氏陰性菌的內(nèi)膜相似。
細(xì)菌的細(xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成，這是細(xì)胞膜基本的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。細(xì)胞膜的脂質(zhì)是兩性分子，不溶于水但易溶解于有機(jī)溶劑中。大約50％的多數(shù)動(dòng)物的細(xì)胞膜由它們組成，其余的幾乎都是蛋白質(zhì)。細(xì)胞膜富含磷脂，磷脂具有極性的頂端和疏水的碳?xì)浠衔锏奈捕?。尾端通常是脂肪酸，它們?cè)陂L(zhǎng)度上是不同的(正常的含有14-24個(gè)碳原子)。長(zhǎng)度的不同和脂肪酸尾端的位置是重要的，因?yàn)樗鼈冇绊懥字肿踊ハ喑淙哪芰?，且因?yàn)檫@個(gè)原因它們影響膜的流動(dòng)性。
脂質(zhì)雙分子層是二維液體結(jié)構(gòu)，可使單個(gè)脂質(zhì)分子在脂質(zhì)雙分子層內(nèi)自由擴(kuò)散。細(xì)胞膜的準(zhǔn)確的流動(dòng)性具有重要的生物學(xué)意義。例如，當(dāng)這種雙分子層的粘度增強(qiáng)超過(guò)起始水平時(shí)，可見(jiàn)膜的運(yùn)輸過(guò)程和酶活性被終止。脂質(zhì)雙分子層的流動(dòng)性取決于它的成分和溫度。細(xì)菌、酵母菌和其他微生物的溫度隨適合它們的細(xì)胞膜脂質(zhì)的脂肪酸成分的環(huán)境而波動(dòng)，以至于保持一相對(duì)穩(wěn)定的流動(dòng)性。
真核生物的細(xì)胞膜尤其含有大量膽固醇——每個(gè)磷脂分子有一個(gè)膽固醇分子。膽固醇分子具有加強(qiáng)脂質(zhì)雙分子層的通透性屏障性能的作用。它們應(yīng)用自身的接近磷脂分子極性端的羥基確定在雙分子層內(nèi)的位置；它們堅(jiān)固的盤(pán)狀類(lèi)固醇環(huán)影響和部分地固定烴鏈上的那些與極性端最接近的區(qū)域。通過(guò)降低第一個(gè)少數(shù)磷脂分子烴鏈的CH2基的活性，膽固醇使脂質(zhì)雙分子層在這個(gè)區(qū)域不易變形，從而削弱雙分子層對(duì)小的水溶性分子的通透性。
多數(shù)真核細(xì)胞的細(xì)胞膜是不同的，不僅在所包含的大量膽固醇方面，還在含有不同的磷脂混合物上。許多哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜中有四種主要的磷脂占有優(yōu)勢(shì)卵磷脂、鞘磷脂、磷酸酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺。
相反，細(xì)菌的細(xì)胞膜通常由一類(lèi)主要的磷脂組成，且不含有膽固醇。這些細(xì)胞膜的機(jī)械穩(wěn)定性是由被覆在外的細(xì)胞壁加強(qiáng)的。這樣，動(dòng)物甾醇類(lèi)(如膽固醇)和植物甾醇類(lèi)(如谷甾醇)相結(jié)合改變細(xì)菌細(xì)胞膜的正常成分和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變。細(xì)菌的分裂被抑制可能是流動(dòng)性發(fā)生改變的結(jié)果，表示巨大的或被拉長(zhǎng)的細(xì)胞在DNA復(fù)制不減弱的情況下的成長(zhǎng)狀況。
另外對(duì)病毒，例如感冒病毒，肝炎病毒等也觀(guān)察得到相同的結(jié)果。
這種運(yùn)用甾醇類(lèi)的獨(dú)特機(jī)制可被用來(lái)構(gòu)成在藥物、nutraceutical、化妝品和家庭日用品(如漱口水、牙膏或者牙粉)中廣泛應(yīng)用的新型抗菌成分，且不會(huì)象抗菌素那樣經(jīng)常產(chǎn)生副作用。
本文引用了多種參考文獻(xiàn)，其所公開(kāi)的全部?jī)?nèi)容僅供參考。本發(fā)明并非限制在本文中描述的特定實(shí)施方案的范圍內(nèi)。確實(shí)，除了那些在本文中所描述的以外，描述中對(duì)本發(fā)明的多種修正對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。本申請(qǐng)旨在將這類(lèi)修正落入到權(quán)利要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)、組織修復(fù)和器官再生的組合物，它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述甾醇化合物的含量是0.01～20重量％。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述甾醇化合物的含量是1～10重量％。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于甾醇化合物的含量是2～6重量％。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述油脂是動(dòng)物油或植物油。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于所述植物油選自玉米油、花生油、棉子油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油和豆油。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述油脂是一種可以藥用的油脂。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述油脂是一種可注射用的油脂。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述甾醇化合物是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述甾醇化合物是選自一種豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。
11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于該組合物還含有蜂蠟。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于所述蜂蠟的含量是1％～20重量％。
14.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于該組合物中進(jìn)一步含有0.1重量％～30重量％的蜂膠。
15.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于該組合物中進(jìn)一步含有含量為0.001％～2重量％的黃芩苷。
16.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于該組合物中進(jìn)一步含有含量為0.001％～2重量％的黃柏內(nèi)酯。
17.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于該組合物中進(jìn)一步含有含量為0.001％～2重量％的黃連素。
18.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于該組合物中進(jìn)一步含有含量為0.001％～2重量％的罌粟殼堿。
19.一種促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)分化的組合物，它含有溶于油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。
20.一種在體外培養(yǎng)真核生物，尤其是培養(yǎng)哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的方法，該方法包括將一種組織細(xì)胞與含至少0.01重量％的溶于油脂中的甾醇化合物的組合物相接觸；所述的組織細(xì)胞生成組織干細(xì)胞；所述的組織干細(xì)胞經(jīng)進(jìn)一步誘導(dǎo)調(diào)節(jié)后分化成各種組織干細(xì)胞；經(jīng)過(guò)對(duì)所述的各種組織干細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞結(jié)合形成相應(yīng)的成體組織與器官。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述的組合物還含有0.001％～99.9重量％的選自黃芩苷，黃柏內(nèi)酯，黃連素，地龍油脂提取物，罌粟殼油脂提取物或其混合物。
22.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于甾醇化合物含量是0.01％～20重量％。
23.一種真核生物，尤其是培養(yǎng)動(dòng)物的干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基中含有脂溶性甾醇化合物，其含量是0.01重量％～20重量％。
24.如權(quán)利要求23所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述甾醇化合物是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。
25.如權(quán)利要求23所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述甾醇化合物是選自一種豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。
26.如權(quán)利要求23所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
27.一種抗消化道潰瘍藥物組合物，其特征在于它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量是0.01重量％～20重量％。
28.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其特征在于所述油脂是動(dòng)物油或植物油。
29.如權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其特征在于所述植物油選自玉米油、花生油、棉子油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油和豆油。
30.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。
31.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物是選自豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。
32.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
33.一種促毛發(fā)再生藥物組合物，其特征在于溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。
34.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物的含量是0.01～20重量％。
35.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其特征在于所述油脂是動(dòng)物油或植物油。
36.如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其特征在于所述植物油選自玉米油、花生油、棉子油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油和豆油。
37.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。
38.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物是選自豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。
39.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
40.一種抑制或殺滅細(xì)菌與病毒的藥物組合物，其特征在于它含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％。
41.如權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物的含量是0.01～20重量％。
42.如權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其特征在于所述油脂是動(dòng)物油或植物油。
43.如權(quán)利要求42所述的藥物組合物，其特征在于所述植物油選自玉米油、花生油、棉子油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油和豆油。
44.如權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。
45.如權(quán)利要40所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物是選自豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和其所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。
46.如權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其特征在于所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
47.一種由重要是油脂和蜂蠟構(gòu)成的壞死組織清除劑，其特征在于所述的油脂中的含有至少是0.01重量％甾醇化合物，蜂蠟的含量是1～20重量％。
48.如權(quán)利要求47所述的壞死組織清除劑，其特征在于所述甾醇化合物的含量是0.01～20重量％，或者1～10重量％。
49.如權(quán)利要求47所述的壞死組織清除劑，其特征在于所述油脂是動(dòng)物油或植物油。
50.如權(quán)利要求49所述的壞死組織清除劑，其特征在于所述植物油選自玉米油、花生油、棉子油、紅花油、茶樹(shù)油、芝麻油、橄欖油和豆油。
51.如權(quán)利要求47所述的壞死組織清除劑，其特征在于所述甾醇化合物是動(dòng)物性甾醇或植物性甾醇。
52.如權(quán)利要求47所述的壞死組織清除劑，其特征在于甾醇化合物選自豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、鏈甾醇、多孔甾醇、胡蘿卜甙和所有天然或合成的，異構(gòu)和衍生的植物性甾醇。
53.如權(quán)利要求47所述的壞死組織清除劑，其特征在于所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇的組合。
54.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于含有黃小蘗堿，其含量范圍為0.001重量％～2重量％。
55.一種美容化妝品，其特征在于含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01重量％～20重量％。
56.一種漱口液，其特征在于含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01～20重量％。
57.一種牙膏或者牙粉，其特征在于含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其含量至少是0.01～20重量％。
全文摘要
本發(fā)明為動(dòng)物、特別是人類(lèi)提供了一種藥學(xué)或營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面的新組合物。該組合物和方法用于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、組織修復(fù)和器官再生，尤其適用于體外。該組合物由含量至少是0.01重量％的溶于油脂中的甾醇類(lèi)化合物組成。它可被應(yīng)用于由各種損傷、疾病和衰老造成的疾病的治療中。如臨床上通過(guò)在體內(nèi)和原位培植再生干細(xì)胞，本發(fā)明方法成功地用來(lái)再生或克隆一個(gè)新器官。
文檔編號(hào)A61K31/575GK1393222SQ02102890
公開(kāi)日2003年1月29日 申請(qǐng)日期2002年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月28日
發(fā)明者徐榮祥 申請(qǐng)人:徐榮祥