專利名稱：一種針對靶的空間變構(gòu)現(xiàn)象篩選可抑制和/或激活所述靶生物活性的物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種模擬或引發(fā)存在受調(diào)控的空間變構(gòu)之特定靶產(chǎn)生空間變構(gòu)現(xiàn)象的方法，以及利用該現(xiàn)象篩選可抑制和/或激活所述靶生物活性的物質(zhì)的方法，特別是提供了一種篩選藥物靶點(diǎn)的方法，尤其是篩選抗病毒藥物靶點(diǎn)的方法，該靶點(diǎn)可作為藥物和/或治療、預(yù)防性抗體的作用位點(diǎn)。本發(fā)明的另一方面涉及已經(jīng)發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)。本發(fā)明的又一方面涉及一種用于預(yù)防和/或治療受試者感染前述靶物質(zhì)之疫苗，其中包含僅具有免疫原性的發(fā)生了空間變構(gòu)的相應(yīng)靶物質(zhì)，或其具有同樣的免疫原性的片段，以及任選的藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明還涉及一種針對前述的發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)的抗體，優(yōu)選為人源化抗體。此外，本發(fā)明還涉及由所述方法篩選得到的用于抑制和/或激活所述靶生物活性的物質(zhì)，以及所述篩選得到的物質(zhì)用于制備治療與所述靶的空間變構(gòu)相關(guān)的生物活性的疾病的藥物之的用途。
背景技術(shù)：
在生命活動中，無論是生物內(nèi)部的各種生命活動過程，還是病原體與宿主之間的相互作用，絕大多數(shù)均涉及生命活動參與分子之間的相互作用，以及作用后引起的靶空間構(gòu)型的改變，這種靶空間構(gòu)型的改變往往是激活下游事件的必要條件，因此這種改變了的分子構(gòu)型可能成為篩選抑制和/或激活所述靶生物活性的藥物的有效作用靶點(diǎn)。但這種在體內(nèi)發(fā)生的靶空間構(gòu)型的改變通常是短暫的。因此，如果可以體外模擬所述靶的空間變構(gòu)現(xiàn)象，從而獲得有效的足夠量的相對穩(wěn)定的這種變構(gòu)了的分子，就會大大方便針對所述靶空間變構(gòu)現(xiàn)象的藥物靶的鑒定，從而進(jìn)一步篩選針對所述靶的相應(yīng)的調(diào)節(jié)所述靶生物活性的物質(zhì)。令人遺憾的是，迄今未見有比較通用的這類方法的報(bào)道。為解決上述問題，更有效地獲得新型藥物篩選模型，本發(fā)明人在此公開了一種體外模擬特定靶的空間變構(gòu)的方法，以及利用所得空間變構(gòu)模型進(jìn)一步篩選針對所述靶的抑制和/或激活所述靶活性的物質(zhì)。并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步得到了預(yù)防和/或治療與該靶物質(zhì)相關(guān)的疾病的疫苗和抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種模擬或引發(fā)存在受調(diào)控的空間變構(gòu)現(xiàn)象的特定靶產(chǎn)生空間變構(gòu)的方法，其中所述空間變構(gòu)現(xiàn)象為該特定靶的生物學(xué)活性相關(guān)，所述方法包括將所述靶與第一種待測定的物質(zhì)在適于發(fā)生空間變構(gòu)的相互作用之條件下接觸一段時(shí)間的步驟，從而使該靶發(fā)生類似于生理狀態(tài)下的變構(gòu)。
本發(fā)明另一方面涉及由上述方法制備的發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)，其中所述靶物質(zhì)可任選地與使其發(fā)生空間變構(gòu)的物質(zhì)相結(jié)合。
本發(fā)明另一方面，涉及一種用于預(yù)防和/或治療受試者感染前述靶物質(zhì)之疫苗，其中包含了僅具有免疫原性的前述發(fā)生了空間變構(gòu)的相應(yīng)靶物質(zhì)，或其具有同樣的免疫原性的片段，以及任選的藥學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明還涉及一種針對前述的發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)的抗體，優(yōu)選為人源化抗體。
本發(fā)明的另一方面，涉及一種利用上述所得的變構(gòu)靶篩選可抑制和/或激活所述靶的生物活性之物質(zhì)的方法，包括將發(fā)生了空間變構(gòu)的靶與第二種待測定的物質(zhì)在適于發(fā)生相互作用的條件下接觸一段時(shí)間；測定經(jīng)上述處理的所述靶的生物活性，并與對照靶相比較；確定能夠引起所述靶生物活性的改變量超過預(yù)定閾值的物質(zhì)。
本發(fā)明的又一方面，涉及利用上述方法獲得的物質(zhì)用于制備治療與所述靶的空間變構(gòu)相關(guān)的疾病的藥物之的用途。
發(fā)明詳述隨著分子免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方面的研究不斷發(fā)展，人們越來越多地發(fā)現(xiàn)，參與多種病理或生理過程的某些分子之間的相互作用過程中存在特殊的空間立體變構(gòu)現(xiàn)象，這種空間變構(gòu)往往是激活下游事件的前提。典型地，病原體與宿主細(xì)胞，尤其是病毒與其靶細(xì)胞之間相互作用的病毒和/或細(xì)胞表面的特定分子，在病毒進(jìn)入該靶細(xì)胞之前往往經(jīng)歷瞬時(shí)的空間變構(gòu)，以暴露出最為有利于相互作用的位點(diǎn)，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對靶細(xì)胞的侵入和攻擊。
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種模擬或引發(fā)存在受調(diào)控的空間變構(gòu)之特定靶產(chǎn)生空間變構(gòu)的方法，其包括將所述靶與第一種待測定的物質(zhì)在適于發(fā)生空間變構(gòu)的相互作用之條件下接觸一段時(shí)間的步驟，從而使該靶發(fā)生類似于生理狀態(tài)下的變構(gòu)。其中，所述受調(diào)控的空間變構(gòu)的出現(xiàn)是該特定靶對相應(yīng)宿主發(fā)揮生物學(xué)作用的前提和必經(jīng)途徑。本發(fā)明中所述生物學(xué)作用包括靶物質(zhì)對宿主的結(jié)合、入侵、感染、等。
本發(fā)明中所述的靶，包括但不限于，與特定疾病相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子、疾病引發(fā)或產(chǎn)生途徑中具有關(guān)鍵作用的酶、或其生物活性片段，以及病毒、輔助病毒，優(yōu)選為甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒，艾滋病病毒；或是，所述病毒衣殼蛋白中的特定生物活性位點(diǎn)；或是該病毒所針對的特定靶細(xì)胞表面的受體分子。在本發(fā)明中，所述用于體外模擬該靶的空間變構(gòu)的第一種待測定的物質(zhì)包括但不限于，針對該靶的單克隆抗體、酶、多肽或其具有結(jié)合活性的片段，可與該靶相互作用的小分子化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要可以使得所述靶體外足夠穩(wěn)定地形成類似生理?xiàng)l件下的變構(gòu)形態(tài)，任何物質(zhì)都可以使用。本發(fā)明人甚至還構(gòu)思了對該靶的體外處理方法，例如特定頻率的光譜照射、加熱或冷凍、改變環(huán)境溶液中的pH值、離子強(qiáng)度等，使得該靶呈期望的變構(gòu)形式。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述靶為戊型肝炎病毒表面蛋白的一個(gè)表位NE2(參見中國專利申請CN00130634.0和國際申請PCT/CN01/01469)，第一種待測定的物質(zhì)選自針對該特定位點(diǎn)的單克隆抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的針對該特定位點(diǎn)的單克隆抗體為8C11。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過將所述靶戊型肝炎病毒表面蛋白表位NE2與特定單克隆抗體8C11結(jié)合，得到了產(chǎn)生明顯的變構(gòu)作用的NE2蛋白-8C11復(fù)合物，該變構(gòu)了的復(fù)合物上與針對原NE2表位之單克隆抗體8H3結(jié)合的表位暴露的更為充分，而其上與針對原NE2表位之單克隆抗體2C9結(jié)合的表位喪失。具體地，在表達(dá)戊型肝炎病毒(HEV)第二開放讀瑪框架(ORF2)的一個(gè)片段NE2(ORF2a.a.394～603)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在溶液中表現(xiàn)為二聚體到十二聚體的多種聚合形式，實(shí)驗(yàn)表明具有良好的免疫反應(yīng)性、免疫原性及免疫保護(hù)性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用NE2免疫Balb/c小鼠，篩選出了多株抗NE2的單抗，其中三株識別構(gòu)相性表位的單抗(8H3、8C11、13D8，分別于2001年11月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，武漢，武漢大學(xué)(CCTCC)，保藏號分別為為C200117、C200116、C200114)能在免疫捕獲PCR實(shí)驗(yàn)中捕獲天然HEV病毒顆粒。
利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和生物傳感器進(jìn)行單抗間對NE2抗原的相互阻斷實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)8C11和13D8的相互阻斷明顯，8H3和2C9的相互阻斷明顯，可能識別共同或空間重疊的抗原表位；而出乎意料的是，當(dāng)13D8對8H3和2C9均表現(xiàn)出一定的阻斷效果的同時(shí)，8C11表現(xiàn)出對8H3與NE2結(jié)合的明顯增強(qiáng)以及使8H3對NE2得結(jié)合從快速結(jié)合快速解離模式轉(zhuǎn)變成快速結(jié)合緩慢解離得模式，同時(shí)對2C9的結(jié)合表現(xiàn)為明顯阻斷，提示8C11與NE2的結(jié)合導(dǎo)致了NE2蛋白的某種變構(gòu)，使8H3的表位暴露得更為充分，同時(shí)導(dǎo)致了2C9表位的破壞。用大腸桿菌表達(dá)HEV ORF2的a.a.368～601片段(208蛋白)、a.a.368～602片段(209蛋白)、a.a.368～603片段(239蛋白)、a.a.356～603片段(251蛋白)、a.a.345～603片段(262蛋白)和a.a.368～660片段(292蛋白)，均可形成類病毒顆粒(VLP)，以這些VLP為抗原，均無一例外可以見到8C11單抗對8H3單抗的明顯增強(qiáng)作用，提示8C11單抗對8H3對應(yīng)表位區(qū)域的變構(gòu)作用并非一種偶然現(xiàn)象。為驗(yàn)證這一變構(gòu)作用是否也存在于天然HEV病毒，我們將不同單抗分別包被eppendorf管，取1份感染HEV3周(抗體尚未陽轉(zhuǎn))的恒河猴排出的HEV RNA陽性糞便懸液進(jìn)行免疫捕獲RT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果8C11包被可以捕獲病毒，若將1∶100 8C11單抗事先與病毒孵育，則可以阻斷捕獲，說明8C11單抗可與HEV病毒顆粒牢固結(jié)合；單以8H3單抗包被，以不同稀釋度的8C11(從1∶10到1∶100 000)先與病毒孵育，則與1∶10、1∶100和1∶1000單抗8C11孵育的病毒可被8H3捕獲，而1∶10 000和1∶100 000單抗8C11孵育的病毒以及未經(jīng)單抗8C11孵育的病毒仍不被捕獲；以1∶100單抗13D8孵育的病毒也不被8H3捕獲；單抗2C9對有無經(jīng)1∶100單抗8C11孵育的病毒均不捕獲。這些結(jié)果說明在天然HEV病毒中也存在著8C11單抗的結(jié)合導(dǎo)致的8H3單抗識別表位區(qū)域的明顯變構(gòu)作用，這一變構(gòu)導(dǎo)致了8H3識別表位的良好暴露，而且并非所有單抗8C11表位區(qū)域的結(jié)合均會導(dǎo)致這一變構(gòu)，因?yàn)樽R別同一區(qū)域的單抗13D8并未引起類似的變構(gòu)。另外，在單克隆抗體對多份戊肝病人感染血清與NE2蛋白結(jié)合的阻斷實(shí)驗(yàn)中，單抗8C11對恢復(fù)期血清的阻斷效果較為明顯，而單純單抗8H3以及單抗2C9未見明顯的阻斷效果，但單8C11與8H3聯(lián)合阻斷時(shí)，阻斷效果比單純的8C11阻斷還要明顯得多；而8C11與2C9聯(lián)用或13D8與8H3聯(lián)用均僅相當(dāng)于8C11或13D8單獨(dú)使用時(shí)的阻斷效果，說明在天然感染血清的抗HEV多抗中，也存在著大量類似于8H3的抗體，因此8H3識別表位區(qū)域的被誘導(dǎo)變構(gòu)的現(xiàn)象很可能亦存在于HEV感染的天然進(jìn)程中。
本發(fā)明另一方面涉及由上述方法制備的發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)，其中所述靶物質(zhì)可任選地與使其發(fā)生空間變構(gòu)的物質(zhì)相結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，本發(fā)明所述引起存在受調(diào)控的變構(gòu)現(xiàn)象的靶物質(zhì)發(fā)生是在可發(fā)生空間變構(gòu)的條件下由特定物質(zhì)引發(fā)或誘導(dǎo)的，所述引發(fā)或誘導(dǎo)該靶物質(zhì)的特定物質(zhì)可以是針對該靶的單克隆抗體、酶、多肽或其具有結(jié)合活性的片段，可與該靶相互作用的小分子化合物。在靶物質(zhì)產(chǎn)生了期望的空間變構(gòu)后，誘導(dǎo)空間變構(gòu)的物質(zhì)可以與該靶物質(zhì)結(jié)合或不結(jié)合，只要該變構(gòu)的物質(zhì)能在一段時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定的構(gòu)象。
本發(fā)明另一方面，涉及一種用于預(yù)防和/或治療受試者感染前述靶物質(zhì)之疫苗，其中包含了僅具有免疫原性的前述發(fā)生了空間變構(gòu)的相應(yīng)靶物質(zhì)，或其具有同樣的免疫原性的片段，以及任選的藥學(xué)可接受的載體。在本發(fā)明中，所述疫苗中包含待預(yù)防的由特定靶物質(zhì)引起的感染或疾病之發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)。例如，如果預(yù)防針對艾滋病病毒引起的感染，則疫苗中含有發(fā)生了空間變構(gòu)的艾滋病病毒衣殼蛋白，其中只要所述發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)的片段具有免疫原性，就可使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，疫苗中包含的藥學(xué)可接受的載體取決于疫苗施用的途徑、受試者類型以及疫苗中包含的具體靶物質(zhì)的性質(zhì)。只要與所使用的疫苗之目的相容的任何疫苗制備中常用的載體均可使用。
本發(fā)明還涉及一種針對前述的發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)的抗體，優(yōu)選為人源化抗體。本發(fā)明所述的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，以及嵌合抗體，單鏈抗體或其片段等。本發(fā)明中公開了針對所述發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)的抗體，尤其是公開了針對在變構(gòu)后暴露出特定表位或形成的特定表位的抗體。只要能夠是產(chǎn)生空間變構(gòu)的本發(fā)明的靶物質(zhì)之構(gòu)象穩(wěn)定足夠的一段時(shí)間，則本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照共知的技術(shù)制備相應(yīng)的抗體。
本發(fā)明的另一方面，涉及一種利用上述變構(gòu)了的靶，篩選可抑制和/或激活所述靶生物活性的物質(zhì)的方法，其中包括1)將發(fā)生了空間變構(gòu)的靶與第二種待測定的物質(zhì)在適于發(fā)生相互作用的條件下接觸一段時(shí)間；2)測定經(jīng)上述處理的所述靶的生物活性，并與對照靶相比較；3)確定能夠引起所述靶生物活性的改變量超過預(yù)定閾值的物質(zhì)。
本發(fā)明中，所述生物活性的改變包括活性增加和/或降低。本發(fā)明中所述的第二種待測定的物質(zhì)可選自針對該變構(gòu)了的靶的單克隆抗體、酶、多肽或其具有結(jié)合活性的片段，可與該變構(gòu)了的靶相互作用的小分子化合物。其中所述的生物活性取決于靶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，一旦該利用上述方法得到了該靶的變構(gòu)形式，從而暴露出其激活下游事件的結(jié)構(gòu)域，即可作為藥物篩選的靶點(diǎn)，或制備該結(jié)構(gòu)域的抗體作為其下游事件的拮抗劑，或作為疫苗使之誘導(dǎo)出有效的抗體?；蚝Y選可模擬該結(jié)構(gòu)域的藥物分子，通過拮抗或模擬該結(jié)構(gòu)域的作用進(jìn)行疾病的治療或預(yù)防。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，靶為戊肝病毒表面蛋白的表位NE2。經(jīng)過如上述方法得到變構(gòu)了的戊肝病毒表面蛋白NE2后，可以其進(jìn)一步篩選中和該病毒的藥物。具體地，在單克隆抗體中和HEV病毒對恒河猴的感染性的實(shí)驗(yàn)中，可以見到單抗8C11和13D8均可至少部分中和HEV病毒的感染性，提示其識別表位很可能是HEV的肝細(xì)胞受體結(jié)合部位。在病毒感染細(xì)胞的過程中，通常需要多個(gè)受體的協(xié)同作用，而繼第一受體結(jié)合之后的第二受體結(jié)合產(chǎn)生的吸附增強(qiáng)作用，通常對于病毒成功侵入細(xì)胞內(nèi)至關(guān)重要。由于HEV病毒存在8C11表位區(qū)域與單抗結(jié)合后引起的明顯的結(jié)構(gòu)改變，以及天然感染血清中大量類似于8H3單抗的抗體的存在，推測8C11單抗對應(yīng)的表位區(qū)域可能為HEV感染宿主細(xì)胞的第一受體的結(jié)合部位，而8H3表位區(qū)域可能對應(yīng)著第二受體的結(jié)合部位，使病毒牢固地吸附在宿主細(xì)胞表面，或者是這一區(qū)域的結(jié)構(gòu)改變使某些蛋白酶切割位點(diǎn)暴露在外，使之可被宿主細(xì)胞的相應(yīng)蛋白酶切割，導(dǎo)致病毒衣殼的裂解、病毒核酸釋放入細(xì)胞漿中，進(jìn)入病毒感染的下一進(jìn)程，因此，能與8C11誘導(dǎo)變構(gòu)后的8H3表位區(qū)域結(jié)合的分子，將很有可能可阻斷HEV的感染進(jìn)程，因此該區(qū)域可作為抗HEV病毒藥物的良好靶點(diǎn)，而易于大量獲得的8C11單抗與NE2蛋白及其類似蛋白的復(fù)合物則可作為足量及穩(wěn)定的藥物篩選靶標(biāo)，使這類藥物的篩選成為可能。
病毒與受體結(jié)合后病毒顆粒表面發(fā)生的一系列變構(gòu)現(xiàn)象已在多種病毒中被發(fā)現(xiàn)。例如，在研究脊髓灰質(zhì)炎病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP4在天然狀態(tài)下是潛伏在毒粒內(nèi)部的，并不突出于表面，當(dāng)病毒與宿主細(xì)胞在近生理溫度下，孵育一段時(shí)間后，即發(fā)現(xiàn)VP4蛋白成分突出到毒粒表面，并與細(xì)胞的某個(gè)特異性受體發(fā)生了結(jié)合，隨后引發(fā)感染形成；用電子顯微鏡冷凍斷裂法研究證明，副粘病毒在結(jié)合紅細(xì)胞后，其主要結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，僅在發(fā)生了形態(tài)改變的顆粒才能與紅細(xì)胞膜融合；艾滋病毒(HIV)gp160由gp120和gp41非共價(jià)結(jié)合而成，gp120形成HIV的棘突，將帶gp120結(jié)合位點(diǎn)的可溶性CD4結(jié)構(gòu)加到HIV中，gp120可釋放出來，通過測定單克隆抗體結(jié)構(gòu)和蛋白酶敏感性的變化，表明包膜糖蛋白構(gòu)型的變化是由可溶性CD4結(jié)合引起的；此外還發(fā)現(xiàn)，可溶性CD4的結(jié)合也強(qiáng)化了猴免疫缺陷病毒的感染，有人認(rèn)為這種受體調(diào)節(jié)的病毒活化是由受體誘導(dǎo)病毒蛋白的構(gòu)型變化所引起的，這種構(gòu)型的變化對病毒的侵入是必需的。因此，根據(jù)本發(fā)明所述方法，首先篩選出可引起HIV gp120發(fā)生構(gòu)型變化的單克隆抗體及識別gp120變構(gòu)后形成的新的優(yōu)勢表位的單克隆抗體，由于gp120變構(gòu)對于HIV成功感染的高度重要性，這一變構(gòu)構(gòu)型可能具有較高的保守性，因此利用所篩到的單抗與重組表達(dá)的gp120形成的變構(gòu)gp120分子作為新型HIV疫苗，使體內(nèi)產(chǎn)生針對這一變構(gòu)表位的中和抗體起到阻斷HIV感染的作用，有可能可回避HIV gp120高度變異造成的疫苗研制的困難，獲得有效的保護(hù)性抗體；或者利用變構(gòu)gp120分子作為抗HIV藥物的新靶點(diǎn)，篩選能有效結(jié)合該變構(gòu)構(gòu)型從而阻斷HIV感染的新藥，或利用這一變構(gòu)分子篩選出細(xì)胞上的相應(yīng)結(jié)合蛋白，作為抗HIV藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)。
類似地，也可對乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)的膜蛋白、核心蛋白篩選類似的單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)可引起類似感染進(jìn)程中變構(gòu)構(gòu)型的單抗，進(jìn)而利用該單抗與相應(yīng)抗原的復(fù)合物所暴露出的構(gòu)型作為靶標(biāo)進(jìn)行抗HBV、抗HCV藥物的設(shè)計(jì)與篩選。
本發(fā)明的另一方面，涉及利用上述方法獲得的物質(zhì)用于制備治療與所述靶的空間變構(gòu)相關(guān)的生物活性的疾病的藥物之的用途。本發(fā)明中，與所述靶的空間變構(gòu)相關(guān)的生物活性的疾病包括但不限于，甲、乙、丙、丁、戊型肝炎，艾滋病。同樣，本發(fā)明所述方法應(yīng)不限于鼠源單克隆抗體，優(yōu)選為嵌合抗體，更優(yōu)選為人源化抗體，還可適用基因工程抗體或其他易于大量制備的能與靶結(jié)合并引起其發(fā)生特定變構(gòu)的其他分子。


圖1。幾種單克隆抗體與所針對的NE2抗原的典型結(jié)合解離過程圖。
圖2。針對NE2抗原的數(shù)種單克隆抗體間的相互阻斷曲線。
圖3。單克隆抗體8C11對8H3結(jié)合天然HEV病毒能力的影響。A1～A4為8C11包被，A6～A12為無包被；B1～B12為8H3包被；C1～C2為8H3包被；B4～B7為2C9包被；C9為RNA提取陰性對照；C11為第二輪PCR陰性對照；A1～A2為直接加糞便懸液；A3～A4為糞便懸液事先與1∶100單抗8C11孵育；A6為直接加糞便懸液；A7～A11依次為糞便懸液與1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000和1∶100 000單抗8C11孵育；A12為糞便懸液與1∶100單抗13D8孵育；B1、B2為直接加糞便懸液；B3、B4為1∶10單抗8C11孵育糞便；B5、B6為1∶100單抗8C11孵育糞便；B7、B8為1∶1000單抗8C11孵育糞便；B9、B10為1∶10000單抗8C11孵育糞便；B11、B12為1∶100 000單抗8C11孵育糞便；C1、C2為1∶100單抗13D8孵育糞便；C4、C5為直接加糞便；C6、C7為1∶100單抗8C11孵育糞便。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步加以描述。為表述方便，特以戊型肝炎病毒為例說明，并不意在限制本發(fā)明所述的要求保護(hù)的范圍僅為戊型肝炎病毒。
單抗相互阻斷程序先于NE2板中加入100μl的第一抗體(阻斷方，用含20mM pH7.2 PBS，1％酪蛋白的樣品稀釋液1∶50稀釋)，并設(shè)置相應(yīng)的空白孔(即加入不含第一抗體的樣品稀釋液100μl)，37℃反應(yīng)30min；PBST洗滌5遍，扣干，于每孔中加入100μlHRP標(biāo)記的第二抗體(被阻斷方，用含20mM pH7.2 PBS，0.5％酪蛋白的酶稀釋液稀釋到空白孔讀值大致在1.0左右)，37℃反應(yīng)30min；PBST洗滌5遍，扣干，每孔中各加入顯色劑A、顯色劑B(HRP顯色底物，北京萬泰生物藥業(yè)公司提供)，37℃顯色10min，然后用2M H2SO4終止，于TECAN公司的SUNriseTM酶標(biāo)儀上讀取OD450/620nm的讀值。按1-樣品孔讀值/空白孔讀值算得這三個(gè)單抗間的抑制率如下表(表一)表一 8H3、8C11、13D8三個(gè)單抗間的相互阻斷率8H3-HRP 8C11-HRP13D8-HRP8H3 ＞80％ ＜30％ ＜30％8C11 -100％*＞80％ ＞70％13D8 ＞70％ ＞70％ ＞80％*8C11對8H3非但沒有抑制，而且還有將讀值提高將近一倍的作用。從上表可以看出，8C11與NE2結(jié)合后，可以使NE2變構(gòu)，使其更易于與8H3反應(yīng)。
說明從上表可看出，對239而言，8C11改變239的構(gòu)象后，大致可10倍增強(qiáng)8H3的與239的反應(yīng)性。
8C11對8H3的增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)在加入的糞便懸液中事先加入不同稀釋度的8C11，檢測其對8H3捕獲HEV病毒能力的影響。結(jié)果如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種模擬或引發(fā)存在受調(diào)控的空間變構(gòu)現(xiàn)象之特定靶發(fā)生空間變構(gòu)的方法，其包括將所述靶與第一種待測定的物質(zhì)在適于發(fā)生空間變構(gòu)的相互作用之條件下接觸一段時(shí)間，從而使該靶發(fā)生類似于生理狀態(tài)下的空間變構(gòu)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的靶選自病毒、輔助病毒，優(yōu)選為甲、乙、丙、丁、戊、和/或庚型肝炎病毒，艾滋病病毒；或所述病毒衣殼蛋白中的特定位點(diǎn)；或是該病毒靶細(xì)胞表面的受體分子。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中用于體外模擬或引發(fā)所述靶的空間變構(gòu)的第一種待測定的物質(zhì)選自針對該靶的單克隆抗體、酶、多肽或其具有結(jié)合活性的片段，可與該靶相互作用的小分子化合物。
4.一種權(quán)利要求1所述方法制備的發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)，其可任選地與使其發(fā)生空間變構(gòu)的物質(zhì)相結(jié)合。
5.一種用于預(yù)防和/或治療受試者感染權(quán)利要求1的靶物質(zhì)之疫苗，其中包含了僅具有免疫原性的權(quán)利要求4所述的發(fā)生了空間變構(gòu)的相應(yīng)靶物質(zhì)，或其具有同樣的免疫原性的片段，以及任選的藥學(xué)可接受的載體。
6.一種針對權(quán)利要求4所述的發(fā)生了空間變構(gòu)的靶物質(zhì)的抗體，優(yōu)選為人源化抗體。
7.一種利用權(quán)利要求4的空間變構(gòu)了的靶篩選可抑制和/或激活所述靶生物活性的物質(zhì)的方法，其中包括1)將發(fā)生了空間變構(gòu)的靶與第二種待測定的物質(zhì)在適于發(fā)生相互作用的條件下接觸一段時(shí)間；2)測定經(jīng)上述處理的所述靶的生物活性，并與對照靶相比較；3)確定能夠引起所述靶生物活性的改變量超過預(yù)定閾值的物質(zhì)。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述生物活性的改變包括活性增加和/或降低。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的第二種待測定的物質(zhì)選自針對該變構(gòu)了的靶的單克隆抗體、酶、多肽或其具有結(jié)合活性的片段，可與該變構(gòu)了的靶結(jié)合的小分子化合物。
10.一種用于如權(quán)利要求1所述方法的體外實(shí)現(xiàn)靶的空間變構(gòu)的物質(zhì)，其選自針對該靶的單克隆抗體、酶、多肽或其具有結(jié)合活性的片段，可與該靶相互作用的小分子化合物。
11.一種利用權(quán)利要求7所述方法篩選得到的用于體外抑制和/或激活所述靶生物活性的物質(zhì)，其選自針對該變構(gòu)了的靶的單克隆抗體、酶、多肽或其具有結(jié)合活性的片段，可與該變構(gòu)了的靶相互作用的小分子化合物。
12.權(quán)利要求10或11所述的物質(zhì)用于制備治療與所述靶的空間變構(gòu)相關(guān)的生物活性的疾病的藥物之的用途，其中所述疾病包括甲、乙、丙、丁、戊、和庚型肝炎，艾滋病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使存在受調(diào)控空間變構(gòu)之特定靶產(chǎn)生變構(gòu)的方法，和用該現(xiàn)象篩選可抑制和/或激活該靶生物活性的物質(zhì)，特別是篩選藥物如抗病毒藥物靶點(diǎn)的方法，和由該方法篩選所得用于抑制和/或激活該靶生物活性的物質(zhì)，以及篩選所得物質(zhì)用于制備治療與該靶的空間變構(gòu)相關(guān)的疾病的藥物之用途。還涉及已變構(gòu)的靶物質(zhì)，和用于預(yù)防感染該靶物質(zhì)之疫苗，其含僅具免疫原性的發(fā)生了空間變構(gòu)的相應(yīng)靶物質(zhì)或其片段，還涉及一種針對該變構(gòu)的靶物質(zhì)的抗體。
文檔編號A61P31/00GK1444995SQ0210448
公開日2003年10月1日 申請日期2002年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月20日
發(fā)明者夏寧邵, 張軍, 葛勝祥, 李少偉, 顧穎, 何志強(qiáng) 申請人:廈門大學(xué), 養(yǎng)生堂有限公司