專利名稱：大環(huán)狀靶特異性反義核酸化合物的制作方法
連續(xù)資料本申請要求了2001年10月13日提交的專利PCT/KR01/01730的優(yōu)先權(quán)，該專利內(nèi)容以其全文在此引用。
2.背景描述反義分子通過沃森-克里克堿基配對與mRNA的互補序列結(jié)合。反義寡核苷酸(AS-oligos)在通過以序列特異的方式降低基因的表達來對基因進行功能性研究中是非常有價值的(Thompson等，Nature，314，363-366(1985)；Melani等，Cancer Res.，51，2897-2901(1991)；Anfossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3379-3383(1989))。已經(jīng)付出了很大努力來開發(fā)能夠消除涉及腫瘤發(fā)生和發(fā)展基因的異常表達的反義抗癌藥劑(Kamano等，Leuk.Res.，14，831-839(1990)；Melotti等，Blood，87，2221-2234(1996)；Ferrari等，Cell growth Differ.，1，543-548(1990)；Ratajczak等，Blood，79，1956-1961(1992)；Kastan等，Blood，74，1517-1524(1989)；Thaler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，1352-1356(1996)；Wagner，Nature，372，333-335(1994))。由于它們易于設計和合成以及對靶基因潛在的特異性，合成的AS-oligos已經(jīng)被廣泛的使用。基因表達的反義抑制被認為是由反義DNA-mRNA雙鏈體形成后的RNaseH活性造成，或者是mRNA與核糖體復合物結(jié)合運動位阻所造成(Dolnick，Cancer Invest.，9，185-194(1991))。已經(jīng)有人利用寡核苷酸針對基因組DNA的啟動子區(qū)域形成三股螺旋來阻止基因表達。而且，與基因組DNA的啟動子區(qū)競爭的雙鏈體寡核苷酸誘餌也已經(jīng)形成(Young等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10023-10026(1991))。在動物模型以及近來的幾個臨床研究中已經(jīng)證實了AS-oligos的功效(Offensperger等，EMBO J.，12，1257-1262(1993)；Tomita等，Hypertension，26，131-136(1995)；Nesterova等，Nat.Med.，1，528-533(1995)；Roush，Science，276，1192-1193(1997))。此外，美國和歐洲也已經(jīng)批準了用于CMV視網(wǎng)膜炎的第一個反義藥物。
然而，對于AS-oligos的預期由于結(jié)果總是不確定而經(jīng)常令人失望。應用AS-oligos的一些問題在于靶點的不可接近性(Flanagan等，Mol.Cell Biochem.，172，213-225(1997)；Matsuda等，Mol.Biol.Cell，7，1095-1106(1996))、核酶的不穩(wěn)定性(Akhtar等，Life Sci.，49，1793-1801(1991)；Wagner等，Science，260，1510-1513(1993)；Gryaznov等，Nucleic Acids Res.，24，1508-1514(1996))、缺乏序列特異性以及體內(nèi)各種副作用。利用化學方法修飾的寡核苷酸已經(jīng)將AS-oligos的穩(wěn)定性改善到某一程度，其被稱為第二代AS-oligos(Helene，Eur J Cancer，27(11)，1466-71(1991)；Bayever等，Antisense Res.Dev.3(4)，383-90(1993)；Baker等，Biochim.Biophys.Acta.，1489，3-18(1999))。硫代磷酸(PS)寡核苷酸和甲基膦酸酯(MP)寡核苷酸已經(jīng)被大量研究并主要用于增加核酶的穩(wěn)定性。但是，每種修飾過的AS-oligos都表現(xiàn)出缺乏序列特異性以及對RNaseH的不敏感性。而且，對DNA復制或修復過程中由水解修飾的核酸循環(huán)所導致的意外插入突變存在擔憂。
已描述了一系列具有增強的穩(wěn)定性的獨特反義分子，稱為‘第三代AS-oligos’，其具有1)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，2)CMAS(共價閉合多反義)結(jié)構(gòu)和3)RiAS(帶狀反義核酸)結(jié)構(gòu)(Moon等，Biochem J.，346，295-303(2000)；Matsuda等，Mol.Biol.Cell，7，1095-1106(1996)；Moon等，J Biol Chem.，275(7)，4647-53(2000))。CMAS和RiAS都表現(xiàn)出對生物流體中外切核酸酶和核酸酶的穩(wěn)定性。這些反義分子對特異性的減少靶mRNA也有效。但是，本領域中仍然需要開發(fā)具有更簡易以及具有增強的結(jié)合效率的反義分子。
某些噬菌體，如M13噬菌體，具有一條單鏈環(huán)狀基因組，其被用于DNA測序分析以及突變研究。M13噬菌粒，其作為用于構(gòu)建重組噬菌體的質(zhì)粒能改建成產(chǎn)生大量包含某特定基因的反義序列的環(huán)狀單鏈基因組DNA。這種生產(chǎn)反義DNA的方法利用了與共價閉合結(jié)構(gòu)相關的核酸酶的穩(wěn)定性，高序列保真度，消除費力的靶點搜尋以及容易的構(gòu)建反義文庫。
α-腫瘤壞死因子(TNF-α)對于正常的免疫應答(Perkins等，ArthritisRheum.，41(12)，2205-10(1998))、敗血癥休克(Camenisch等，J.Immunol.，162(6)，3498-503(1999))以及當生產(chǎn)過量時移植物對宿主排斥反應(Hill等，J.Immunol.，164(2)，656-63(2000))是必須的細胞因子。TNF-α也是一種典型的促炎細胞因子，與關節(jié)炎、過敏反應和其它免疫失調(diào)包括敗血癥和炎癥狀況都密切相關(Perkins等，Arthritis Rheum.，41(12)，2205-10(1998))。TNF-α表達能用脂多糖(LPS)處理大鼠單核細胞系WRT7/P2來誘發(fā)。
核因子-κB(NF-κB)調(diào)節(jié)多種細胞因子(Collins，Lab Invest.，68，499-508(1993))；Collins等，F(xiàn)ASEB J.，9，899-909(1995)和粘著受體(Thanos等，Cell，80，529-532(1995))的基因。在巨噬細胞、平滑肌細胞和人關節(jié)鞏膜組織的內(nèi)皮細胞中都能檢測到活化的NF-κB(Defillipi等，Curr Top Microbiol Immunol.，184，87-98(1993))，這表明NF-κB在炎癥和增殖過程中的重要作用(Brand等，J Clin Invest.，97，1715-1722(1996))。
致癌基因ras在人腫瘤中經(jīng)常處于活化狀態(tài)。RAS p21蛋白屬于GTP/GDP-結(jié)合蛋白大家族，位于質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)。ras基因內(nèi)的一個點突變能夠使RAS p21蛋白不能夠水解其所結(jié)合的GTP，從而傳遞胞內(nèi)信號，導致不可調(diào)節(jié)的細胞增殖(Alberts等，Molecular biology of the cell.Garland，New York，1273-1290(1994))。
原癌基因c-myb在造血細胞的增殖和分化中扮演重要的角色。造血細胞表現(xiàn)出差別表達c-myb并且對于終末分化展示了較少的基因表達(Melotti等，Blood，87，2221-2234(1996)；Ferrari等，Cell growth Differ.，1，543-548(1990))。在白血病細胞中經(jīng)常能夠發(fā)現(xiàn)c-myb基因產(chǎn)物的過量表達(Melani等，Cancer Res.，51，2897-2901(1991)；Anfossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3379-3383(1989)；Kamano等，Leuk.Res.，14，831-839(1990))。
MYC癌蛋白在腫瘤細胞生長中起到?jīng)Q定性的作用(Packham等，Biochim.Biophys.Acta.，1242，11-28(1995)；Henriksson等，Adv.Cancer Res.，68，109-182(1996))。MYC能夠誘導處于靜止期的細胞進入細胞周期(Eilers等，Nature，340，66-68(1989))，表明其對于持續(xù)的細胞生長是必須的，而其抑制能夠干涉有絲分裂信號并誘導細胞進入末期分化(Heikkila等，Nature，328，445-448(1987)；Sawyers等，Cell，70，901-910(1992))。
細胞周期調(diào)節(jié)基因的主要組分代表為一類被稱為細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的蛋白激酶家族。對于控制細胞周期從一個時相轉(zhuǎn)化到另一個時相的分子事件的更深刻理解使人們發(fā)現(xiàn)了CDK(Morgan，Nature(Lond.)，374，131-134(1995))。CDK直到與它們的共活化劑一單獨的細胞周期蛋白結(jié)合后才變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。細胞進入G1期時，CDK4和CDK6的激酶活性對于通過早期G1檢查點的轉(zhuǎn)化是必須的(Sherr，Cell，73，1059-1065(1993))，CDK2-細胞周期蛋白E復合體的活性對于從G1期到S期的轉(zhuǎn)化是必須的(Ohtsubo等，Mol.Cell.Biol.，15，2612-2624(1994))。開發(fā)對于CDK活性有效的反義寡核苷酸用于抑制腫瘤細胞生長是一條有吸引力的途徑。
本領域需要采用針對各種人類疾病的更特異、更穩(wěn)定和更有效的反義分子。
應該理解到本發(fā)明不僅局限于治療癌癥。本發(fā)明反義化合物的原理可以應用于有效消除任何靶RNA。這種以治療腫瘤、清除病毒感染產(chǎn)生的副作用、治療代謝疾病、免疫失調(diào)等形式所表現(xiàn)的化學活性都是反義治療的結(jié)果。
本發(fā)明進一步包含所要求的反義分子與可藥用載體的組合物。
本發(fā)明指一種大環(huán)狀核酸分子，包括靶點特異性反義區(qū)域，其能夠特異性的結(jié)合于一種基因所表達的一部分RNA，其中所述的反義分子能夠有效的降低所述基因的表達。大環(huán)狀核酸分子至少可以約3,000個核苷酸的長度，分子的反義區(qū)至少可以有50個核苷酸的長度。進一步，反義區(qū)域可以基本上與整個基因序列相互補。
在本發(fā)明的一個實施方案中，大環(huán)狀核酸分子可以為重組噬菌體或噬菌?；蚪M的單鏈形式，例如絲狀噬菌體，以及尤其是噬菌體M13。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，公開了一種包含如上所述大環(huán)狀核酸分子的載體。該載體可以來源于絲狀噬菌體。同樣在本發(fā)明的另一個實施方案中，公開了包含該載體的宿主細胞。
本發(fā)明還指一種組合物，包含大環(huán)狀核酸分子和其可藥用載體，該分子包含靶特異性反義區(qū)域，能夠特異性的結(jié)合到一種基因所表達的部分RNA上，其中所述的反義分子能夠有效降低所述基因的表達。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，公開了一種通過大環(huán)狀核酸分子靶向與編碼所選定蛋白的RNA來抑制所選定的蛋白表達的方法，其中該方法包括將核酸分子靶向RNA使得核酸分子能夠與RNA雜交形成與RNA的雙鏈體，該雙鏈體抑制了選定蛋白的表達。靶蛋白可以導致細胞增殖或癌癥。癌癥可以為但不限于白血病、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、腦癌或前列腺癌。具體的，癌癥可以為白血病、子宮癌或乳腺癌。
可替代的，靶蛋白可以為腫瘤壞死因子、核因子、MYB、MYC、RAS或細胞分裂激酶。如果靶蛋白是病毒蛋白，病毒可以是但不限于皰疹病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、HIV、天花病毒、單核細胞增多癥病毒(EB病毒)、肝炎病毒或呼吸道合胞病毒(RSV)。
靶蛋白可以造成代謝疾病或免疫失調(diào)。代謝疾病可以是但不限于苯丙酮尿癥(PKU)、原發(fā)性甲狀腺機能減退、半乳血糖癥、血色素異常、I型和II型糖尿病或肥胖癥。如為免疫失調(diào)疾病，其可以是但不限于斯耶格倫綜合征、抗磷脂綜合征、免疫復合體疾病、紫癜、舍恩萊因-亨諾赫、免疫缺陷綜合征、全身性紅斑狼瘡、免疫缺陷、風濕病、腎或肝硬化。
本發(fā)明還指一種嵌合的大環(huán)狀核酸分子，其包含靶特異性反義區(qū)域，能夠特異性的結(jié)合到由多個靶基因所表達的多個靶RNA，其中所述的核酸分子能夠有效的降低所述基因的表達。而且，還公開了包含嵌合的大環(huán)狀核酸分子和可藥用載體的組合物。
本發(fā)明還指一種通過大環(huán)狀核酸分子靶向編碼多個所選定蛋白的多個RNA分子來抑制多個選定蛋白表達的方法，其包括(1)產(chǎn)生包含靶向于所述多個靶RNA的靶特異性反義區(qū)域的嵌合大環(huán)狀核酸分子；和(2)靶向多個RNA使得嵌合的大環(huán)狀核酸分子與所述RNA雜交形成雙鏈體，其中該雙鏈體能夠降低多個選定蛋白的表達。
進一步，本發(fā)明還指一種抑制細胞增殖的方法，包括給所述細胞施用一種大環(huán)狀核酸分子，其包含一個或多個基本與一個或多個靶基因互補的反義區(qū)，其中通過抑制所述基因的表達來抑制細胞增殖。
在另一個實施方案中，公開了一種用來制備能抑制選定蛋白表達的包含靶特異性反義區(qū)的大環(huán)狀核酸分子的方法，包括(1)將目的靶特異性DNA插入到噬菌體或噬菌?；蚪M中；(2)使噬菌體能夠產(chǎn)生單鏈形式，其為大環(huán)狀核酸分子；以及(3)通過凝膠柱分離所述的大環(huán)狀核酸分子。
本發(fā)明還提供了一種用來篩選基因功能的方法，包括(a)產(chǎn)生含有與人細胞中表達的RNA基本互補的反義核酸區(qū)的大環(huán)狀核酸分子；(b)用大環(huán)狀核酸分子接觸細胞使得反義分子能夠進入細胞并與細胞中表達的RNA雜交從而抑制其基因產(chǎn)物的表達；和(c)分析細胞表型變化。
在上述方法中，步驟(a)到(c)可以應用于所述大環(huán)狀核酸分子的文庫。而且，方法中的核酸分子可以為單鏈形式的重組噬菌體或噬菌?；蚪M。
本發(fā)明中的這些和其它目的可以通過本發(fā)明下面的描述、所附參考圖以及權(quán)利要求來更充分理解。
圖3A和3B表明噬菌體基因組反義分子的層析純化。
A.從凝膠濾柱層析中對環(huán)狀反義分子的洗脫圖。Sephacryl S-1000超細(1.0×50cm)樹脂被用于DNA分級分離。洗脫緩沖液為包含0.2MNaCl的50mM Tris-HCl(pH8.3)，流速設定為0.3ml/分鐘。每個分離級分的樣品體積設定為70μg(70μl洗脫液濃度1mg/ml)。
B.從凝膠濾柱層析中得到的級分電泳圖。1道為粗DNA，2-8道組分I-VII相應于保留時間。純化的DNA在1％瓊脂糖凝膠中電泳并用溴乙錠染色顯色。
圖4A和4B表明包含有TNF-α序列的噬菌體基因組的反義分子的生化特性A.TNFα-M13AS分子的特征。1道，入HindIII DNA分子量標記物；2道，包含TNFαcDNA的質(zhì)粒DNA(TNFα-質(zhì)粒)；3道，TNFα-M13AS4道，TNFα-質(zhì)粒用Xho I酶切；5道，TNFα-M13AS質(zhì)粒用Xho I酶切；6道，TNFα-質(zhì)粒用S1核酸酶酶切；7道，TNFα-M13AS用S1核酸酶酶切；8道，TNFα-質(zhì)粒用Xho I酶切后再用外切核酸酶III溫育；9道，TNFα-M13AS用Xho I酶切后再用外切核酸酶III溫育。TNFα-質(zhì)粒或TNFα-M13AS按照廠商的說明和各種酶溫育。
B.TNFα-M13AS的穩(wěn)定性檢測。噬菌體基因組的反義分子在30％胎牛血清中溫育不同的時間。1-8道用血清處理不同的時間和9道，為假性處理的對照。用血清處理的反義分子在1％瓊脂糖凝膠中電泳并用溴乙錠染色顯色。
圖5A和5B表明TNFα-M13AS和雙鏈質(zhì)粒分子的熔解溫度圖。當溫度從30℃上升到95℃時在3分鐘間隔中每0.5℃的增量檢測吸光度。A.包含TNFα插入的雙鏈噬菌粒的Tm1/2圖。B.單鏈環(huán)狀反義分子TNFα-M13AS的Tm1/2圖。
圖6A-6D表明在WRT7/P2細胞中TNFα-M13AS在TNFαmRNA水平的反義活性。在A，C和D中顯示的結(jié)果得自于RT-PCR，在B中顯示的結(jié)果得自于Southern雜交。RT-PCR用全RNA來進行。細胞用TNFα-M13AS(1.4nM，1.65μg/ml)與脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Lipofectamine)(6.6μg/ml)形成的混合物來處理。在用反義分子進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，在WRT7/P2細胞中用LPS處理來誘導TNF-α產(chǎn)生，然后分離全RNA。A.用兩套引物或TNF-α引物或β-肌動蛋白引物來進行RT-PCR1道，脂質(zhì)體；2道，TNFα-M13AS(反義)；3道，TNFα-M13SE(有義)；4道，M13SS(沒有反義插入的噬菌體基因組DNA)。B.將來自A組的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并用的標記20多聚體寡核苷酸作探針。C.通過RT-PCR擴增IL-1β和GAPDH來檢查非特異性反義的作用?？俁NA和單鏈環(huán)狀分子，包括反義化合物的量與A組中的相同。擴增的PCR片段在1％瓊脂糖凝膠中電泳并用溴乙錠染色顯色。D.TNFα-M13AS對TNFαmRNA表達的劑量依賴作用。1道，脂質(zhì)體；2-5道，TNFα-M13AS；6道，TNFα-M13SE；和7道，M13SS。
圖7A和7B表明在THP1細胞中NFκB-M13AS對人NF-κB mRNA水平的作用。用不同量的NFκB-M13AS、NFκB-M13SE或M13SS轉(zhuǎn)染THP1細胞(1×105細胞/孔)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，細胞用PMA(160nM)刺激6小時?？俁NA被分離并進行RT-PCR。A.通過NFκB-M13AS處理以劑量依賴方式降低了NF-κB的信使RNA水平。根據(jù)圖，1道左側(cè)沒有標記道為分子量標記物(100bp梯級標記)，1道，假性處理的對照；2-4道，NFκB-M13AS(分別為0.14nM、0.28nM和0.56nM)；5-6道，NFκB-M13SE(分別為0.28nM和0.56nM)；7-8道，M13SS(0.28nM和0.56nM)；在9道右側(cè)沒有標記的道為脂轉(zhuǎn)染胺試劑。B.A組中的DNA條帶被轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并進行Southern雜交。
圖8A-8D表明c-myc-M13AS、c-myb-M13AS、k-ras-M13AS和cdk2-M13AS對于它們各自基因mRNA表達的作用。K562和HL-60細胞用c-myc-M13AS和c-myb-M13AS分子分別轉(zhuǎn)染。A.在K562細胞上進行RT-PCR的結(jié)果。1-2道，c-myc-M13AS(分別為0.56nM和1.12nM)；3-4道，c-myc-M13SE(分別為0.56nM和1.12nM)；5道，M13SS(0.56nM)。B.在HL-60細胞上進行RT-PCR的結(jié)果。1-2道，c-myb-M13AS(分別為0.56nM和1.12nM)；3-4道，c-myb-M13SE(分別為0.56nM和1.12nM)。C和D.HeLa細胞分別用不同量的k-ras-M13AS和cdk2-M13AS分子來處理。C.1-2道，k-ras-M13AS(分別為0.28nM和0.84nM)；3-4道，k-ras-M13SE(分別為0.28nM和0.56nM)；5-6道，M13-SS(分別為0.28nM和0.56nM)。D.1-3道，cdk2-M13AS(分別為0.28nM、0.56nM和0.84nM)；4-6道，cdk2-M13SE(分別為0.28nM、0.56nM和0.84nM)。擴增的DNA片段在1％瓊脂糖凝膠中電泳并用溴乙錠染色顯色。
圖9A和9B表明通過施用噬菌體基因組反義分子降低了TNFα和CDK2的表達。A.釋放到培養(yǎng)基中的TNF-α用ELISA測量。WRT7/P2細胞用TNFα-M13AS、TNFα-M13SE或M13SS轉(zhuǎn)染(分別為1-3道)。用30μg/ml LPS誘導TNF-α6小時。細胞培養(yǎng)物中的上清液在檢測前立即稀釋50倍。每個柱值代表了三次重復試驗的平均值±S.D。統(tǒng)計學顯著性用斯氏t檢驗(方差分析，*p＜0.05)來計算。B.在用cdk2-M13AS分子處理后HeLa細胞中對CDK2用Western印跡分析。


圖10A和10B表明噬菌體基因組反義分子對MCF-7和HeLa細胞的增殖的作用。MTT分析用k-ras-M13AS和cdk2-M13AS分別處理后測定對細胞生長的抑制。A.MCF-7細胞以1∶3(w/w)的比率用0.28nM或0.56nM k-ras-M13AS與Lipofectamine 2000形成的復合物處理□為k-ras-M13AS； 為k-ras-M13SE； 為僅裸k-ras-M13AS；和■為僅Lipofectamine 2000。B.HeLa細胞用cdk2-M13AS(0.84nM)與Lipofectamine 2000形成的復合物來處理。柱1，cdk2-M13AS(0.84nM)；柱2，cdk2-M13SE(0.84nM)；柱3，沒有脂質(zhì)體的cdk2-M13AS；和柱4，僅Lipofectamine 2000。每個柱值都代表了三次重復試驗的平均值±S.D.。
圖11A和11B表明c-myb-M13AS分子對K562和HL-60細胞增殖的作用。MTT分析檢測c-myb-M13AS對細胞生長的抑制。構(gòu)建了兩種c-myb-M13AS分子c-myb-M13AS1和c-myb-M13AS2，它們分別包含0.5kb或1.5kb的c-myb序列。K562(A)和HL-60(B)細胞用c-myb-M13AS(0.84nM)與Lipofectamine 2000形成的復合物來處理。柱1，c-myb-M13AS 0.5kb；柱2，c-myb-M13AS 1.5kb；柱3，c-myb-M13SE 1.5kb；和柱4，僅裸c-myb-M13AS 1.5kb。每個柱值都代表了三次重復試驗的平均值±S.D.。
發(fā)明詳述本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)大環(huán)狀核酸分子包含靶特異性反義區(qū)，尤其是由噬菌體產(chǎn)生的大環(huán)狀核酸分子可用作有效的基因表達抑制物。
在本發(fā)明中，“a”和“an”用來指單個和多個物體。
如本發(fā)明所用，術語“反義”是指反義核酸(DNA或RNA)和其類似物，也指一系列化學物種，這些化學物種具有一系列核苷酸堿基序列，能通過與靶序列的核苷酸堿基氫鍵相互作用識別多核苷酸靶序列或序列部分。靶序列可以是單鏈或雙鏈RNA，或單鏈或雙鏈DNA。
這些RNA或DNA類似物包括但不限于2′-O-烷基糖修飾、甲基磷酸脂、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲縮醛(formacetal)、3′-硫代甲縮醛(3′-thioformacetal)、砜、氨基磺酸酯和硝基骨架修飾、氨基化合物和其中堿基部分已被修飾的類似物。而且，分子的類似物可以為多聚物，其中的糖部分已被其它合適的部分修飾或替換，產(chǎn)生的多聚物包括但不限于嗎啉代類似物和肽核酸(PNA)類似物。這些類似物包括上述修飾的不同組合，包含連接基團和/或糖或堿基的結(jié)構(gòu)修飾來改進RNaseH介導的靶RNA的破壞、結(jié)合親和力、核酸酶抗性和/或靶特異性。
如本發(fā)明所用，術語“反義療法”為一個遺傳名詞，其包含大環(huán)狀核酸分子的特異性結(jié)合，該分子包括了對于靶基因的反義區(qū)段，從而在體內(nèi)或體外使非所需的目的靶DNA或RNA序列失活。
如本發(fā)明所用，“細胞增殖”是指細胞分裂。如本發(fā)明所用，術語“生長”包括由于較快的細胞分裂和由于較慢的編程性細胞死亡速率即細胞死亡所造成的細胞數(shù)目的增加。非控制的細胞增殖是癌細胞或非正常細胞類型的標志。正常非癌細胞以特定細胞類型的特征頻率有規(guī)律的分裂。當一個細胞已經(jīng)轉(zhuǎn)化為癌細胞狀態(tài)時，細胞分裂和增殖不受控制。抑制增殖或生長能夠調(diào)節(jié)不受控制的細胞分裂。
如本發(fā)明所用，“嵌合大環(huán)狀核酸分子”指包含多個基本與多個靶基因互補反義核酸區(qū)段的大環(huán)狀核酸分子。反義核酸的區(qū)段可以用每個區(qū)段之間間隔區(qū)使其直接或間接的相互聯(lián)系或連接。
如本發(fā)明所用，”絲狀噬菌體”指用于生產(chǎn)本發(fā)明的大環(huán)狀核酸分子的運載體?？梢允褂檬删w或噬菌粒。在這個例子中，所需序列插入或克隆到運載體中使得當單鏈分子能夠由噬菌體或噬菌粒產(chǎn)生時，大環(huán)狀核酸分子被產(chǎn)生出來。DNA或RNA噬菌體可以用于此目的。特別的，可以使用絲狀噬菌體。絲狀噬菌體如M13、fd和f1具有絲狀衣殼以及環(huán)狀ssDNA分子。它們的生命周期包括細胞內(nèi)dsDNA中間復制形式，該形式早于衣殼化被轉(zhuǎn)化為ssDNA。這種轉(zhuǎn)化提供了制備ssDNA的一種方法。噬菌體M13已經(jīng)被改造用作克隆載體。
如本發(fā)明所用，“基因”指基因完整的核酸序列或基因的部分序列。
如本發(fā)明所用，術語“抑制”和“降低”可以替換使用，表示降低基因表達或細胞增殖或任何其它表型特性。
如本發(fā)明所用，“大環(huán)狀核酸分子”也被稱為“大環(huán)狀反義分子”為一單鏈分子，其至少包含一個與靶基因或RNA序列基本互補并結(jié)合反義區(qū)，該反義區(qū)抑制或降低了基因表達以及在某種情況下該基因同種型的表達。環(huán)狀單鏈核酸分子可以包含對于一個或幾個基因的有義或反義序列，只要該序列對于靶基因為反義形式。
大環(huán)狀核酸分子可以通過化學方法合成。但通常其由絲狀噬菌體系統(tǒng)生產(chǎn)，該系統(tǒng)包括M13和來源于M13的噬菌粒。當大環(huán)狀核酸分子被從噬菌體中產(chǎn)生出來時，其也可以稱為“噬菌體基因組反義復合物”。
在某種意義上，大環(huán)狀核酸分子比通常的寡核苷酸序列要長，后者約為20到30核苷酸。相反，大環(huán)狀核酸分子至少有3,000核苷酸長。通常其范圍從約3,000到約8,000核苷酸長。盡管約3,100到約7,000長度的核苷酸可以用于本發(fā)明，優(yōu)選的長度范圍約為3,300到約6,000堿基。
可替代的，可以理解對于大環(huán)狀核酸分子長度沒有絕頂?shù)纳舷藓拖孪?。當噬菌體用來產(chǎn)生大環(huán)狀核酸分子時特別如此，在該情況下噬菌體的大小和至少編碼一部分靶基因的插入片段的大小可控制所產(chǎn)生的單鏈核酸的長度。因此，在一個實施方案中，核酸分子可以為一個噬菌體如絲狀噬菌體所能容納的長度。
大環(huán)狀核酸分子可以包括特異性的反義序列和外部序列。外部序列可以包括其它各種基因的有義或反義形式?；蛘?，如果噬菌體被用于產(chǎn)生核酸分子，外部序列可以為載體序列。大環(huán)狀核酸分子的靶特異性反義區(qū)的長度可以無限制從稍低于約100核苷酸到超過5,000個核苷酸。通常范圍為從約200到約3000核苷酸。更具體的，范圍從約400到約2,00核苷酸。靶特異性反義區(qū)也可以互補于整個基因。
在另一個實施方案中，反義分子可以由噬菌體基因組中產(chǎn)生，作為噬菌體天然生命周期的一部分。
如本發(fā)明所用，“基本互補”意指反義序列與一個反義化合物具有約80％的同源性，該化合物本身與靶RNA互補并特異性結(jié)合。通常不需要絕對的互補。任何與靶核酸分子具有足夠互補性形成穩(wěn)定的雙鏈體或三鏈體的反義分子都被認為是合適的。因為穩(wěn)定雙鏈體的形式依賴于雜交反義分子的序列和長度以及在反義分子和靶序列之間互補的程度，系統(tǒng)可以容忍與大環(huán)狀分子互補性中較低的保真度。
如本發(fā)明所用，“靶”或“靶向”指制備的反義分子所針對的特定的單個基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，反義分子來自于在LC-反義化合物中的一個插入。在某些情況下，“靶向”意指反義分子結(jié)合或?qū)е卤唤Y(jié)合到內(nèi)源性表達的轉(zhuǎn)錄文本使得靶基因表達被消除。靶核酸序列可以選自涉及各種惡性腫瘤的基因，包括涉及不同疾病如免疫疾病、感染性疾病、代謝性疾病和遺傳疾病或任何其它由基因不正常表達所引發(fā)的疾病起始與發(fā)展的基因。
本發(fā)明的反義分子在生化和生物學活性上發(fā)現(xiàn)要優(yōu)于常規(guī)合成的AS-oligos。盡管常規(guī)的AS-oligos能容易的用DNA合成儀合成，但它們需要對靶點進行選擇。選擇靶點的過程有時被命名為“AS-oligos設計”。這個過程費時而且有時是非決定性的。此外，合成的AS-oligos對于核酸酶是不穩(wěn)定的，具有頻繁的序列錯誤，需要高的生產(chǎn)成本，以及即使在與脂質(zhì)體形成復合物后表現(xiàn)出較差的細胞吸收。
在本發(fā)明的一個實施方案中，公開了由噬菌體產(chǎn)生的單鏈環(huán)狀基因組DNA被用于反義載體。具體的，所用的噬菌體可以是M13噬菌體或其任何修飾形式。但可以理解任何能產(chǎn)生單鏈核酸分子的噬菌體或噬菌粒，病毒或任何克隆運載體都可以使用。優(yōu)選的，所產(chǎn)生的單鏈核酸為環(huán)狀。產(chǎn)生反義分子的DNA分子可以被克隆到運載體的基因組中，例如噬菌體。
在反義研究領域中常規(guī)知識已阻礙使用長的反義分子，因為人們認為長AS-oligos具有更少的特異性、合成困難以及對細胞的吸收效率低下。實際上，化學修飾的第二代AS-oligos如硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸如同AS-oligos被延長一樣已經(jīng)降低了序列特異性。而且，線性AS-oligos的合成越來越困難，隨著AS-oligos長度的增加序列保真度顯著降低。
噬菌體載體使得容易產(chǎn)生包括高序列保真度的反義序列的長單鏈序列。所發(fā)明的反義分子，盡管長度非常規(guī)長，但在消除靶mRNA的表達方面仍表現(xiàn)出較好的序列特異性。不被任何反義核酸作用的特定理論或機制所限制，人們認為一旦一小部分反義序列結(jié)合到其互補序列上，反義序列就會在全長互補靶序列上拉上拉鏈。然后反義DNA和有義RNA之間所形成的長雙鏈體作為RNasH活性的底物更穩(wěn)定地維持著。
發(fā)明的反義分子優(yōu)勢結(jié)合的另一個原因可能是對于長反義分子存在較高的機會結(jié)合到結(jié)構(gòu)暴露的靶點上。信使RNA通過與細胞質(zhì)中的RNA結(jié)合蛋白相互作用在其自身序列內(nèi)傾向于形成廣泛的二級和三級結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)了一個對反義分子開放的靶位點，這對于成功的反義活性是關鍵的。因其較長的長度，噬菌體基因組反義分子不得不具有能夠接近暴露的靶mRNA互補序列的某些序列，因此增加了靶mRNA消除的機會。
本發(fā)明的反義分子的原理可以應用于任何目的靶基因。盡管如本發(fā)明反義分子實施例公開了TNF-α、NFκB、c-myb、c-myc、cdk2和k-ras，本發(fā)明的反義分子可制成針對任何目的基因。實際上，本發(fā)明的反義分子對于核酸酶具有更顯著的穩(wěn)定性以及有效的靶消除。作例證的序列特異性的降低了靶基因TNF-α、NFκB、c-myb、c-myc、cdk2和k-ras支持了本反義方法的廣泛應用。因此，本發(fā)明的反義分子可以被用于結(jié)合到任何來源的任何靶mRNA序列。
反義活性也在蛋白質(zhì)水平上被檢測以保證靶mRNA和蛋白消除的相關性。施用TNFα-M13AS發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)基中能顯著降低大鼠TNF-α的分泌，從而證實了有效的反義活性。相反的，對照的噬菌體基因組復合物(沒有反義插入的單鏈環(huán)狀分子)DNA僅表現(xiàn)出TNF-α分泌的輕微減少。通過添加對照反義分子輕微降低TNF-α分泌，這由位于核內(nèi)體的自由陽離子脂質(zhì)體的細胞毒性部分能夠解釋。用陽離子脂質(zhì)體單獨處理的細胞表現(xiàn)出比用脂質(zhì)體-反義分子復合物處理的細胞更低的存活率。用cdk2-M13AS處理導致相似的CDK2表達的消除。而且，當本發(fā)明的基因特異性反義復合物施用到攜帶c-myb和cdk2的腫瘤細胞系中，觀察到生長抑制。
傳統(tǒng)AS-oligos當與陽離子脂質(zhì)體形成復合物后，其細胞吸收能夠顯著增強。但是，AS-oligos在與不同類型的脂質(zhì)體形成復合物后表現(xiàn)出不一致和細胞吸收經(jīng)常無效。相反，噬菌體基因組反義分子由于其自身長度較長形成眾多短的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)得更像質(zhì)粒DNA。實際上，當和不同類型的脂質(zhì)體形成復合物時，反義DNA表現(xiàn)出一致并增強細胞吸收(數(shù)據(jù)未顯示)。
合成的AS-oligos通常為15到25個核酸殘基，只與一個單靶點結(jié)合并消除底物mRNA。但是，大多數(shù)人類慢性疾病表現(xiàn)出多基因失調(diào)需要反義分子能夠靶向涉及疾病的多個基因。為滿足這個需要，需設計一種具有多重靶向能力的反義分子。但是，由于化學合成中的各種障礙，化學合成這種分子是不切實際的。利用噬菌體基因組DNA，多重反義序列可以通過基因克隆容易構(gòu)建。而且，具有多重反義序列的噬菌體基因組DNA的序列完整性等于在細菌細胞中擴增的質(zhì)粒DNA的序列完整性。
用噬菌體基因組反義分子的另一個優(yōu)勢為對于序列變異的廣泛耐受性。只要在不同的基因變異體間小塊相同序列有超過約15個連續(xù)的核苷酸是保守的，本發(fā)明的基因組反義分子就有效。這個特性在靶向致病病毒如HIV和HBV多態(tài)性株時特別有用，在這些多態(tài)性株中同樣的反義分子可以用來針對變異形式。此外，只要在來源和靶向的生物體之間的序列變異不是沿著編碼序列均勻的擴散，從一個物種如人中產(chǎn)生的這種類型的噬菌體基因組反義分子可以被用于研究其它物種如嚙齒動物的基因功能。
反義分子還是通過所謂的“基因敲低(knockdown)”途徑研究基因功能的有效手段(De Backer等，Nat.Biotechnol.，19，235-241(2001)；Ji等，Science，293，2266-2269(2001))。在“基因敲低”途徑中，基因功能可以在不破壞基因的情況下被闡明。這種策略比通常所用鑒別基因功能的“基因敲除”方法更快。在本發(fā)明的一個實施方案中的基因組反義分子，獨特的適合于‘海量(massive)’的功能基因組。這些噬菌體基因組反義復合物用于海量功能基因組的一些顯著的特性為1)不需要詳盡的反義設計即能構(gòu)建反義分子，2)用大量單獨的克隆來構(gòu)建反義文庫，以及3)較高的反義活性，從而避免由于部分反義活性造成的數(shù)據(jù)的錯誤解釋。
在本發(fā)明的一個實施方案中通過使用噬菌體基因組反義方法，用于海量功能基因組的系統(tǒng)有效性要比常規(guī)的AS-oligos方法高幾百倍。而且，與用其它間接的系統(tǒng)相反，如DNA芯片、基因表達的連續(xù)分析(SAGE)、TIGR直向同源基因?qū)Ρ?TOGA)數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)組，使用發(fā)明的噬菌體基因組反義系統(tǒng)的海量功能基因組采用了一種直接基因功能化的系統(tǒng)。
來源于噬菌體系統(tǒng)特別是M13噬菌體系統(tǒng)或相稱的噬菌粒系統(tǒng)的環(huán)狀反義分子是穩(wěn)定并能夠有效的阻斷靶基因的表達。噬菌體基因組反義分子在少量時即是有效的，但也能大量的制備。發(fā)明的反義分子針對各種類型的癌癥、病毒感染、免疫失調(diào)、代謝性失調(diào)和其它人類疾病是有效的治療劑，其中調(diào)節(jié)基因表達對于干涉疾病的發(fā)生和發(fā)展都有好處。
在治療應用中，大環(huán)狀核酸分子能夠根據(jù)不同給藥方式配成制劑，包括口服、局部或局部化給藥。技術和配方通常在最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa中可以找到?；钚越M分為反義分子其通常結(jié)合著一種載體如稀釋的賦形劑，包括裝填物、補充劑、接合劑、潤濕劑、分解質(zhì)、表面活性劑、可降解的多聚物或滑潤劑、依賴于給藥模式的性質(zhì)和配藥形式。典型的配藥形式包括藥片、藥粉、液體制劑包括懸浮液、乳化液和溶液、藥粒和膠囊。
本發(fā)明的大環(huán)狀核酸化合物的某些類型特別適合于口服給藥，這在常規(guī)的藥物傳送條件下需要在將藥暴露于胃酸條件下長達4小時，當以持續(xù)釋放的形式呈遞時，能夠長達12小時。將這些反義化合物配成以持續(xù)釋放的形式制劑對于治療某些疾病非常有利。
可以通過跨粘膜或經(jīng)皮方法獲得大環(huán)狀核酸分子系統(tǒng)給藥，或口服復合物。對于跨粘膜或經(jīng)皮給藥，適合于穿透屏障的滲透劑可以被用于制劑中。這些滲透劑在本領域中通常是已知的，包括，例如用于跨粘膜給藥的膽酸鹽和梭鏈孢酸衍生物。此外，去垢劑可以被用來協(xié)助透過。跨粘膜給藥例如可以是通過用鼻腔噴霧，以及適合于吸入或栓劑給藥的制劑。
本發(fā)明的大環(huán)狀核酸分子也能夠與適于被試者施用的可藥用載體結(jié)合。合適的藥物載體的例子為各種陽離子脂質(zhì)體，包括但不限于N-(1-2，3-二油基氧)丙基-n，n，n-三甲基銨氯(N-(1-2，3-dioleyloxy)propyl)-n，n，n-trimethylammonium chloride)(DOTMA)和二油酰基磷脂酸基乙醇胺(dioleoylphophotidyl ethanolamine)(DOPE)。脂質(zhì)體也是本發(fā)明的反義分子的合適載體。其它合適的載體為包含所要求的反義分子的緩釋凝膠或聚合體。
大環(huán)狀核酸分子可以通過任何有效途徑施用給病人，包括肌肉注射、靜脈內(nèi)注射、胸內(nèi)注射、鼻內(nèi)注射、腹膜注射、瘤內(nèi)注射、皮下注射、原位注射和口服給藥?？诜o藥需要腸衣以保護所要求的反義分子和其類似物在胃腸道中免被降解。大環(huán)狀核酸分子可以與一定量的生理上可接受的載體和稀釋劑混合，例如鹽溶液或其它合適的液體。反義分子還可以與其它保護核酸分子或其類似物在到達其靶點之前免被降解的載體和/或與協(xié)助反義分子或其類似物通過組織障礙的載體相結(jié)合。
在一個實施方案中，大環(huán)狀核酸分子以有效抑制癌癥或異常的細胞生長的劑量給藥。在其它實施方案中，反義分子可以用來治療病毒感染，如但不限于皰疹病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、HIV、天花病毒、單核細胞增多癥病毒(EB病毒)，或呼吸道合胞病毒(RSV)等。此外，也可以治療代謝性疾病，例如但不限于苯丙酮尿癥(PKU)、原發(fā)性甲狀腺機能減退、半乳血糖癥、血色素異常、I型和II型糖尿病或肥胖癥等。本發(fā)明的反義分子還可以用于治療其它疾病如免疫性疾病包括，例如但不限于斯耶格倫綜合癥、抗磷脂綜合癥、免疫復合物疾病、紫癜、舍恩萊因-亨諾赫、免疫缺陷綜合癥、全身性紅斑狼瘡、免疫缺陷、風濕病等。
任何所施用的特定大環(huán)狀核酸分子的實際用量依賴于很多因素如疾病或感染的類型和階段、反義分子對體內(nèi)其它細胞的毒性、其被細胞吸收的速率、施用核酸分子的病人的年齡和體重。通過常規(guī)方法例如逐漸增加反義分子的劑量使其從對抑制細胞增殖無效到有效，可以確定病人的有效量。預計呈遞給疾病細胞的濃度范圍從約0.1nM到約30μM都能夠有效抑制基因表達并表現(xiàn)出可檢測的表型。對于反義分子在治療癌癥或其它疾病化療應用中測定藥理學/藥代動力學的方法在本領域是已知的。
大環(huán)狀核酸分子施用給病人至少持續(xù)的時間足夠產(chǎn)生所需要效果。為維持有效水平，可有必要每天多次、每天一次或間隔頻率較短施用反義核酸分子。對于癌細胞，施用反義分子直到檢測不到癌細胞，或降低到進一步治療不能夠明顯降低其數(shù)量的程度，或者細胞數(shù)減少到能夠被外科手術或其它治療處理的程度。施用反義分子的時間長度依賴于多種因素例如癌細胞對于特定分子的吸收速率和細胞對于分子作出反應所需要的時間。
以本發(fā)明說明而不是限制方式提供了下列實施例。實施例
2.TNF-αmRNA的誘導表達以及編碼大鼠TNF-α和人NF-κB的基因的克隆在WRT7/P2細胞中用脂多糖(LPS，30μg/ml)誘導大鼠TNF-α的表達。在48孔板每個孔中按1×105細胞/孔接種細胞并用LPS處理。在所需要的時間點收集細胞并檢測mRNA的量。選擇誘導TNF-α表達達到最高水平的LPS溫育時間來進行進一步的試驗。
從如上所述從擴增的cDNA片段中得到大鼠TNF-αcDNA。包含全部編碼序列的TNF-αRT-PCR片段(708bp)用下列引物對擴增5’-GATCGTCGACGATGAGCACAGAAAGCATGATCC-3’(SEQ IDNO1)和5-GATCGAATTCGTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3’(SEQ ID NO2)。利用SalI和EcoRI限制性位點，將大鼠TNF-αcDNA片段克隆到pBluescript(pBS)KS(-)載體的多克隆位點，其方向與lacZ基因的方向相同(圖1)。
相似的，NF-κB、c-myb、c-myc、k-ras和cdk2基因的cDNA片段用一組PCR引物對(表1)擴增并克隆到經(jīng)末端補平的pBS-KS(+)載體的EcoRV位點?？傆孟拗菩悦盖泻虳NA測序來證實擴增的cDNA片段。
3.用噬菌粒載體和M13KO7輔助噬菌體來構(gòu)建大環(huán)狀核酸分子(1)構(gòu)建含有有義或反義序列的單鏈噬菌體基因組根據(jù)標準的克隆程序構(gòu)建含有特異性針對靶基因的反義區(qū)的大環(huán)狀核酸分子(Sambrook等，Molecular Cloning，1989)。含有pBS-KS(+)或(-)噬菌粒以及適當?shù)腸DNA的感受態(tài)細菌細胞(XL-1 Blue MRF′)用輔助噬菌體M13K07(NEB Nucleic Acids，USA)感染。在噬菌粒載體中克隆的cDNA的方向決定著是有義還是反義序列。輔助噬菌體感染的細胞生長在2X YT中過夜培養(yǎng)，20％聚乙二醇(PEG 8000)加入到上清液中。噬菌體沉淀在TE(pH8.0)中重新懸浮，噬菌體基因組DNA用苯酚抽提和乙醇沉淀分離。
(2)噬菌體基因組反義分子的純化從輔助噬菌體殘余的基因組DNA和宿主細菌中純化噬菌體基因組反義分子，或者用0.8％低熔點(LMP)瓊脂糖凝膠中進行小規(guī)模純化，或者用凝膠過濾柱層析(1.0×50cm)進行大規(guī)模純化。用于凝膠過濾的柱樹脂為超細SephacrylTMS-1000(截留分子量20,000bp)(Amersham Pharmacia Biotech AB，Sweden)，并用含有0.2M NaCl(pH8.3)的50mM Tris-HCl緩沖液來包裝和平衡。反義分子的起始體積調(diào)整為凝膠外水體積的5％并且用與平衡樹脂相同的緩沖液來進行DNA洗脫(流速為0.3ml/min)。用雙波長UV檢測系統(tǒng)在260/280nm對樣品進行UV掃描并在洗脫過程中每隔5分鐘收集樣品。清洗樣品級分并用70％的冰乙醇沉淀然后重懸于蒸餾的超純水和PBS(磷酸鹽緩沖液)中來進行后續(xù)的試驗。在1％瓊脂糖凝膠中檢測純化的反義分子的數(shù)量和純度。用克隆到pBS-KS(+)的TNF-αcDNA片段構(gòu)建對照有義分子，其方向與載體中l(wèi)acZ基因的方向相反。通過用T7引物測序來證實有義或反義的單鏈分子序列的完整性。DNA測序用自動化DNA測序儀進行。
4.噬菌體基因組環(huán)狀反義分子的結(jié)構(gòu)分析和穩(wěn)定性檢測按照下述方式檢測反義分子為單鏈、環(huán)狀和穩(wěn)定的事實。編碼TNF-α基因的反義分子(1μg)用XhoI(10U/μg DNA)、核酸外切酶III(160U/μg DNA)或S1核酸酶(10U/μg DNA)在37℃處理3小時，并用苯酚抽提，乙醇沉淀，并在1％的瓊脂糖凝膠中電泳來研究它們的穩(wěn)定性和酶切模式。
對于穩(wěn)定性檢測，單獨檢測1μg的反義分子或在其與脂質(zhì)體以DNA脂質(zhì)體約為1∶3(w/w)的比率形成混合物來檢測。沒有熱滅活的30％FBS溶液加入到反義-脂質(zhì)體復合物中并在37℃溫育不同的時間直到48小時。在用FBS和核酸酶溫育后，反義DNA用氯仿抽提并用乙醇沉淀，然后用1％瓊脂糖凝膠電泳。
環(huán)狀反義分子(TNF-α反義)和雙鏈質(zhì)粒DNA(包含TNF-αcDNA片段的噬菌粒pBS-KS(-))的熱變性在100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM鈉鹽PIPES(Sigma，USA)的溶液中進行。10μg/ml(10nM)的DNA加熱到95℃并在變性試驗前緩慢的冷卻到室溫。溫度以0.5℃/3分鐘的速率上升。在裝備有珀耳帖溫度控制器的二極管陣列分光光度計(Hewlett Packard，USA)。上進行熔化研究。
5.靶基因轉(zhuǎn)錄的檢測(1)反義分子與脂質(zhì)體復合物的轉(zhuǎn)染陽離子脂質(zhì)體，如LipofectamineTM，Lipofectamine 2000TM或Lipofectamine PlusTM(Life Technologies，USA)與反義分子或有義對照分子混合。這些脂質(zhì)體-DNA復合體與OPTI-MEM(Life Technologies，USA)混合，并根據(jù)生產(chǎn)商提示的方案加入到細胞中。按照如下方式進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)在補加有10％FBS的PRMI 1640或EMEM中并在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染前30分鐘用OPTI-MEM洗兩次。細胞在200μl培養(yǎng)基中接種于48-孔板(1×105細胞/孔)。反義分子與陽離子脂質(zhì)體以約1∶3(w/w)的比率混合并加入到細胞中進行轉(zhuǎn)染。細胞在沒有血清的培養(yǎng)基中37℃溫育6小時。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，2X FBS和抗生素加入到培養(yǎng)基中并于37℃進一步溫育18小時。大鼠TNF-α的表達用LPS(30μg/ml)誘導。細胞用于制備RNA，用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)培養(yǎng)上清液中是否存在IL-10。
(2)用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄根據(jù)生產(chǎn)商推薦的試驗程序采用Tri reagentTM(MRC，USA)制備RNA。從每個孔中收集的細胞和1ml Tri Reagent和200μl氯仿混合用于RNA純化。純化的RNA在50μl反應體積中用AccessTMRT-PCR試劑盒(Promega，USA)進行RT-PCR。在PCR管中加入純化RNA、一對引物(表2)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/μl)、Tfl DNA聚合酶(5U/μl)、dNTP(10mM，1μl)和MgSO4(25mM，2.5μl)。反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈式反應在熱循環(huán)儀(Hybaid，UK)上連續(xù)進行。第一條鏈cDNA的合成在48℃進行45分鐘，隨后通過30個重復的循環(huán)進行DNA擴增，在94℃30秒(變性)，59℃ for 1分鐘(退火)，68℃2分鐘(聚合)。在1％瓊脂糖凝膠上證實PCR產(chǎn)物，用AlphaImager 1220-凝膠記錄設備(AlphaInno-Tech corporation，USA)對擴增的DNA進行定量分析。
(3)Southern印跡用ECL(化學發(fā)光增強劑)標記寡核苷酸以及檢測系統(tǒng)(AmershamLife Science，UK)制備用于Southern雜交的探針。RT-PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠電泳并轉(zhuǎn)到在0.4M NaOH溶液中的尼龍膜上。用于TNF-α的寡核苷酸探針為22多聚體5’-GATGAGAGGGAGCCCATTTGGG-3’(SEQ ID NO3)，對于NF-κB的寡核苷酸探針為25多聚體5’-CTTCCAGTGCCCCCTCCTCCACCGC-3’(SEQ ID NO4)。
100pmol的寡核苷酸探針與熒光素-11-dUTP、二甲胂酸鹽緩沖液和末端轉(zhuǎn)移酶混合，在37℃溫育70分鐘來進行ECL標記。探針與轉(zhuǎn)移有DNA的尼龍膜在6ml的雜交緩沖液(5 X SSC、0.02％SDS、液體封閉(liquid block))中于42℃雜交14小時。尼龍膜用含有0.1％SDS的5XSSC中清洗兩次和用含0.1％SDS的1XSSC中清洗一次，每次清洗45℃15分鐘。膜與結(jié)合有HRP抗熒光素的抗體一起溫育30分鐘，隨后在暴露于X-射線膠片前用ECL檢測試劑溫育約5分鐘。
(4)用ELISA或Western印跡檢測多肽在反義處理后用ELISA或Western印跡方法對靶蛋白進行定量分析。對于ELISA檢測，細胞培養(yǎng)上清液稀釋50倍并加入到包被有抗TNF-α抗體的ELISA板中。將抗TNF-α生物素?；亩壙贵w加入到ELISA板的各孔中并在室溫下溫育90分鐘。清洗三次后，加入鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶并溫育45分鐘。板洗四次以除去沒結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶，然后加入色原。溫育20分鐘顯色后，在450nm測量其光密度。
進行Western印跡來檢測CDK2的存在。在細胞用有義或反義DNA處理后用BCATM蛋白分析試劑盒(Pierce，USA)來測定全部蛋白的量。20μg蛋白樣品加到12％聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳后，蛋白被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Bio-Rad，USA)。用含有3％脫脂牛奶和0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖液溫育膜來封閉。然后膜與兔抗人CDK2的多克隆IgG抗體(Santa Cruz biotechnology，USA)溫育。連接有辣根過氧化酶的驢抗兔IgG的二級抗體(Amersham Life science，Sweden)加入，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色。
(5)MTT檢驗用于檢測細胞生長抑制用MTT檢驗研究反義分子對c-myb、k-ras和cdk2的生長抑制作用。MTT試劑為3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-苯基-四唑鎓溴化物(Sigma，USA)。用OPTI-MEM將K562、HL-60、HeLa和MCF-7細胞清洗兩遍并以6×104細胞/ml的細胞密度在96孔板的各孔中接種50μl體積。Lipofectamine 2000或Lipofectamine Plus(Life Technologies，USA)以約1∶3(w/w)的比率與反義分子混合用于細胞吸收。細胞和反義-脂質(zhì)體復合體在含有10％FBS(HyClone，USA)的OPTI-MEM中溫育5小時并于37℃在CO2(5％)培養(yǎng)箱中維持5天。
MTT試劑用PBS稀釋到5μg/ml的濃度，100mg MTT試劑加入到含有100μl培養(yǎng)基的每孔中。細胞于37℃在CO2(5％)培養(yǎng)箱中維持4小時并用等量的異丙醇(含有0.1N HCl)在室溫下處理1小時。然后用ELISA讀數(shù)儀，SpectraMAX 190(Molecular devices，USA)在570nm測定吸光度。實施例2-試驗方法和結(jié)果1.用重組M13噬菌體系統(tǒng)構(gòu)建大環(huán)狀核酸化合物進行試驗以檢測M13噬菌體的環(huán)狀噬菌體基因組是否能容納反義序列作為其基因組的一部分，以及這些新的反義分子能否克服和反義寡核苷酸合成形式相關的問題。通過M13K07輔助噬菌體感染已經(jīng)轉(zhuǎn)化有pBluescript KS(-)噬菌粒的細菌細胞來生產(chǎn)重組的M13噬菌體(Jupin等，Nucleic Acid Res.，23，535-536(1995))。我們利用噬菌粒的Fl起始子來產(chǎn)生含有對于靶基因反義或有義序列的單鏈環(huán)狀噬菌體基因組。在編碼大鼠TNFα基因的情況下，基因的全長cDNA安放到pBluescript KS(-)載體中來產(chǎn)生反義序列(圖1)。采用T7測序引物通過DNA測序來證實單鏈基因組DNA中的反義序列(圖2)。在TNF-α反義插入的5’和3’側(cè)翼序列表明為噬菌粒載體的序列。插入序列相應于TNF-αmRNA序列表明反義序列的存在。含有對TNF-α、NF-kB、c-myb、c-myc、k-ras和cdk2的反義序列的環(huán)狀噬菌體基因組被分別命名為TNFα-M13AS、NFκB-M13AS、c-myb-M13AS、c-myc-M13AS、k-ras-M13AS和cdk2-M13AS。
2.噬菌體基因組反義DNA的柱層析純化在用M13K07輔助噬菌體感染已經(jīng)由含大鼠TNF-αcDNA的重組噬菌粒轉(zhuǎn)化的細菌細胞后，分離TNFα-M13AS。當用噬菌粒系統(tǒng)生產(chǎn)具有反義序列的噬菌體基因組DNA時，單鏈DNA可能會被少量的M13噬菌體的雙鏈復制形式和/或來自輔助噬菌體的野生型單鏈基因組DNA所污染。而且，反義制劑發(fā)現(xiàn)含有高水平的污染的脂多糖(LPS)，LPS能夠顯著降低轉(zhuǎn)染效率并影響細胞的增殖(數(shù)據(jù)沒有顯示)。用瓊脂糖凝膠純化方法可以少量分離含有反義序列的噬菌體基因組DNA。
凝膠過濾柱層析檢測用來大規(guī)模純化環(huán)狀噬菌體基因組反義DNA。Sephacryl S-1000超細凝膠用50mM Tris-HCl緩沖液(pH8.3，0.2M NaCl)平衡并裝入反義樣品(膠體積的5％)。當柱用與平衡緩沖液相同的洗脫緩沖液洗脫時，在75到120分鐘的保留時間段得到主洗脫峰(圖3A)。峰分為7個級分，每個級分的保留時間為5或10分鐘，從級分I到級分VII。每個洗脫級分加入到1％瓊脂糖凝膠來證實反義鏈的純化質(zhì)量(圖3B)。在級分III中發(fā)現(xiàn)野生型的M13噬菌體DNA作為主要條帶(保留時間75分鐘)。級分IV包含大環(huán)狀反義分子作為主要條帶(保留時間80分鐘)?？缭奖Ａ魰r間為80到110分鐘的級分被收集并用乙醇沉淀。然后用70％的冰乙醇來洗滌反義沉淀物并用蒸餾水重新懸浮用于進一步試驗。大環(huán)狀反義鏈以回收率60％獲得，反義分子的光密度在260/280比率時超過1.8。當用LAL檢驗測定LPS時，反義分子基本沒有LPS的污染，表明通過層析純化有效的除去了污染物。
3.噬菌體基因組DNA的結(jié)構(gòu)分析和穩(wěn)定性檢測檢測TNFα-M13AS的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和其對核酸酶的穩(wěn)定性。反義分子由于其封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，預期具有對核酸外切酶的穩(wěn)定性。當TNFα-M13AS和核酸內(nèi)切酶XhoI和外切酶III一起溫育時，發(fā)現(xiàn)反義分子至少在和核酸酶溫育3小時后大部分仍保持完整。與之相反，當XhoI加入到重組M13噬菌體DNA的雙鏈復制形式中時，如同預期的一樣，DNA被限制性酶和核酸外切酶III完全降解。通過用S1核酸酶對反義分子的完全消化證實了TNFα-M13AS為單鏈環(huán)狀分子的事實(圖4A)。
由于在與血清溫育后大部分仍能夠保持其結(jié)構(gòu)完整性，發(fā)現(xiàn)噬菌體基因組反義分子具有穩(wěn)定性。當TNFα-M13AS與陽離子脂質(zhì)體相結(jié)合時，在與胎牛血清(FBS)進行長時間溫育后大部分反義分子能夠保持其完整性。實際上，即使與30％FBS一起溫育超過24小時后TNFα-M13AS仍然保持完整。結(jié)果表明通過與脂質(zhì)體形成復合物，噬菌體基因組反義分子在體內(nèi)應用中可進一步穩(wěn)定(圖4B)。
通過測量熔解溫度(Tm1/2)測定了單鏈TNFα-M13AS和含有TNF-α插入的雙鏈噬菌粒DNA的結(jié)構(gòu)差異。當溫度逐漸升高時檢測雙鏈噬菌粒DNA在260nm的吸收值，在約87℃時檢測到典型的染色質(zhì)變化。但是，當檢測噬菌體基因組反義分子的熔解溫度時，在約54℃檢測到中度斜率的染色質(zhì)變化，這表明帶有短分子內(nèi)雙鏈體區(qū)域變性(圖5)。這些結(jié)果證實了TNFα-M13AS為單鏈環(huán)狀分子。
4.通過TNFα-M13AS有效和特異性的消除大鼠TNF-αmRNA檢測TNFα-M13AS的反義活性。TNFα-M13AS包含一段長的反義序列，其包括非特異性的反義噬菌粒載體序列和特異于大鼠TNFαmRNA的反義區(qū)。噬菌體基因組反義分子具有大量非特異性序列的事實對于全面分析反義活性的靶特異性是必要的。為了測定噬菌體基因組反義分子是否特異性地消除靶基因表達，多個對照基因用于比較mRNA的消除水平。
為檢測TNFα-M13AS的特異性活性，0.5μg(1.4nM)的反義分子與1.5μg的陽離子脂質(zhì)體形成復合體并加入到1×105個細胞的單核細胞系WRT7/P2中。然后細胞用LPS處理來誘導TNF-α的表達。當細胞用TNFα-M13AS處理時，TNF-αmRNA的誘導水平顯著降低。相反的，當細胞用TNFα-M13SE(TNF-α的有義鏈)或M13SS(沒有反義插入的單鏈噬菌體基因組)處理時，并沒有表現(xiàn)TNF-αmRNA的大量減少(圖6A)。用能夠結(jié)合擴增的DNA片段中部的探針通過Southern雜交證實了TNF-α的RT-PCR條帶(圖6B)。
TNFα-M13AS包含大鼠TNF-α反義序列以及β-半乳糖酶(LacZ)和內(nèi)酰胺酶(Amp)基因的反義序列，為全長3.7kb的單鏈環(huán)狀基因組。TNF-α特異性的反義部分約708堿基長。因此與常規(guī)合成的20或30個核苷酸反義分子相比TNFα-M13AS中的TNF-α特異性反義序列非常長。這是非常重要的，因為在此技術領域中通常認為隨著反義分子的延長，其序列的特異性下降。進一步的確證試驗表明TNFα-M13AS的反義活性確實是序列特異性的。
為表明序列特異性的反義活性，在TNFα-M13AS的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后檢測三種不同的基因的mRNA水平。其為β-肌動蛋白、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)和IL-1β(白介素-1β)。這些基因的表達不受TNFα-M13AS的脂質(zhì)體感染的影響(Fig.6A，C)。
同時檢測了TNFα-M13AS反義活性的劑量依賴性。當TNFα-M13AS以0.01μg(0.03nM)的濃度使用時，TNF-α的表達只有輕微的降低。當濃度為0.05μg(0.14nM)時，TNF-α的表達被部分消除。當TNFα-M13AS的量達到0.1μg(0.28nM)時，發(fā)現(xiàn)TNF-αmRNA完全消除(圖6D)。這些結(jié)果表明TNFα-M13AS能以比常規(guī)使用的反義分子小得多的量有效的消除靶mRNA。
5.通過噬菌體基因組反義分子特異性的消除NF-κB、c-myc、c-myb、k-ras和cdk2基因的mRNA表達觀察TNFα-M13AS的有效性，進行試驗檢測特異性的針對其它基因的噬菌體基因組反義復合物能否阻斷這些基因的表達，如NF-κB、c-myc、c-myb、k-ras和cdk2。對NF-κB(NFκB-M13AS)的反義復合物生產(chǎn)出來并在THP-1細胞中檢測其有效的反義活性。NFκB-M13AS也和脂質(zhì)體形成復合體并以增加量加入到細胞中。當0.05μg(0.14nM)的NFkB-M13AS加入到THP-1中時，NF-кB mRNA降低約70％。當NFκB-M13AS的量增加到0.1μg(0.28nM)和到0.2μg(0.56nM)時，NF-κB mRNA消除超過90％。相反的，細胞用NFκB-M13SE(具有NFκB有義序列的噬菌體基因組DNA)或M13SS處理，NF-κB的表達不受太大影響(圖7A)。通過Southern雜交進一步證實NF-κB的PCR擴增條帶(圖7B)。
當0.4μg(1.12nM)的c-myc-M13AS加入到K562細胞中時，c-mycmRNA降低約80％。相反的，在用c-myc-M13SE或M13SS處理的K562細胞中，c-myc的表達基本不受影響(圖8A)。當0.2μg(0.56nM)和0.4μg(1.12nM)的c-myb-M13AS加入到HL-60細胞中時，與c-myb-M13SE相比c-myb mRNA降低了約70％。相反的，在用c-myb-M13SE處理的HL-60細胞中，c-myb表達基本上不受影響(圖8B)。
當0.3μg(0.84nM)的k-ras-M13AS加入到HeLa細胞中時，k-rasmRNA降低了約80％。相反的，在用k-ras-M13SE或M13SS處理的HeLa細胞中，k-ras的表達沒有太大影響(圖8C)。
最后，當用0.1μg(0.28nM)和0.2μg(0.56nM)的cdk2-M13AS加入到HeLa細胞中時，與cdk2-M13SE相比，cdk2 mRNA水平分別降低了約70％和75％。當cdk2-M13AS的量增加到0.3μg(0.84nM)時，內(nèi)源性的cdk2 mRNA水平消除超過90％。相反的，在用cdk2-M13SE處理的HeLa細胞中，cdk2的表達基本上不受影響(圖8D)。
6.TNF-α和CDK2活性的降低當靶基因的mRNA通過反義方法消除后，不能產(chǎn)生mRNA的翻譯產(chǎn)物。證實靶基因蛋白的降低或消除對支持由反義分子導致的生物作用是必要的。在用反義分子處理細胞后用兩種不同的方法檢測蛋白水平。
WRT7/P2細胞用TNFα-M13AS進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，用ELISA分析測定轉(zhuǎn)染子中分泌的TNF-α。與內(nèi)源性TNF-αmRNA降低的水平相似，在施用TNFα-M13AS后細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α蛋白也降低超過90％(圖9A)。但是，對照的反義分子TNFα-M13SE(含有TNF-α基因的有義鏈)或M13SS都不會降低WRT7/P2轉(zhuǎn)染子的TNF-α表達。這些結(jié)果表明TNFα-M13AS對于TNF-αmRNA的消除和隨后轉(zhuǎn)染子中TNF-α的消失都是有效的。
用Western印跡檢查轉(zhuǎn)染有cdk2-M13AS的轉(zhuǎn)染子的CDK2水平。HeLa細胞用cdk2-M13AS或cdk2-M13SE處理，轉(zhuǎn)染后48小時用于抽提總細胞蛋白。分離的蛋白標準化用于定量并用Western印跡技術檢驗。當cdk2-M13AS濃度達到0.8nM(0.3μg/孔)，CDK2水平降低超過70％，而cdk2-M13SE對蛋白細胞水平?jīng)]有作用(圖9B)。這些結(jié)果表明這種噬菌體基因組反義分子能夠有效的特異性消除靶mRNA，并導致轉(zhuǎn)染子中靶蛋白的消失。
7.用噬菌體基因組反義方法對癌細胞的生長抑制癌基因涉及腫瘤轉(zhuǎn)化和癌細胞的發(fā)展。由于癌基因是反義介入的良好靶子，檢測了幾種腫瘤細胞系以測定如果兩個重要的癌基因c-myb和k-ras的表達由特異于這些基因的噬菌體基因組反義分子所特異性阻斷，腫瘤細胞生長抑制能否發(fā)生。此外，因為對施用cdk2-M13AS的反應阻斷了cdk2基因表達，也檢測了其對腫瘤細胞生長的抑制作用。
k-ras的噬菌體基因組反義分子加入到MCF-7(乳腺癌)細胞系中；c-myb反義分子加入到K562(慢性髓性白血病)或HL-60(急性原發(fā)性白血病)細胞系；以及cdk2的反義分子加入到HeLa(子宮頸癌)細胞系。用MTT檢驗法檢測對每一個這些反義復合物的反義轉(zhuǎn)化子用于抑制腫瘤細胞生長(圖10和11)。
當k-ras(k-ras-M13AS)的噬菌體基因組反義分子加入到MCF-7細胞中時，在反義濃度為0.1μg(0.5nM)和0.2μg(1nM)時轉(zhuǎn)染子表現(xiàn)出超過70％抑制細胞生長。相反，k-ras-M13SE(Ras基因的有義對照)只表現(xiàn)了對于細胞生長微弱的抑制，在反義濃度為0.5nM時少于約9％的抑制，在濃度為1nM時少于約15％的抑制(圖10A)。
當HeLa細胞用濃度為2nM的cdk2-M13AS處理時，觀察到70％以上的生長抑制。相反，cdk2-M13SE(cdk2基因的有義對照)表現(xiàn)出對轉(zhuǎn)染的HeLa細胞不到30％的抑制(圖10B)。
構(gòu)建兩種不同長度的c-myb反義分子，0.5kb(c-myb-M13AS1)和1.5kb(k-myb-M13AS2)。當白血病細胞系，K562和HL-60用c-myb-M13AS1或c-myb-M13AS2處理后，這些細胞系被觀察到具有相似的超過約60％的生長抑制(圖11)。相反，c-myb-M13SE(對照有義分子)基本上不表現(xiàn)出K562和HL-60細胞生長抑制。
所有在此引用文獻都以其全文引作參考。
*****那些本領域的普通技術人員無需采用比常規(guī)試驗更復雜的試驗就能夠認識到或確定許多與具體在此描述的本發(fā)明的具體實施方案的相等物。這些相等物包含在本權(quán)利要求書所涵蓋的范圍中。
表1.克隆引物和大小表引物 序列克隆大小(bp)c-myb1 5′5′-ggcggcagcgccctgccgacgcc-3′(SEQ ID NO5) 5023′5′-cattgttttccaattctcccct-3′(SEQ ID NO6)c-myb2 5′5′-cggcggagccccgccgcccgccgc-3′(SEQ ID NO7) 15603′5′-tgaaactcagcaacaaatccag-3′(SEQ ID NO8)c-myc 5′5′-ggagaacttctaccagca-3′(SEQ ID NO9)9783′5′-gacattctcctcggtgtccgaggac-3′(SEQ ID NO10)k-ras 5′ 5′-cggactgggagcgagcgcggcgcag-3′(SEQ ID NO11) 7613′ 5′-gaaaaaaattaggtaatgctaaaa-3′(SEQ ID NO12)cdk25′ 5′-atggctacctctcgatatga-3′(SEQ ID NO13) 9113′ 5′-cactccggattaccttcat-3′(SEQ ID NO14)NFκB 5′5′-gatcgtcgacgcgccacccggcttcagaatggc-3′(SEQ ID NO15)7003′5′-gatcgaattcggtgaagctgccagtgctatccg-3′(SEQ ID NO16)表2.RT-PCR引物表基因 引物 序列TNF-α5′引物5′-catctccctccggaaaggacac-3′(SEQ ID NO17)3′引物 5′-cggatgaacacgccagtcgc-3′(SEQ ID NO18)NFκB 5′引物 5′-cctggccggagccactagac-3′(SEQ ID NO19)3′引物 5′-ctatactcagatccatcacc-3′(SEQ ID NO20)c-myc 5′引物5′-ccagcagcctcccgcgacgatg-3′(SEQ ID NO21)3′引物5′-gaggggtcgatgcactctgagg-3′(SEQ ID NO22)c-myb 5′引物5′-gctaccaacacagaaccacac-3′(SEQ ID NO23)3′引物5′-tgaaactcagcaacaaatccag-3′(SEQ ID NO24)k-ras 5′引物 5′-ctcccggcccccgccatttc-3′(SEQ ID NO25)3′引物5′-ctctgggaatactggcacttcg-3′(SEQ ID NO26)cdk2 5′引物5′-ctgacccgactcgctggcgc-3′(SEQ ID NO27)3′引物5′-ggagagggtgagattagggc-3′(SEQ ID NO28)
序列表<110>偉進株式會社(Welgene Inc.)<120>大環(huán)狀靶特異性反義核酸化合物(Large Circular Target-specific AntisenseNucleic Acid Compounds)<130><150>PCT/KR01/01730<151>2001-10-13<150>KR2001-12061<151>2001-03-08<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>1gatcgtcgac gatgagcaca gaaagcatga tcc 33<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>2gatcgaattc gtcacagagc aatgactcca aag 33<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>3gatgagaggg agcccatttg gg 22<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>4cttccagtgc cccctcctcc accgc 25<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>5ggcggcagcg ccctgccgac gcc23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>6cattgttttc caattctccc ct 22<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>7cggcggagcc ccgccgcccg ccgc 24<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>8tgaaactcag caacaaatcc ag 22<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>9ggagaacttc taccagca 18<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>10gacattctcc tcggtgtccg aggac 25<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>11cggactggga gcgagcgcgg cgcag 25<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>12gaaaaaaatt aggtaatgct aaaa 24<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>13atggctacct ctcgatatga20<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>14cactccggat taccttcat 19<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>15gatcgtcgac gcgccacccg gcttcagaat ggc 33<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>16gatcgaattc ggtgaagctg ccagtgctat ccg 33<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>17catctccctc cggaaaggac ac 22<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>18cggatgaaca cgccagtcgc20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>19cctggccgga gccactagac20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>20ctatactcag atccatcacc20<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>21ccagcagcct cccgcgacga tg 22<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>22gaggggtcga tgcactctga gg 22<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>23gctaccaaca cagaaccaca c 21<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>24tgaaactcag caacaaatcc ag 22<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>25ctcccggccc ccgccatttc20<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>26ctctgggaat actggcactt cg 22<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>27ctgacccgac tcgctggcgc20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>28ggagagggtg agattagggc20<210>29<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列合成引物<400>29ccccctcgag gtcgacgatg agcacagaaa gcatgatccg agatgtggaa ctggcagagg60aggcgctccc ca7權(quán)利要求
1.一種包含靶特異性反義區(qū)的大環(huán)狀核酸分子，其特異性地與一種基因表達的RNA的一部分相結(jié)合，其中所述的反義分子能夠有效地降低所述基因的表達。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的大環(huán)狀核酸分子，其中所述的分子至少為約3,000個核苷酸長度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的大環(huán)狀核酸分子，其中所述分子的反義區(qū)至少為約50個核苷酸的長度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的大環(huán)狀核酸分子，其中所述的反義區(qū)基本上與整個基因序列互補。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的大環(huán)狀核酸分子，其中所述的核酸分子為重組噬菌體或噬菌粒基因組的單鏈形式。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的大環(huán)狀核酸分子，其中所述的噬菌體或噬菌粒來源于絲狀噬菌體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的大環(huán)狀核酸分子，其中所述的絲狀噬菌體為噬菌體M13。
8.一種重組載體，其包含權(quán)利要求1的大環(huán)狀核酸分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，其中所述的載體來源于絲狀噬菌體。
10.一種宿主細胞，其包含權(quán)利要求8的載體。
11.一種組合物，其包括含有靶特異性的反義區(qū)的大環(huán)狀核酸分子和其可藥用載體，所述大環(huán)狀核酸分子特異性地與基因所表達的RNA的一部分相結(jié)合，其中所述的反義分子能夠有效的降低所述基因的表達。
12.通過靶向編碼選定蛋白的RNA的大環(huán)狀核酸分子來抑制選定蛋白表達的方法，包括使所述核酸分子靶向RNA使得核酸分子與RNA雜交并與RNA形成雙鏈體，其中所形成的雙鏈體抑制選定蛋白的表達。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述靶蛋白的表達導致細胞增殖或癌癥。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的癌癥為白血病、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、腦癌或者前列腺癌。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的癌癥為白血病、子宮頸癌或乳腺癌。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的靶蛋白為腫瘤壞死因子、核因子、MYB、MYC、RAS或細胞分裂激酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述的蛋白為病毒蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的病毒為皰疹病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、HIV、天花病毒、單核細胞增多癥病毒(EB病毒)、肝炎病毒或呼吸道合胞病毒(RSV)。
19.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述靶蛋白的表達導致了代謝性疾病或免疫失調(diào)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的代謝性疾病為苯丙酮尿癥(PKU)、原發(fā)性甲狀腺機能減退、半乳血糖癥、血色素異常、I型和II型糖尿病或肥胖癥。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述的免疫失調(diào)為斯耶格倫綜合征、抗磷脂綜合征、免疫復合物疾病、紫癜、舍恩萊因-亨諾赫、免疫缺陷綜合征、全身性紅斑狼瘡、免疫缺陷、風濕病、腎或肝硬化。
22.嵌合大環(huán)狀核酸分子，其包含靶特異性反義區(qū)，該反義區(qū)特異性地與多個靶基因表達的多個靶RNA結(jié)合，其中所述的核酸分子能夠有效地降低所述基因的表達。
23.一種組合物，其包括含有靶特異性反義區(qū)的嵌合的大環(huán)狀核酸分子及可藥用載體，所述反義區(qū)特異性地與多個靶基因表達的多個靶RNA結(jié)合，其中所述的核酸分子能夠有效地降低所述基因的表達。
24.一種通過靶向于編碼多個選定蛋白的多個RNA分子的大環(huán)狀核酸分子來抑制多個選定蛋白表達的方法，其包括(i)產(chǎn)生一種包含靶向所述多個靶RNA的靶特異性反義區(qū)的嵌合大環(huán)狀核酸分子；和(ii)靶向多個RNA使得嵌合大環(huán)狀核酸分子與所述的RNA雜交形成雙鏈體，其中所形成的雙鏈體降低多個選定蛋白的表達。
25.一種抑制細胞增殖的方法，其包括給所述細胞施用大環(huán)狀核酸分子，該分子包括一個或多個基本上與一個或多個靶基因互補的反義區(qū)，其中通過抑制所述基因的表達來抑制細胞增殖。
26.一種產(chǎn)生包含靶特異性反義區(qū)的大環(huán)狀核酸分子的方法，所述反義區(qū)抑制選定蛋白的表達，該方法包括(i)將目的靶特異性DNA插入到噬菌體或噬菌?；蚪M中；(ii)使噬菌體產(chǎn)生單鏈形式，其為大環(huán)狀核酸分子；和(iii)通過凝膠過濾柱分離所述的大環(huán)狀核酸分子。
27.一種篩選基因功能的方法，包括(a)產(chǎn)生包含與細胞中所表達的RNA基本上互補的反義區(qū)的大環(huán)狀核酸分子；(b)使大環(huán)狀核酸分子接觸細胞以使得反義分子進入細胞并與細胞表達的RNA雜交從而抑制其基因產(chǎn)物的表達；和(c)檢測細胞表型的變化。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中將步驟(a)到(c)應用于所述大環(huán)狀核酸分子的文庫。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述核酸分子為重組噬菌體或噬菌?；蚪M的單鏈形式。
全文摘要
本申請描述了一種能夠有效消除RNA和蛋白質(zhì)表達的大環(huán)狀靶特異性反義分子。大環(huán)狀反義分子用來治療任何人類疾病,在該疾病中基因表達調(diào)節(jié)能有益于干涉疾病的開始和發(fā)展。
文檔編號A61P31/12GK1374316SQ02107110
公開日2002年10月16日 申請日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月8日
發(fā)明者樸鐘九, 許嬪 申請人:偉進株式會社