專利名稱：新型慢性乙肝治療性dna疫苗的制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及乙型肝炎及肝癌的預(yù)防與治療。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的慢性乙肝治療性DNA疫苗的制備及用途，及含有該疫苗的藥物組合物。
國內(nèi)外常用的乙肝治療方法，有藥物治療、免疫治療和肝移植，干擾素仍是唯一被認(rèn)可對(duì)慢性乙肝具有療效的抗病毒藥物，目前也僅有20-40％的近期療效。研究表明干擾素雖然對(duì)于前C區(qū)變異的HbeAg陰性患者有一定的療效，延長(zhǎng)治療可維持療效，但治療中斷即會(huì)引起復(fù)發(fā)?？笻be陽性的慢性乙肝患者經(jīng)干擾素6個(gè)月的治療后，70％的患者病毒被抑制至血清未檢出的水平，但療效持續(xù)短暫，停藥后90％的患者病毒重新復(fù)制，單一干擾素的治療對(duì)于ALT正常或接近正常的患者其長(zhǎng)期療效也不佳。
乙肝疫苗的研究現(xiàn)狀(1)血源性疫苗從1975年開始研究人員一直在尋找有效的抗乙型肝炎的疫苗。最早的HBV疫苗是從慢性肝炎病人血漿中純化的22nm亞病毒，給人注射后有保護(hù)作用，但一方面成本高，另一方面來源不足，難以滿足需要，還需要逐個(gè)在黑猩猩中做安全試驗(yàn)，而且還有感染愛滋病病毒的危險(xiǎn)，故實(shí)用價(jià)值不大。
(2)重組抗原疫苗后來發(fā)展的有實(shí)用價(jià)值的疫苗主要為重組亞單位蛋白疫苗，包括在酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的乙肝病毒表面抗原S蛋白(主要蛋白)疫苗；以及在CHO細(xì)胞表達(dá)的S蛋白(S protein)和M蛋白(M protein)疫苗，這種疫苗經(jīng)過了糖基化，已經(jīng)取得一定的效果。
無論血漿來源的亞病毒顆粒疫苗還是重組的亞單位疫苗，盡管具有一定的預(yù)防作用，但是對(duì)于乙肝慢性患者而言治療是最關(guān)鍵的，該類疫苗治療性療效差，成本高是其明顯的缺點(diǎn)。而且由于制備過程相對(duì)復(fù)雜，成本偏高是不可避免的結(jié)果。這樣限制了這些疫苗在發(fā)展中國家特別是貧困地方的廣泛使用，而這些地方恰恰正是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)。
除了成本高的缺點(diǎn)外，此類疫苗一般要求冷藏保存及運(yùn)輸，這給疫苗的應(yīng)用帶來不便。而且疫苗免疫2-3次才能達(dá)到保護(hù)作用，在實(shí)際免疫時(shí)會(huì)有一些不便。在乙型肝炎的流行區(qū)，為了阻斷母嬰垂直傳播需要在出生幾天內(nèi)注射乙肝疫苗，但其他疫苗如百日咳、白喉、破傷風(fēng)疫苗為避免母體抗體的干擾必須稍后使用，這樣相應(yīng)增加了免疫的次數(shù)和費(fèi)用。
對(duì)于已經(jīng)罹患乙型肝炎的病人而言，最大的問題是治療，而不是預(yù)防，但目前治療效果最好的INF-的治療效果也不盡人意，開發(fā)新的治療手段十分必要。需要研制一種安全、有效、價(jià)廉、使用方便的新疫苗，以適應(yīng)世界范圍內(nèi)的需要。
根據(jù)目前不同動(dòng)物模型試驗(yàn)的結(jié)果來看，DNA疫苗可能能夠達(dá)到這一要求，而且能夠克服其他疫苗的免疫低反應(yīng)和不反應(yīng)問題，接種后對(duì)已患乙型肝炎的病人也有一定的治療作用DNA疫苗是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到機(jī)體內(nèi)，使外源基因在體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。一方面，DNA疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)后，被抗原提呈細(xì)胞(APC)攝取，表達(dá)的蛋白質(zhì)被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體復(fù)合物降解為8～10個(gè)氨基酸多肽，多肽被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔上的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)運(yùn)送進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在那里與MHC-I類分子及β2-微球蛋白形成三聚體，三聚體移出細(xì)胞并定位在細(xì)胞膜上，從而誘導(dǎo)MHC-I限制的抗原特異性的CTL，產(chǎn)生細(xì)胞免疫；另一方面，胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)通過分泌或細(xì)胞裂解釋放入血，并被專職APC內(nèi)吞，在內(nèi)體中被降解為12～18個(gè)氨基酸的多肽，與此同時(shí)，胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的MHC-II類分子(含α，β，γ三鏈)也被高爾基體運(yùn)至內(nèi)體，在內(nèi)體中，γ鏈被降解，剩余的MHC-II類分子的α，β鏈與抗原肽結(jié)合成抗原肽-II類分子復(fù)合物而提呈于APC表面，成為CD4+Th細(xì)胞免疫監(jiān)視的靶位，Th細(xì)胞分泌淋巴因子，刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)了抗原特異性的體液免疫應(yīng)答。
DNA疫苗不僅能全面誘導(dǎo)機(jī)體體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且能夠誘發(fā)局部的免疫應(yīng)答和免疫記憶。如果用基因槍將包裹有DNA疫苗的金顆粒導(dǎo)入粘膜下，即可能被粘膜下豐富的粘膜相關(guān)淋巴組織中的淋巴細(xì)胞或粘膜上皮細(xì)胞攝取并表達(dá)，產(chǎn)生的抗原蛋白分子也很容易被局部豐富的APC識(shí)別、攝取、加工并提呈給Th細(xì)胞，進(jìn)一步激活局部淋巴濾泡中的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞和Bm細(xì)胞，后者產(chǎn)生免疫記憶，前者可合成IgA，且兩個(gè)IgA單體由J鏈連接在一起，通過粘膜時(shí)，由粘膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的分泌片與雙體IgA連接，組成穩(wěn)定的分泌型IgA隨粘膜分泌液一起排出細(xì)胞，分布于粘膜表面，在粘膜局部防御感染中起十分重要的作用。
此外，與其他類型疫苗不同的是DNA疫苗載體中的非編碼免疫刺激序列(immunostimulatory sequences，ISS)具有免疫佐劑功能，可有效誘導(dǎo)Th1應(yīng)答。ISS由胞嘧啶核苷酸和鳥嘌呤核苷酸(CpG)為基元(motif)組成，在DNA疫苗的質(zhì)粒載體DNA骨架中，氨芐抗性基因中的兩個(gè)5′-AACGTT-3′序列就是具有較強(qiáng)活性的ISS。此結(jié)構(gòu)在細(xì)菌DNA中比例較高，而在脊椎動(dòng)物DNA中比例較少，并且，脊椎動(dòng)物中80％以上的CpG均被甲基化。脊椎動(dòng)物DNA和細(xì)菌DNA的這種顯著差別可能是使CpG序列成為免疫刺激信號(hào)的基礎(chǔ)。ISS可作用于多種免疫活性細(xì)胞。1995年，Krieg等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CpG刺激后95％的B細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖期，并分泌IgM和IL-6。在體外將ISS作用于人單核/巨噬細(xì)胞可顯著增加細(xì)胞中IFN-α，IFN-β，IL-12以及IL-18的mRNA表達(dá)。這些細(xì)胞因子的分泌可促進(jìn)NK細(xì)胞活化和IFN-γ的合成，并使Th前體細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。
DNA疫苗具有其他常規(guī)蛋白疫苗更優(yōu)越的特性(1)DNA疫苗既能誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)質(zhì)粒所編碼的抗原產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的體液免疫應(yīng)答，又能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CTL特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。(2)DNA疫苗不僅具有預(yù)防疾病的作用，同時(shí)還具有治療疾病的作用。(3)DNA疫苗誘導(dǎo)的針對(duì)病原體保守抗原的保護(hù)性免疫應(yīng)答對(duì)不同亞型的病原體有交叉抵御作用。(4)DNA疫苗表達(dá)的抗原接近天然構(gòu)象，抗原性強(qiáng)。(5)DNA疫苗相對(duì)容易進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，成本相對(duì)較低，性質(zhì)比較穩(wěn)定，便于長(zhǎng)途儲(chǔ)運(yùn)，分發(fā)等。(6)能聯(lián)合免疫，即可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中或?qū)⒉煌乖虻亩喾N質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，制備多價(jià)DNA疫苗。(7)接種途徑多樣化。既能采用注射方式接種(包括皮內(nèi)、皮下、肌注、基因槍注射技術(shù))，亦能口服、噴霧接種。
作為第三代疫苗，美國FDA已批準(zhǔn)等至少十余種DNA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，這預(yù)示DNA疫苗在21世紀(jì)將成為人類與疾病抗?fàn)幍挠欣淦?。?dāng)然，DNA疫苗應(yīng)用到臨床尚需多方面共同的努力。在不久的將來，DNA疫苗將用于臨床各種疾病的防治。
治療性疫苗概念的提出及倍受公眾關(guān)注大約于二十世紀(jì)九十年代中期前后。美國Scripps的Chisari小組在1995年所發(fā)表的文章中即提出了therapeuticvaccines。實(shí)際上在這之前，已有若干研究小組在從事這方面的研究工作，多采用“vaccine immunetherapy”、“therapeutic application”等來提示其研究工作的性質(zhì)和目的。1995年左右，隨著治療性疫苗概念的提出，其研究開始為人們所注意，尤其在慢性乙肝方面，Chisari小組治療性疫苗“Theradigm-HBV”已由動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)；自身免疫病治療性疫苗V17TCR多肽疫苗開始進(jìn)行I期臨床類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者的安全性試驗(yàn)。
近年來，治療性疫苗的研制取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，呈現(xiàn)出形式多樣化、設(shè)計(jì)針對(duì)性、組成多元化、技術(shù)新潁性的特點(diǎn)。1)、雖然大部分治療性疫苗的靶抗原仍為病原體的成分，但其形式趨向多樣化和復(fù)合化可能是大分子蛋白或是小分子多肽，可能是病毒基因DNA、RNA或模擬基因基序，也可能是病原體成分與多種輔助成分如蛋白、脂類、基因、小分子的復(fù)合體。輔助成分及新型佐劑的聯(lián)合更進(jìn)一步提高了治療性疫苗的效果，日益受到廣泛的應(yīng)用。2)、治療性疫苗針對(duì)已感染者被感染的病原體種類、致病機(jī)理、感染程度及特點(diǎn)進(jìn)行疫苗設(shè)計(jì)，因此疫苗主體更為精確和簡(jiǎn)明，力求準(zhǔn)確的靶向性和有效的多元輔助，同時(shí)減少無關(guān)的副效應(yīng)。3)、其治療機(jī)制為主動(dòng)地激活患者的自身免疫力，通過強(qiáng)化疫苗靶抗原的抗原性、激活并提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)靶抗原的識(shí)別和效應(yīng)閾，或改善免疫系統(tǒng)的總體平衡來實(shí)現(xiàn)治療的目的。
20世紀(jì)80年代國外就有報(bào)道采用乙肝預(yù)防性疫苗治療HBsAg陽性的兒童，無癥狀攜帶者及慢性肝炎的研究，均被證實(shí)無效。90年代初，Pol等采用CHO細(xì)胞表達(dá)的HBsAg+PreS2治療慢性乙肝患者，隨訪6個(gè)月，血清HBVDNA陰轉(zhuǎn)率為21.4％，另有28.6％患者的血清HBVDNA顯著降低。除采用HBsAg作為治療性疫苗外，以HbcAg作為治療性疫苗的病毒表位也做了許多工作，療效也不如人意。而在DNA疫苗的研究方面，取得了很有希望的結(jié)果。
HBsAg DNA疫苗Schirmbeck等以pRKS/S(編碼HB-sAg)免疫H-2‘小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生了Ld限制性HBsAg28-39多肽特異性CTL應(yīng)答。該應(yīng)答顯著強(qiáng)于以天然HBsAg顆粒作蛋白免疫的對(duì)照組；以上述DNA免疫H-2。鼠，可以誘生K”及Db限制性CTL應(yīng)答，而以外源重組HBsAg蛋白免疫這類小鼠后則檢測(cè)不到CTL應(yīng)答。這一實(shí)驗(yàn)提示DNA免疫可能在慢性持續(xù)性病毒感染防治中有重要作用。Mancini等在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，單次HBsA8DNA免疫后Tg小鼠外周血中原來大量存在的表面抗原顆粒完全消失并持續(xù)5個(gè)月以上；T8小鼠肝組織中HBV mRNA的表達(dá)亦大大降低；脾細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移試驗(yàn)證實(shí)這一作用是由CD4‘Th1細(xì)胞和CD8‘CTL共同介導(dǎo)的。這首次表明了DNA誘導(dǎo)的CTL免疫應(yīng)答對(duì)清除體內(nèi)持續(xù)性病毒感染的確實(shí)療效。Hui等L41將前S1第21-47位氨基酸抗原肽的編碼基因與HBsAg編碼基因融合而成的質(zhì)粒，免疫HBV Tg小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的HBsAg特異性CTL應(yīng)答。高滴度抗前S1抗體，有利于清除慢性罩BV攜帶者血清中的Dane顆粒，在治療慢性HBV感染中有重要作用。Bohm等E5’研究了免疫途徑對(duì)免疫應(yīng)答的影響。他們以HBsAg DNA疫苗通過肌肉、皮下、靜脈及腹腔等途徑對(duì)Balb/c小鼠免疫，發(fā)現(xiàn)肌肉和皮下免疫能有效地誘導(dǎo)體液和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類限制性CTL應(yīng)答，而靜脈及腹腔注射卻不能。這表明免疫效果與DNA導(dǎo)入方式相關(guān)。Kwi6sa等E6’構(gòu)建了由巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和人結(jié)蛋白啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)控的HBsAg DNA疫苗，將其分別免疫Balb/c小鼠，結(jié)果這兩種質(zhì)粒在所有免疫小鼠中都誘導(dǎo)出相同強(qiáng)度的MHCI類限制性CTL應(yīng)答和Th1抗體應(yīng)答，這表明在DNA免疫中，人結(jié)蛋白啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列和病毒調(diào)控序列一樣有效。上述研究為DNA免疫作為慢性HBV感染的治療性疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
HBcAg/HBeAg DNA疫苗HBcAg具有高度免疫原性，幾乎所有HBV感染者都產(chǎn)生抗-HBc，后者同時(shí)還是一種極有效的T細(xì)胞免疫原。HBcAg對(duì)HBsAg有分子間/結(jié)構(gòu)內(nèi)T細(xì)胞輔助功能，HBcAg致敏的T細(xì)胞可輔助抗HBV包膜多個(gè)表位抗體的產(chǎn)生，且這種Th細(xì)胞活性只要求HBcAg和HBsAg在同一結(jié)構(gòu)內(nèi)，而不要求它們?cè)谕环肿觾?nèi)。HBeAg是一種分泌性蛋白，它與具有免疫原性的HBcAg不同。HBeAg在慢性感染過程中可作為耐受原，而HBeAg特異性Th2細(xì)胞占主導(dǎo)地位或許會(huì)影響HBV慢性攜帶狀態(tài)的開始及延續(xù)。因此，HBeAg不僅在圍產(chǎn)期感染HBV時(shí)可作為耐受原，在成年獲得性感染慢性化過程中，也是病毒逃避免疫監(jiān)督、產(chǎn)生免疫耐受性的重要原因。Kuhober等報(bào)道，以pCMV-1/c(編碼HBcAg)或pCMV-1/e(編碼髓BeAg)免疫C57BL/6小鼠，可有效地誘生特異性抗體應(yīng)答和CTL應(yīng)答，并證實(shí)該CTL主要識(shí)別HBcAg多肽第93-100位氨基酸殘基間的8肽分子(MGLKFRQL)。Geissler等E9]發(fā)現(xiàn)，以HBcAg DNA疫苗免疫的小鼠都產(chǎn)生了抗-H比及強(qiáng)烈的HBcAg特異性MHC E類限制性CD4+T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。T細(xì)胞培養(yǎng)揭示這種細(xì)胞免疫特點(diǎn)是優(yōu)先釋放出Th1型細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素IL-2和γ-干擾素(1FN-γ)，而不是IL-4。更為重要的是，這些免疫小鼠還產(chǎn)生了強(qiáng)烈的MHC I類限制性CD8+CT1免疫應(yīng)答。CTL應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)證實(shí)在第一次免疫后16-21天，CTI就已產(chǎn)生抗HBcAg的細(xì)胞毒性溶解作用，而且此CTL活性至少可維持?jǐn)?shù)月。由于小鼠和人類HBcAg和HBeAg的Th細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)具有高度交叉反應(yīng)性，HBcAg特異性T細(xì)胞可識(shí)別HBcAg/HBeAg序列中多個(gè)不同位點(diǎn)，而且目前已證實(shí)HBcAg也是有效的人類T細(xì)胞抗原。因此，這些實(shí)驗(yàn)表明此種HBcAg DNA疫苗具有良好的細(xì)胞免疫原性，可用于慢性HBV感染的治療。
HBV DNA疫苗與佐劑合用在HBV感染慢性化進(jìn)程中，Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌紊亂，特別是Th1類細(xì)胞因子(1FN-γ、IL-2和IL-12)的產(chǎn)生缺陷，導(dǎo)致針對(duì)HBV的細(xì)胞免疫功能以及輔佐B細(xì)胞功能低下，病毒不易被清除。所以針對(duì)慢性乙型肝炎患者的Th1類細(xì)胞因子的產(chǎn)生不足，用外源性Th1類因子增強(qiáng)免疫，力圖清除病毒的治療成為目前研究的熱點(diǎn)。
HBV DNA疫苗與IL-2、IL-12和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等細(xì)胞因子基因聯(lián)合注射后誘導(dǎo)出了強(qiáng)烈的Th1型免疫應(yīng)答，CTL活性增強(qiáng)。聯(lián)用IL-2還克服了與MHC相關(guān)的、對(duì)HBsAg的無反應(yīng)性。免疫刺激序列CpG基序亦可直接作為DNA佐劑使用，作用機(jī)理可能為刺激II-12等細(xì)胞因子產(chǎn)生，使吞噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等功能增強(qiáng)。通過未甲基化DNA的協(xié)同輸送作用進(jìn)一步增強(qiáng)了Th1型免疫應(yīng)答。磷酸鈣和鋁鹽是僅有的已獲準(zhǔn)在人類中廣泛使用的佐劑，安全性好。將其與HBsAg DNA疫苗聯(lián)合使用后，抗體滴度增加了10～100倍，其中HB5Ag特異性IgG2a明顯增強(qiáng)，而DNA疫苗的使用劑量卻減少10倍。研究還發(fā)現(xiàn)，將脂質(zhì)體與編碼HBsAg的DNA疫苗聯(lián)合注射，特異性IgG2a抗體滴度增加，免疫應(yīng)答傾向于Th1型。因此，將HBV的治療性靶點(diǎn)與佐劑聯(lián)合熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一類在生物進(jìn)化中高度保守、廣泛存在于原核及真核生物中的一類蛋白質(zhì)，是生物細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)產(chǎn)物，HSP在機(jī)體的免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，通過參與抗原加工遞呈、T細(xì)胞活化等重要的生理過程，與機(jī)體的抗腫瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病等生理及病理機(jī)制密切相關(guān)，是一類重要的免疫分子。熱休克蛋白家族按照分子量可以分為四類HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子HSP家族。其中HSP70家族是HSP中最保守和最主要的一類。Armold的實(shí)驗(yàn)表明，用轉(zhuǎn)染了β-Gal的細(xì)胞來源的HSP90家族分子gp96免疫小鼠，可以產(chǎn)生針對(duì)β-Gal特異性的CD8+的CTL。Blachere等在體外重構(gòu)了HSP70和gp96的多肽復(fù)合物，結(jié)果表明HSP本身是沒有誘導(dǎo)出特異性的免疫，而HSP結(jié)合的多肽能誘導(dǎo)出抗原特異性的CTL，但將肽結(jié)合在其它的肽結(jié)合蛋白如小鼠的清蛋白，則無免疫原性。Srivastava的實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤細(xì)胞來源的HSP70多肽復(fù)合物可以誘導(dǎo)特異的抗腫瘤免疫，并且證實(shí)，這種免疫原性是來自于HSP多肽復(fù)合物中的小分子物質(zhì)而不是HSP，經(jīng)過反相HPLC分析，這些小分子物質(zhì)的分子量為1-5kD，去除了這些小分子物質(zhì)，HSP則喪失其免疫原性，但僅用這些小分子物質(zhì)免疫小鼠并不能得到好的免疫效果，因此HSP在抗原遞呈過程中的佐劑樣作用及小分子肽的免疫原性是HSP介導(dǎo)的免疫治療所不可缺少的兩個(gè)重要部分。Blachere等的研究表明，HSP可以成為CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的一種新的佐劑。Moroi等采用OVA257-264T細(xì)胞表位作為抗原肽，在體外與HWDFAWPW這種可以與HSP70蛋白結(jié)合的肽結(jié)合域交聯(lián)，形成雜合蛋白，結(jié)果有效地誘導(dǎo)出針對(duì)OVA抗原的特異性的CTL，并且可以明顯抵抗E.G7-OVA腫瘤細(xì)胞的攻擊，而單獨(dú)使用OVA抗原肽或HSP70則不能誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，表明HSP70分子對(duì)T細(xì)胞的激活具有明顯的佐劑樣效應(yīng)。
HSP家族明顯的佐劑樣作用引起了國內(nèi)外學(xué)術(shù)界的關(guān)注，近年來已成為HSP家族以至整個(gè)免疫學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Arnold-Schild等證實(shí)了HSP誘導(dǎo)的特異性CTL反應(yīng)是由于專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)上存在HSP的受體，可以使APC特異性地通過HSP受體介導(dǎo)抗原肽的內(nèi)吞，從形態(tài)學(xué)上推測(cè)了HSP受體的存在。隨后在2000年6月的J.Exp.Med上，Castellino和Singh-Jasuja等在不同的實(shí)驗(yàn)中分別證實(shí)了DC表面存在HSP受體，并推測(cè)HSP受體是可飽和的[45]，同時(shí)證實(shí)了HSP結(jié)合的抗原在胞內(nèi)是通過TAP依賴及TAP非依賴途徑，被遞呈到MHC-I類分子上，并誘導(dǎo)隨后的CTL反應(yīng)的。這種受體被證明存在于DC、巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞等APC上，而不存在于T細(xì)胞上。因此可以認(rèn)為，HSP通過HSP受體與APC相互作用是HSP作為佐劑的一個(gè)重要機(jī)理。研究表明，這種受體介導(dǎo)的抗原遞呈方式的效率比吞噬高1000～10000倍。Asea等發(fā)現(xiàn)，HSP70分子在胞外可以行使類似細(xì)胞因子樣作用。HSP70可與單核細(xì)胞產(chǎn)生高親和力的結(jié)合，誘導(dǎo)其產(chǎn)生IL-6、IL-1等活性細(xì)胞因子，并可以誘導(dǎo)DC成熟，上調(diào)其MHC-II和CD86分子表達(dá)，分泌IL-12和TNF-α，從而增強(qiáng)DC的抗原遞呈能力。因此采用HSP作為免疫佐劑，可以靶向性介導(dǎo)抗原的遞呈，增強(qiáng)抗原的遞呈效率，從而誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。
機(jī)體感染HBV后，其抗病毒免疫功能及病毒逃避免疫攻擊的能力決定HBV感染的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。已知病毒感染的清除主要依賴特異性體液免疫及細(xì)胞免疫。體液免疫應(yīng)答通過特異性抗體中和細(xì)胞外游離的病毒，而細(xì)胞免疫則主要通過特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別、殺傷、破壞病毒感染細(xì)胞，清除胞內(nèi)感染的病毒。后者在抗病毒感染中尤為重要。由于慢性乙型肝炎患者的特異性T細(xì)胞殺傷活性低下，甚至產(chǎn)生免疫耐受性，因此增強(qiáng)CTL識(shí)別反應(yīng)，使機(jī)體免疫特別是細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)，打破HBV感染后的免疫耐受狀態(tài)，對(duì)HBV的清除有重要意義。
新型乙肝治療性DNA疫苗從機(jī)理上，用新的真核高效表達(dá)元件，可以更高效地表達(dá)目的基因；在疫苗的設(shè)計(jì)上，采用了新型佐劑熱休克蛋白與HBsAg和PreS2共表達(dá)的體系，不僅可以將治療性疫苗的表位特異性地導(dǎo)入體內(nèi)最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞——樹突狀細(xì)胞，而且可以有效地刺激樹突狀細(xì)胞表達(dá)IL-1，IL-12，IFN-γ等細(xì)胞因子，從而發(fā)揮強(qiáng)大的T細(xì)胞的激活作用，誘導(dǎo)高效價(jià)的抗HBs及抗PreS2抗體及病毒特異性CTL的產(chǎn)生，有利于打破HBV感染的免疫耐受狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。對(duì)體內(nèi)病毒的清除具有重要意義。
本發(fā)明的另一目的是提供一種藥物組合物，它包括有該DNA疫苗及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的又一目的是提供一種制備乙型肝炎治療性DNA疫苗的方法，該方法包括①提供一種乙肝治療性DNA疫苗載體的構(gòu)建方法，該載體的表達(dá)盒包括啟動(dòng)子序列，缺失終止碼的熱休克蛋白序列和PreS2序列，HBsAg序列，聚腺苷酸化信號(hào)序列。熱休克蛋白序列包括人熱休克蛋白70家族、人熱休克蛋白90家族中分子的序列及其變異體。這種熱休克蛋白的變異體包括與原始熱休克蛋白序列至少有8個(gè)氨基酸序列完全一致的熱休克蛋白的全部編碼序列或部分片段。
②提供一種乙肝治療性DNA疫苗的制備方法該方法包括從工程菌中擴(kuò)增該DNA疫苗載體，并通過離子交換和凝膠過濾層析純化該疫苗。
本發(fā)明的另一目的是上述乙肝治療性疫苗在防治慢性乙型肝炎和HBsAg陽性的肝癌中的應(yīng)用。
圖2為PreS2與HBsAg的cDNA克隆。
圖3為pTKV1-70S2-S的雙酶切鑒定。
圖4為純化后的DNA疫苗的鑒定。
將以上擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用HindIII和EcoR I酶切后膠回收純化，插入質(zhì)粒pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒p70，參見圖l。
實(shí)施例2PreS2+HBsAg基因的克隆用PCR從質(zhì)粒pEco63(ATCC31518，該質(zhì)粒含有全長(zhǎng)HBV基因組序列)中擴(kuò)增，上游引物5‘-GC GGA TCC CAT CTC TCC ACC TCT AAG AGA CAG TCA GGC CAT-3’下游引物5‘-GCGAATTCCTA ATG TAT ACC CAG AGA CAA AAG AAA ATT GGT AACAGC GGT ATA-3’。
PreS2+HBsAg基因產(chǎn)物的預(yù)計(jì)大小為885bp。PCR反應(yīng)體積為50μl，引物濃度為0.4μM，擴(kuò)增參數(shù)為94℃1’、55℃1’、72℃2’，20個(gè)循環(huán)后產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析(電泳分析見圖2)。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后，克隆至pBluescript II-SK(美國Stratagene公司)進(jìn)行全自動(dòng)測(cè)序，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Stratagene公司)，陽性克隆經(jīng)全自動(dòng)測(cè)序(ABI373，PE公司)分析，結(jié)果表明克隆到的PreS2+HBsAgcDNA與報(bào)道一致，參見圖2。
實(shí)施例3.新型慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗載體構(gòu)建及鑒定將以上擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用Hind III和EcoR I酶切后膠回收純化，插入DNA疫苗專用載體pTKV1(保密)的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒p70，再將PreS+HBsAg的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物PCR產(chǎn)物通過BamH I及EcoR I的酶切、膠回收純化后插入質(zhì)粒p70的BamH I/EcoR I酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成表達(dá)人HSP70與PreS2+HBsAg融合蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pTKV1-70S2-S。
將構(gòu)建的pTKV1-70S2-S用HindIII和EcoRI雙酶切，行0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析(電泳分析見圖3)。
實(shí)施例4.新型慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗的制備、純化與檢測(cè)用接種環(huán)將待培養(yǎng)細(xì)菌劃至含有營養(yǎng)物質(zhì)和相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基表面，于37℃培養(yǎng)過夜。從固體培養(yǎng)基中挑取單菌接種于30ml培養(yǎng)基LB(含適量相應(yīng)抗生素)中，于37℃空氣搖床中振蕩培養(yǎng)(200r/min)過夜；次日，將含相應(yīng)抗生素的500ml LB培養(yǎng)基放入2L的三角燒瓶中，加入25ml上述過夜菌，于37℃振蕩培養(yǎng)2.5h，使細(xì)菌得以充分?jǐn)U增；加入氯霉素溶液，使其終濃度為170μg/ml養(yǎng)16h，按一定的比例轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為37℃，將I程菌培養(yǎng)液倒入500ml離心管中，4℃，10000×g30min，棄盡上清，向?yàn)V液中加入0.6倍體積的異丙醇混勻，室溫放2 hr，4℃，10000×g30min，棄盡上清，加入20ug/mlRNase A，37℃作用30min，加入NH4AC至終濃度為2.5M，冰浴15min，4℃，10000×g20min，棄沉淀，再向?yàn)V液中加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放2hr以沉淀質(zhì)粒，4℃，10000×g20min，沉淀用1ml 10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0重懸，離子交換層析，buffer A10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0，600mM NaCl bufferB10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0，700mM NaCl，通過254nm吸光度監(jiān)測(cè)，645mM20min，645-700mM22min，700mM10min；645mM20min，645-672.5mM11min，672.5-700mM0.1min，700mM14min。流速為5ml/min.仔細(xì)收集每一峰(將每一峰當(dāng)作單一成分)，做HPLC、蛋白、凝膠電泳等分析。
濃度測(cè)定采用260nm紫外光吸收測(cè)定純化的核酸藥物的核酸濃度；其濃度為532.1ug/ml。
純度的測(cè)定分光光度法檢測(cè)的核酸樣品在260nm和280nm的紫外吸收的比值，其比值為1.93。
限制性酶切圖譜的分析參見圖4，經(jīng)純化后的DNA疫苗為8k左右大小，經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切后，為3k及5k大小兩條帶。
實(shí)施例5.新型慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗質(zhì)粒的體外表達(dá)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293細(xì)胞，將真核表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體Lipofectamine，按一定比例混合，室溫作用45’，于70％Confluence生長(zhǎng)的細(xì)胞，用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基洗兩遍后，加入DNA混合物，37℃培養(yǎng)6-8小時(shí)，加等量含20％血清的正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)基，72小時(shí)后，加入G418(600μg/ml)進(jìn)行篩選，2周后獲得穩(wěn)定表達(dá)的克隆。
(2)體外HBsAg表達(dá)的檢測(cè)收集篩選的細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解物，采用Surrase公司生產(chǎn)的HBsAg檢測(cè)試劑盒，按照其說明書檢測(cè)。
(3)RT-PCR檢測(cè)5×106上述細(xì)胞溶于1ml Trizol，室溫放置5分鐘，加入200μl氯仿，振蕩混勻，室溫放置3分鐘，12,000g，4℃離心10分鐘，吸出上清，加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘后于4℃、12,000g離心15分鐘，70％乙醇洗一遍后自然干燥，溶于40μ1水中，紫外分光光度計(jì)定量。取10μg總RNA，于50μl體積中作反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物oligo-dT12~185μg/ml，dNTP500μM，10,000U/ml M-MLV，37℃1小時(shí)，75℃15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，取5μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板在50μl的體積中作PCR。引物序列如下上游引物5′-GCA AGCTT ATG GCC AAA GCC GCG GCA GTC GGC-3′下游引物5‘-ACC CAG AGA CAA AAG AAA ATT-3’表1.新型乙肝治療性DNA疫苗的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體外表達(dá)

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變更和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種新的慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗載體的構(gòu)建方法，其特征是在HBsAg和Pre S2開放讀框的前端和啟動(dòng)子之間插入有缺失終止碼的熱休克蛋白的編碼區(qū)，構(gòu)成的表達(dá)盒依次包括啟動(dòng)子序列，缺失終止碼的熱休克蛋白序列和PreS2序列，HBsAg序列，聚腺苷酸化信號(hào)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新的慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗，其特征是熱休克蛋白序列包括人熱休克蛋白70家族、人熱休克蛋白90家族中分子的序列及其變異體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熱休克蛋白，其特征是所述的熱休克蛋白的變異體包括與原始熱休克蛋白序列至少有8個(gè)氨基酸序列完全一致的熱休克蛋白的全部編碼序列或部分片段。
4.一種新的慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗的制備及純化方法其特征在于，采用離子交換與凝膠過濾層析純化該疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的DNA疫苗，其特征是在防治慢性乙型肝炎和治療HBsAg陽性肝中的應(yīng)用。
6.一種藥物組合物，其特征是它包括有效量的根據(jù)前述權(quán)利要求所述的DNA疫苗和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗的構(gòu)建、制備方法及用途。這種新的治療性DNA疫苗應(yīng)用于臨床，具有成本低、使用方便、療效好等優(yōu)點(diǎn)，適用于慢性乙型肝炎、部分HBsAg陽性的肝癌的治療及部分對(duì)乙型肝炎蛋白疫苗不反應(yīng)的健康人的免疫預(yù)防。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1435259SQ02110670
公開日2003年8月13日 申請(qǐng)日期2002年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月28日
發(fā)明者王建莉, 張立煌, 王青青 申請(qǐng)人:上海海欣生物技術(shù)有限公司