專利名稱：脂質(zhì)體包封的漿果赤霉素iii衍生物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂質(zhì)體包封的漿果赤霉素III衍生物及其用途，屬于制藥工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
目前，植物細胞培養(yǎng)規(guī)模上已從搖瓶走向反應(yīng)器，并采用了分批補料、半連續(xù)、連續(xù)、二步法、雙液相和灌注培養(yǎng)等培養(yǎng)技術(shù)。隨著研究的發(fā)展，植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成為一種成熟的工業(yè)化生產(chǎn)方式具有巨大的潛力。
本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方法為兩步法，即細胞株先在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間以累積生物量，再轉(zhuǎn)入生產(chǎn)培養(yǎng)基促使細胞大量合成紫杉醇。
紫杉醇(Paclitaxel)的結(jié)構(gòu)及其基本生物合成途徑 式1.1紫杉醇的分子結(jié)構(gòu)紫杉醇(分子結(jié)構(gòu)見式1.1)以其獨特的抗癌作用，高效、低毒的作用機制被認為是近幾十年中最好的天然抗癌藥。早在1969年，就被首次從太平洋短葉紅豆杉(Pacific yew tree，Taxus brevifolia)的樹皮和木部的粗提物中發(fā)現(xiàn)了這種四環(huán)、二萜酰胺類化合物。Schiff等發(fā)現(xiàn)了紫杉醇的抗癌機制在于，它與細胞微管蛋白結(jié)合，促進微管的聚合，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，并阻止其解聚，使細胞有絲分裂停止在G2/M期，抑制了癌細胞的快速分裂。臨床結(jié)果表明，紫杉醇對晚期卵巢癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌和非小細胞肺癌等有明顯療效。1992年底，美國食品與藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)紫杉醇作為卵巢癌治療藥物上市。
高等植物次生代謝物的生物合成途徑很復(fù)雜，牽涉到眾多代謝支路和酶。從生源途徑來看，通常可以把植物次生代謝物分成三個主要大類，即萜類、芳香化合物和生物堿。紫杉烷類屬于萜類化合物。一般認為，萜類化合物是從乙酰輔酶A出發(fā)，經(jīng)過甲羥戊酸、異戊烯基焦磷酸后再分支生成各類化合物，其中有一個化合物GGPPi(香葉基香葉醇焦磷酸)，據(jù)說這是紫杉醇母核生物合成的起始物。紫杉醇的生物合成途徑大致可分為三個主要的生物合成階段1、紫杉烷碳環(huán)系統(tǒng)即母核的生物合成；2、C13位側(cè)鏈的生物合成；3、母核與側(cè)鏈的酯化反應(yīng)，經(jīng)修飾形成紫杉醇(見式1.2)。
紫杉烷碳環(huán)系統(tǒng)的生物合成大致可分為兩步紫杉烷碳環(huán)骨架的合成和其骨架上的官能化反應(yīng)。目前已知其第一步重要反應(yīng)是自然界廣泛存在的雙萜烯前體GGPPi在紫杉二烯合成酶(Taxadiene synthase)催化環(huán)化為4(5)，11(12)-紫杉二烯(taxadiene)。隨著紫杉烷碳環(huán)骨架的建立，環(huán)上復(fù)雜的官能化反應(yīng)亦隨之發(fā)生。這些反應(yīng)包括羥基化、羥基上的?；?、酮基化、苯基化以及環(huán)氧系統(tǒng)的生成等，最終形成漿果赤霉素III(BaccatinIII、巴卡亭III)，它是紫杉醇合成的直接前體。這些反應(yīng)的前后順序尚未搞清。只知C5位的羥基化反應(yīng)由細胞色素P450羥化酶催化，將紫杉二烯(Taxadiene)轉(zhuǎn)變?yōu)?(20)，11(12)紫杉二烯(Taxadiene)-5α-醇(ol)。紫杉醇側(cè)鏈的生物合成和酯化反應(yīng)α-苯丙氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶催化變?yōu)棣?苯丙氨酸，再發(fā)生C2位羥化反應(yīng)形成苯基異絲氨酸。此產(chǎn)物與漿果赤霉素III C13位羥基酯化形成N-去苯甲酰紫杉醇，再與同樣來自苯丙氨酸的苯甲酰輔酶A?；纬勺仙即?。如果N-去苯甲酰紫杉醇與N-甲基巴豆酰反應(yīng)就形成Cephalomanine，一個常見的較難與紫杉醇分離的紫杉烷。 式1.2被推測的紫杉醇生物合成途徑紫杉醇生物合成的代謝調(diào)控依據(jù)紫杉醇生物合成路徑的理論，采用加入代謝前體分子、關(guān)鍵酶激活劑和旁路酶抑制劑，可以提高植物細胞培養(yǎng)合成紫杉醇的產(chǎn)量。
目前已知的紫杉醇合成關(guān)鍵酶有紫杉二烯合成酶Taxadiene synthase，此酶活性依賴Mg2+，但一般培養(yǎng)基中的Mg2+濃度遠超過它需要的飽和濃度(1mM)，最適pH中性偏堿。由于此酶的惰性，因此加入代謝前體和各種誘導(dǎo)子，對紫杉醇的合成量的提高并不明顯。另外，加入一些有機酸和芳香氨基酸，如乙酸、檸檬酸和苯丙氨酸，提供紫杉醇側(cè)鏈側(cè)基的前體，可明顯提高紫杉醇的合成量。而加入C13側(cè)鏈合成路徑的酶激活劑茉莉酮酸甲酯可較專一地使?jié){果赤霉素III(BaccatinIII)轉(zhuǎn)化為紫杉醇，抑制Cephalomanine的形成。
另外，還有許多誘導(dǎo)子如多糖類的殼聚糖、葡聚糖；重金屬鹽類的銀、汞、鑭、鈰等都對細胞培養(yǎng)物中的紫杉醇含量的提高有作用。
植物細胞培養(yǎng)技術(shù)在生產(chǎn)紫杉醇上的應(yīng)用在研究紫杉醇的過程中，科學(xué)家們分離提純了一些紫杉醇的類似物、紫杉烷和代謝中間產(chǎn)物，已發(fā)現(xiàn)一些紫杉烷類具有和紫杉醇相似的治療作用。而一些紫杉醇類似物和代謝中間產(chǎn)物可通過一些修飾和半合成轉(zhuǎn)化為紫杉醇，但涉及多步手性合成，使成本居高不下。
目前用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇類還存在一些問題(1)缺乏高產(chǎn)細胞株；(2)細胞株生產(chǎn)不穩(wěn)定，大多細胞在經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后產(chǎn)物含量下降甚至消失；(3)產(chǎn)物含量低，達不到商業(yè)化生產(chǎn)要求；(4)對目的產(chǎn)物的代謝途徑還不是很清楚，無法采取相應(yīng)的調(diào)控措施來大量積累產(chǎn)物；(5)由于植物細胞自有的一些特點，放大困難，大多數(shù)情況細胞從搖瓶轉(zhuǎn)到反應(yīng)器后，產(chǎn)物產(chǎn)量明顯下降。
本發(fā)明詳細考察了不含對人有害的合成植物激素的紅豆杉細胞培養(yǎng)基，提供了一種通過植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的工藝；特別是本發(fā)明提供了一種可以充分利用從天然植物提取紫杉醇后的副產(chǎn)物漿果赤霉素III(BaccatinIII)和/或10-脫乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)作為原料，利用植物細胞培養(yǎng)使之生物轉(zhuǎn)化為紫杉醇的工藝。
紅豆杉細胞生長較慢，其倍增時間遠大于細菌等微生物；紫杉醇合成代謝途徑較長且復(fù)雜，其水中溶解度甚低；紅豆杉細胞種子遺傳上也不穩(wěn)定等等問題都限制了細胞培養(yǎng)在紫杉醇工業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用。不僅國內(nèi)植物細胞培養(yǎng)用于工業(yè)生產(chǎn)的例子沒有，國外也只有屈指可數(shù)的幾個產(chǎn)品，至于用紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇更是未見公開報道。近年來紫杉醇類化學(xué)半合成的研究和灌木型紅豆杉(T.media)的大規(guī)?？焖倥嘤M行得如火如荼，導(dǎo)致紫杉醇原料價格一降再降，純以紅豆杉細胞培養(yǎng)從碳源全合成紫杉醇已不具有競爭優(yōu)勢，為此本發(fā)明把細胞培養(yǎng)和化學(xué)半合成的優(yōu)點結(jié)合起來，克服前者產(chǎn)率低和后者手性合成副產(chǎn)物分離困難的缺點。
本發(fā)明采用的中國紅豆杉(T.chinesis)細胞是先從其野生植株(采自湖北房縣)幼莖外植體誘導(dǎo)愈傷組織，再移入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行擴增培養(yǎng)若干代后，根據(jù)不同植株來源決定細胞株編號，共有四個HL、NA、YS、NS。所有細胞冷凍保藏作為種子細胞庫，使用時取一瓶細胞復(fù)蘇后移至半固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，繼代二次后再用液體培養(yǎng)基(不加植物激素)繼代三次后即可使用。細胞繼代培養(yǎng)不超過十次。本發(fā)明采用的細胞株編號為HL-1，該細胞株樣品已經(jīng)提交給位于北京中關(guān)村的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心予以保藏。保藏日期2002年1月24日，編號CGMCCNo.0701，分類命名Taxus Chinese愈傷組織細胞株。
向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物和前體分子促進紫杉醇合成早有報道。根據(jù)誘導(dǎo)子對紅豆杉細胞的作用和其來源不同可分為三類一、是植物激素類，有乙烯、茉莉酮酸甲酯、脫落酸等；二、是大分子外源生物組分(主要是多糖)，如真菌提取物、殼聚糖、葡聚糖等；三、是一些重金屬離子，如汞、鑭、鈰等。
前體分子主要是有機酸和芳香氨基酸以及紫杉醇生物合成中間體，它們的作用效果各不相同，有的對細胞有毒害作用，有的同時促進細胞生長。由于最終目的是以細胞培養(yǎng)生產(chǎn)作為藥物的紫杉醇，因此凡是可能對人體有害的誘導(dǎo)子就不宜采用，同時避免增加后期純化工作量和檢驗項目。
本發(fā)明采用Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基，另添加0.5mg/l 6-芐基腺嘌呤(6-BA)，0.2mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.5mg/l萘乙酸(NAA)，0.5g/l水解酪蛋白和30g/l(液體培養(yǎng)基)或25g/l(半固體培養(yǎng)基)蔗糖。培養(yǎng)基在滅菌前pH調(diào)節(jié)至5.8，半固體培養(yǎng)基需加1.5％的瓊脂。
紅豆杉細胞繼代培養(yǎng)14天后，無菌過濾所得培養(yǎng)液即為紅豆杉細胞條件培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件搖瓶培養(yǎng)，將紅豆杉細胞在25℃、120rpm的搖床上進行暗培養(yǎng)。250ml三角瓶中培養(yǎng)基裝液量為100ml，接種量為100g鮮細胞/升培養(yǎng)基(10％指細胞鮮重與培養(yǎng)基體積比)，繼代周期為14天，培養(yǎng)周期為21天。半固體培養(yǎng)裝液量為100ml，接種量為5％，在25℃的培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，繼代周期為21天。分析方法細胞量的測定細胞懸浮液用布氏漏斗減壓過濾，然后用蒸餾水淋洗細胞2-3次，稱量得細胞濕重；將稱量后的細胞置于50℃烘箱，烘干至恒重，稱量得細胞干重。培養(yǎng)液用于測定培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)成分如糖、氮和磷及胞外紫杉醇等。主要培養(yǎng)基成份的測定總糖和果糖采用濃硫酸-苯酚法和鉬酸銨比色法測定；硝酸根、銨根離子和磷酸根的定量分別采用水楊酸-濃硫酸法、苯酚-次氯酸鹽反應(yīng)和抗壞血酸還原法測定。紫杉醇(Paclitaxel)、漿果赤霉素III(Baccatin III)和Cephalomanine的測定分離和提取稱取0.1g干細胞，磨成細粉，加入2ml甲醇超聲提取，離心后取上清液，共三次，合并上清液揮干，加入二氯甲烷和蒸餾水各2ml，充分震蕩混合后靜置數(shù)分鐘，離心取下層二氯甲烷相，揮干，加入1ml HPLC級甲醇溶解，用于高效液相色譜(HPLC)分析。取培養(yǎng)基濾液5ml也用乙酸乙酯抽提三次，有機相經(jīng)洗滌干燥后減壓濃縮至于，所得油狀物也用1ml HPLC級甲醇溶解轉(zhuǎn)移到磨口試管保存，供HPLC分析，兩者換算相加即總的紫杉醇含量。
HPLC分析采用配有Waters 486紫外檢測儀的Waters 510(英國)型高效液相色譜儀，檢測波長為227nm。采用美國Whatman公司生產(chǎn)的五氟苯硅烷柱(PFP)。流動相為乙腈∶水＝42∶58，流速為1ml/min。每次進樣量為20μl，進樣前樣品用10000rpm離心去除固體雜質(zhì)。
漿果赤霉素III(Baccatin III)和/或10-脫乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)對紫杉醇合成的影響1988年法國Denis等用從法國漿果紅豆杉(T.baccta)的葉中得到的10-脫乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)作為母核，進行半合成，得到紫杉醇。
根據(jù)對紫杉醇生物合成途徑的研究，漿果赤霉素III是紫杉醇的前體，10-DAB可通過乙酰基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為漿果赤霉素III，而此二者在紅豆杉植物提取紫杉醇后的紫杉烷雜質(zhì)中占較大比例，因此用紅豆杉細胞把他們轉(zhuǎn)化為紫杉醇，既可增加紫杉醇產(chǎn)量，又提高了稀少的紅豆杉資源的利用率。
脂質(zhì)體包封的漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)(見通式I)的制備 通式I R＝H 10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)R＝Ac 漿果赤霉素III(BaccatinIII)將漿果赤霉素III溶于丙酮，心磷脂、卵磷脂和膽酸鈉溶于乙醇，以摩爾比為1∶1∶5∶5混合?；旌先芤涸谡婵毡∧饪s器內(nèi)40℃減壓蒸發(fā)至干，形成磷脂和藥物的薄膜。然后加入20mM Tris-HCl緩沖液(PH7.5，內(nèi)含0.15MNaCl和0.01M NaNO3)溶解薄膜，溶液用超聲波處理30分鐘，然后對溶液透析除去有機溶劑。將透析液用葡聚糖凝膠層析。除去未被包封的漿果赤霉素III，脂質(zhì)體部分超濾濃縮至含漿果赤霉素III 1mg/ml，低溫保存。
包封率采用超離心和HPLC方法測定。漿果赤霉素III脂質(zhì)體溶液經(jīng)超離心取沉淀，用乙醇溶解，用HPLC測定漿果赤霉素III含量。HPLC測定條件見表1。
包封率(％)＝C脂/C總*100％式中C總＝漿果赤霉素III加入總量C脂＝脂質(zhì)體中漿果赤霉素III的量10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)脂質(zhì)體的制備方法同上。表1漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)和紫杉醇的HPLC定量分析條件

以中國紅豆杉細胞株HL-1培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇時，先在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國紅豆杉細胞株HL-1約14天；細胞培養(yǎng)物以15％接種于100ml下表2所列培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，并于24℃培養(yǎng)14天。
將漿果赤霉素III和/或10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)分別以普通形式和脂質(zhì)體形式(平均直徑124.5nm，多分散性指數(shù)0.45)加入到培養(yǎng)了14天的培養(yǎng)物中，投料量為30mg/l(終濃度)，對照組加入等體積的溶劑和空白脂質(zhì)體，觀察7天后紫杉醇含量細胞生長量的變化，見附

圖1漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III及其脂質(zhì)體對紫杉醇合成和細胞生長的影響。
結(jié)果表明與對照相比，漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III單體對細胞生長影響不大，對紫杉醇合成的促進作用也一般，但經(jīng)脂質(zhì)體包封后可明顯促進紫杉醇合成。這是因為脂質(zhì)體包封的原料克服了溶解度限制增加了投料量(最高可達100mg/l)并更易進入細胞，經(jīng)相關(guān)酶催化轉(zhuǎn)化為紫杉醇。
漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III脂質(zhì)體投料量為10-100mg/l，40-70mg/l較好。
可以在9-18天時加入漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III脂質(zhì)體，第15天時加入較好。
在15天和21天測量細胞干重和紫杉醇產(chǎn)量。表2紅豆杉屬植物細胞培養(yǎng)基

按照本發(fā)明提供的工藝過程，可以充分利用從天然植物提取紫杉醇后的副產(chǎn)物漿果赤霉素III(Baccatin III)和/或10-脫乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)作為原料，制備得到漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III的脂質(zhì)體。按本發(fā)明工藝制得的脂質(zhì)體，可以用于植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇。不僅提高了植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的產(chǎn)量，并降低成本，對保護、節(jié)約有限的天然植物資源也有重要意義。
包封率采用超離心和HPLC方法測定。漿果赤霉素III脂質(zhì)體溶液經(jīng)超離心取沉淀，用乙醇溶解，用HPLC測定漿果赤霉素III含量。HPLC測定條件見表1。包封率(％)＝C脂/C總*100％式中C總＝漿果赤霉素III加入總量C脂＝脂質(zhì)體中漿果赤霉素III的量10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)脂質(zhì)體的制備方法同上。
測量細胞干重方法如下首先將一5.5cm濾紙(No.541，Whatman Co.U.S.A)置于一裝配抽濾瓶的布氏漏斗中，在其上噴少量雙蒸水并真空抽濾使濾紙完全貼于漏斗濾孔上，然后將5ml待測植物細胞培養(yǎng)液傾倒于濾紙上，并減壓抽濾除水，并用少量雙蒸水洗滌一、二次。將抽濾后的濾餅連用濾紙置于一鋁箔盤中，并在烘箱中50℃干燥24小時，取出鋁箔盤冷卻至室溫，稱出總重再減區(qū)鋁箔盤和濾紙重量的預(yù)先測量值，所得數(shù)字再乘以200即為每升培養(yǎng)液中的細胞干重。表3漿果赤霉素III脂質(zhì)體對紅豆杉屬植物細胞生長和紫杉醇產(chǎn)量的影響

實施例3、脂質(zhì)體包封的10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)對植物細胞生長及紫杉醇產(chǎn)量水平的影響在含0.5g/l水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國紅豆杉HL-1 14天。將細胞培養(yǎng)物以15％接種于100ml表2所列培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，并于24℃培養(yǎng)14天。在15天時分別加入10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)、10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)脂質(zhì)體，投料量為30mg/l(終濃度)，對照組加入等體積乙醇和空白脂質(zhì)體。在15天和21天測量細胞干重和紫杉醇產(chǎn)量，結(jié)果見表4。表4 10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)脂質(zhì)體對細胞生長和紫杉醇產(chǎn)量的影響

實施例4、不同濃度的漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)脂質(zhì)體對紫杉醇產(chǎn)量水平的影響將漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)脂質(zhì)體分別以10、30、50、70、100mg/l的投料量進行實驗，細胞株為HL-1，實驗方法見實施例2。結(jié)果見表5表5不同濃度的漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)脂質(zhì)體對紫杉醇產(chǎn)量的影響

注轉(zhuǎn)化率是指所得紫杉醇產(chǎn)量減去對照的紫杉醇產(chǎn)量再除以投料量得出的重量收率。
由此可見，不同濃度的漿果赤霉素III、10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)脂質(zhì)體對細胞培養(yǎng)物的紫杉醇產(chǎn)量都有一定的促進作用，但以50mg/l濃度的漿果赤霉素III脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率最高。
由此看出，在細胞培養(yǎng)的第15天投下漿果赤霉素III脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)化率最高，而在第12天投下10-去乙酰漿果赤霉素III(10-DAB)脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)化率也較高，但低于漿果赤霉素III脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率。
權(quán)利要求
1.一種以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物脂質(zhì)體，其特征是這里的R可以是氫或乙?；?。
2.按權(quán)利要求1所述的以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物脂質(zhì)體，其特征是脂質(zhì)體的平均直徑124.5nm，多分散性指數(shù)0.45。
3.按權(quán)利要求1、2所述的以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物脂質(zhì)體的制備方法，包括將以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物溶于丙酮，心磷脂、卵磷脂和膽酸鈉溶于乙醇，以摩爾比為1∶1∶5∶5混合；混合溶液真空減壓蒸發(fā)至干，形成磷脂和藥物的薄膜；用Tris-HCl緩沖液(PH7.5，內(nèi)含0.15M NaCl和0.01M NaNO3)溶解薄膜，透析除去溶液中的有機溶劑；將透析液用葡聚糖凝膠層析，除去未被包封的以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物，即得以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物脂質(zhì)體。
4.按權(quán)利要求1、2所述的以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物脂質(zhì)體在植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇中的應(yīng)用方法，包括在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國紅豆杉細胞株HL-114天；細胞培養(yǎng)物24℃再培養(yǎng)14天；在9-18天時加入以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物脂質(zhì)體，投料量為10-100mg/l。
5.按權(quán)利要求4所述的以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物脂質(zhì)體在植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇中的應(yīng)用方法，其特征在于在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國紅豆杉細胞株HL-114天后，細胞培養(yǎng)物以15％接種于如下成分的培養(yǎng)基中MgSO4.7H2O 370(mg/l)；KH2PO4170(mg/l)；KNO31900(mg/l)；NH4NO31650(mg/l)；CaCl2.2H2O 440(mg/l)；H3BO36.2(mg/l)；MnSO4.H2O 15.6(mg/l)；ZnSO4.7H2O 8.6(mg/l)；NaMoO4.2H2O 0.25(mg/l)；CuSO4.5H2O 0.025(mg/l)；CoCL2.6H2O 0.025(mg/l)；KI0.83(mg/l)；Na2EDTA 37.3(mg/l)；FeSO4.7H2O 27.8(mg/l)；肌醇 100(mg/l)；鹽酸硫胺 .05(mg/l)；鹽酸吡哆醇0.5(mg/l)；煙酸 0.05(mg/l)；蔗糖 30000(mg/l)；水解酪蛋白500(mg/l)；萘乙酸1.0(mg/l)；6-芐基腺嘌呤 0.5(mg/l)24℃培養(yǎng)14天；在15天時加入以通式I表示的漿果赤霉素III衍生物脂質(zhì)體，投料量為40-70mg/l。
全文摘要
利用從天然植物提取紫杉醇后的副產(chǎn)物漿果赤霉素III(Baccatin III)和/或10－脫乙酰漿果赤霉素III(10－DAB)作為原料,制備得到漿果赤霉素III、10－去乙酰漿果赤霉素III的脂質(zhì)體。按本發(fā)明工藝制得的脂質(zhì)體,可以用于植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇。不僅提高了植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的產(chǎn)量,并降低成本,對保護、節(jié)約有限的天然植物資源也有重要意義。
文檔編號A61K9/127GK1369556SQ0211071
公開日2002年9月18日 申請日期2002年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月31日
發(fā)明者楊凌風(fēng), 陳旭峰 申請人:上海華聯(lián)制藥有限公司