專利名稱：促胰島素分泌肽Exendin4類似物及其鹽的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促胰島素分泌肽Exendin 4類似物及其鹽的新用途，具體的說，涉及該促胰島素分泌肽Exendin 4類似物及其鹽在制備治療II型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
糖尿病是世界性疾病。1998年統(tǒng)計結(jié)果，美國的糖尿病患者約為II型1200萬，I型100萬。1999年，日本糖尿病患者690萬(I型約占10％)，中國糖尿病患者約為人口的3.6％，共4000萬，90％以上為II型。印度糖尿病患者多于我國。糖尿病患者需終生用藥，因此開發(fā)高效低價的II型糖尿病新藥具有重大的社會保健意義和經(jīng)濟意義。
II型糖尿病患者是一個病因復(fù)雜的群體，其主要特點是胰臟具有合成胰島素能力，但胰島素分泌量不足，餐后胰島素分泌滯后。
一般而言，可以通過使用胰島素、口服藥物以及飲食控制等手段來治療或控制糖尿病。根據(jù)1988年日本對糖尿病臨床治療的調(diào)查，飲食控制占35％，注射胰島素占25％，口服藥物占40％。
對NIDDM病人，促進胰臟β-細(xì)胞分泌胰島素進而控制血糖是II型糖尿病治療藥物的一個重要目標(biāo)，磺酰脲類藥物提供了促進胰島素分泌治療NIDDM的途徑，但其促進胰臟分泌胰島素作用并不依賴血糖濃度的高低，藥物進入體內(nèi)后不斷地刺激胰臟分泌胰島素，容易產(chǎn)生低血糖，對糖基血紅蛋白HbA1c含量無降低作用。此類藥物還有諸多副作用，而且每年都有相當(dāng)數(shù)量的糖尿病患者應(yīng)用此類藥物不再奏效。
近年來對促胰島素分泌肽GLP-1和Exendin 4的研究進展很快，應(yīng)用于治療II型糖尿病效果很好。GLP-1是人腸道中分離純化得到的多肽，Exendin4從墨西哥巨蜥蜴的毒液中分離得到(1996年Jean-Pierre Ranfman首先在《Regulatory Peptides》雜志上報道發(fā)現(xiàn)Exendin 4)。兩者在很低濃度下即可促進胰臟合成和分泌胰島素(Diabetologia，1996年，39卷，1546-1553頁；Diabetologia，1999年，42卷，45-50頁)，從而能幫助糖尿病人控制血糖。
研究表明，缺乏C肽與糖尿病的并發(fā)癥存在密切聯(lián)系，這些并發(fā)癥包括腎功能衰竭，神經(jīng)功能失控以及視網(wǎng)膜病變。胰島細(xì)胞在分泌胰島素的同時，會相應(yīng)分泌C肽。因此，GLP-1和Exendin 4給藥能同時促進胰島素和C肽的分泌，這有助于減輕上述并發(fā)癥的癥狀，控制糖尿病的病情。
以上這些研究表明促胰島素分泌肽在II型糖尿病治療方面良好的應(yīng)用前景。
美國專利USP 05424286公開了Exendin 4與GLP-1促胰島素分泌的對比實驗。與GLP-1相比，產(chǎn)生促胰島素分泌作用所需的Exendin 4濃度更低，而且Exendin 4在人體內(nèi)的半衰期更長。這些研究表明，Exendin 4可能成為一種較為理想的II型糖尿病治療藥物。
一般可采用化學(xué)合成和基因工程技術(shù)兩種方法生產(chǎn)多肽。但生產(chǎn)Exendin4的成本很高，這成為其進入藥品市場的障礙。
通過改變肽鏈中的少數(shù)若干個氨基酸可得到Exendin 4的類似物，這些類似物有可能具有與Exendin 4相似的促胰島素分泌作用，同時又可以大規(guī)模低成本地進行生產(chǎn)，從而有可能為糖尿病患者大量提供價格很低的促胰島素分泌肽藥品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了三種促胰島素分泌肽Exendin 4類似物及其鹽在制備治療II型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的促胰島素分泌肽Exendin 4類似物的分子結(jié)構(gòu)如式1和式2所示10H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-20 30Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-40Pro-Ser-Ser-Gly-A1a-Pro-Pro-Pro-Ser-Arg-OH (式1)10H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu(Ile)-20 30Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-40Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Arg-OH (式2)式2中第14個氨基酸為Leu或Ile。
上述三種促胰島素分泌肽的結(jié)構(gòu)及制備方法均已由本發(fā)明的申請人在其申請?zhí)枮?1112856.9，申請日為2001年5月10日的發(fā)明專利申請說明書中公開。
天然的Exendin 4是一個由39個氨基酸構(gòu)成的多肽，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式3所示10H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-20 30Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-39Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2(式3)
式1的Lys20，Arg40與Exendin 4相區(qū)別，簡寫為Exendin 4(Lys20，Arg40)。
式2的Leu14(Ile14)，Lys20，Arg40與Exendin 4相區(qū)別，簡寫為Exendin4(Leu14/Ile14，Lys20，Arg40)。
本發(fā)明提供的Exendin 4類似物是兩性化合物，可與酸性或堿性物質(zhì)反應(yīng)形成鹽。通常采用的形成酸加成鹽的酸為鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，硫酸，磷酸，對-甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，對溴苯基磺酸，碳酸，琥珀酸，檸檬酸，苯甲酸，乙酸等。這類鹽的例子包括硫酸鹽，焦硫酸鹽，硫酸氫鹽，亞硫酸鹽，亞硫酸氫鹽，磷酸鹽，磷酸氫鹽，磷酸二氫鹽，偏磷酸鹽，焦磷酸鹽，鹽酸鹽，溴化物，碘化物，乙酸鹽，丙酸鹽，癸酸鹽，辛酸鹽，丙烯酸鹽，甲酸鹽，異丁酸鹽，己酸鹽，庚酸鹽，丙炔酸鹽，草酸鹽，丙二酸鹽，丁二酸鹽，辛二酸鹽，癸二酸鹽，富馬酸鹽，馬來酸鹽，丁炔-1，4-二酸鹽，己炔-1，6-二酸鹽，苯甲酸鹽，氯苯甲酸鹽，甲基苯甲酸鹽，二硝基苯甲酸鹽，羥基苯甲酸鹽，甲氧基苯甲酸鹽，苯乙酸鹽，苯丙酸鹽，苯丁酸鹽，檸檬酸鹽，乳酸鹽，γ-羥基丁酸鹽，甘醇酸鹽，酒石酸鹽，甲磺酸鹽，丙磺酸鹽，萘-1-磺酸鹽，萘-2-磺酸鹽，扁桃酸鹽等，優(yōu)選的酸加成鹽是Exendin 4類似物與無機酸如鹽酸，氫溴酸，尤其是鹽酸形成的鹽。
堿性物質(zhì)也可以與Exendin 4反應(yīng)形成鹽，這些堿性物質(zhì)包括銨，堿金屬或堿土金屬的氫氧化物，以及碳酸鹽，碳酸氫鹽等。典型的有氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，碳酸鉀等。
本發(fā)明的此一用途，可以通過提供包含該活性成分的各種制劑來實現(xiàn)，這些制劑包括有注射劑，口含片，舌下貼片，口頰膜貼片，腸溶制劑，鼻噴劑，肺部吸入劑，直腸栓劑，皮下包埋劑。
用本發(fā)明提供的糖尿病治療方法，將低價高效的促胰島素分泌肽應(yīng)用于II型糖尿病治療，能夠降低治療成本，改善治療效果，顯著提高糖尿病患者的生活質(zhì)量。
圖2為Exendin 4(Lys20，Arg40)的促胰島素分泌作用實驗結(jié)果示意圖。
圖3為Exendin 4(Lys20，Arg40)的促C肽分泌作用實驗結(jié)果示意圖。
實施例1 Exendin 4(Lys20，Arg40)和Exendin 4(Leu14，Lys20，Arg40)對NOD小鼠的降血糖作用實驗材料與方法NOD小鼠禁食過夜(中國科學(xué)院上海動物中心提供)0.9％NaCl溶液，Exendin 4(Lys20，Arg40)，Exendin 4(Leu14，Lys20，Arg40)血糖測定試劑盒(中國衛(wèi)生部上海生物制品所出品)NOD小鼠禁食過夜，分為三組。第一組腹腔注射200微升40％葡萄糖和1微克Exendin 4(Lys20，Arg40)，第二組腹腔注射200微升40％葡萄糖和2微克Exendin 4(Leu14，Lys20，Arg40)，第三組為對照組，只注射葡萄糖。立刻用刻度毛細(xì)管(注射前以肝素處理)從眼竇取血20微升，置入300微升生理鹽水中混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，血清用于血糖濃度測定。分別于30，60，120分鐘按同樣操作取血，分離血清。三組血清均按照試劑盒所述方法測定血糖濃度，以檢驗GLP-1(7-36)的降血糖作用。
結(jié)果如

圖1所示。
對照組血糖濃度大幅度升高后，逐漸回落到正常水平；而給藥組血糖濃度未出現(xiàn)顯著升高，一直保持在正常水平附近。這是由于給藥后促進了胰島素分泌，從而避免了血糖濃度的大幅波動。由此可證明Exendin 4(Lys20，Arg40)和Exendin 4(Leu14，Lys20，Arg40)的降血糖作用。
實施例2 Exendin 4(Lys20，Arg40)的促胰島素分泌作用實驗材料與方法
NOD小鼠(中國科學(xué)院上海動物中心提供)40％葡萄糖溶液，0.9％NaCl溶液，Exendin 4(Lys20，Arg40)放射免疫胰島素測定試劑盒(中國衛(wèi)生部上海生物制品所出品)NOD小鼠分成兩組。首先用刻度毛細(xì)管(先以1mg/mL肝素潤洗毛細(xì)管內(nèi)壁并晾干)從眼竇取血50微升，然后兩組小鼠分別腹腔注射5微克Exendin 4(Lys20，Arg40)和200微升生理鹽水，并記此時為零時刻。然后分別于5，10，20，30分鐘按同樣操作取血。取血后各血樣立刻加入盛有50微升生理鹽水的離心管中，混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，按放射免疫試劑盒使用方法測定血清中胰島素濃度，以檢驗Exendin 4(Lys20，Arg40)的促胰島素分泌作用。
實驗結(jié)果如圖2所示。該結(jié)果表明，腹腔注射Exendin 4(Lys20，Arg40)能顯著促進胰島素的分泌。
實施例3 Exendin 4(Lys20，Arg40)的促C肽分泌作用實驗材料與方法健康C57/BL小鼠(中國科學(xué)院上海動物中心提供)40％葡萄糖溶液，0.9％NaCl溶液，Exendin 4(Lys20，Arg40)放射免疫胰島素測定試劑盒(中國衛(wèi)生部上海生物制品所出品)放射免疫C-肽測定試劑盒(中國衛(wèi)生部上海生物制品所出品)健康C57/BL小鼠分成兩組。首先用刻度毛細(xì)管(先以1mg/mL肝素潤洗毛細(xì)管內(nèi)壁并晾干)從眼竇取血50微升，然后兩組小鼠分別腹腔注射5微克Exendin 4(Lys20，Arg40)和200微升生理鹽水，并記此時為零時刻。然后分別于5，10，20，30分鐘按同樣操作取血。取血后各血樣立刻加入盛有50微升生理鹽水的離心管中，混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，按放射免疫試劑盒使用方法測定血清中C肽濃度，以檢驗Exendin 4(Lys20，Arg40)的促C肽分泌作用。
實驗結(jié)果如圖3所示。該結(jié)果表明，腹腔注射Exendin 4(Lys20，Arg40)能顯著促進C肽的分泌。
權(quán)利要求
1.促胰島素分泌肽Exendin 4類似物在制備治療II型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促胰島素分泌肽Exendin 4類似物的鹽在制備治療II型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促胰島素分泌肽Exendin4類似物及其鹽的新用途,具體來說,公開了促胰島素分泌肽Exendin4類似物及其鹽在制備治療II型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將Exendin4類似物應(yīng)用于II型糖尿病治療,能夠降低治療成本,改善治療效果,顯著提高糖尿病患者的生活質(zhì)量。
文檔編號A61P3/10GK1381271SQ0211156
公開日2002年11月27日 申請日期2002年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月29日
發(fā)明者孫玉昆, 伍登熙, 朱志勇, 余剛, 沈春娟, 趙少凌, 周加祥 申請人:上海華誼生物技術(shù)有限公司