專利名稱：川楝素作為引起瘤細(xì)胞分化和凋亡的誘導(dǎo)劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從楝屬植物中提取的三萜化合物—川楝素的新用途，特別涉及其作為引起瘤細(xì)胞分化和凋亡的誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。
由受精卵到動(dòng)物個(gè)體的發(fā)育過程中，細(xì)胞的分化和細(xì)胞的凋亡是必不可少的環(huán)節(jié)。細(xì)胞分化是未定型細(xì)胞在形態(tài)、特性及生化組成上向?qū)Ｒ缓吞禺愋苑较蜣D(zhuǎn)化，由原來較簡單的可塑性狀態(tài)向異樣化穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生具不同形態(tài)、功能的細(xì)胞類型的過程，是生物體形成組織，器官的重要手段(Sci.Am.，253136-147，1985；Cell differentiation，1867-68，1986)。細(xì)胞凋亡也稱細(xì)胞程序性死亡，是在發(fā)育一定階段，細(xì)胞出現(xiàn)的自然死亡，是有機(jī)體發(fā)育過程中去除多余的結(jié)構(gòu)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目，去除有害及受損細(xì)胞的方式，對(duì)機(jī)體的正常生命活動(dòng)是不可豁缺的(Science，259760-761，1993；Cancer andMetastosis Review，1195-102，1992)。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖同等重要，這種生與死的動(dòng)態(tài)平衡保證了細(xì)胞向特定的組織、器官分化，構(gòu)筑成熟的機(jī)體，維持正常的生理功能。細(xì)胞凋亡也與胚胎發(fā)育缺陷，組織分化錯(cuò)亂，腫瘤及某些疾病的發(fā)生有密切關(guān)系?；诩?xì)胞分化和細(xì)胞凋亡的重要性，它們發(fā)生及調(diào)控機(jī)制一直是生命科學(xué)中的研究熱點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡的藥物，無論從基礎(chǔ)理論研究，還是從實(shí)際應(yīng)用角度，其重要意義不言而喻。這些藥物將為治療多種疾病，如神經(jīng)退行性疾病及腫瘤等開拓光明前景，在器官移植中也是不可缺少的。
腫瘤是目前人類疾病中發(fā)病及死率居高不下的疾病之一。腫瘤細(xì)胞的重要特性就是不能進(jìn)行正常的分化，啟動(dòng)正常的凋亡過程。腫瘤細(xì)胞的分化程度越低，對(duì)現(xiàn)有的放療和化療藥物越不敏感，因而惡性程度越高。由此，發(fā)現(xiàn)能引起腫瘤細(xì)胞分化或凋亡的藥物，能使腫瘤細(xì)胞停止惡性增殖，進(jìn)入分化和凋亡程序，直至死亡，無疑是研制腫瘤治療藥物的正確選擇途徑。近年我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)的三氧化二砷(As2O3)，在低濃度下可引起早幼粒性白血病細(xì)胞(Leukemic pro myelocyte)凋亡或部分分化，已應(yīng)用于臨床治療白血病，取得療效(Blood，873404-3409，1996；Blood，893354-3360，1997)。


圖1是川楝素作用24小時(shí)后所引起的PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化示意圖。其中(A)對(duì)照組細(xì)胞(B)1.0×10-7g/ml川楝素作用組(C)2.5×10-7g/ml川楝素作用組(D)5.0×10-7g/ml川楝素作用組圖2是川楝素作用24(空心圓)及48小時(shí)(實(shí)心方塊)后，PC12細(xì)胞的分化百分比示意圖。其中結(jié)構(gòu)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(每次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取150個(gè)細(xì)胞)，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。與對(duì)照組(川楝素濃度為0)相比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
圖3是流式細(xì)胞儀對(duì)PC12細(xì)胞DNA含量的分析(A-D)及凋亡細(xì)胞百分比(E)示意圖。在A-D中，橫坐標(biāo)0-60處對(duì)應(yīng)的為凋亡細(xì)胞，80附近對(duì)應(yīng)的是G0/G1期細(xì)胞，150附近對(duì)應(yīng)的是G2/M期的細(xì)胞，E為它們的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。其中(A)對(duì)照組細(xì)胞(B)5.0×10-7g/ml川楝素作用24小時(shí)(C)5.0×10-7g/ml川楝素作用48小時(shí)(D)5.0×10-7g/ml川楝素作用72小時(shí)(E)PC12細(xì)胞凋亡百分比。結(jié)構(gòu)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。與對(duì)照組相比較，*P＜0.05。
實(shí)驗(yàn)方法神經(jīng)瘤細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入分化程序的標(biāo)志是神經(jīng)突起的生長。測定細(xì)胞分化，采用測量神經(jīng)細(xì)胞突起的長度，以確定分化細(xì)胞的百分比(方法見經(jīng)典文獻(xiàn)J.Neuroscience，155966-5975，1995；Neuroscience，86611-617，1998)的經(jīng)典方法。即在顯微鏡下逐個(gè)測量細(xì)胞突起的長度，凡長度大于胞體直徑1.5倍的細(xì)胞被視為分化細(xì)胞，隨機(jī)選取不同視野的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分化細(xì)胞百分比。
檢測細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀是一種對(duì)細(xì)胞的物理、化學(xué)性質(zhì)，如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)及抗原等進(jìn)行快速測定并可分類收集的一項(xiàng)技術(shù)。它可以通過對(duì)細(xì)胞DNA含量的分析來確定處于不同細(xì)胞增殖階段及進(jìn)入凋亡程序的細(xì)胞數(shù)目。是檢測凋亡細(xì)胞的常用方法。文獻(xiàn)BiochinBiophys Acta，1133275-285，對(duì)該技術(shù)有詳盡的敘述。
結(jié)果和實(shí)例將傳代的PC12細(xì)胞于培養(yǎng)液中做增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)液為RPMI1640，另加入10％馬血清，5％小牛血清，100單位/毫升的青霉素，100單位/毫升的鏈霉素，于37℃，95％空氣+5％CO2，pH7.4條件下培養(yǎng)，于培養(yǎng)不同時(shí)間(24，48，72小時(shí))后，分別檢測分化細(xì)胞的百分比和凋亡細(xì)胞比例，作為對(duì)照組。觀察川楝素誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞亦在同樣條件下培養(yǎng)，但于培養(yǎng)液中加入不同濃度的川楝素，亦于培養(yǎng)后不同時(shí)間，檢測分化細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的所占的比例，并與對(duì)照組數(shù)據(jù)比較。使用的川楝素是經(jīng)兩次乙醇重結(jié)晶的純品，含量＞98％。獲得的結(jié)果是1.PC12細(xì)胞經(jīng)含川楝素(1.0～5.0×107g/ml)的培養(yǎng)液培養(yǎng)后(24或48h)，引起細(xì)胞分化(圖1)，統(tǒng)計(jì)的分化細(xì)胞百分比，明顯高于對(duì)照組的(圖2)。
2.當(dāng)在含川楝素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)時(shí)，引起細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞比例可達(dá)20％，明顯大于對(duì)照組的(圖3)。
3.川楝素濃度低于10-7g/ml數(shù)量級(jí)不影響PC12細(xì)胞增殖，高于此數(shù)量級(jí)將更迅速引起細(xì)胞的凋亡。
這些結(jié)果清楚地表明在一定濃度范圍，川楝素既引起細(xì)胞分化，又誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
權(quán)利要求
1.一種川楝素作為引起瘤細(xì)胞分化和凋亡的誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了川楝素作為能引起瘤細(xì)胞分化和凋亡的誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn),證明從楝屬植物分離、純化的川楝素在一定濃度范圍具促進(jìn)瘤細(xì)胞分化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。川楝素及其具相似的上述兩種作用的衍生物,將成為促進(jìn)細(xì)胞分化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一類有用化合物,也可能發(fā)展成為應(yīng)用于臨床(如治療腫瘤)的治療藥物。
文檔編號(hào)A61K31/352GK1381234SQ0211156
公開日2002年11月27日 申請日期2002年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月29日
發(fā)明者施玉梁, 王中峰, 王文萍, 湯勉芝 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究中心