專利名稱：2－去甲基2－甲氧基－吸水菌酯素,其制備方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的2-去甲基2-甲氧基-吸水菌酯素化合物，其制備方法，以該化合物為活性成分的藥物組合物，以及它在預(yù)防和治療肺癌、白血病的藥物上的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于提供一種從鏈霉菌Streptomyces sp.CS發(fā)酵液中提取分離出來(lái)的化合物2-去甲基2-甲氧基-吸水菌酯素。
本發(fā)明的另一目的是提供一種預(yù)防和治療病原菌感染及肺癌、白血病的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供化合物2-去甲基2-甲氧基-吸水菌酯素在制備預(yù)防和治療病原菌感染及肺癌、白血病的藥物方面的用途。
發(fā)明人由云南美登木(Maytenus hookeri)愈傷組織分離得到的鏈霉菌Streptomyces sp.CS的發(fā)酵液中提取分離出來(lái)一種新的化合物2-去甲基2-甲氧基-吸水菌酯素，該化合物具有多種有價(jià)值的藥物活性。
本發(fā)明新的化合物2-去甲基2-甲氧基-吸水菌酯素用式(I)表示
式(I)化合物的制備方法包括從云南美登木(Maytenus hookeri)愈傷組織分離得到的鏈霉菌Streptomyces sp.CS，經(jīng)液體發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵液的乙酸乙脂提取物，用抗真菌活性追蹤法，經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析和反向硅膠柱層析分離得到，化合物的名稱為2-去甲基2-甲氧基-吸水菌酯素(2-demethyl-2-methoxylhygrolidin)。
式(I)化合物的制備方法更具體地步驟是，首先把放線菌CS菌株從甘油管中移出，進(jìn)行斜面活化，然后用滅過(guò)菌的組成為葡萄糖，麥芽提取物，酵母提取物的GMY液體培養(yǎng)基懸浮斜面孢子，放入發(fā)酵罐中，28℃水浴恒溫培養(yǎng)48小時(shí)后，接種于新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)96小時(shí)后，收集培養(yǎng)液，通過(guò)硅藻土壓濾后，進(jìn)行D101大孔樹脂柱層析，大孔樹脂經(jīng)水充分洗滌后，再用丙酮洗脫，收集丙酮液，減壓回收丙酮得深紅色粘稠狀水溶液，用乙酸乙酯萃取和水相減壓濃縮至干得提取物；然后提取物用Wakogel硅膠拌樣后進(jìn)行硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙脂1∶1或1∶2，甲醇梯度洗脫，再經(jīng)反復(fù)反向硅膠柱層析，甲醇∶水梯度洗脫，得式(I)化合物。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物對(duì)肺癌、白血病、多種人體病原菌感染具有預(yù)防和治療作用。本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的式(I)化合物和藥學(xué)上可以接受的載體。
本發(fā)明的化合物和藥物組合物可用于制備預(yù)防和治療肺癌、白血病以及抗人體病原菌的藥物。
上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等，粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過(guò)口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式是片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑、鼻噴霧劑和注射劑，特別優(yōu)選在腸道的特定部位釋放的制劑。
本發(fā)明的藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1％-99.5％的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5％-95％的活性成分。
本發(fā)明化合物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量可以是0.01-10mg/kg體重，優(yōu)選0.1-5mg/kg體重?？梢砸淮位蚨啻问┯?。
下面的實(shí)施便可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例12-去甲基2-甲氧基-吸水菌酯素(2-demethyl-2-methoxylhygrolidin)化合物(以下簡(jiǎn)稱CSN3)的制備1.1鏈霉菌Streptomyces sp.CS的大規(guī)模發(fā)酵
先從云南美登木(Maytenus hookeri)愈傷組織分離得到鏈霉菌Streptomyces sp.CS(以下鏈霉菌簡(jiǎn)稱CS)，具體方法為將云南美登木新鮮葉片表面消毒后，切成小片，接種到裝有改良MS培養(yǎng)基的三角瓶中，25遮光培養(yǎng)，培養(yǎng)后及時(shí)將長(zhǎng)有細(xì)菌和霉菌的葉片淘汰。30天后，將葉片和愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中。當(dāng)愈傷組織上長(zhǎng)出與內(nèi)生菌相似的菌落后，將菌落轉(zhuǎn)移到適宜的培養(yǎng)基中，經(jīng)此步驟得到CS。然后把CS菌株從甘油管中移出，進(jìn)行斜面活化，然后用滅過(guò)菌的GMY液體培養(yǎng)基(其組成為葡萄糖4g，麥芽提取物10g，酵母提取物4g，水1000mL)懸浮斜面孢子，放入25L的發(fā)酵罐中(20L液體培養(yǎng)基)，28℃水浴恒溫，培養(yǎng)48小時(shí)后，接種于150L的新鮮培養(yǎng)基中(200L發(fā)酵罐)，培養(yǎng)96小時(shí)后，收集培養(yǎng)液，通過(guò)硅藻土壓濾后，進(jìn)行大孔樹脂柱層析(D101)。大孔樹脂經(jīng)水充分洗滌后，再用丙酮洗脫，收集丙酮液，減壓回收丙酮得1L深紅色粘稠狀水溶液。用乙酸乙酯萃取得19.4g提取物，水相減壓濃縮至干，得45g提取物。
1.2乙酸乙酯提取物中活性化合物的分離提取CSN3的分離乙酸乙脂提取物用Wakogel硅膠拌樣后，硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙脂(石油醚，1∶1，1∶2，乙酸乙脂，甲醇)梯度洗脫，根據(jù)TLC結(jié)果合并，共分成11個(gè)部分。生物活性檢測(cè)結(jié)果表明，第2-6部分有抗橙色青霉(P.avellaneumUC-4376)活性(記為CSN共400mg)。合并活性部分，經(jīng)反復(fù)反向硅膠柱層析，甲醇∶水梯度洗脫，根據(jù)TLC結(jié)果合并，共收集13個(gè)組分。TLC檢測(cè)表明第11分為一個(gè)點(diǎn)，抗真菌活性測(cè)試陽(yáng)性，則為本發(fā)明化合物2-去甲基2-甲氧基-hygrolidin，簡(jiǎn)稱CSN3 20mg。
1.3活性化合物CSN3的結(jié)構(gòu)鑒定[α]D28-29.5(c，20，MeOH)，高分辨快速原子轟擊質(zhì)譜給出該化合物的分子式為C38H58O12(HRFABMS-，m/z實(shí)測(cè)值705.3833，計(jì)算值705.3850)，同時(shí)測(cè)得了1個(gè)主要碎片峰115的組成為C4H3O4*(m/z實(shí)測(cè)值115.0031，計(jì)算值115.0031)。該化合物的紅外吸收光譜在1690.7cm-1和1714.4cm-1處的吸收表明碳碳雙鍵的存在，在2934cm-1和2966.9cm-1的吸收表明飽和烷基的存在，在3482.3cm-1的吸收表明羥基和/或羧基的存在。
化合物CSN3的碳譜(包括DEPT)給出38個(gè)信號(hào)包括8個(gè)甲基，2個(gè)甲氧基，3個(gè)亞甲基，18個(gè)次甲基和7個(gè)季碳(其中3個(gè)羰基碳)。根據(jù)HMQC和HMBC實(shí)驗(yàn)，我們確定了CSN3的結(jié)構(gòu)為hygrolidin型16元大環(huán)內(nèi)酯，并且確定了HRFABMS-給出的C4H3O4*片段的結(jié)構(gòu)為2-丁烯二酸，又根據(jù)C-21位質(zhì)子與C-1’的遠(yuǎn)程相關(guān)關(guān)系，確定了2-丁烯二酸的取代位置是C-21，因此化合物CSN3的化學(xué)結(jié)構(gòu)式鑒定為如

圖1所示，并對(duì)全部的NMR光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了指定(表1)，為一新化合物。
實(shí)施例2片劑CSN3 1mg乳糖 180mg玉米淀粉 50mg硬脂酸鎂 3mg實(shí)施例3膠囊劑CSN31mg乳糖190mg硬脂酸鎂2mg制備方法將CSN3與助劑混合，過(guò)篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個(gè)膠囊重200mg，CSN3含量為1mg。
表1.化合物CSN3在CD3OD中的NMR光譜數(shù)據(jù)
實(shí)施例4安瓿劑CSN3 1mg氯化鈉9mg制備方法將CSN3和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過(guò)濾所得溶液在無(wú)菌條件下裝入安瓿瓶中。
實(shí)施例5活性部位CSN的抗真菌和抗癌活性測(cè)試CS菌株的活性成分CSN3是用橙色青霉(P.avellaneum UC-4376)作為指示菌進(jìn)行分離得到的，所以該化合物具有抗真菌活性。于是我們進(jìn)行了活性部位的其它抗菌活性檢測(cè)。
抗菌活性檢測(cè)指示菌橙色青霉(P.avellaneum UC-4376)，大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillius subtillis)、白色念珠菌(Candida albicans)、燕麥鐮刀菌(Fusarium acenaceum)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisies)，灰霉菌(Botryticcinerea)本實(shí)驗(yàn)在云南大學(xué)云南省微生物研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)方法紙片擴(kuò)散法和杯蝶法活性指標(biāo)有無(wú)透明的抑菌圈以及抑菌圈的大小，抑菌圈越大，表明活性越強(qiáng)。
表2.CSN3對(duì)指示菌的抑制作用Table 2.Inhibitory activities of the active fraction CSN against testedmicroorganisms
結(jié)論從表2活性結(jié)果可以看出，該化合物對(duì)原核的大腸桿菌(E coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtillis)，對(duì)真核的釀酒酵母(S.cerevisies)、橙色青霉(P.avellaneumUC-43)等都有很強(qiáng)的抑制作用，所以可以作為一種廣譜的抗菌劑。
實(shí)施例6抗腫瘤生物活性體外篩選實(shí)驗(yàn)篩選方法四氮唑鹽(Methyl-Thiazol-Tetozolium，MTT)還原法。
硫酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法細(xì)胞株P(guān)388小鼠白血病和A-549人肺腺癌作用時(shí)間48-72小時(shí)結(jié)果評(píng)定無(wú)效10-6mol/L(85％弱效10-5mol/L≥85％或10-6mol/L＞50％強(qiáng)效10-6mol/L＞85％或10-7mol/L＞5表3.CSN3對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率％Table 3.The inhibitory rate of the active fraction CSN against tumor cells
結(jié)論從表3可以看出，CSN3在濃度為10-8M時(shí)，對(duì)小鼠白血病細(xì)胞P388和人肺腺癌細(xì)胞A-549有強(qiáng)效抑制作用，所以該化合物可以作為有關(guān)癌細(xì)胞的化學(xué)抑制劑。
權(quán)利要求
1.式(I)所示的化合物2-去甲基2-甲氧基吸水菌酯素(2-demethyl-2-methoxylhygrolidin)
2.權(quán)利要求1化合物的制備方法，其特征在于包括從云南美登木(Maytenushookeri)愈傷組織分離得到鏈霉菌Streptomyces sp.CS，再經(jīng)液體發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物用抗真菌活性追蹤法，經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析和反向硅膠柱層析分離得到式(I)化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于先把鏈霉菌CS菌株從甘油管中移出，進(jìn)行斜面活化，然后用滅過(guò)菌的組成為葡萄糖、麥芽提取物、酵母提取物的GMY液體培養(yǎng)基懸浮斜面孢子，放入發(fā)酵罐中，28℃水浴恒溫培養(yǎng)48小時(shí)后，接種于新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)96小時(shí)后，收集培養(yǎng)液，通過(guò)硅藻土壓濾后，進(jìn)行D101大孔樹脂柱層析，大孔樹脂經(jīng)水充分洗滌后，再用丙酮洗脫，收集丙酮液，減壓回收丙酮得深紅色粘稠狀水溶液，用乙酸乙酯萃取和水相減壓濃縮至干得提取物；然后提取物用Wakogel硅膠拌樣后進(jìn)行硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙脂1∶1或1∶2，甲醇梯度洗脫，再經(jīng)反復(fù)反向硅膠柱層析，甲醇∶水梯度洗脫，得式(I)化合物。
4.用于預(yù)防和治療肺癌的藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1化合物和藥學(xué)上可以接受的載體。
5.用于預(yù)防和治療白血病的藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1化合物和藥學(xué)上可以接受的載體。
6.權(quán)利要求1的化合物在制備預(yù)防和治療肺癌、白血病的藥物上的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1化合物在制備治療病原菌感染病的藥物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎的2－去甲基2－甲氧基－吸水菌酯素化合物,其制備方法,以該化合物為活性成分的藥物組合物,以及它在預(yù)防和治療肺癌、白血病的藥物上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1367256SQ02113278
公開(kāi)日2002年9月4日 申請(qǐng)日期2002年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月25日
發(fā)明者魯春華, 沈月毛, 趙沛基, 甘煩遠(yuǎn), 郝小江 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所