專利名稱：紫草萘醌類衍生物及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類紫草萘醌類衍生物及其在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
多種中藥所含的萘醌類化合物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有一定的抗腫瘤活性，如從硬紫草根分離的β-羥基異戊酰紫草素可誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞凋亡；β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)人前列腺癌細(xì)胞(DU145，LNCaD，PC-3)具有抑制作用；新疆紫草素對(duì)大腸癌細(xì)胞有抑制作用，并使細(xì)胞凋亡等。只是由于它們的抗腫瘤活性不夠高，目前仍未能在臨床使用[中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，中草藥現(xiàn)代研究(第二卷)，p274，1996年，北京醫(yī)科大學(xué)-中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社]。
我們?cè)谘芯孔喜葺刘惢衔锘瘜W(xué)反應(yīng)性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，它們能夠與不同的親核試劑反應(yīng)，生成不同取代程度、不同取代位置的衍生物。對(duì)這些衍生物進(jìn)行體外癌細(xì)胞抑制試驗(yàn)表明，它們對(duì)多種癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性比天然紫草萘醌類化合物強(qiáng)得多(50～250倍)。用人癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)證明了天然紫草萘醌類化合物經(jīng)過化學(xué)修飾后得到的衍生物，具有優(yōu)良的抗癌活性。
本發(fā)明的紫草萘醌類衍生物如以下式I所示
式I中的R1，R2，R3所代表的基團(tuán)可以是以下各項(xiàng)之一(1)、R1為OH、(CH3)2C＝CHCOO、H3COO或CH3COOC(CH3)2CH2COO；R2為(CH3)2N、PhNH、CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5SR3為H；(2)、R1為OH、(CH3)2C＝CHCOO、CH3COO或CH3COOC(CH3)2CH2COO；R2為H；R3為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；(3)、R1為OH、(CH3)2C＝CHCOO、CH3COO或CH3COOC(CH3)2CH2COO；R2為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R3為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S、HOC2H4S或C2H5S；(4)、R1為PhNH、p-CH3COPhNH、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R2為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R3為H；(5)、R1為PhNH、p-CH3COPhNH、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R2為H；R3為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；(6)、R1為PhNH、p-CH3COPhNH、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R2為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R3為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；(7)、R1為OH、CH3)2C＝CHCOO、H3COO或CH3COOC(CH3)2CH2COO；R2＝R3＝H。
本發(fā)明的式I所示的紫草萘醌類衍生物，可以通過天然紫草萘醌類化合物與不同的親核試劑反應(yīng)，生成不同取代程度、不同取代位置的紫草萘醌類衍生物。
本發(fā)明所說的天然紫草萘醌類化合物，例如紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetyshikonin)、β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧(β，β-dimethyacrylalkannin)等可從紫草中提取，經(jīng)分離和純化制得。
本發(fā)明通過體外癌細(xì)胞抑制試驗(yàn)表明，紫草萘醌類衍生物對(duì)多種癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。
本發(fā)明通過人癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型體內(nèi)試驗(yàn)，證明了紫草萘醌類衍生物具有優(yōu)良的抗癌活性。
本發(fā)明通過動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)，確定紫草萘醌類衍生物或其藥學(xué)組合的使用劑量范圍是10～100mg/kg/day。
本發(fā)明通過動(dòng)物毒理實(shí)驗(yàn)，確定紫草萘醌類衍生物是一類在有效治療劑量范圍內(nèi)毒副作用小、可以長(zhǎng)期服用的藥物。
根據(jù)本發(fā)明，上述式I所示化合物或其藥學(xué)組合可以制成注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑的形式使用；其給藥途徑可為口服、經(jīng)皮、靜脈或肌肉。
稱取5kg的四川密花滇紫草，磨碎過20目篩，用95％乙醇進(jìn)行常溫滲漉提取，至近無(wú)色為止。合并提取液，減壓濃縮，于濃縮液中加入相當(dāng)于1/3～1/2濃縮液體積的2％NaOH，溶液由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色。過濾除去不溶物后加入濃HCl酸化，此時(shí)溶液由藍(lán)色變?yōu)樽霞t色，同時(shí)有大量沉淀物生成，靜置過夜。濾出沉淀物，用蒸餾水洗至近中性。將沉淀物干燥，得粉末狀固體粗產(chǎn)物約60g。將粗產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，加硅膠適量攪拌勻，自然揮干后上柱。色譜柱的填料為120～160目硅膠，洗脫劑用石油醚(60～90℃)-丙酮和石油醚-丙酮-三氯甲烷，依次洗脫并收集。濃縮后經(jīng)重結(jié)晶分別得到下列四個(gè)紫草素類化合物紫草素(Shikonin，1)0.60g、乙酰紫草素(acetylshikonin，2)0.85g、β，β-二甲基丙烯酰紫草素(β，β-dimethylacrylshikonin，3)2.30g、β-乙酰氧基異戊酰紫草素(β-acetoxyisovalerylshikonin，4)0.93g。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)已經(jīng)MNR、MSUV和元素分析數(shù)據(jù)確定。 實(shí)施例二阿卡寧類萘醌化合物的提取、分離及純化阿卡寧類化合物[R1＝OH、(CH3)2C＝CHCOO、CH3COO或CH3COOC(CH3)2CH2COO，R2＝R3＝H]萘醌衍生物的構(gòu)型為S-型，在新疆軟紫草[Arnebia euchroma(Royle)Johust]中含量較高。
新疆軟紫草干根5kg粉碎后，用石油醚(30～60℃)12升，在室溫浸泡提取兩次。浸取液過濾后，經(jīng)常壓和減壓脫溶劑，得黑紅色膏狀物約80g。將該提取濃縮物用硅膠柱層析粗分，用石油醚(69-90℃)-乙酸乙酯梯度洗脫，得到不同極性溶劑洗脫的四個(gè)紅色組分。進(jìn)一步用快速硅膠柱層析進(jìn)行分離純化，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫。最后分離出四個(gè)紅色或紫紅色物質(zhì)阿卡寧(alkannin，5)1.20g、乙酰阿卡寧(acetylalkannin，6)1.65g、β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧(β，β-dimethylacrylalkannin，7)2.85g、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧(β-acetoxyisovalerylalkannin，8)1.42g。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)已經(jīng)UV、IR、NMR分析確定。 實(shí)施例三R2或R3為取代苯氨基的紫草萘醌衍生物的合成將0.2mmol β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧和1mmol苯胺的甲醇溶液(8mL)在室溫下攪拌反應(yīng)6天，用TLC跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)完成后，減壓脫溶劑，粗產(chǎn)物用快速柱層析分離(用石油醚-乙酸乙酯溶劑為洗脫劑)，得到C-7或C-8位氫被芳胺基取代的產(chǎn)物(9，10)，總產(chǎn)率約80％。 應(yīng)用相同的方法，用β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧為原料，可以合成化合物11和12。 實(shí)施例四R1為取代苯氨基，R2或R3為取代苯氨基的紫草萘醌衍生物的合成在冰浴和攪拌下，一次將NaBH4固體(0.45mmol)加到0.2mmol β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧和1mmol苯胺的甲醇溶液(8mL)中，紅色溶液立即變?yōu)榈S色，在室溫下繼續(xù)攪拌12小時(shí)，黃色溶液又逐漸變?yōu)樽霞t色，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全。減壓脫溶劑，粗產(chǎn)物用快速柱層析分離(用石油醚-乙酸乙酯溶劑為洗脫劑)，得到C-11位酯基被芳胺基取代，同時(shí)C-7或C-8位氫被芳胺基取代的紫紅色產(chǎn)物(13，14)，總產(chǎn)率約75％。 實(shí)施例五R1為苯硫基，R2或R3為苯硫基的紫草萘醌衍生物的合成將0.2mmol β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧和0.45mmol苯硫酚的甲醇溶液(8mL)在室溫下攪拌反應(yīng)8小時(shí)，用TLC跟蹤反應(yīng)。減壓脫溶劑，粗產(chǎn)物用快速柱層析分離(用石油醚-乙酸乙酯溶劑為洗脫劑)，得到C-11位酯基被取代，同時(shí)C-7或C-8位氫被芳巰基取代的紫紅色產(chǎn)物(15，16)，總產(chǎn)率約85％。 應(yīng)用相同的方法，用β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧為原料，可以合成化合物17和18。 實(shí)施例六R1為苯硫基，R2或R3為苯胺基的紫草萘醌衍生物的合成將化合物9或10與苯硫酚的甲醇溶液長(zhǎng)時(shí)間攪拌回流，用TLC跟蹤反應(yīng)。減壓脫溶劑，粗產(chǎn)物用快速柱層析分離(用石油醚-乙酸乙酯溶劑為洗脫劑)，得到C-11位酯基被苯硫基取代，同時(shí)C-7或C-8位氫被芳胺基取代的紫紅色產(chǎn)物(19，20)，總產(chǎn)率約75％。 實(shí)施例七R1、R2和R3均為巰基的紫草萘醌衍生物的合成將0.2mmol β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧與1mmol的2-巰基乙醇的甲醇溶液(10mL)在室溫下攪拌反應(yīng)3d，減壓脫溶劑，粗產(chǎn)物用快速柱層析分離(用石油醚-乙酸乙酯溶劑為洗脫劑)，可得到R1、R2和R3均為巰基的紫紅色化合物(21)，產(chǎn)率約88％。 實(shí)施例八β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧(7)*及其衍生物對(duì)S180，EAC，HepA的細(xì)胞毒作用方法MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的S180、EAC和HepA細(xì)胞，分別稀釋成2×104個(gè)/mL，分裝于96孔板(0.2mL/孔)。設(shè)無(wú)藥對(duì)照組，DMSO對(duì)照組及5個(gè)不同濃度的受測(cè)化合物，每孔10μL。各組設(shè)4個(gè)平行孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。實(shí)驗(yàn)終止前4h加入MTT液(5mg/mL)10μL/孔，再培養(yǎng)4h。棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 100μL/孔，混勻振蕩，使結(jié)晶甲臢完全溶解，在570nm波長(zhǎng)下，用美國(guó)生產(chǎn)的BioRad 550型酶標(biāo)儀測(cè)出OD值，按下列公式計(jì)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(半數(shù)抑制濃度，IC50)。
生長(zhǎng)抑制率＝(1-用藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100％IC50值越小，此化合物的細(xì)胞毒性越大。*天然紫草萘醌化合物中，β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧(7)活性最高，我們選擇此化合物作為標(biāo)準(zhǔn)，比較各種合成的紫草萘醌衍生物的活性。表1.β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧(7)及其衍生物對(duì)S180，EAC，HepA的細(xì)胞毒性(IC50)

結(jié)果表明，化合物7(β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧)對(duì)S180、EAC和HepA的細(xì)胞毒作用較??；化合物9、10、13、14的細(xì)胞毒作用比7增強(qiáng)3-8倍，顯示出中度細(xì)胞毒作用；化合物16的細(xì)胞毒作用很強(qiáng)，比化合物7的細(xì)胞毒作用增強(qiáng)156-213倍，顯示出強(qiáng)細(xì)胞毒作用。實(shí)施例九β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧(7)及其衍生物對(duì)5種人癌細(xì)胞的抑制作用方法MTT法。實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例八。表2.β，β-二甲基丙烯酰阿卡(7)及其他5個(gè)衍生物對(duì)5種人癌細(xì)胞的抑制作用

結(jié)果表明，化合物16和18對(duì)鼻咽癌、乳腺癌、肝癌、肺癌和大腸癌的具有顯著的抑制作用。實(shí)施例十化合物16和18對(duì)鼻咽癌及肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞CNE2或肝癌細(xì)胞Bel-7402，用胰酶消化后配成1×107個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，在無(wú)菌條件下接種于BALB/C裸小鼠靠右腋窩皮下0.2mL/只(相當(dāng)于2×106個(gè)細(xì)胞)。接種后7天，待腫瘤長(zhǎng)至直徑3-5mm時(shí)，按體積大小，隨機(jī)分為對(duì)照組、5-Fu組(陽(yáng)性藥對(duì)照組)、化合物16和18的低、中、高劑量組，每組8只小鼠。分組后當(dāng)天開始給藥，腹腔注射，每天給藥一次，每周6次，連用3周。停藥次日稱體重，處死裸鼠，剝出瘤塊后稱重記錄，算出平均瘤重量，按下列公式計(jì)算抑瘤率，并作t測(cè)驗(yàn)。
抑瘤率＝(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重量/對(duì)照組平均瘤重量)×100％表3.化合物16、18對(duì)人鼻咽癌及肝癌細(xì)胞Bel-7402裸鼠移植瘤的抑制作用

結(jié)果表明，化合物16和18在動(dòng)物耐受劑量下，對(duì)鼻咽癌和肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型有很好的抑制作用，抑制率與劑量呈正相關(guān)。醫(yī)藥上實(shí)用性本發(fā)明的上述實(shí)施例表明(1)通過紫草萘醌類衍生物對(duì)癌細(xì)胞抑制試驗(yàn)和癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型試驗(yàn)，證明了天然紫草萘醌類化合物經(jīng)過化學(xué)修飾后得到的衍生物具有優(yōu)良的抗癌活性。(2)使用本發(fā)明的式1所示紫草萘醌類衍生物，使用劑量范圍是10～100mg/kg/day。(4)使用本發(fā)明的式1所示紫草萘醌類衍生物，在正常劑量下，其作為藥物應(yīng)用是安全的。(5)使用本發(fā)明的式1所示的化合物或它的藥學(xué)組合，具有抗癌效果好、副作用小和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.式I所示的紫草萘醌類衍生物 式I中的R1，R2，R3所代表的基團(tuán)為以下各項(xiàng)之一(1)、R1為OH、(CH3)2C＝CHCOO、H3COO或CH3COOC(CH3)2CH2COO；R2為(CH3)2N、PhNH、CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R3為H；(2)、R1為OH、(CH3)2C＝CHCOO、CH3COO或CH3COOC(CH3)2CH2COO；R2為H；R3為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；(3)、R1為OH、(CH3)2C＝CHCOO、CH3COO或CH3COOC(CH3)2CH2COO；R2為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R3為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S、HOC2H4S或C2H5S；(4)、R1為PhNH、p-CH3COPhNH、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R2為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R3為H；(5)、R1為PhNH、p-CH3COPhNH、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R2為H；R3為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；(6)、R1為PhNH、p-CH3COPhNH、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R2為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S；R3為(CH3)2N、PhNH、p-CH3COPhNH、Ph-N-CH3、PhS、HOC2H4S或C2H5S。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫草萘醌類衍生物，其特征是該紫草萘醌類衍生物為天然紫草中分離純化得到的化合物經(jīng)過化學(xué)修飾后得到的產(chǎn)物。
3.權(quán)利要求1所述的式I的紫草萘醌類衍生物在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
4.一種用于治療癌癥的藥物，其中含有權(quán)利要求1的式I所示的紫草萘醌類衍生物，以及藥學(xué)上可接受的輔助劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征是所述藥物是制成注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、懸浮劑或乳劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及紫草萘醌類衍生物及其在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明,紫草萘醌類衍生物對(duì)于腫瘤細(xì)胞株CNE
文檔編號(hào)A61P35/00GK1374288SQ0211497
公開日2002年10月16日 申請(qǐng)日期2002年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月19日
發(fā)明者古練權(quán), 劉宗潮, 黃志紓, 段志芳, 馬林, 謝冰芬, 朱孝峰 申請(qǐng)人:中山大學(xué)