專利名稱：倍半萜烯類注射劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有倍半萜烯類的植物提取物的新注射劑型，更具體地說涉及這些制劑的脂質(zhì)體劑型，納米脂質(zhì)體劑型，前體脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)納米脂質(zhì)體劑型，納米微乳劑型，靜脈乳劑型，脂質(zhì)納米球劑型和脂肪乳劑型。本發(fā)明還涉及這些劑型的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
近年來，在抗癌天然藥物研究領(lǐng)域中的許多研究人員都致力于研究紫杉醇、欖香烯各種異構(gòu)體、姜黃提取物、溫郁金提取物等的抗癌活性和這些藥物的各種制劑形式。
欖香烯是存在于某些植物中的一種倍半萜類化合物，拉丁名為Elemenum，英文名為Elemene，化學(xué)名是1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙烯基環(huán)己烷，分子式C15H24。欖香烯有多種異構(gòu)體，這些異構(gòu)體中β-欖香烯，δ-欖香烯，γ-欖香烯已被證實有抗癌活性。欖香烯是可以從植物溫郁金(Curcuma Wenyujin Y.H.Chen et C.ling)的根莖(俗稱溫莪術(shù))地揮發(fā)油中提取的化合物，或是從植物香茅(Cymbopoqon citratus(DC.)Stapt)的油中提取的化合物，例如從香茅油中除掉檸檬醛、香茅醇之后余下的混合油狀物，提取的化合物實際上是包含β-欖香烯的欖香烯異構(gòu)體混合物。
上述植物溫郁金與另外兩種可作為天然藥物使用的植物莪術(shù)和姜黃同屬于姜科植物類群，產(chǎn)于中國的廣東、四川、福建、廣西、浙江等省。包含欖香烯的植物有溫郁金、香茅、水菖蒲、土木香、人參等50多種，其中香茅是在中國分布廣、資源充足的植物。目前，欖香烯類化合物主要從溫郁金油和香茅油中提取。
有許多文獻涉及直接采用天然藥物制備防治癌癥的草藥制劑，例如中國專利公開CN1216256A公開了治療肝癌的草藥制劑，它包括含有白花蛇舌草、姜黃，虎杖和山豆根的提取物作為主要天然藥物的可注射組合物(A)和含有白花蛇舌草、重樓、虎杖、山豆根、龍膽草、大黃、連翹、赤芍、姜黃和石菖蒲的提取物作為主要天然藥物的口服組合物(B)。
在中國專利公開CN1302559中公開了姜黃素制劑，它是通過制備在水可混合的有機溶劑中或水和水可混合的有機溶劑的混合物中的姜黃素分子分散體，然后向該溶液添加保護膠體水溶液，姜黃素的疏水相形成毫微分散相。最終的制劑形式主要是水性分散體或干粉，在優(yōu)選的情況下粒徑小于10μm。
在CN1200266A中公開了通過二次分餾從香茅油中提取β-欖香烯的方法。
在中國專利公開CN1247756A中公開了用于治療惡性腫瘤的姜郁注射液，其中姜黃與郁金的重量比為50-60∶50-40，該注射液是一種簡單的混合物。
中國專利公開CN1076613A涉及欖香烯乳注射液及其制備方法，該注射液是一種乳狀液，平均粒徑一般不超過15微米，特別不超過2微米。
中國專利公開CN1244389A涉及欖香烯注射液及其制備方法，該注射液是一種簡單混合物，不是脂質(zhì)體。
中國專利公開CN1110134A涉及脂質(zhì)體制備工藝及制劑，其中特別描述了欖香烯脂質(zhì)體注射液制備方法和由該方法獲得的欖香烯脂質(zhì)體注射液，欖香烯的包封率達85％以上，但沒有給出有關(guān)脂質(zhì)體的平均粒徑的數(shù)據(jù)。從制備方法可以判斷該脂質(zhì)體具有較大的平均粒徑。
中國專利公開CN1221607A涉及利用CO2的臨界或超臨界方法來制備脂溶性藥物脂質(zhì)體的工藝和所制備的欖香烯脂質(zhì)體注射液，雖然欖香烯的脂質(zhì)體的包封率很高，但脂質(zhì)體的平均粒徑同樣太大。
以上這些文獻所公開的制劑在貯存穩(wěn)定性和抗癌活性上都存在著不足。
另外，在一些專利文獻中還公開了欖香烯的各種衍生物和欖香烯金屬絡(luò)合物。例如，在CN11531158A中公開了一種欖香烯金屬絡(luò)合物和它作為抗癌藥物的使用。CN1153167A涉及欖香烯含氮衍生物及其作為抗癌藥物的用途。CN1153168A涉及欖香烯羥基類衍生物及其作為抗癌藥物的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供提取物注射劑，它含有從含有倍半萜烯類的植物中提取的具有總倍半萜烯類含量≥70wt％的提取物，表面活性劑，和含水介質(zhì)，該注射劑是一種水性分散體，分散相的平均粒徑≤1微米，表面活性劑的量是總注射劑的1-5wt％，在注射劑中總倍半萜烯類(活性成分)的濃度是1-10mg/ml。更優(yōu)選地，該含水介質(zhì)是水。
本發(fā)明的另一目的是提供提取物的新注射劑型，更具體地說涉及該提取物的脂質(zhì)體劑型，納米脂質(zhì)體劑型，前體脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)納米脂質(zhì)體劑型，納米微乳劑型，靜脈乳劑型，脂質(zhì)納米球劑型或脂肪乳劑型。
本發(fā)明的另一個目的是提供這些注射劑型的制備方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供這些新劑型的制劑用于制備治療癌癥或缺血性中風(fēng)的藥物注射劑的用途，這些注射劑型用于緩解腫瘤疼痛的用途，以及這些新劑型的制劑用于抑制和/或治療腫瘤的用途。
本發(fā)明提供這些提取物的新注射劑型。以從樹蘭花、香椿子、海風(fēng)藤、丁香、沒藥、黃花杜鵑、葛縷子、百里香、歐芹、廣藿香、茅蒼術(shù)、蛇床子、啤酒花、檀香木、香檸檬、防風(fēng)根、柏木、松節(jié)油、香茅、人參、溫郁金、姜黃等獲取的精油(或稱作揮發(fā)油)中提取的提取物作為原料分別制備成其納米脂質(zhì)體劑型，前體脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)納米脂質(zhì)體劑型，納米微乳劑型，靜脈乳劑型，脂質(zhì)納米球劑型和脂肪乳劑型。這些劑型的平均粒徑一般小于或等于1微米，甚至小于或等于100納米。


圖1是實施例1的注射劑1的透射電鏡照片。
本發(fā)明的詳細說明
現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中已經(jīng)知道欖香烯某些異構(gòu)體、姜黃提取物、溫郁金提取物具備抑制腫瘤的作用，一些文獻公開了這些天然藥物的各種制劑形式(或劑型)，例如脂質(zhì)體、乳劑、脂肪乳等制劑。但是，由于這些劑型的平均粒徑普遍較大，注射到人或動物體內(nèi)后會引起人或動物體內(nèi)的各種反應(yīng)，例如刺激性大，有時候發(fā)生溶血現(xiàn)象。
本發(fā)明人經(jīng)過多年的研究工作，發(fā)現(xiàn)將倍半萜烯類化合物或從植物中提取的含倍半萜烯類的提取物制成平均粒徑≤1微米或≤100納米的各種注射劑型，其中包括脂質(zhì)體劑型，納米脂質(zhì)體劑型，前體脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)納米脂質(zhì)體劑型，納米微乳劑型，靜脈乳劑型，脂質(zhì)納米微球劑型，脂肪乳劑型等，可以克服現(xiàn)有技術(shù)的注射制劑中的諸多問題，尤其本發(fā)明的這些劑型在靜脈注射應(yīng)用中大大減少了刺激性，它們的穩(wěn)定性得到進一步提高。本發(fā)明的新劑型顯著提高了藥物制劑的藥效，但這些劑型的抑制癌細胞的機理目前還不是十分清楚。本發(fā)明人根據(jù)大量的試驗結(jié)果作出以下推測由于本發(fā)明制劑具有小的平均粒徑并且具有特殊的表面性質(zhì)(例如親水/親脂平衡，表面電荷等)，使得這些制劑中的藥物(或活性成分)對癌細胞有較強的親和力，能夠充分附著于癌細胞上，讓活性成分直接作用于癌細胞，達到抑制或殺滅癌細胞的效果。另外，發(fā)現(xiàn)，納米粒度的制劑起效快，防止癌細胞轉(zhuǎn)移方面有一定效果。
同時，盡管本發(fā)明制劑具有小的平均粒徑，但是所獲得的各種劑型的制劑同時具有高的穩(wěn)定性，它們在長時間的貯存中不會發(fā)生凝聚問題，使得可以較長時間進行貯存而不降低穩(wěn)定性。
本發(fā)明提供提取物注射劑，它含有從植物中提取的具有總倍半萜烯類含量≥70wt％的提取物，表面活性劑，和含水介質(zhì)，該注射劑是一種水性分散體，分散相的平均粒徑≤1微米，提取物與表面活性劑的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，在注射劑中總倍半萜烯類(活性成分)的濃度是1-10mg/ml，其中這些植物中排除溫郁金、姜黃，而且提取物的總欖香烯異構(gòu)體含量＜70wt％，優(yōu)選＜60wt％。
本發(fā)明提供另一種提取物注射劑，與上述注射劑相同，只是植物是溫郁金或姜黃。本發(fā)明還提供一種提取物注射劑，與上述第一種注射劑相同，只是提取物含有≥70wt％的總欖香烯異構(gòu)體，該注射劑中的總欖香烯異構(gòu)體的濃度是1-10mg/ml。
本發(fā)明提供上述提取物注射劑的制備方法，它包括用總倍半萜烯類含量≥70wt％的從植物中提取的提取物作為原料，添加表面活性劑，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀成膜或CO2臨界或超臨界方法來混合均勻，添加注射用水，進行高壓均質(zhì)化處理和/或超聲波處理，一直處理到獲得分散相平均粒徑≤1微米的穩(wěn)定水性分散體為止，從而制得注射劑，其中提取物與表面活性劑的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射劑中總倍半萜烯異構(gòu)體的最終濃度為1～10mg/ml。
能夠在本發(fā)明中用來制成新劑型的從植物中提取的倍半萜烯類(在這里有時候稱作活性成分)基本上包括全部倍半萜烯類化合物(C15H24)，倍半萜烯類化合物的混合物或從植物中提取的倍半萜烯類提取物，對于這些提取產(chǎn)物要求倍半萜烯類化合物的純度在70％以上，優(yōu)選在75％以上，更優(yōu)選在85％以上，特別優(yōu)選在90％以上，甚至特別優(yōu)選在95％以上。
需要指出的是，在本發(fā)明中作為本發(fā)明的起始原料來制備各種劑型的制劑的各種提取物可以使用商購的產(chǎn)品如欖香烯產(chǎn)品(提取物)、β-欖香烯產(chǎn)品(提取物)、姜黃提取物或溫郁金提取物，以及從樹蘭花、香椿子、海風(fēng)藤、丁香、沒藥、黃花杜鵑、葛縷子、百里香、歐芹、廣藿香、茅蒼術(shù)、蛇床子、啤酒花、檀香木、香檸檬、防風(fēng)根、柏木、松節(jié)油、香茅、人參等的揮發(fā)油(或精油)中提取的提取物產(chǎn)品。如果在本申請中需要自己制備這些提取物，用于制備這些提取物的各種揮發(fā)油可以使用商購產(chǎn)品，也可以使用通過普通的水蒸汽蒸餾法或CO2超臨界提取法從植物中獲得的揮發(fā)油。每一種提取物能夠用作本發(fā)明的起始原料，而且這些提取物中任何兩種或多種按任何比例的摻合物也能夠用作本發(fā)明的起始原料。
倍半萜烯類包括欖香烯(elemene)，姜黃烯(curcumene)，姜烯(zingiberene)，波旁烯(bourbonene)，蛇麻烯(humulene)，金合歡花烯(farnesene)，杜松烯(cadinene)，芹子烯(selinene)，馬阿里烯(maaliene)，檀香烯(santalene)，廣藿香烯(patchonlene)，石竹烯(也稱作丁香烯，caryophyllene)，吉馬烯(大香葉烯，germacrene)，畢澄茄油烯(cubebene)，柏木烯(cedrene)，長葉烯(longifolene)，防風(fēng)根烯(或紅沒藥烯，bisabolene)，香檸檬烯(bergamotene)，古蕓烯(gurjunene)，愈瘡木烯(guaiene)，衣蘭烯(ylangene)，異石竹烯(isocaryophyllene)，長蒎烯(longipinene)，白菖烯(calarene)，木羅烯(muurolene)，菖蒲二烯(acoradiene)，倍半水芹烯(β-sesquiphellandrene)等。
原則上，從植物中提取的含有60wt％以上倍半萜烯類的所有提取物都可用于制備本發(fā)明的新劑型，倍半萜烯類是所有劑型的活性成分。含有70wt％以上倍半萜烯類的提取物是理想的，含有75wt％以上倍半萜烯的提取物是優(yōu)選的，含有85wt％以上倍半萜烯的提取物是更優(yōu)選的，含有90wt％以上或甚至含有95wt％以上倍半萜烯類的提取物是特別優(yōu)選的。
樹蘭(又稱米仔蘭或珠蘭)主要產(chǎn)于中國福建的樟州和福州，廣東和云南也出產(chǎn)。從樹蘭花(A glaia odorata Lour)中獲取的精油(或稱作揮發(fā)油)主要含有四種倍半萜烯，即α-蛇麻烯，β-欖香烯，β-丁香烯，和樹蘭烯(aglaiene)(參見化學(xué)學(xué)報，1981年增刊，248頁)。香椿子揮發(fā)油(seeds of Toona sinensis)的組成參見中國藥學(xué)雜志2002年2月第37卷第2期的香椿子揮發(fā)油的“GC-MS分析”文章。黃花杜鵑(Rhododendron authopogonoides Maxim)揮發(fā)油的組成參見1980年4月第38卷第2期化學(xué)學(xué)報的“黃花杜鵑揮發(fā)油化學(xué)成分的研究”文章。人參揮發(fā)油(panax ginseng C.A.Mey)的組成在許多文獻有報道(例如參見<常用中藥成分與藥理手冊>的第29頁，中國醫(yī)藥科技出版社)。
術(shù)語的解釋
在本發(fā)明中所述的粒徑或粒度是指分散相的粒徑或粒度。
在本申請中，提取物指從植物中獲取的揮發(fā)油(或精油)經(jīng)真空填料式精餾裝置精餾出的組分或經(jīng)分子蒸餾儀精制出的組分，經(jīng)GC-MS檢測，提取物含有60wt％以上、優(yōu)選70wt％以上、更優(yōu)選75wt％以上、特別優(yōu)選80wt％、甚至更優(yōu)選85wt％的倍半萜烯類。其中倍半萜烯類是指包括全部的倍半萜烯異構(gòu)體。
如果在劑型前加“納米”修飾，則指該劑型的平均粒徑≤150納米，在理想的情況下平均粒徑≤100納米。注射劑和注射制劑可互換使用。
脂質(zhì)體劑型，在本發(fā)明中是指分散或懸浮在含水介質(zhì)中的由磷脂和膽固醇等組成的脂雙層結(jié)構(gòu)，該脂雙層結(jié)構(gòu)類似于細胞膜結(jié)構(gòu)。
納米脂質(zhì)體劑型，在本發(fā)明中是指平均粒徑低于或等于150納米的脂質(zhì)體。
前體脂質(zhì)體劑型，在本發(fā)明中是指在脂質(zhì)體的配方基礎(chǔ)上再添加賦形劑，通過真空冷凍干燥(真空凍干)方法所制備的凍干粉。該凍干粉在臨床應(yīng)用之前通過添加注射用水，經(jīng)過振搖或振蕩，使之恢復(fù)成脂質(zhì)體形態(tài)。
長循環(huán)脂質(zhì)體劑型，簡單地說，在本發(fā)明中是指在脂質(zhì)體的配方基礎(chǔ)上再增加聚乙二醇磷脂酰乙醇胺所制備的脂質(zhì)體。它注射到體內(nèi)后比普通的脂質(zhì)體在體內(nèi)發(fā)揮效用的時間更長，或在體內(nèi)消除緩慢。
納米微乳劑型，指平均粒徑≤150納米，在理想情況下≤100納米的乳劑。
靜脈乳劑型，在本發(fā)明中指平均粒徑≤1微米的注射乳。
脂質(zhì)納米微球劑型，在本發(fā)明中是指平均粒徑≤150納米的脂肪乳。
脂肪乳劑型，在本發(fā)明中要求它的平均粒徑≤1微米；另外在中國國家藥典中也規(guī)定平均粒徑≤1微米。
nm是指納米，μ是指微米。在本申請中純度是指按重量計的百分純度，除非另有說明。
在本發(fā)明中，如果用30米左右長度毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色譜柱BP-5)檢測提取物含有≥70wt％欖香烯(包括各種欖香烯異構(gòu)體的混合物)而且含有＜85wt％β-欖香烯，則該提取物簡稱欖香烯，如果提取物含有≥85wt％β-欖香烯，則該提取物簡稱β-欖香烯。
在本申請中所使用的起始原料是提取物，它的總倍半萜烯類含量≥70wt％，理想的是75wt％，優(yōu)選≥80wt％，更優(yōu)選≥85wt％，特別優(yōu)選≥90wt％，更特別優(yōu)選≥95wt％。
使用這里所述的大約30米(至少24米以上)長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測提取物，含有≥70wt％倍半萜烯類的提取物就可用于本發(fā)明中。
本申請中所使用的提取物原料、試劑沒有特別的限制，只要該提取物是從天然植物中提取并且總倍半萜烯類純度≥70wt％就可在本發(fā)明中使用，更理想的是，該純度≥75wt％，更理想≥80wt％，優(yōu)選≥85wt％，特別優(yōu)選≥90wt％。
除非另有說明，否則在本發(fā)明中使用的其它成分如膽固醇、大豆磷脂、卵磷脂、甘油、亞油酸、聚乙二醇磷脂酰乙醇胺、脂族胺、大豆油等一般要求符合國家藥用標(biāo)準，溶劑也應(yīng)該符合國家藥用標(biāo)準，這些主要出于健康方面的考慮；類似地，對于一些原料用“精制”修飾，表明該原料必須符合國家藥用標(biāo)準，例如精制大豆磷脂是注射劑可用的產(chǎn)品，精制大豆油是注射劑可用的產(chǎn)品。
除非另有說明，否則在本申請中色譜分析所使用的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀是Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色譜柱(大約30米長)是BP-5。
本發(fā)明的各種劑型能夠以靜脈注射、局部給藥方式用于治療目的。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案
在下列的實施方案中作為原料主要使用提取物“欖香烯”、提取物“β-欖香烯”、姜黃提取物、溫郁金提取物，還可以使用樹蘭花、香椿子、海風(fēng)藤、丁香、沒藥、黃花杜鵑、葛縷子、百里香、歐芹、廣藿香、茅蒼術(shù)、蛇床子、啤酒花、檀香木、香檸檬、防風(fēng)根、柏木、松節(jié)油以及香茅、人參等的提取物，以及它們當(dāng)中任何兩種或多種按任何比例的摻合物。顯然，其中某一種倍半萜烯異構(gòu)體的純度較高(例如≥85wt％)的產(chǎn)品都能夠作為原料，而且利用化學(xué)方法合成的各種倍半萜烯類及其衍生物都能夠用于本發(fā)明中。
本發(fā)明提供了脂質(zhì)體或納米脂質(zhì)體的制備方法，它包括將提取物與大豆磷脂、膽固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，優(yōu)選0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更優(yōu)選0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特別優(yōu)選1∶3.2∶1.5進行混合；添加溶劑(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以使混合物充分溶解，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上脫除溶劑成膜，添加余量的注射用水(根據(jù)所要配制的最終濃度來計算該余量)(例如利用注射用水補充至5000ml)，然后將物料作為一批料或分批置入常規(guī)的超聲波細胞粉碎機中進行超聲波處理；取樣利用帶標(biāo)尺的顯微鏡、Coulter儀、電子顯微鏡來檢驗平均粒徑，在達到規(guī)定的平均粒徑例如≤1微米(脂質(zhì)體)，或≤100納米(納米脂質(zhì)體)后，調(diào)節(jié)PH，使PH值為4.5～6.5，經(jīng)0.8μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，100℃蒸汽流滅菌，利用色譜儀(氣相或液相)測得活性成分的最終濃度(倍半萜烯類活性成分的重量(mg)/總制劑體積(ml))為1～10mg/ml，優(yōu)選為2～7.5mg/ml，更通常為5～7.5mg/ml。
納米脂質(zhì)體的包封率檢測用分子篩法檢測，即，利用SephadexG25層析系統(tǒng)，將提取物納米脂質(zhì)體制劑分成兩個流份，即提取物納米脂質(zhì)體流份和游離的提取物流份，經(jīng)氣相色譜儀檢測兩個流份中含有的提取物含量。包封率計算公式＝提取物納米脂質(zhì)體流份的提取物含量÷(提取物納米脂質(zhì)體流份的提取物含量+游離的提取物含量)。顯微鏡或透射電鏡驗證是否為脂質(zhì)體。
本發(fā)明提供前體脂質(zhì)體的制備方法將提取物與精制大豆磷脂、膽固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，優(yōu)選0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更優(yōu)選0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特別優(yōu)選1∶3.2∶1.5進行混合，添加溶劑(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解該混合物，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上脫除溶劑成膜，添加余量的注射用水(根據(jù)所要配制的最終濃度來計算該余量)以補充至例如5000ml，然后將物料作為一批料或分批置入超聲波細胞粉碎機進行超聲處理，取樣利用帶標(biāo)尺的顯微鏡或Coulter儀來檢驗平均粒徑，當(dāng)平均粒徑≤1微米后，調(diào)節(jié)PH，使PH值為4.5～6.5，經(jīng)0.8μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，加入占總制劑量的1-2wt％的賦形劑(例如乳糖或平均分子量Mw為約4000-40000的低分子右旋糖苷)，100℃蒸汽流滅菌，無菌條件下冷凍干燥、灌封。在使用之前添加注射水以達到最終活性成分濃度(倍半萜烯類活性成分的重量(mg)/制劑體積(ml))為1～10mg/ml，優(yōu)選為2～8mg/ml，更優(yōu)選為2～7.5mg/ml，更通常為5～7.5mg/ml。
包封率的檢測用分子篩法檢測方法，即根據(jù)所要配制的最終制劑濃度(mg/ml)，將一定量的提取物前體脂質(zhì)體制劑先添加余量體積的水振搖均勻，此時又變成了脂質(zhì)體，利用Sephadex G25層析系統(tǒng)分成兩個流份，即提取物脂質(zhì)體流份和游離的提取物流份，經(jīng)氣相色譜儀檢測兩個流份中含有的提取物量。包封率計算公式＝提取物脂質(zhì)體流份的提取物含量÷(提取物脂質(zhì)體流份的提取物含量+游離的提取物量)。顯微鏡或透射電鏡證實是否為前體脂質(zhì)體。
本發(fā)明提供長循環(huán)提取物納米脂質(zhì)體的制備方法，該方法包括將提取物與精制大豆磷脂、聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺、膽固醇以重量比0.5-1.5∶1.5-3.5∶0.3-1.2∶0.8-2.0，優(yōu)選以重量比0.8-1.2∶1.8-3.0∶0.4-1.0∶1.2-1.8，更優(yōu)選以重量比0.9-1.1∶2.4-2.8∶0.6-1.0∶1.2-1.6，特別優(yōu)選以重量比1∶2.6-2.7∶0.7-0.9∶1.3-1.5進行混合，添加溶劑(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解該混合物，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上脫除溶劑成膜，添加余量的注射用水(根據(jù)所要配制的最終濃度來計算該余量)以補充至例如5000ml，然后將物料作為一批或分批置入常規(guī)的超聲波細胞粉碎機進行超聲波處理，取樣利用帶標(biāo)尺的顯微鏡、Coulter儀或電子顯微鏡來檢驗平均粒徑，在達到規(guī)定的平均粒徑(例如≤100納米)后，調(diào)節(jié)PH，使PH值為4.5～6.5，經(jīng)0.8μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，100℃蒸汽流滅菌，(氣相或液相)色譜法測得活性成分的最終濃度(倍半萜烯類活性成分的重量(mg)/總制劑體積(ml))為1～10mg/ml，優(yōu)選為2～7.5mg/ml，更優(yōu)選為2～8mg/ml，更通常為5～7.5mg/ml。對于聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺，其中“2000”指聚乙二醇鏈段的平均分子量(道爾頓)。
該注射劑的包封率的檢測與前面的脂質(zhì)體注射劑的包封率檢測方法相同。
本發(fā)明提供帶負電荷及帶正電荷的提取物納米微乳的制備方法
制備方法1帶負電荷的納米微乳的制備
將提取物與精制大豆磷脂、膽固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，優(yōu)選0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更優(yōu)選0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特別優(yōu)選1∶3.2∶1.5進行混合，添加溶劑(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解該混合物，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上脫除溶劑成膜，添加余量的注射用水(根據(jù)所要配制的最終濃度來計算該余量)以補充例如5000ml，然后置入常規(guī)的超聲波細胞粉碎機進行超聲波處理，取樣利用帶標(biāo)尺的顯微鏡、Coulter儀或電子顯微鏡來檢驗平均粒徑，在達到規(guī)定的平均粒徑(例如≤100納米)后，調(diào)節(jié)PH，使PH值為4.5～6.5，經(jīng)0.8μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，100℃蒸汽流滅菌，活性成分的最終濃度(倍半萜烯類活性成分的重量(mg)/總制劑體積(ml))為1～10mg/ml，優(yōu)選為2～7.5mg/ml，更通常為5～7.5mg/ml。顯微鏡、透射電鏡檢測，證實是否是納米微乳。
制備方法2帶正電荷的納米微乳的制備
將提取物、精制卵磷脂、C14-C22直鏈或支鏈脂族胺、膽固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-3.5∶0.2-0.6∶1.0-2.0，優(yōu)選0.8-1.2∶2.5-3.0∶0.3-0.5∶1.2-1.8，更優(yōu)選0.9-1.1∶2.7-2.9∶0.3-0.5∶1.4-1.6，特別優(yōu)選1∶2.8∶0.4∶1.5進行混合，添加溶劑(如乙醚或丙酮或氯仿)，添加量足以充分溶解該混合物，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上脫除溶劑成膜，然后添加余量的注射用水(根據(jù)所要配制的濃度計算出該余量)以補充至例如5000ml，然后置入常規(guī)的超聲波細胞粉碎機進行超聲處理，取樣利用帶標(biāo)尺的顯微鏡、Coulter儀或電子顯微鏡來檢驗平均粒徑，在達到規(guī)定的平均粒徑(例如≤100納米)后，調(diào)節(jié)PH，使PH值為7.5～9.0，經(jīng)0.8μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，100℃蒸汽流滅菌，倍半萜烯類活性成分的最終濃度為1～10mg/ml，優(yōu)選為2～7.5mg/ml，更通常為5～7.5mg/ml。顯微鏡、透射電鏡檢測，證實是否為納米微乳。
本發(fā)明還提供提取物脂質(zhì)納米球的制備方法，該方法包括取提取物與大豆磷脂一起加入大豆油中，升溫控制成油相(保持為油相)，將該油相加入到含10-50wt％甘油的水溶液中。其具體重量比例為提取物占最終配制劑總量的0.08～0.8wt％，大豆磷脂0.8～2.5wt％，大豆油8-12wt％，甘油1.8-2.8wt％，注射用水加至5000ml；優(yōu)選的重量比例為提取物占最終配制劑總量的0.1wt％～0.5wt％，大豆磷脂1.2wt％～2.0wt％，大豆油10wt％，甘油2.25～2.5wt％，注射用水加至5000ml。然后高速攪拌，調(diào)節(jié)PH為4.5～6.5，再經(jīng)過普通的高壓均質(zhì)機(例如M110-E/H型(日本MIZUHO產(chǎn)))處理，然后進行前面所述的超聲波處理，取樣利用帶標(biāo)尺的顯微鏡、Coulter儀或電子顯微鏡來檢驗平均粒徑，在其脂質(zhì)球的平均粒徑達到規(guī)定值例如≤100nm之后，再經(jīng)0.8μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，100℃～120℃滅菌。(氣相或液相)色譜法測得倍半萜烯類活性成分的最終濃度為1～10mg/ml，優(yōu)選為2～7.5mg/ml，更通常為2～5mg/ml，更理想為2.0～3.0mg/ml。根據(jù)需要可以在該最終制劑中加入適量膽固醇、亞油酸等。
本發(fā)明提供提取物靜脈注射乳的制備方法，該方法包括將提取物、精制大豆磷脂、膽固醇以重量比0.5-1.5∶2.5-4.0∶1.0-2.0，優(yōu)選0.8-1.2∶2.8-3.6∶1.2-1.8，更優(yōu)選0.9-1.1∶3.0-3.4∶1.4-1.6，特別優(yōu)選1∶3.2∶1.5，與余量的注射用水(根據(jù)所要配制的最終濃度來計算該余量)進行混合，用常規(guī)的高壓均質(zhì)機(例如M110-E/H型(日本MIZUHO產(chǎn)))乳化，取樣利用帶標(biāo)尺的顯微鏡或Coulter儀來檢驗平均粒徑，在達到規(guī)定的平均粒徑例如≤1微米后，調(diào)節(jié)PH，使PH值為4.5～6.5，經(jīng)1.2μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，經(jīng)100℃～120℃滅菌，得到提取物靜脈乳，(氣相或液相)色譜法測得倍半萜烯類活性成分的最終濃度為1～10mg/ml，優(yōu)選為2～7.5mg/ml，更通常為5～7.5mg/ml。
本發(fā)明提供提取物脂肪乳的制備方法，該方法包括取提取物與大豆磷脂加入大豆油中，升溫控制成油相(保持為油相)，將該油相加入到含10-50wt％甘油的水溶液中。其具體重量比為提取物占最終配制劑總量的0.08～0.8wt％，大豆磷脂0.8～2.5wt％，大豆油8-12wt％，甘油1.8-2.8wt％，注射用水加至5000ml；優(yōu)選的重量比例為提取物占最終配制劑總量的0.1wt％～0.5wt％，大豆磷脂1.2wt％～2.0wt％，大豆油10wt％，甘油2.25～2.5wt％，注射用水加至5000ml。然后高速攪拌，調(diào)節(jié)PH為4.5～6.5，再經(jīng)過普通的高壓均質(zhì)機(例如M110-E/H型(日本MIZUHO產(chǎn)))處理，使其粒徑小于1μ，再經(jīng)1.2μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，100℃～120℃滅菌。倍半萜烯類活性成分的最終濃度為1～10mg/ml，優(yōu)選為2～7.5mg/ml，更理想為2.0～3.0mg/ml或為5～7.5mg/ml。根據(jù)需要可以在該最終制劑中加入適量膽固醇、亞油酸等。
根據(jù)需要，本發(fā)明的制劑可以用不同尺寸例如1.2μ、1.0μ、0.9μ、0.8μ、0.7μ、0.6μ、0.5μ等的微孔濾膜進行過濾，可以截取平均粒徑≤0.8μ、≤0.7μ、≤0.6μ、≤0.5μ、≤0.45μ、≤0.4μ、≤0.3μ等的分散相。
下面的制備例和實施例用于舉例說明本發(fā)明，但不應(yīng)認為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護范圍由權(quán)利要求來定義。
制備例1人參揮發(fā)油的分子蒸餾制備人參提取物
以1000ml人參揮發(fā)油(含有≥48wt％的倍半萜烯類)為原料，經(jīng)廣州漢維機電公司MD-S80型分子蒸餾儀精制，其工藝條件蒸餾溫度35～45℃，蒸餾壓力70～90Pa，刮膜速度300-320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，物料流速15～30毫升/小時，得到餾出物，僅收集餾余物，積累到足夠量(約750ml)，繼續(xù)進行分子蒸餾。蒸餾溫度45～60℃，蒸餾壓力30～70Pa，刮膜速度300-320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，該餾分流速15～30毫升/小時，分別收集餾出物(約220ml)與餾余物(約530ml)，將得到的二次餾余物繼續(xù)進行分子蒸餾。蒸餾溫度30～70℃，蒸餾壓力10～50Pa，刮膜速度300-320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，該餾分流速15～30毫升/小時，收集餾出物(約180ml)，放掉餾余物，將最后兩次的溜出物合并(約400ml)再添加到分子蒸餾儀中繼續(xù)重復(fù)蒸餾一直到利用大約30米長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色譜柱BP-5)檢測提取物的總倍半萜烯含量≥75wt％為止，最終獲得提取物約320ml。用氣相色譜法制定供檢測用指紋圖譜。該產(chǎn)物稱作人參提取物。
制備例2從樹蘭花揮發(fā)油制備樹蘭花提取物
按照與制備例1相同的方法，用1000ml樹蘭花揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞25wt％)代替1000ml人參揮發(fā)油，獲得的200ml的總倍半萜烯含量≥75wt％的提取物，該產(chǎn)物稱作樹蘭花提取物A。
制備例3樹蘭花揮發(fā)油的填料式真空精餾制備樹蘭花提取物B
將1000ml的樹蘭花揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞25wt％)經(jīng)填料式真空精餾裝置精餾，填料式真空精餾裝置由裝樹蘭花揮發(fā)油的釜、填料精餾塔(理論塔板數(shù)≥30)、回流器、真空泵構(gòu)成，由上?；ぱ芯吭盒滦吞盍霞夹g(shù)開發(fā)中心設(shè)計，填料為狄克松填料(Q網(wǎng)環(huán)填料)，真空度為1-3mmHg，收集82℃/3mmHg以上的餾分，利用大約30米長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色譜柱BP-5)檢測提取物的總倍半萜烯含量≥75wt％，最終獲得提取物約180ml。用氣相色譜法制定供檢測用指紋圖譜。該產(chǎn)物稱作樹蘭花提取物B。
制備例4從黃花杜鵑揮發(fā)油獲得黃花杜鵑提取物
按照與制備例1相同的方法，用1000ml黃花杜鵑揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞15wt％)代替1000ml人參揮發(fā)油，獲得約120ml的總倍半萜烯含量≥75wt％的提取物，該產(chǎn)物稱作黃花杜鵑提取物A。
按照與制備例3相同的方法，用1000ml黃花杜鵑揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞15wt％)代替1000ml樹蘭花揮發(fā)油，獲得約120ml的總倍半萜烯含量≥75wt％的提取物，該產(chǎn)物稱作黃花杜鵑提取物B。
制備例5從海風(fēng)藤揮發(fā)油獲得海風(fēng)藤提取物
按照與制備例1相同的方法，用1000ml海風(fēng)藤揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞15wt％)代替1000ml人參揮發(fā)油，獲得約125ml的總倍半萜烯含量≥75wt％的提取物，該產(chǎn)物稱作海風(fēng)藤提取物A。
按照與制備例3相同的方法，用1000ml海風(fēng)藤揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞15wt％)代替1000ml樹蘭花揮發(fā)油，獲得約124ml的總倍半萜烯含量≥75wt％的提取物，該產(chǎn)物稱作海風(fēng)藤提取物B。
制備例6從香椿子揮發(fā)油獲得香椿子提取物
按照與制備例1相同的方法，用1000ml香椿子揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞30wt％)代替1000ml人參揮發(fā)油，獲得約250ml的總倍半萜烯含量≥75wt％的提取物，該產(chǎn)物稱作香椿子提取物A。
按照與制備例3相同的方法，用1000ml香椿子揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞30wt％)代替1000ml樹蘭花揮發(fā)油，獲得約240ml的總倍半萜烯含量≥75wt％的提取物，該產(chǎn)物稱作香椿子提取物B。
制備例7從柏木揮發(fā)油獲得柏木提取物
按照與制備例1相同的方法，用1000ml柏木揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞14wt％)代替1000ml人參揮發(fā)油，獲得約120ml的總倍半萜烯含量≥75wt％的提取物，該產(chǎn)物稱作柏木提取物A。
按照與制備例3相同的方法，用1000ml柏木揮發(fā)油(倍半萜烯含量約＞14wt％)代替1000ml樹蘭花揮發(fā)油，獲得約120ml的總倍半萜烯含量≥75wt％的提取物，該產(chǎn)物稱作柏木提取物B。
制備例8欖香烯的制備
以1000ml香茅油Cymbopoqon citratus(DC.)Stapt次要成分(香茅油除掉檸檬醛、香茅醇之后余下的混合油狀物，含有約30wt％的倍半萜烯類，購自廣州百花香料廠)為原料，經(jīng)廣州漢維機電公司MD-S80型分子蒸餾儀分餾欖香烯，其工藝條件蒸餾溫度30～45℃，蒸餾壓力70～90Pa，刮膜速度300～320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，物料流速15～30毫升/小時，僅收集餾余物約700ml，將餾余物進行分子蒸餾。蒸餾溫度為40～60℃，蒸餾壓力20～70Pa，刮膜速度300～320轉(zhuǎn)/分，冷凝溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，物料流速15～30毫升/小時，分別收集餾出物約160ml與約540ml餾余物，將該餾余物繼續(xù)進行分子蒸餾。蒸餾溫度為30～70℃，蒸餾壓力10～50Pa，刮膜速度300～320轉(zhuǎn)/分，冷凝溫度20～25℃，系統(tǒng)溫度20～25℃，物料流速15～30毫升/小時，收集餾出物約140ml，放掉餾余物，將得到的二次餾出物混合(約300ml)，繼續(xù)蒸餾，一直到用大約30米長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(儀器Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色譜柱BP-5)檢測產(chǎn)物的總欖香烯異構(gòu)體純度達到約≥75wt％為止，最終獲得欖香烯提取物約220ml(約200g)，簡稱欖香烯產(chǎn)品。
制備例9欖香烯的制備
以1000ml由浙江瑞安甌海植物油精煉廠生產(chǎn)的溫郁金(Curcumawenyujin Y.H.Chen et C.Ling)揮發(fā)油(約含有＞7wt％的總欖香烯異構(gòu)體)為原料，按照與上述制備例1同樣的方法精煉，最終獲得80ml的總欖香烯異構(gòu)體純度約≥75wt％的提取物，簡稱欖香烯產(chǎn)品。
制備例10β-欖香烯的制備
以1000ml上述香茅油Cymbopoqon citratus(DC.)Stapt次要成分為原料，經(jīng)廣州漢維機電公司MD-S80型分子蒸餾儀分餾β-欖香烯，其工藝條件蒸餾溫度30～45℃，蒸餾壓力70～100Pa，刮膜速度300～320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，物料流速7～10毫升/小時，僅收集餾余物約700ml，將餾余物進行分子蒸餾。蒸餾溫度為40～60℃，蒸餾壓力20～70Pa，刮膜速度300～320轉(zhuǎn)/分，冷凝溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，物料流速7～10毫升/小時，分別收集餾出物約160ml與約540ml餾余物，將該餾余物繼續(xù)進行分子蒸餾。蒸餾溫度為30～70℃，蒸餾壓力10～50Pa，刮膜速度300～320轉(zhuǎn)/分，冷凝溫度20～25℃，系統(tǒng)溫度20～25℃，物料流速7～10毫升/小時，收集餾出物約140ml，放掉餾余物，將得到的二次餾出物混合(約300ml)，繼續(xù)蒸餾，一直到用大約30米長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(儀器Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色譜柱BP-5)檢測產(chǎn)物的β-欖香烯純度達到≥85％為止，最終獲得提取物約120ml(約105g)。顯然，如果將該產(chǎn)物進一步精餾，則能夠獲得更高純度(例如β-欖香烯純度達到≥90wt％或甚至≥90wt％)的提取物，簡稱β-欖香烯產(chǎn)品。
制備例11β-欖香烯的制備
以1000ml由浙江瑞安甌海植物油精煉廠生產(chǎn)的溫郁金(Curcumawenyujin Y.H.Chen et C.Ling)揮發(fā)油(約含有＞7wt％的總欖香烯異構(gòu)體)為原料，按照與上述制備例3同樣的方法精煉，最終獲得45ml的β-欖香烯純度≥約85wt％的提取物，簡稱β-欖香烯產(chǎn)品。
制備例12姜黃提取物的制備
制備方法1姜黃揮發(fā)油的分子蒸餾
以1000ml姜黃揮發(fā)油(倍半萜烯類含量≥16wt％)為原料，經(jīng)廣州漢維機電公司MD-S80型分子蒸餾儀精制，其工藝條件蒸餾溫度35～45℃，蒸餾壓力70～90Pa，刮膜速度300-320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，物料流速15～30毫升/小時，得到餾出物，僅收集餾余物，積累到足夠量(約450ml)，繼續(xù)進行分子蒸餾。蒸餾溫度45～60℃，蒸餾壓力30～70Pa，刮膜速度300-320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，該餾分流速15～30毫升/小時，分別收集150ml餾出物與約300ml餾余物，將得到的二次餾余物積累到足夠量(750ml)，繼續(xù)進行分子蒸餾。蒸餾溫度30～70℃，蒸餾壓力10～50Pa，刮膜速度300-320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，該餾分流速15～30毫升/小時，收集餾出物(320ml)，放掉餾余物，將溜出物再添加到分子蒸餾儀中繼續(xù)重復(fù)蒸餾一直到用氣相色譜儀(即大約30米長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色譜柱BP-5)檢測時總倍半萜烯含量≥75wt％為止，獲得150ml提取物。該提取物經(jīng)上述氣相色譜儀檢測，還含有相當(dāng)于全部倍半萜烯類總重量的約1/20的姜黃素。用氣相色譜法制定供檢測用指紋圖譜。該產(chǎn)物稱作姜黃提取物A。
制備方法2填料式真空精餾
將3000ml的姜黃揮發(fā)油(倍半萜烯類含量≥16wt％)經(jīng)填料式真空精餾裝置精餾，填料式真空精餾裝置由裝姜黃揮發(fā)油的容積為5000ml的釜、填料精餾塔(理論塔板數(shù)≥30)、回流器、真空泵構(gòu)成，由上?；ぱ芯吭盒滦吞盍霞夹g(shù)開發(fā)中心設(shè)計，填料為狄克松填料(Q網(wǎng)環(huán)填料)，真空度為1-3mmHg，收集82℃/3mmHg以上的餾分，利用大約30米長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(儀器Bio-RadFTS-65A，HP5890II，色譜柱BP-5)檢測提取物的總倍半萜烯含量≥75wt％，它還含有相當(dāng)于全部倍半萜烯類總重量的約1/20的姜黃素，總共獲得約450ml的提取物。用氣相色譜法制定供檢測用指紋圖譜。該產(chǎn)物稱作姜黃提取物B。
另外，將姜黃經(jīng)CO2超臨界提取得到的揮發(fā)油留下的渣(1000g)，添加甲醇，加熱抽提3小時得到黃色粘稠液，將甲醇蒸餾掉，得到棕黃色膏狀物，將這些膏狀物用硅膠制備色譜純化，用氯仿洗脫得到純度≥90wt％的姜黃素產(chǎn)物(13g)。將上述姜黃提取物A和姜黃提取物B以50∶50重量比混合，將所形成的混合物與該姜黃素產(chǎn)物按20∶1(重量)的比例進行混合而獲得另一種混合物，稱作姜黃提取物C。
制備例13溫郁金提取物的制備
制備方法A以1000ml的溫郁金揮發(fā)油(含有≥7wt％的倍半萜烯類)為原料，經(jīng)廣州漢維機電公司MD-S80型分子蒸餾儀精制，其工藝條件蒸餾溫度35～45℃，蒸餾壓力70～90Pa，刮膜速度300～320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)溫度20～25℃，物料流速15～30毫升/小時，僅收集約720ml餾余物，將餾余物繼續(xù)進行分子蒸餾。蒸餾溫度為45～60℃，蒸餾壓力30～70Pa，刮膜速度300～320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，物料流速15～30毫升/小時，分別收集約170ml餾出物與約540ml餾余物，將餾余物進行分子蒸餾。蒸餾溫度為30～70℃，蒸餾壓力10～50Pa，刮膜速度300～320轉(zhuǎn)/分，冷凝面溫度20～25℃，系統(tǒng)保溫20～25℃，物料流速15～30毫升/小時，收集160ml餾出物，放掉餾余物，將得到的二次餾出物混合(330ml)，繼續(xù)蒸餾，一直到利用大約30米長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(儀器Bio-Rad FTS-65A，HP5890II，色譜柱BP-5)檢測提取物的總倍半萜烯含量≥75wt％為止，它還含有相當(dāng)于全部倍半萜烯類總重量的約1/25的姜黃素，獲得大約70ml的提取物。用氣相色譜法制定供檢測用指紋圖譜。該產(chǎn)物稱作溫郁金提取物A。
制備方法B.將溫郁金揮發(fā)油，經(jīng)填料式真空精餾裝置精餾
填料式真空精餾裝置由裝1000ml溫郁金揮發(fā)油(含有≥7wt％的倍半萜烯類)的釜、填料精餾塔(理論塔板數(shù)＞30)、回流器、真空泵構(gòu)成，由上?；ぱ芯吭盒滦吞盍霞夹g(shù)開發(fā)中心設(shè)計制造，填料為狄克松填料(Q網(wǎng)環(huán)填料)，真空度為1～3mmHg，收集82℃/3mmHg以上的餾分。利用大約30米長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測提取物的總倍半萜烯含量≥75wt％，獲得大約80ml的提取物。提取物經(jīng)上述氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，還含有相當(dāng)于全部倍半萜烯類總重量的約1/25的姜黃素。用氣相色譜法制定供檢測用指紋圖譜。該產(chǎn)物稱作溫郁金提取物B。
另外，取經(jīng)CO2超臨界提取過揮發(fā)油的溫郁金藥渣(1000g)，加入甲醇加熱回流3小時，得到棕色溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫除掉甲醇，得到棕色粘稠物，將該棕色粘稠膏狀物用硅膠進行制備色譜，以氯仿洗脫，得到純度≥90wt％的8g姜黃素產(chǎn)物。將上述溫郁金提取物A和溫郁金提取物B以50∶50重量比混合，將所形成的混合物與該姜黃素產(chǎn)物按20∶1(重量)的比例進行混合而獲得另一種混合物，稱作溫郁金提取物C。
實施例1人參提取物的納米脂質(zhì)體注射劑的制備
將制備例1的人參提取物(6.5g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)與精制大豆磷脂、膽固醇以重量比1∶3.2∶1.5混合作為起始原料，添加乙醚，添加量足以充分溶解該混合物，置入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上脫除乙醚成膜，添加余量的注射用水(根據(jù)所要配制的最終濃度即5mg/ml來計算該余量)補充至1升(L)，然后均分成3批置入山東濟寧超聲電子儀器廠出產(chǎn)的超聲波細胞粉碎機(型號JCS-204)超聲處理，取樣利用帶標(biāo)尺的顯微鏡、Coulter儀或電子顯微鏡來檢驗平均粒徑，當(dāng)平均粒徑≤100納米后，用1M磷酸二氫鈉水溶液調(diào)節(jié)PH，使PH值為4.5～6.5，經(jīng)0.8μ微孔濾膜(上海新亞凈化器件廠生產(chǎn)，規(guī)格0.8μ)過濾和然后裝瓶，100℃蒸汽流滅菌，所獲得的注射劑產(chǎn)品簡稱注射劑1。取樣用這里所述的約30米長毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測得活性成分(總倍半萜烯類活性成分的重量(mg)/制劑體積(ml))的最終濃度為5±0.10mg/ml。
用分子篩法檢測包封率，即，利用Sephadex G25層析系統(tǒng)將提取物納米脂質(zhì)體制劑分成兩個流份，即提取物納米脂質(zhì)體流份和游離的提取物流份，經(jīng)氣相色譜儀檢測兩個流份中含有的提取物含量。包封率超過85％。包封率計算公式＝提取物納米脂質(zhì)體流份的提取物含量÷[提取物納米脂質(zhì)體流份的提取物含量+游離的提取物量]。顯微鏡、透射電鏡檢測，證實是納米脂質(zhì)體，在附圖1中給出該注射劑的透射電鏡照片(標(biāo)尺200nm)。
實施例2人參提取物的前體脂質(zhì)體的制備
按照與實施例1中相同的方法和原料配比，重復(fù)進行實施例1的程序，只是超聲波處理后要求分散相的粒徑≤1微米以及在過濾之后和在裝瓶之前，加入占所獲得的制劑總重量的1-2％的乳糖，然后利用100℃蒸汽流滅菌，無菌條件下冷凍干燥、灌封(分裝)。用Coulter儀檢測證實制劑是前體脂質(zhì)體。該注射劑產(chǎn)品簡稱注射劑2。包封率高于85％。該制劑在注射應(yīng)用之前添加注射水以達到最終活性成分(總倍半萜烯類)濃度為5±0.10mg/ml。
實施例3樹蘭花提取物的前體脂質(zhì)體的制備
重復(fù)上述實施例2，只是用制備例2和3各自的樹蘭花提取物A和B按1∶1重量比的混合物(倍半萜烯類含量約76±2wt％)代替制備例1的人參提取物，用平均分子量Mw為約40000的低分子右旋糖苷代替乳糖。該注射劑簡稱注射劑3。用Coulter儀檢測證實制劑是前體脂質(zhì)體。包封率高于85％。該制劑在注射應(yīng)用之前添加注射水以達到最終活性成分濃度(總倍半萜烯類的重量(mg)/制劑體積(ml))為5±0.10mg/ml。
實施例4黃花杜鵑提取物的長循環(huán)納米脂質(zhì)體的制備
重復(fù)實施例1的操作程度，只是起始原料由以下組分組成黃花杜鵑提取物A(6.5g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)∶大豆磷脂∶聚乙二醇(2000)磷脂酰乙醇胺∶膽固醇＝1∶2.6∶0.8∶1.4(重量比)。該注射劑簡稱注射劑4。取樣檢驗平均粒徑≤100nm。制劑中總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。包封率高于85％。
實施例5帶負電荷及帶正電荷的提取物的納米微乳的制備
5A-1帶負電荷的黃花杜鵑提取物納米微乳的制備
重復(fù)實施例1的程序，只是用制備例4的黃花杜鵑提取物B(6.5g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)代替人參提取物，而且不測定包封率。取樣測得總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。用Coulter儀證實是納米微乳。該注射劑產(chǎn)品簡稱5A-1。
5A-2帶正電荷的黃花杜鵑提取物納米微乳的制備
重復(fù)實施例1的程序，只是起始原料由以下組成組成黃花杜鵑提取物B(6.5g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)∶卵磷脂∶正十八烷基胺∶膽固醇＝1∶2.8∶0.4∶1.5(重量比)，不測定包封率。取樣測得總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。用Coulter儀證實是納米微乳。該注射劑簡稱5A-2。
5B-1帶負電荷的海風(fēng)藤提取物納米微乳的制備
重復(fù)上述5A-1，只是用制備例5的海風(fēng)藤提取物A(6.5g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)代替黃花杜鵑提取物B。取樣測得總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。用Coulter儀證實是納米微乳。所獲得的注射劑簡稱5B-1。
5B-2帶正電荷的海風(fēng)藤提取物納米微乳的制備
重復(fù)上述5A-2，只是用制備例5的海風(fēng)藤提取物A代替制備例4的黃花杜鵑提取物B。取樣測得總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。用Coulter儀證實是納米微乳。所獲得的注射劑簡稱5B-2。
實施例6香椿子提取物的脂質(zhì)納米球制劑的制備
取制備例6的香椿子提取物A(2.7g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)與大豆磷脂一起加入大豆油中，升溫控制成油相(即保持為油相)，將該油相加入到含甘油的水溶液(含有20wt％甘油)中。其具體重量比為提取物占最終制劑總重量的0.27％，大豆磷脂1.6％，大豆油10％，甘油2.5％，余量為注射用水(補充至1L)，然后高速攪拌，用1M磷酸二氫鈉水溶液調(diào)節(jié)PH為4.5～6.5，再經(jīng)M110-E/H型(日本MIZUHO產(chǎn))高壓均質(zhì)機處理，然后按照實施例1中相同方法進行超聲波處理，使其脂質(zhì)球的平均粒徑≤100nm，再經(jīng)0.8μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，100℃～120℃滅菌。取樣測得總倍半萜烯類的最終濃度為2±0.04mg/ml。所獲得的注射劑簡稱注射劑6。根據(jù)需要可以在原料中包括適量的膽固醇、亞油酸等。
實施例7香椿子提取物的靜脈注射乳的制備
將制備例6的香椿子提取物B(6.5g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)、精制大豆磷脂、膽固醇以重量比1∶3.2∶1.5混合，用注射用水加至1L，用M110-E/H型(日本MIZUHO產(chǎn))高壓均質(zhì)機乳化，一直用Coulter儀檢驗粒徑小于1μ為止。然后，用1M磷酸二氫鈉水溶液調(diào)節(jié)PH，使PH值為4.5～6.5，經(jīng)1.2μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，經(jīng)100℃～120℃滅菌，得到香椿子提取物靜脈乳，取樣測得總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。該注射劑簡稱7。
實施例8柏木提取物脂肪乳的制備
取制備例7的柏木提取物A和B按1∶1重量比的混合物(2.7g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)與大豆磷脂加入大豆油中，升溫控制成油相，將該油相加入到含甘油的水溶液(含20wt％甘油)中。其具體重量比為柏木提取物占總制劑重量的0.27％，大豆磷脂1.2％，大豆油10％，甘油2.5％，用注射用水加至1L。然后高速攪拌，用1M磷酸二氫鈉水溶液調(diào)節(jié)PH為4.5～6.5，再經(jīng)M110-E/H型(日本MIZUHO產(chǎn))高壓均質(zhì)機處理，一直到用Coulter儀檢驗粒徑≤1μ為止，再經(jīng)1.2μ微孔濾膜過濾和然后裝瓶，100℃～120℃滅菌。測得總倍半萜烯類的最終濃度為2±0.04mg/ml。所獲得的注射劑簡稱8。根據(jù)需要可以在原料中包括適量膽固醇、亞油酸等。
實施例9CO2超臨界法制備納米脂質(zhì)體
注射劑9A將占膽固醇重量的10wt％的三氯甲烷加入膽固醇(0.8125g)中使之浸潤，將大豆磷脂和制備例2的樹蘭花提取物A(0.65g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)加入其中進行混合(提取物∶大豆磷脂∶膽固醇＝重量比1.2∶3.2∶1.5)，將所獲得的混合物放入CO2超臨界提取儀(廣州漢維機電公司生產(chǎn)，型號SFE100ml)的萃取器中，通入CO2(壓力50-80kg)，體系溫度50℃，進行臨界或超臨界分散，使混合物均勻混合，然后緩慢減壓釋放CO2，讓CO2將三氯甲烷帶出，取出萃取器，在萃取器中加入余量的注射用水達到100mL，用攪拌器攪拌，將所形成的分散體用上述超聲波設(shè)備進行處理，一直到脂質(zhì)體的分散相平均粒徑≤100納米為止(得到納米脂質(zhì)體)。然后將脂質(zhì)體用1M磷酸二氫鈉水溶液調(diào)節(jié)PH，使PH值為4.5～6.5，經(jīng)0.8μ微孔濾膜(上海新亞凈化器件廠生產(chǎn)，規(guī)格0.8μ)過濾和然后裝瓶，100℃蒸汽流滅菌，所獲得的注射劑簡稱注射劑9A。取樣用氣相色譜法測得總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。包封率高于88％。
9B重復(fù)上述9A，只是用制備例4的黃花杜鵑提取物A(0.65g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)代替制備例2的樹蘭花提取物A，制得納米脂質(zhì)體。測得在制劑中總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。所獲得的注射劑簡稱9B。包封率高于88％。
9C重復(fù)上述9A，只是用人參提取物(制備例1)、香椿子提取物A(制備例6)和柏木提取物A(制備例7)的混合物(1∶1∶1重量比，0.65g，倍半萜烯類含量約76±2wt％))代替制備例2的樹蘭花提取物A，制得納米脂質(zhì)體。測得在制劑中總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。所獲得的注射劑簡稱9C。包封率高于88％。
9D重復(fù)上述9A，只是用制備例8和9各自的欖香烯產(chǎn)品按1∶1重量比的混合物(0.65g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)代替制備例2的樹蘭花提取物A，制得納米脂質(zhì)體。測得在制劑中總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。所獲得的注射劑簡稱9D。包封率高于88％。
9E重復(fù)上述9A，只是用制備例10和11各自的β-欖香烯產(chǎn)品按1∶1重量比的混合物(0.58g，β-欖香烯含量約86±2wt％)代替制備例2的樹蘭花提取物A，制得納米脂質(zhì)體。測得在制劑中β-欖香烯的最終濃度為5±0.10mg/ml。所獲得的注射劑簡稱9E。包封率高于88％。
此外，用姜黃提取物A和姜黃提取物B按1∶1重量比的混合物，溫郁金提取物A和溫郁金提取物B按1∶1重量比的混合物，或溫郁金提取物C(它們各自0.65g，倍半萜烯類含量約76±2wt％)代替制備例2的樹蘭花提取物A，重復(fù)上述9A，分別獲得注射劑9F、9G和9H，總倍半萜烯類的最終濃度為5±0.10mg/ml。包封率都高于88％。
藥效學(xué)試驗
藥物制劑的體內(nèi)抗腫瘤效果的評價方法已在以上列舉的某些專利文獻中有描述(例如參見CN1153168A)。
在本發(fā)明中，各種劑型的制劑對皮下接種的人體腫瘤異種移植模型QGY肝癌、MKN-45胃癌的療效，可以通過以80mg(倍半萜烯類)/kg(體重)、40mg/kg和20mg/kg的劑量，每天尾靜脈給藥1次，連續(xù)給藥10天的治療方案來確認，其中沒有給藥的作為對照組。具體的操作過程和腫瘤抑制率(抑瘤率)的計算按照目前(指本申請的申請日以前)的國家藥品監(jiān)督管理局的相關(guān)規(guī)定“抗腫瘤藥物的藥效評價辦法”來實施。
抑瘤率％＝[(沒有給藥的模型的腫瘤重量-給藥的模型的腫瘤重量)/沒有給藥的模型的腫瘤重量]×100％
表1.人體腫瘤異種移植模型QGY肝癌的抑瘤率
表2.人體腫瘤異種移植模型MKN-45胃癌的抑瘤率
表3時顱內(nèi)原位接種小鼠腦瘤G422模型的療效(抑瘤率)。
表4對皮下接種小鼠腦瘤G422模型的療效(抑瘤率)。
另外，各種劑型的注射劑對荷Lewis肺癌的小鼠NK細胞與對照組比活性提高21％～23％。各種劑型的注射劑對荷Lewis肺癌的小鼠淋巴細胞增殖活性影響、刺激指標(biāo)提高了1.5～1.45。
總之，從上述表中數(shù)據(jù)可以看出，各種制劑經(jīng)QGY肝癌、MKN-45胃癌、小鼠腦瘤G422模型藥理學(xué)試驗有效。對免疫功能影響試驗，荷Lewis肺癌的小鼠NK細胞與對照組比提高21％～23％。淋巴細胞增值活性影響、刺激指標(biāo)提高了1.5～1.45.
所以，注射劑能夠用于抑制和/或治療腫瘤。另外，經(jīng)過試驗，該制劑還能夠用于抑制癌細胞轉(zhuǎn)移，用于緩解腫瘤疼痛，用于預(yù)防或治療缺血性中風(fēng)。
權(quán)利要求
1.含有倍半萜烯類的植物的提取物注射劑，它含有從含有倍半萜烯類的植物中提取的具有總倍半萜烯類含量≥70wt％的提取物，表面活性劑，和含水介質(zhì)，其特征在于該注射劑是一種水性分散體，分散相的平均粒徑≤1微米，提取物與表面活性劑的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射劑中總倍半萜烯類的最終濃度為1～10mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的提取物注射劑，其中注射劑的劑型包括脂質(zhì)體劑型，納米脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)脂質(zhì)體劑型或長循環(huán)納米脂質(zhì)體劑型，其中這些注射劑的總倍半萜烯類的濃度是2～7.5mg/ml，這些制劑的包封率≥80％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的提取物注射劑，其中注射劑的劑型包括納米微乳劑型，靜脈乳劑型，脂質(zhì)納米球劑型或脂肪乳劑型；其中注射劑的總倍半萜烯類的濃度是2-7.5mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的提取物注射劑，進一步包括前體脂質(zhì)體劑型，它是通過先制備脂質(zhì)體，添加賦形劑，然后凍干而制得，包封率≥80％，該前體脂質(zhì)體制劑在注射之前添加注射水以達到最終活性成分濃度(總倍半萜烯類的重量(mg)/制劑體積(ml))為2～8mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3的注射劑，其中納米脂質(zhì)體劑型、長循環(huán)納米脂質(zhì)體劑型、納米微乳劑型或脂質(zhì)納米球劑型的注射劑的分散相平均粒徑≤100納米，當(dāng)劑型為前體脂質(zhì)體、脂質(zhì)體或長循環(huán)納米脂質(zhì)體時包封率≥85％；和其中表面活性劑是磷脂和/或膽固醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或5的注射劑，脂質(zhì)納米球劑型和脂肪乳劑型的注射劑的總倍半萜烯類的濃度為2.0-3.0mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項的注射劑，它是靜脈注射劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或4的注射劑，其中提取物含有≥80wt的倍半萜烯類，和其中含倍半萜烯類的植物的提取物包括樹蘭花、香椿子、海風(fēng)藤、丁香、沒藥、黃花杜鵑、葛縷子、百里香、歐芹、廣藿香、茅蒼術(shù)、蛇床子、啤酒花、檀香木、香檸檬、防風(fēng)根、柏木、松節(jié)油、香茅、人參、溫郁金或姜黃各自的提取物，或這些提取物中兩種或多種按任何比例的摻合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或3的注射制劑，其中注射劑進一步含有選自植物油和動物油的油或作為等滲透劑的甘油。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或3的注射制劑，其中當(dāng)表面活性劑是卵磷脂時，注射劑進一步含有C14-C22直鏈或支鏈脂族胺。。
11.含有倍半萜烯類的植物的提取物注射劑的制備方法，它包括用總倍半萜烯類含量≥70wt％的從含有倍半萜烯類的植物中提取的提取物作為原料，添加表面活性劑，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀成膜或CO2臨界或超臨界方法來混合均勻，添加注射用水，進行高壓均質(zhì)化處理和/或超聲波處理，一直處理到獲得分散相平均粒徑≤1微米的穩(wěn)定水性分散體為止，從而制得注射劑，其中提取物與表面活性劑的重量比是0.5-1.5∶3.5-6.0，注射劑中總倍半萜烯類的最終濃度為1～10mg/ml。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的制備方法，其中注射劑的劑型包括脂質(zhì)體劑型，納米脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)脂質(zhì)體劑型或長循環(huán)納米脂質(zhì)體劑型，其中這些注射劑的總倍半萜烯類的濃度是2.0-7.5mg/ml，這些制劑的包封率≥80％。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的制備方法，其中注射劑的劑型包括納米微乳劑型，靜脈乳劑型，脂質(zhì)納米球劑型或脂肪乳劑型；其中這些注射劑的總倍半萜烯類的濃度是2.0-7.5mg/ml。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的制備方法，進一步包括在制備脂質(zhì)體之后，添加賦形劑，然后凍干，從而制備前體脂質(zhì)體劑型的制劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的制備方法，其中提取物含有≥80wt的倍半萜烯類，和其中含倍半萜烯類的植物的提取物包括樹蘭花、香椿子、海風(fēng)藤、丁香、沒藥、黃花杜鵑、葛縷子、百里香、歐芹、廣藿香、茅蒼術(shù)、蛇床子、啤酒花、檀香木、香檸檬、防風(fēng)根、柏木、松節(jié)油、香茅、人參、溫郁金或姜黃各自的提取物，或這些提取物中兩種或多種按任何比例的摻合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求11或13的制備方法，其中與表面活性劑一起還添加選自植物油和動物油的油或作為等滲透劑的甘油。
17.權(quán)利要求1-10中任何一項的提取物注射劑用于抑制和/或治療腫瘤，用于抑制癌細胞轉(zhuǎn)移，用于緩解腫瘤疼痛，用于預(yù)防或治療缺血性中風(fēng)的用途。
18.權(quán)利要求1-10中任何一項的提取物注射劑用于制備抑制或治療癌癥的藥物的用途。
19.由權(quán)利要求11-16中任何一項的方法制備的注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物提取物的新劑型，更具體地說涉及它們的納米脂質(zhì)體劑型，前體脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)脂質(zhì)體劑型，長循環(huán)納米脂質(zhì)體劑型，納米微乳劑型，靜脈乳劑型，脂質(zhì)納米球劑型和脂肪乳劑型。
文檔編號A61P35/00GK1454615SQ0211708
公開日2003年11月12日 申請日期2002年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月29日
發(fā)明者李德山, 陳澤平 申請人:大連醫(yī)大安鵬生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司