專(zhuān)利名稱(chēng)：染料木素的制備工藝及其藥物組合物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及染料木素的制備工藝，特別是從豆科植物中提取純化槐屬甙再酸水解生成染料木素的提取純化工藝，以及它在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、婦女更年期綜合癥、腫瘤和心、腦血管性疾病的應(yīng)用，屬于藥物制造和藥物治療領(lǐng)域。
骨質(zhì)疏松癥患者，特別是絕經(jīng)后女性患者，由于體內(nèi)雌激素水平下降，對(duì)破骨細(xì)胞抑制作用減弱，使其活性增強(qiáng)，骨溶解加速，當(dāng)這一作用大于骨形成作用，骨代謝處于負(fù)平衡狀態(tài)，則易發(fā)生骨量減少，骨顯微結(jié)構(gòu)退化，導(dǎo)致骨脆性增加，極易造成骨折，甚至造成永久性功能喪失。女性50-60歲后，男性60-70歲后發(fā)病率升高，80歲以上達(dá)高峰，女性患病率可達(dá)100％。50-90歲婦女脊椎骨折發(fā)生率是60歲以前的20倍。骨質(zhì)疏松癥最常見(jiàn)的癥癥①疼痛以腰背痛多見(jiàn)，占疼痛患者中的70％-80％。②身長(zhǎng)縮短、駝背多在疼痛后出現(xiàn)，脊椎椎體前部幾乎多為松質(zhì)骨組成，而且此部位是身體的支柱，負(fù)重量大，尤其第11、12胸椎及第3腰椎，負(fù)荷量更大，容易壓縮變形，使脊椎前傾，背曲加劇，形成駝背，隨著年齡增長(zhǎng)，骨質(zhì)疏松加重，駝背曲度加大，致使膝關(guān)節(jié)攣拘顯著。③骨折這是退行性骨質(zhì)疏松癥最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的并發(fā)癥，它不僅增加病人的痛苦，加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并嚴(yán)重限制患者活動(dòng)，甚至縮短壽命。據(jù)我國(guó)統(tǒng)計(jì)，老年人骨折發(fā)生率為6.3-24.4％，尤以高齡(80歲以上)女性老人為甚。骨質(zhì)疏松癥所致骨折在老年前期以橈骨遠(yuǎn)端骨折(Colles骨折)多見(jiàn)，老年期以后腰椎和股骨上端骨折多見(jiàn)。④呼吸功能下降胸、腰椎壓縮性骨折，脊椎后彎，胸廓畸形，可使肺活量和最大換氣量顯著減少，肺上葉前區(qū)小葉型肺氣腫發(fā)生率可高達(dá)40％；老年人多數(shù)有不同程度肺氣腫，肺功能隨著年齡增長(zhǎng)而下降，若再加骨質(zhì)疏松癥所致胸廓畸形，患者往往可出現(xiàn)胸悶、氣短、呼吸困難等癥狀。
目前，骨質(zhì)疏松癥主要分為兩型。第一型為原發(fā)性I型骨質(zhì)疏松癥，即屬高代謝型，是由于絕經(jīng)后雌激素減少，使骨吸收亢進(jìn)引起骨量丟失；因此，多選用骨吸收抑制劑如雌激素、降鈣素、鈣制劑治療，經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用證實(shí)長(zhǎng)期使用是有效的，但其潛在的主要副作用是可能增加子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的發(fā)生；另外，黃遂柱等研究亦指出雌激素缺乏和補(bǔ)充超生理劑量雌激素均對(duì)去勢(shì)小鼠骨折早期愈合不利，補(bǔ)充生理劑量雌激素對(duì)小鼠骨折愈合影響較小。第二型是原發(fā)性II型骨質(zhì)疏松癥，其病因是由于增齡老化所致調(diào)節(jié)激素失衡使骨形成低下，通常采用骨形成促進(jìn)劑，如活性維生素D、蛋白同化激素(苯丙酸諾龍)、鈣制劑、氟化劑和維生素K2等治療能獲得一定療效；然而，不少骨形成促進(jìn)劑的使用受到伴發(fā)性疾患象胃酸缺乏或慢性腎衰等的限制，其氟化物因其胃腸道不良反應(yīng)、外周疼痛綜合征和應(yīng)激性骨折等不良反應(yīng)給臨床治療帶來(lái)困難。
染料木素是異黃酮類(lèi)物質(zhì)中所占比率較高的一種，廣泛存在于包括槐角在內(nèi)的豆科類(lèi)植物中。Adlercreutz等首次發(fā)表異黃酮和木脂體與哺乳動(dòng)物雌激素結(jié)構(gòu)的相似性，并闡述它們的可能防癌作用以來(lái)，人們極為關(guān)注大豆異黃酮(isoflavone)對(duì)健康的影響。大豆異黃酮是大豆及其制品中的一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，主要有黃豆甙原(7，4′-二羥基異黃酮)、染料木黃酮(5，7，4′-三羥基異黃酮即染料木素，genistein)、生原禪寧A(biochaninA)和芒柄花素(7-羥基-4′-甲氧異黃酮)。人們研究較多的主要是黃豆甙原和Genistein，生原禪寧A和芒柄花素是其前體物。盡管黃豆甙原和Genistein不是甾體激素，因其能夠與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮微弱的雌激素效應(yīng)，故稱(chēng)為植物雌激素(phytoestrogen)。植物雌激素為雜環(huán)多酚類(lèi)化合物，主要有異黃酮、木脂體(lignan)和香豆雌酚(coumestrol)3大類(lèi)。由于異黃酮的活性是雌二醇的1/1000，與雌二醇競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體，低水平補(bǔ)充時(shí)由于其占位效應(yīng)所產(chǎn)生雌激素效應(yīng)較雌二醇有害效應(yīng)低得多，對(duì)雌激素表現(xiàn)為拮抗作用，進(jìn)而對(duì)激素相關(guān)疾病具有保護(hù)作用。因此，植物雌激素與這些疾病的關(guān)系成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)綜合癥為中老年人群的常見(jiàn)病，并在很大程度上與雌性激素的活性及其代謝有關(guān)。亞洲人因食用大豆制品較多，這些疾病發(fā)生較少，但隨著飲食的西化使其發(fā)病率有增加趨勢(shì)。同時(shí)，移民流行病學(xué)研究也顯示移居美國(guó)的亞裔人由于大豆食用量減少發(fā)病率增加。
染料木素又叫金雀異黃素，化學(xué)名為5，7，4’-三羥基異黃酮，英文名為Genistein；Prunetol；Genisteol，4’，5，7-trihydroxyisoflavone，分子式為C15H1005；分子量為270.23，結(jié)構(gòu)式為 染料木素的基礎(chǔ)研究證實(shí)具有良好藥理作用①動(dòng)物藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，染料木素具有明顯防治骨質(zhì)疏松的作用。Andersons等報(bào)道，在成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中，純化的金雀黃素即染料木素誘導(dǎo)酶合成的釋放的最適劑量為50～100mg/d，濃度過(guò)高將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，否則無(wú)作用，而且須長(zhǎng)期攝入效應(yīng)才能鞏固。Citvell等發(fā)現(xiàn)，將異丙氧黃酮與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共同孵育，培養(yǎng)基中骨鈣素濃度升高，說(shuō)明該藥物對(duì)骨髓細(xì)胞具有顯著的刺激作用。Arjmand等以切除雙側(cè)卵巢的授乳大鼠為模型，這些大鼠因哺乳幼鼠以鈣的需求較大并普遍存在骨量丟失，喂養(yǎng)添加異黃酮飲料兩周的授乳大鼠的骨密度明顯高于安慰劑組和結(jié)合雌激素(生理劑量)治療組，但所有大鼠的子宮均無(wú)變化。Blarir等分別給予兩組去勢(shì)大鼠含有異黃酮或酪蛋白的飼料，前組大鼠的股骨密度明顯高于后組。這些實(shí)驗(yàn)支持異黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松的防治作用。
初步臨床試驗(yàn)表明染料木素具有較好骨質(zhì)疏松癥的治療作用①染料木素作為異黃酮類(lèi)的主要成分，具有選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑作用。子宮組織富含α受體，染料木素與之結(jié)合后發(fā)揮拮抗劑作用，阻止雌二醇DNA的激活和蛋白質(zhì)的合成，有效避免了雌激素替代治療潛在誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌并發(fā)癥危險(xiǎn)。②染料木素對(duì)絕經(jīng)后婦女發(fā)揮著多重有益的預(yù)防保健作用。異黃酮對(duì)成人骨代謝具有良好治療作用的發(fā)現(xiàn)源于亞洲人食用豆制品的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。亞洲人均30～40g/d，日本人200mg/d，從中可獲得異黃酮25～45mg/d，西方人來(lái)自膳食的異黃酮不足5mg/d，因此，日本婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、骨折發(fā)病的低風(fēng)險(xiǎn)與異黃酮的預(yù)防作用直接相關(guān)。1973年Utian等報(bào)道非甾體雌激素與結(jié)合雌激素相比，前者能顯著降低雙側(cè)卵巢切除術(shù)后女性(45例)的血鈣水平；Potter等認(rèn)為異黃酮可有效預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，而且老年絕經(jīng)婦女?dāng)z入閾值量異黃酮(90mg/d)6個(gè)月即獲得明顯療效。Wilcox等人體試驗(yàn)的初步結(jié)果提示大豆蛋白可增加骨密度。但由于豆類(lèi)植物中異黃酮含量隨地域、品種而有所差異，不同種族膳食習(xí)慣的差異和豆類(lèi)中異黃酮的消化、吸收、循環(huán)、代謝過(guò)程都會(huì)影響血液異黃酮水平；當(dāng)時(shí)，因從植物中提純異黃酮尚難以實(shí)現(xiàn)，從而促進(jìn)了人工合成異黃酮—異丙氧黃酮的問(wèn)世。意大利、比利時(shí)、匈牙利、韓國(guó)和日本已采用異丙氧黃酮治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。如意大利一項(xiàng)針對(duì)400余名絕經(jīng)后老年骨質(zhì)疏松患者為期5年的研究顯示與安慰劑組相比，治療組(異丙氧黃酮600mg/d)不僅有明顯的骨儲(chǔ)備和骨密度改善，而且在治療幾個(gè)月后部分骨生化指標(biāo)也發(fā)生顯著變化。Gambacciani等證實(shí)該藥可改善絕經(jīng)后老年骨密度降低，并可使之恢復(fù)至絕經(jīng)前骨密度水平。然而，異丙氧黃酮確實(shí)具有改善骨質(zhì)疏松的作用，但常引起食欲減退、惡心、嘔吐、腹痛等副作用，而且服量較多。
綜上所述，染料木素為異黃酮類(lèi)化合物，具有重要的生理功能如雌激素樣作用和抗癌活性等，被用于預(yù)防和治療婦科腫瘤、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病，亦用于美容、減肥、減少女性的熱潮紅與絕經(jīng)期綜合癥。因此，有關(guān)染料木素的研究和開(kāi)發(fā)已成為倍受人們關(guān)注的新熱點(diǎn)。染料木素的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有良好的發(fā)展前景。但是，有關(guān)提純工藝的文獻(xiàn)報(bào)道不多，其純品價(jià)格特別昂貴。Sigma公司5mg包裝、純度98％的染料木素報(bào)價(jià)為30-50美元，且價(jià)格還在逐年上升，若作為藥品開(kāi)發(fā)使用，必然受到限制。為此，有必要尋找來(lái)源豐富的原料和提取簡(jiǎn)單、成本低廉的制備工藝，以供大量生產(chǎn)，為染料木素作為藥品的開(kāi)發(fā)提供條件。
依據(jù)參考文獻(xiàn)(詳見(jiàn)文獻(xiàn)資料部分)，紫花苜蓿中含量最高而且西北地區(qū)資源豐富，但是從紫花苜蓿中提取染料木素的工藝，由于原料葉綠素含量高，脫色困難，收率不高難以工業(yè)化。從大豆中提取genistein，由于大豆含植物蛋白和油脂太多，得到純品(純度＞98％)相當(dāng)困難，而從槐角中提取槐角甙和染料木素早在80年代就有人報(bào)道，并對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。但至今尚未見(jiàn)工業(yè)生產(chǎn)的報(bào)道。
經(jīng)過(guò)綜合比較發(fā)現(xiàn)，從大豆、三葉草、葛根、槐花、槐角等多種豆科植物中可提取Genistein，但是所采用的工藝、原料的成本和收率差別較大；經(jīng)過(guò)優(yōu)化后確定從槐角中提取Genistein?；苯菍?000年版藥典法定藥材，分布于全國(guó)各地；資源豐富易得。從槐角中提取染料木素的工藝路線(xiàn)容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
在槐屬植物中，染料木素含量低于槐屬甙，且染料木素水溶解性較槐屬甙差，使提取較為困難。染料木素和槐屬甙的差異僅在于槐屬甙4’位上多了一個(gè)葡萄糖，若將該糖去掉則由槐角甙變成染料木素?，F(xiàn)有技術(shù)中曾報(bào)道用10％HCl酸解去糖得到了苷元。
從植物中提取純化槐屬甙至少包括首先，將植物粗粉用醇回流提?。黄浯?，濃縮回收醇制備浸膏，加水進(jìn)行沉淀，洗去沉淀中的水溶性雜質(zhì)，收集沉淀；然后，將沉淀進(jìn)行有機(jī)溶劑回流脫脂，并用水洗滌沉淀，用醇進(jìn)行結(jié)晶，收集沉淀；最后，結(jié)晶干燥，得到純化的槐屬甙。
用于提取的植物為豆科植物。
用于回流植物粗粉的醇為甲醇或乙醇或其混合物。為甲醇時(shí)，其濃度為80-90％，提取時(shí)間為0.5-2小時(shí)，提取次數(shù)為一次或多次，優(yōu)選為三次；為乙醇時(shí)，其濃度為75-90％，料液比即重量體積比為1∶1-3。
浸膏比重為1.10-1.20。
用于回流脫脂的有機(jī)溶劑為氯仿或乙醚或其混合物。
用于洗滌沉淀的水為自來(lái)水或蒸餾水。
收集沉淀的工藝為離心或?yàn)V過(guò)。將槐屬甙進(jìn)行酸水解并純化得到染料木素至少包括如下步驟首先，將槐屬甙進(jìn)行回流酸水解得到結(jié)晶；其次，用水洗滌結(jié)晶至pH值為中性；然后，收集沉淀物進(jìn)行結(jié)晶干燥，得到染料木素。
其中將槐屬甙進(jìn)行回流酸水解的條件為酸解液濃度為8-12％HCl-50-70％乙醇液；料液比即重量體積比為1∶5-15；溫度為80-95℃；時(shí)間為2-4小時(shí)。
將槐屬甙進(jìn)行回流酸水解的條件優(yōu)選為酸解液濃度為10％HCl-60％乙醇液；料液比即重量體積比為1∶10；溫度為90℃；時(shí)間為3.5小時(shí)。
預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、婦女更年期綜合癥、腫瘤、心腦血管性疾病的藥物組合物，含有上述工藝制備的染料木素為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
藥物組合物為膠囊劑或片劑或顆粒劑或注射劑或緩釋劑或丸劑或凍干劑。
上述工藝制備的染料木素在制備預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、婦女更年期綜合癥、腫瘤、心腦血管性疾病的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)本發(fā)明的制備工藝制備的染料木素在與抗骨質(zhì)疏松有關(guān)的藥理試驗(yàn)中顯示出優(yōu)良的抗骨質(zhì)疏松活性。
本發(fā)明因此還涉及含有該工藝制備的染料木素作為活性成份的有效劑量的化合物以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。
藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的工藝制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將用該工藝制備的染料木素與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明制備的染料木素的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重及個(gè)體反應(yīng)，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。通常對(duì)成人患者，所給本發(fā)明制備的染料木素的日劑量為50.4mg-100.8mg。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明制備的染料木素在抗骨質(zhì)疏松中顯示出優(yōu)良效果。因而可作為抗骨質(zhì)疏松藥用于動(dòng)物，優(yōu)選用于哺乳動(dòng)物，特別是人。
根據(jù)文獻(xiàn)資料和臨床研究，本發(fā)明制備的染料木素還可以用于預(yù)防和治療婦女更年期綜合癥，預(yù)防和治療腫瘤，預(yù)防和治療心腦血管性疾病。
本發(fā)明建立了先從豆科植物中提取純化槐屬甙再酸水解生成染料木素的提取純化工藝，該工藝簡(jiǎn)便、易行，平均產(chǎn)品收率達(dá)到0.636％，槐角甙純度(HPLC歸一化法)達(dá)到95％以上，染料木素純度(HPLC歸-化法)大于98％，并經(jīng)過(guò)核磁、紫外、質(zhì)譜、熔點(diǎn)測(cè)定等分析，證明其結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道完全一致。同時(shí)該工藝適用于批量生產(chǎn)，并大大降低了生產(chǎn)成本。


圖1為本發(fā)明的制備槐屬甙的工藝流程圖；圖2為本發(fā)明的從槐屬甙制備染料木素的工藝流程圖。
實(shí)施例1染料木素的制備工藝(以槐角為例)槐角(2000年版中國(guó)藥典P292)系豆科植物Sophora japonica L.的干燥成熟果實(shí)；槐角的性味屬苦、寒，歸肝、大腸經(jīng)。具有清熱瀉火，涼血止血之功能；主治腸熱便血，痔腫出血，肝熱頭痛，眩暈?zāi)砍嗟劝Y?；苯侵刑崛〉漠慄S酮單體成分即染料木素(Genistein)的中文異名為染料木因或金雀異黃素，英文異名為Prunetol或Genisteol?；瘜W(xué)名為4H-1-Benzopyran-4-one，5，7-dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)。分子式為C15H10O5；分子量270.23。Genistein為長(zhǎng)方形或六邊形棒狀結(jié)晶(60％乙醇)；樹(shù)枝狀結(jié)晶(乙醚)，熔點(diǎn)297～298℃(略微分解)。溶于常用的有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水。溶于稀堿顯黃色。
槐角甙是在染料木素的4’位上連有一個(gè)葡萄糖，形成葡萄糖甙故又叫染料木素-4-葡萄糖甙。英文名Sophoricoside。由于比染料木素多一個(gè)葡萄糖，其水溶性較染料木素大?；苯沁暗慕Y(jié)構(gòu)式如下圖。

在槐角甙的提取中，為了防止大量植物蛋白提取出來(lái)而影響以后分離，故采取用高醇提取，使蛋白變性的工藝，又根據(jù)槐角甙和染料木素水溶性差的特點(diǎn)，以水作為溶劑去除水溶性物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行純化。利用槐角甙在氯仿、乙醚中幾乎不溶的特性，選用氯仿、乙醚脫脂，考慮到以后工業(yè)生產(chǎn)，因乙醚沸點(diǎn)太低，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)中使用而選用氯仿。
該工藝的大體流程如下槐角篩選處理得到粗粉，接著用甲醇(或乙醇)回流提取后，濃縮回收醇得到浸膏，向浸膏中加水沉淀槐角甙，洗去水溶雜質(zhì)后，收集沉淀，將有機(jī)溶劑回流脫脂后，水洗沉淀，得到醇結(jié)晶槐角甙，收集結(jié)晶體(該結(jié)晶體即為槐角甙)；然后，加HCl酸解，得到酸解液，回收酸醇，得到沉淀并用水洗滌，再收集沉淀，用醇溶解，得到結(jié)晶，最后收集結(jié)晶(該結(jié)晶即為染料木素)。
該工藝的詳細(xì)步驟為步驟一槐角甙的制備1、篩選槐角并進(jìn)行處理，得到槐角粗粉；槐角篩選槐角(Fructus sophorae)為豆科植物槐Sophora japoniaL.的干燥成熟果實(shí)。按中華人民共和國(guó)藥典2000年版第292～293頁(yè)要求鑒別和收集。
槐角洗滌與干燥將收集來(lái)的槐角過(guò)篩，揀去樹(shù)枝等雜物后快速用水沖洗去泥沙，烘干(80℃～90℃)。
槐角粉碎將烘干的槐角用粉碎機(jī)粉碎，最大顆粒不超過(guò)0.8×1cm。2、槐角粗粉用醇進(jìn)行回流提取后，濃縮所回收的醇得到浸膏；用于回流植物粗粉的醇為甲醇或乙醇或其混合物。為甲醇時(shí)，其濃度為80-90％，提取時(shí)間為0.5-2小時(shí)，提取次數(shù)為一次或多次，優(yōu)選為三次；為乙醇時(shí)，其濃度為75-90％，料液比即重量體積比為1∶1-3。浸膏比重為1.10-1.20。
3、向浸膏中加水，產(chǎn)生沉淀，用水洗去水溶性雜質(zhì)后，收集沉淀；用于洗滌沉淀的水為自來(lái)水或蒸餾水。
收集沉淀的工藝為離心或?yàn)V過(guò)。
4、將沉淀用有機(jī)溶劑回流脫脂后，收集沉淀；用于回流脫脂的有機(jī)溶劑為氯仿或乙醚或其混合物，優(yōu)選為氯仿。
收集沉淀的工藝為離心或?yàn)V過(guò)。
5、將沉淀用醇進(jìn)行再結(jié)晶，所收集的結(jié)晶體即為槐角甙。步驟二酸解槐角甙制備染料木素1、將槐屬甙在酸性條件下回流水解；回流酸水解的條件為酸解液濃度為8-12％HCl-50-70％乙醇液；料液比即重量體積比為1∶5-15；溫度為80-95℃；時(shí)間為2-4小時(shí)。
特別優(yōu)選為酸解液濃度為10％HCl-60％乙醇液；料液比即重量體積比為1∶10；溫度為90℃；時(shí)間為3.5小時(shí)。
2、回流后的酸醇溶液回收后用水進(jìn)行沉淀，將沉淀用水洗滌至pH值為中性后收集；用于洗滌沉淀的水為自來(lái)水或蒸餾水。
收集沉淀的工藝為離心或?yàn)V過(guò)。
3、將沉淀用醇進(jìn)行再結(jié)晶，所收集的結(jié)晶體即為染料木素。
藥物組合物的制備本發(fā)明制備的染料木素或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等，可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分的本發(fā)明化合物或其立體異構(gòu)體與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物或其立體異構(gòu)體制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。該工藝制備的染料木素及其制劑的藥理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果1、染料木素的主要藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)論①染料木素可抑制去勢(shì)模型大鼠的體重增加，增加維甲酸模型大鼠的體重，并明顯增加維甲酸大鼠的左股骨重量、左脛左脛骨重量和(P＜0.05或P＜0.01)。②模型大鼠的血清Ca、P、Mg、CT水平明顯降低，BGP、ALP水平升高，與正常對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)；4.5mg/kg、9mg/kg染料木素治療后，上述各指標(biāo)均顯著改善，與模型組比較相差顯著(P＜0.05或P＜0.01)。4.5mg/kg、9mg/kg染料木素可顯著改善模型大鼠股骨最大載荷、最大橈度、彈性載荷、彈性橈度；其作用明顯優(yōu)于骨疏康(陽(yáng)性對(duì)照藥)。4.5mg/kg、9mg/kg染料木素可明顯增強(qiáng)模型大鼠的股骨、脛骨和腰椎L2-4的骨密度(P＜0.05或P＜0.01)。4.5mg/kg、9mg/kg染料木素可明顯升高維甲酸和去勢(shì)模型大鼠血清中微量元素含量(P＜0.05或P＜0.01)。4.5mg/kg、9mg/kg染料木素可明顯增加模型大鼠的骨小梁面積百分比(BV/TV％)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁數(shù)目(Tb.N)，降低骨小梁間隔(Tb.Sp)。13mg/kg、26mg/kg染料木素具有顯著抗炎和鎮(zhèn)痛作用(P＜0.05或P＜0.01)。對(duì)小鼠單核巨噬系統(tǒng)有明顯抑制作用(P＜0.01)。⑨擬推薦臨床用藥采用口服法；成人日用劑量為50.4～100.8mg[計(jì)算工藝4.5mg/kg(9.0/中劑量)用藥劑量×(200/1000)kg大鼠體重×56體重指數(shù)＝50.4(100.8)mg]。⑩推薦用藥3個(gè)月為一療程。
2、染料木素一般藥理研究的試驗(yàn)結(jié)論染料木素給藥后對(duì)小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，大鼠的呼吸頻率，ECG(心電圖)，BP(血壓)變化不明顯；故染料木素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)無(wú)明顯影響，提示臨床用藥具有安全性。
3、染料木素的小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)論按最大耐受量(MTD)測(cè)定法，給30只小鼠一日內(nèi)分兩次(間隔6h)灌胃染料木素24g/kg，觀察一周無(wú)動(dòng)物死亡，表明該試藥MTD＞24g/kg，該劑量是臨床成人用藥劑量的21818倍[24g/kg×1000mg÷1.1mg/kg(平均76mg÷70kg體重)成人日用劑量]。
4、染料木素大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)論8、160和320mg/kg(相當(dāng)于臨床成人擬用劑量7、146、291倍)染料木素連續(xù)灌胃給藥6個(gè)月，對(duì)動(dòng)物的心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、子宮、卵巢、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、胰腺、膀胱、淋巴結(jié)、腦、脊髓、胸骨(骨和骨髓)、股骨、腰(胸)椎骨、視神經(jīng)及垂體等臟器，經(jīng)病理組織學(xué)檢查，未見(jiàn)由藥物所致的病理性改變。
5、染料木素Beagle犬長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果表明，Beagle犬連續(xù)口服6mg/kg d-1，250mg/kg d-1，500mg/kg d-1(相當(dāng)于臨床成人擬用劑量的6、227、455倍)染料木素36周，對(duì)Beagle犬的生長(zhǎng)、發(fā)育、飲食、精神狀態(tài)、大小便無(wú)明顯影響。對(duì)消化道、血液常規(guī)指標(biāo)及肝、腎功能無(wú)明顯毒性。對(duì)心、肝、脾、肺、腎等主要臟器無(wú)損害。
6、染料木素致突變?cè)囼?yàn)結(jié)論染料木素誘發(fā)鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97、TA98、TA100、TA102的回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍。根據(jù)《中藥新藥研究指南》結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，受檢樣品——染料木素的鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性。
染料木素小鼠骨髓微核試驗(yàn)，試驗(yàn)溶劑對(duì)照雌、雄性小鼠的微核率分別為5.0‰、3.0‰；陽(yáng)性對(duì)照雌、雄性小鼠的微核率分別為65.8‰、64.8‰，符合試驗(yàn)工藝的要求。受檢樣品——染料木素各劑量組的微核率與溶劑對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，未見(jiàn)有顯著性差異。根據(jù)《中藥新藥研究指南》結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，受檢樣品染料木素的小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
7、染料木素致畸變?cè)囼?yàn)結(jié)論染料木素小鼠睪丸精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，本試驗(yàn)溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組的染色體畸變率分別為1.0％和2.8％，兩組的染色體畸變率用X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異(P＜0.05)，符合試驗(yàn)工藝的要求。受檢樣品各劑量組的染色體畸變率為0.8％～1.2％，與溶劑對(duì)照組的染色體畸變率用X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均未見(jiàn)有顯著性差異。根據(jù)《中藥新藥研究指南》結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)判定，受檢樣品染料木素的小鼠睪丸精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性。
8、染料木素生殖毒理試驗(yàn)結(jié)論染料木素的一般生殖毒性試驗(yàn)，雌、雄性大鼠試驗(yàn)組給予受檢樣品染料木素劑量分別為16、160、480mg/kg·bw；溶劑對(duì)照給予0.5ml/kg·bw蒸餾水。雄性大鼠連續(xù)給藥60天后與給藥14天的雌性大鼠合籠，雄性大鼠給藥至交配結(jié)束，雌性大鼠給藥至妊娠第17天。各組孕鼠1/2于妊娠第14天剖檢，另1/2孕鼠使其自然分娩哺乳；仔鼠于第28、35天分別處死1/2剖檢，觀察有無(wú)畸形。試驗(yàn)結(jié)果表明受檢樣品染料木素480mg/kg·bw劑量引起親代雄性大鼠精子活動(dòng)度下降，但未發(fā)現(xiàn)睪丸病變，也未影響雄鼠生殖能力；同時(shí)使雌鼠妊娠期體重增長(zhǎng)明顯低于其他組，但未影響胚胎形成、仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。160mg/kg·bw劑量對(duì)親代和仔代未引起明顯的異常。因此，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為受檢樣品染料木素對(duì)大鼠不具有一般生殖毒性。
9、染料木素藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)論采用高效液相色譜(HPLC)法研究染料木素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。本研究所建立的HPLC法經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備、特異性、回收率及精密度考察，符合新藥藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)的基本要求。大鼠灌胃(ig)給予6.25、12.5和50mg/kg的染料木素(分別為人推薦用量的2.5、5、20倍)，發(fā)現(xiàn)染料木素ig后能迅速吸收入血，血漿中藥物的消除與給藥劑量有關(guān)，50mg/kg呈現(xiàn)異常動(dòng)力學(xué)過(guò)程。6.25和12.5mg/kg兩劑量的藥-時(shí)數(shù)據(jù)經(jīng)3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析，體內(nèi)過(guò)程符合一室模型，平均消除t1/2 Ke為6.006h。與大鼠尾靜脈注射9mg/kg染料木素的AUC相比，該藥膠囊劑ig給藥的絕對(duì)生物利用度為66.28％。大鼠ig給予12.5mg/kg染料木素，測(cè)定不同時(shí)間原型藥物的組織分布，發(fā)現(xiàn)除胃腸組織外，其他組織在給藥后80min藥物分布達(dá)最高，其中以肝臟、腎、子宮和卵巢組織分布較多，以后隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，在同一時(shí)間以胃腸組織藥物含量最高。染料木素吸收入血后，迅速與葡萄糖醛酸結(jié)合，且結(jié)合量與給藥劑量呈正相關(guān)(吸收相)。大鼠ig給予9mg/kg染料木素，24h內(nèi)藥物經(jīng)尿的排謝率為9.63％(原型藥物及葡萄糖醛酸結(jié)合形式)，經(jīng)糞便的排謝率為20.06％(原型藥物及葡萄糖醛酸結(jié)合形式)。染料木素的臨床應(yīng)用1、抗腫瘤作用大豆異黃酮有明顯的抗腫瘤作用，特別是對(duì)激素依賴(lài)性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌，植物雌激素(主要為染料木素)與雌二醇競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合雌激素受體，從而抑制雌二醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的促有絲裂作用，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
另外，抑制與癌癥相關(guān)的酶合性，特別是酪氨酸激酶、染料木素還能抑制一些與DNA切斷有關(guān)酶后性的作用。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，給染料木素200mmol/kg，可抑制β/6F-10黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移癌小結(jié)形成，抑制率53.6％，小鼠壽命延長(zhǎng)47.7％。2、預(yù)防和治療婦女更年期綜合癥研究發(fā)現(xiàn)，婦女更年期綜合癥亞洲比西方低，這與動(dòng)物中大豆制品含量有關(guān)，日本婦女比加拿大婦女面頸紅熱的次數(shù)低，原因是食物中植物雌激素含量高，特別是染料木素含量高，現(xiàn)已用于雌激素替代治療的I期臨床和志愿者試驗(yàn)。采用植物雌激素治療絕經(jīng)期婦女老年性癡呆癥發(fā)生的危險(xiǎn)下降40％，在植物雌激素中，染料木素因來(lái)源豐富而受重視。3、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥染料木素能有效緩解因切除卵巢后大鼠的骨質(zhì)減少能使大鼠骨密度回復(fù)到與未切除卵巢大鼠相近水平。98年有人研究確認(rèn)投與90mg異黃酮人群的脊椎骨密度明顯長(zhǎng)高，更年期婦女服異黃酮5～10周，血管彈性增強(qiáng)26％(P＜0.001)，去卵巢大鼠喂染料木素0.5mg/d，14d后骨密度升高17％。4、預(yù)防和治療心、腦血管疾病人群服用56～90mg/日異黃酮6個(gè)月，血中非HDL膽固醇明顯下降，而HDL膽固酮含量相對(duì)升高，另外，抑制血小板凝集，以及抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生等作用而用于預(yù)防動(dòng)脈硬化及冠狀動(dòng)脈疾患。
另外，異黃酮對(duì)其它動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子也有影響，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成。
權(quán)利要求
1.一種制備染料木素的工藝，其特征在于首先，從植物中提取純化槐屬甙；其次，將純化的槐屬甙進(jìn)行酸水解，并純化得到染料木素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備染料木素的工藝，其特征在于從植物中提取純化槐屬甙至少包括首先，將植物粗粉用醇回流提?。黄浯危瑵饪s回收醇制備浸膏，加水進(jìn)行沉淀，洗去沉淀中的水溶性雜質(zhì)，收集沉淀；然后，將沉淀進(jìn)行有機(jī)溶劑回流脫脂，并用水洗滌沉淀，用醇進(jìn)行結(jié)晶，收集沉淀；最后，結(jié)晶干燥，得到純化的槐屬甙。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的植物為豆科植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的用于回流植物粗粉的醇為甲醇或乙醇或其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的用于回流植物粗粉的醇為甲醇時(shí)，其濃度為80-90％，提取時(shí)間為0.5-2小時(shí)，提取次數(shù)為一次或多次，優(yōu)選為三次。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的用于回流植物粗粉的醇為乙醇時(shí)，其濃度為75-90％，料液比即重量體積比為1∶1-3。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的浸膏比重為1.10-1.20。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的用于回流脫脂的有機(jī)溶劑為氯仿或乙醚或其混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的用于洗滌沉淀的水為自來(lái)水或蒸餾水。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的收集沉淀的工藝為離心或?yàn)V過(guò)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備染料木素的工藝，其特征在于將槐屬甙進(jìn)行酸水解并純化得到染料木素至少包括如下步驟首先，將槐屬甙進(jìn)行回流酸水解得到結(jié)晶；其次，用水洗滌結(jié)晶至pH值為中性；然后，收集沉淀物進(jìn)行結(jié)晶干燥，得到染料木素。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的將槐屬甙進(jìn)行回流酸水解的條件為酸解液濃度為8-12％HCl-50-70％乙醇液；料液比即重量體積比為1∶5-15；溫度為80-95℃；時(shí)間為2-4小時(shí)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備染料木素的工藝，其特征在于所述的將槐屬甙進(jìn)行回流酸水解的條件優(yōu)選為酸解液濃度為10％HCl-60％乙醇液；料液比即重量體積比為1∶10；溫度為90℃；時(shí)間為3.5小時(shí)。
14.一種預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物，其特征在于含有上述權(quán)利要求1-13所述的工藝制備的染料木素為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
15.一種預(yù)防和治療婦女更年期綜合癥的藥物組合物，其特征在于含有上述權(quán)利要求1-13所述的工藝制備的染料木素為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
16.一種預(yù)防和治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于含有上述權(quán)利要求1-13所述的工藝制備的染料木素為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
17.一種預(yù)防和治療心、腦血管性疾病的藥物組合物，其特征在于含有上述權(quán)利要求1-13所述的工藝制備的染料木素為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求14或15或16或17所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物為膠囊劑或片劑或顆粒劑或注射劑或緩釋劑或丸劑或凍干劑。
19.權(quán)利要求1-13所述的工藝制備的染料木素在制備預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。
20.權(quán)利要求1-13所述的工藝制備的染料木素在制備預(yù)防和治療婦女更年期綜合癥的藥物中的應(yīng)用。
21.權(quán)利要求1-13所述的工藝制備的染料木素在制備預(yù)防和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
22.權(quán)利要求1-13所述的工藝制備的染料木素在制備預(yù)防和治療心腦血管性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種制備染料木素的工藝，至少包括從植物中提取純化槐屬甙；將純化的槐屬甙進(jìn)行酸水解，并純化得到染料木素。該工藝大體流程為植物粗粉用醇回流提??；濃縮回收醇制備浸膏，加水沉淀，洗去水溶性雜質(zhì)；將沉淀用有機(jī)溶劑回流脫脂，水洗滌沉淀，醇結(jié)晶后干燥，得到純化的槐屬甙；將槐屬甙進(jìn)行回流酸水解得到結(jié)晶；用水洗滌結(jié)晶至pH值為中性；收集沉淀物進(jìn)行結(jié)晶干燥，得到染料木素。一種藥物組合物，包括以該工藝制備的染料木素為活性成分及制藥領(lǐng)域中常用的載體。還涉及該工藝制備的染料木素在制備預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥、婦女更年期綜合癥、腫瘤和心腦血管性疾病藥物中的應(yīng)用。該工藝簡(jiǎn)便、易行，產(chǎn)品收率高，適用于批量生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1465570SQ02123450
公開(kāi)日2004年1月7日 申請(qǐng)日期2002年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者王四旺, 王增祿, 王劍波 申請(qǐng)人:西安恒泰本草科技有限公司