專利名稱：刺云實粉提取物及其藥用制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種刺云實粉提取物及其藥用制劑，屬天然植物藥技術(shù)領(lǐng)域。
刺云實是由云南省首次引種成功的一個新種，它屬于豆科植物，為蘇木屬的一種灌木或小喬木，學(xué)名為刺云實(Caesalpinia spinosa Kuntze)。刺云實粉提取物及其藥用制劑，是以滇產(chǎn)藥用植物刺云實的豆莢殼(簡稱刺云實粉)為原料研制成的提取物及新藥。
通過國內(nèi)外文獻檢索，未見與本發(fā)明技術(shù)相同的報道。
本發(fā)明所作的毒理學(xué)、藥效學(xué)及臨床觀察實驗結(jié)果(數(shù)據(jù)及結(jié)論)如下1、抗病毒活性試驗由于病毒只能在活細胞中生長復(fù)制，因而細胞培養(yǎng)抗病毒試驗，是抗病毒藥物活性試驗的最常用方法---抑制病毒致細胞病變法(簡稱CPE)，并規(guī)定以抑制細胞病變50％的藥物最低稀釋濃度為IC50。
1-1實驗材料---DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s培養(yǎng)基)、磷酸緩沖鹽液是Sigma公司出品；胰蛋白酶-EDTA(x10)及胰蛋白酶(1∶250)為Gibco公司出品；胎牛血清(FBS)為Biofluids有限公司出品。
1-2病毒病原菌株及活細胞---呼吸道合胞病毒(RSV)及副流感病毒3型(parainfluenza type 3 virus)為試驗病毒病原菌株；Hep2細胞均由美國Type CultureCollection提供。
1-3試驗用藥及對照品----三批試驗用藥樣品由發(fā)明人提供；對照試驗用藥品為浙江溫卅第三制藥廠生產(chǎn)的化學(xué)藥品三氮唑核苷(Ribavirin)。
1-4抑病毒試驗----用上述規(guī)格的材料和病毒病原菌株，并采用抑制病毒致細胞病變法(簡稱CPE)進行抑病毒試驗。對提取物三批樣品進行了抑病毒試驗結(jié)果如表1及表2所示。
表1三個樣品對呼吸道合胞病毒(RSV)的抗病毒活性試驗樣品IC50(μg/ml)aTC50(μg/ml)bTCc1 2.82.81.02 2.32.31.03 12.0 12.0 1.0三氮唑核苷2.923.0 7.9a IC50-----抑制細胞病變50％的藥物最低稀釋濃度b TC50-----為產(chǎn)生50％細胞毒性效應(yīng)(cytotoxic effect)的藥物濃度c TCc＝TC50/IC50表2三個樣品對副流感病毒3型病原菌的抗病毒活性試驗樣品IC50(μg/ml)aTC50(μg/ml)bTCc1 2.82.81.02 2.32.31.03 12.0 12.0 1.0三氮唑核苷5.262.5 12.0試驗結(jié)果表明，提取物，比對照試驗的化學(xué)藥品“三氮唑核苷(Ribavirin)”具有更多優(yōu)點，而且副作用小得多，這正是提取物制成的藥制的特色所在。
2、刺云實粉提取物抑菌實驗(平皿法)2-1培養(yǎng)基---采用美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的Muller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基。
2-2對照品---選用昆明制藥廠出產(chǎn)的鹽酸黃蓮素片劑。
2-3供試菌株---共選用了八種金黃色葡萄球菌(Staphyloccus albus，ATCC-25923)、綠膿桿菌(Pseudomonas aerusinosa，ATCC--27853)、大腸桿菌(Escherichia coli ATCC--25922)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)甲型溶血性鏈球菌、(S.hemolyticus)以及痢疾桿菌、宋氏痢疾桿菌。其中金黃色葡萄球菌(Staphyloccus albus，ATCC-25923)、綠膿桿菌(Pseudomonas aerusinosa，ATCC--27853)、大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC--25922)為美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的菌株，其余五種為云南省微生物研究所提供的菌種。
2-4試驗結(jié)果---抑菌試驗結(jié)果表明，刺云實粉提取物對八種菌株均有明顯地抑制作用，最低抑菌濃度(MIC)在0.150g％-0.0613g％之間，小于對照品鹽酸黃蓮素片劑(MIC一般在0.150g％-0.5000g％之間)。
供試八種菌株包括了革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌，桿菌和球菌，均為新型抗生素篩選常用的指示菌，所以從抑菌試驗結(jié)果可以初步表明，刺云實粉提取物具有廣譜抗菌活性。因此刺云實粉提取物具有清熱解毒、抗菌消炎的功效。
3、毒理學(xué)試驗毒理學(xué)試驗包括急毒、長毒、特殊毒性試驗(致癌試驗、生殖毒性試驗、致突變試驗)三個部份，由授權(quán)單位昆明醫(yī)學(xué)院天然藥物藥理重點實驗室完成。特殊毒性試驗要回答的是潛在性危害問題，對用藥者及下一代有無致癌、致畸、致突變的危險。我們研制的是中藥二類新藥，按規(guī)定特殊毒性試驗可以不做，報送說明資料即可。刺云實粉提取物在原產(chǎn)地南美洲是當?shù)赝林褡迨朗来u用的藥物，至少有二百多年使用歷史，沒有發(fā)現(xiàn)任何毒副作用，非常安全。
3-1急毒試驗實驗動物----選體重為18-20.0g健康的ICR小鼠20只，雌雄各半用于進行預(yù)試驗，探索該提取物的中毒劑量及死亡劑量。預(yù)試結(jié)果證明，測不出半致死量，小鼠經(jīng)口最大耐受量為22.8g/kg體重。為臨床用藥量的250倍以上。故按規(guī)定采用最天耐受量試驗(M.T.D)。
最大耐受量試驗---選體重為18-20.0g健康的ICR小鼠20只，雌雄各半用于進行最大耐受量試驗，按常規(guī)設(shè)計要求灌胃給藥后，計算得最大耐受量(M.T.D)。
毒理試驗結(jié)果---試驗結(jié)果測不出半致死量，小鼠經(jīng)口最大耐受量為22.8g/kg體重。為臨床用藥量的250倍以上。在給藥后8小時、24小時直至到第七天的觀察中，未見動物出現(xiàn)中毒反應(yīng)。在15天的連續(xù)觀察中，試驗動物情況良好，活動、食欲、糞便均未見異常，口、眼、鼻、耳無異常分泌物。體重增長也屬正常范圍，平均每天每只增長0.5克左右。在14天的連續(xù)觀察后，將小鼠解剖，內(nèi)臟完全正常。毒理結(jié)論認為，以刺云實粉提取物為原料的藥用制劑，是一種少有的安全可靠的新藥。
3-2長期毒性試驗長期毒性試驗的主要目的是觀察動物因長期連續(xù)給藥所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，以確定該藥的毒性和臨床用藥安全劑量。
實驗動物----選了兩種動物1、狗，年齡5個月。每劑量組雌雄各2只；2、大鼠，鼠齡7周，體重為120-150.0g健康的SD系大鼠，每劑量組雌雄各10只；對照組與試驗組動物數(shù)量相同。
劑量---急毒理試驗結(jié)果表明，刺云實粉提取物毒性很低，測不出半數(shù)至死量(LD50)，最大耐受量為22.8g/Kg體重/日，因此長期毒性試驗選兩個劑量組就足夠說明問題了1)、與臨床推薦量一致，此為低劑量；2、最大耐受量(M.T.D)的1/8，即2.85g/Kg體重/日，此為高劑量，相當于臨床推薦量的30倍以上。對照品---選用哈爾濱中藥二廠出產(chǎn)的黃蓮素片劑。
毒理試驗結(jié)果---急毒理試驗結(jié)果表明，刺云實粉提取物毒性很低，最大耐受量(M.T.D)為22.8g/Kg體重/日，該劑量為臨床推薦量的250倍，在給藥后8小時、24小時直至到第6周的觀察中，未見動物出現(xiàn)中毒反應(yīng)。在42天的連續(xù)觀察中，試驗動物情況良好，活動、食欲、糞便均未見異常，口、眼、鼻、耳無異常分泌物，尿常規(guī)、血常規(guī)、肝腎功能、體重完全正常。在42天的連續(xù)觀察后，將2/3的動物處死，解剖，留下1/3動物繼續(xù)觀察了3周，再處死解剖檢查，檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟(包括心、肝、脾、肺、腎等臟器)毫無異樣，一致正常！長期毒性試驗結(jié)論認為，以刺云實粉提取物為原料的藥用制劑，是一種安全可靠的新藥。
4、臨床療效觀察4-1病例選擇按隨機原則，對流感病患者共130例，設(shè)治療組(100例)與對照組(30例)。
4-2對照組選用溫卅第三制藥廠生產(chǎn)的三痰唑核苷。
4-3臨床療效觀察結(jié)論以刺云實粉提取物為原料的藥用制劑，經(jīng)臨床療效觀察證實，總有效率達93.83％，對流感患者有效率高達96.00％；對成年上呼吸道感染患者有效率達91.67％。它不僅顯效快，療效顯著，而且患者均未出現(xiàn)不適及毒副作用。
5、刺云實粉提取物藥用制劑的抗炎作用的檢驗刺云實粉提取物藥用制劑對二甲苯所致小鼠皮膚毛細血管通透性增高的作用。
皮膚毛細血管通透性增高是檢驗藥物是否有抗炎作用的最常用動物模型之一，而且由于炎癥反應(yīng)發(fā)生于動物皮膚，故本方法具有可以直接觀察炎癥變化的優(yōu)點。
酚類衍生物是刺云實粉提取物的主要有效成分，臨床上用于治療多種急慢性病毒感染炎癥，效果好。
取30只小鼠，雄雌各半，體重19-21g，隨機均分為三組，每組10只，雄雌各半，用生理鹽水為對照，另兩組經(jīng)口服高低兩個劑量刺云實粉提取物藥用制劑(下表中簡稱提取物)，按常規(guī)進行操作，對二甲苯所致小鼠皮膚毛細血管通透性增高的作用，實驗結(jié)果如下表3表3提取物對二甲苯所致小鼠皮膚毛細血管通透性增高的影響藥物劑量(mg/kg) 鼠數(shù)(只) 藍斑色澤深淺(級) 藍斑染料量(μg)生理鹽水 ---107.1±2.1 2.00±0.23提取物 20 102.1±1.4 1.21±0.10提取物 35 102.0±1.1 1.10±0.16從實驗結(jié)果可以看出，無論以藍斑色澤深淺(數(shù)字小，抗菌作用強)評比，或是藍斑染料量(μg，數(shù)字小，抗菌作用強)進行比較，刺云實粉提取物組動物數(shù)值均明顯低于生理鹽水對照組，表明刺云實粉提取物藥用制劑能明顯抑制二甲苯所致小鼠皮膚毛細血管通透性增高，即其具有朋顯消炎功能。
6、刺云實粉提取物藥用制劑的免疫作用---巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗巨噬細胞具有強大的吞噬能力。雞紅細胞對鼠類是一種較強的抗原性異物，當將雞紅細胞注入小鼠腹腔后，可引起腹腔巨噬細胞聚集并吞噬雞紅細胞，這是一項機體免疫功能的主要指標，因此可以檢驗藥物對機體免疫能力的影響。
取30只小鼠，雄雌各半，體重19-21g，隨機均分為三組，每組10只，雄雌各半，用生理鹽水為對照，另兩組經(jīng)口服高低兩個劑量刺云實粉提取物藥用制劑(簡稱提取物)，按常規(guī)進行操作，對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力影響的實驗。實驗結(jié)果如下表4表4提取物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響藥物劑量(mg/kg) 鼠數(shù)(只)吞噬百分率 吞噬指數(shù)生理鹽水 ---1026.2±2.700.501±0.029提取物 15 1066.4±4.280.950±0.219提取物 30 1068.2±2.080.965±0.139從實驗結(jié)果可以看出，無論以吞噬百分率(數(shù)字大，免疫功能增強)評比，或以吞噬指數(shù)(數(shù)字大，免疫功能增強)進行比較，刺云實粉提取物組動物數(shù)值均明顯高于生理鹽水對照組，表明刺云實粉提取物藥用制劑能明顯增高對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力，即增高小鼠免疫功能。
經(jīng)上述研究證實，本發(fā)明具有明顯抗病毒、抗菌消炎、清熱解毒的功能。特別適合于嬰兒下呼吸道感染和成人上呼吸道感染等癥，并具有明顯的扶正培本功效。
稱取提取物精粉15克，185克藥用淀粉，將二者混合均勻，灌裝成1000粒膠囊，鋁塑壓板后，經(jīng)8K強度輻照消毒滅菌，包裝即完成整個研制過程，每1粒含精粉15mg。
2、取刺云實粉經(jīng)30％丙酮提取4次，常規(guī)過濾后，在50℃左右減壓(0.08Mpa)濃縮成膏狀，用乙酸乙醋萃取4次，經(jīng)100-300目硅膠柱層析純化，分出活性分，此為剌云實粉提取物精粉，含65-90％酚類衍生物。
稱取提取物精粉16克，184克藥用淀粉，將二者混合均勻，灌裝成1000粒膠囊，鋁塑壓板后，經(jīng)8K強度輻照消毒滅菌，包裝即完成整個研制過程，每1粒含精粉16mg。
3、取剌云實粉經(jīng)70％丙酮提取4次，常規(guī)過濾后，在40℃左右減壓(0.06Mpa)濃縮成膏狀，用乙酸乙醋萃取4次，經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化，分出活性分，此為剌云實粉提取物精粉，含75-97％酚類衍生物。
稱取提取物精粉14克，藥用混合賦形劑186克(內(nèi)含糊精71.9克，淀粉71.9克，糖粉36.2克，氫氧化鋁凝膠6.1克)。將二者混合均勻，采取全粉末直接壓片法，壓制成1000片，每片含取提取物精粉14mg，裝瓶后，經(jīng)輻照消毒滅菌，包裝即完成整個研制過程，每1粒含精粉14mg。
下面是幾個典型病例的摘錄資料1，王云鶴男，60歲，工人、退休。主要癥狀持續(xù)發(fā)燒三天38-39℃之間，嘴角起泡疹，呼吸吃力，不思飲食，咳嗽。診斷為病毒感性重感冒、輕度支氣管炎。服用病毒消(膠囊)，每日三次每次2粒，3天病情得到控制，精神逐漸好轉(zhuǎn)，8天后癥癥狀基本消失。
2，李怡怡，女，2歲，主要癥狀突然發(fā)燒39℃左右，不愿進食，咳嗽、哭鬧。家長開始服用一般小兒退燒藥，幾乎無效，經(jīng)醫(yī)生診斷為病毒感染引起支氣管炎。服用病毒消(膠囊)及維生素C，病毒消膠囊每日4次每次1粒，維生素C每日2次(早晚各服1次)每次1粒，2天后病情得到控制，情緒安定，不再哭鬧，愿意進食，6天后痊愈。
4、李家發(fā)，男，45歲。主要癥狀咳嗽，打噴嚏，流清鼻涕，全身乏力，嗜睡，發(fā)燒三天38℃。診斷為流感。服用病毒消(膠囊)及復(fù)合維生素，病毒消每日三次每次2粒，復(fù)合維生素每日三次每次2粒，8天后痊愈。
4、張芳，女，12歲，發(fā)熱、頭痛、咽痛3天，加重伴咳嗽2天后服用病毒消(膠囊)，每天三次，每次2粒，2天后病情緩解，6天后痊愈。
權(quán)利要求
1.刺云實粉提取物，選用從滇產(chǎn)引種刺云實粉為原料，用現(xiàn)有技術(shù)提取、分離，確定有效部位和有效成分，其特征在于該刺云實粉提取物為含酚生物65-97％。
2.刺云實粉藥用制劑，其特征在于該藥用制劑為用含有14-16g刺云實粉和常規(guī)藥用輔助劑制成的膠囊或片劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種刺云實粉提取物及其藥用制劑，屬天然植物藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明選用從滇產(chǎn)引種刺云實粉為原料，用現(xiàn)有技術(shù)提取、分離純化。對理化特性、分子結(jié)構(gòu)鑒定、抑菌效果、毒理實驗、質(zhì)量檢測標準、產(chǎn)品劑型等內(nèi)容進行了較深入系統(tǒng)的研究，得到刺云實粉提取物及其藥用制劑。其中，刺云實粉提取物為含酚類衍生物65－97％的精粉；刺云實粉藥用制劑為用有14－16g刺云實粉和常規(guī)藥用輔助劑制成的膠囊或片劑。本發(fā)明具有明顯抗病毒、抗菌消炎、清熱解毒的功能。特別適合于嬰兒下呼吸道感染和成人上呼吸道感染等癥，并具有明顯的扶正培本功效。
文檔編號A61P31/12GK1456190SQ02127969
公開日2003年11月19日 申請日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者謝金倫, 林南英, 楊輝, 謝玉冰 申請人:云南大學(xué)