專利名稱：基于粘蛋白1核心序列的手性肽抗原及疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于刺激機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應的肽疫苗，特別是涉及基于粘蛋白1之核心序列的手性肽抗原，含有所說的肽抗原的疫苗組合物，其制備方法及其作為免疫原在刺激機體產(chǎn)生免疫反應中的應用。
腫瘤免疫反應的基礎(chǔ)在于腫瘤抗原的表達和存在。近二十年來，已相繼發(fā)現(xiàn)了多種與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的腫瘤抗原，其中之一就是粘蛋白。粘蛋白是一類由各種正?；驉盒陨掀ぜ毎磉_的高分子量(≥200KDa)跨膜糖蛋白，已知存在有至少九種形式的糖蛋白。各種粘蛋白均具有相似的結(jié)構(gòu)，都富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸，并且具有不同數(shù)目的串聯(lián)重復序列。其中粘蛋白1(MUC1)是第一個發(fā)現(xiàn)的，可被抗上皮細胞單克隆抗體識別的粘蛋白。MUC1多肽骨架由胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段三部分組成。其中，跨膜段和胞內(nèi)段具有種間保守性，故推測其在MUC1功能的發(fā)揮中起重要作用。胞外段含有20-125個連續(xù)的重復序列，每個重復序列包括20個氨基酸，即PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA。其中S、T、A、G和P五種氨基酸占50％以上，且P對MUC1空間結(jié)構(gòu)的形成并進而對分子的免疫原性發(fā)揮重要作用。大約有50-90％的O-連接的寡糖被連接到粘蛋白核心區(qū)(20氨基酸基元的串聯(lián)重復區(qū))的絲氨酸和蘇氨酸殘基上，從而提高了整個分子的剛性和柔韌性(Strous et al.，Crit.Biochem.Biol.2557，1992)。已知每個串聯(lián)重復均包括5個可能的糖基化位點，并且在成對的蘇氨酸和絲氨酸之間為含有抗原決定基的免疫優(yōu)勢區(qū)域。
人MUC1基因位于染色體1q21上，并含有7個外顯子。MUC1基因的一個重要特征是其多態(tài)性，即其第2個外顯子含有許多連續(xù)的重復序列(VNTR)。每個VNTR包括60個堿基且富含GC。不同人的VNTR數(shù)目從20到125個不等。
目前的研究表明，MUC1既可誘發(fā)抗腫瘤CTL免疫反應(MHC限制性的和非MHC限制性的)，同時又可抑制免疫活性細胞對腫瘤細胞的殺傷。高水平的MUC1表達與腫瘤的預后呈負相關(guān)，提示MUC1可能參與免疫反應的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，見于腫瘤細胞膜表面上的粘蛋白在某些方面不同于正常上皮細胞上的粘蛋白。例如，加在正常乳腺產(chǎn)生的粘蛋白上的O-葡聚糖是基于核心2的并且是與之復合的，而加在乳腺癌粘蛋白上的O-葡聚糖則是基于核心1的。這就意味著，串聯(lián)重復序列中的某些抗原決定基在正常粘蛋白中是被遮蔽的，而在腫瘤相關(guān)粘蛋白中則是暴露的。因為乳腺癌粘蛋白分子上也攜帶有新的糖類抗原決定基，所以整個分子在抗原性上不同于正常乳腺粘蛋白。有人發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及其他一些分泌組織腫瘤有異常糖基化粘蛋白的表達。有證據(jù)表明，在某些患有轉(zhuǎn)移的乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌的病人，血清粘蛋白水平提高與免疫治療后抗腫瘤反應及病人存活率降低有關(guān)(MacLean etal.，J.Immunotherapy，2070，1997)。另外還發(fā)現(xiàn)，親和純化的腫瘤相關(guān)MUC1粘蛋白和合成的MUC1多肽核心重復序列可抑制人T細胞對多克隆刺激物的增殖反應，而且對細胞增殖的抑制程度與MUC1多肽核心中串聯(lián)重復的數(shù)目成正比(Agawal et al，Nature Med.443，1998)。Chen等人(Chen L，et al，J.Immunol.139351-359，1997)進一步發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞分泌的MUC1可抑制T淋巴細胞的增殖，使之處于Go/G！期。Jerome及其同事的研究顯示，某些腫瘤病人的淋巴結(jié)中存在可與人粘蛋白反應的細胞毒性淋巴細胞(CTL)，而抗MUC1抗體可阻斷MUC1陽性靶細胞中CTL的活性(Jerome et al，CellularImmunity and Immunotherapy of Cancer，321-328，1990)。另一方面，用上皮細胞腫瘤和相關(guān)正常組織的反應性單克隆抗體進行的實驗表明，腫瘤細胞因其粘蛋白分子的異常糖基化，而可能存在與正常細胞粘蛋白不同的抗原決定基。腫瘤細胞表達的粘蛋白分子糖基化不完全，糖鏈相對較短，從而導致粘蛋白分子串聯(lián)重復序列在細胞表面上的暴露(Devine et al，CancerRes.，515826，1991)。
粘蛋白特別是MUC1的上述這些性質(zhì)，特別是腫瘤細胞上粘蛋白核心序列的暴露，以及免疫系統(tǒng)對粘蛋白分子這些結(jié)構(gòu)的反應能力，使我們有可能以粘蛋白特別是MUC1作為腫瘤免疫治療的靶分子，利用基于粘蛋白的肽疫苗進行腫瘤特異性免疫治療(Devine et al，Cancer Res.，512908，1991)。
近年來，一些研究者設計并制備了一系列基于粘蛋白特別是MUC1的合成或重組的抗原肽或其糖或脂的結(jié)合物，或含有這類肽及相關(guān)成分的免疫調(diào)節(jié)組合物。例如，美國專利5,744,144號公開了包括至少5個MUC1串聯(lián)重復，并在串聯(lián)重復序列N或C末端連有5個附加氨基酸的合成的MUC1樣肽。所說的肽在沒有糖基化的情況下呈現(xiàn)天然構(gòu)象。美國專利6,177,256號公開了一種用作免疫原性抗腫瘤疫苗的，由氧化甘露糖和人粘蛋白MUC1多肽組成的結(jié)合物。美國專利6,168,804號公開了含有基于MUC1核心肽之串聯(lián)重復區(qū)的抗原肽的緩釋載體，及其在引發(fā)Th1型抗腫瘤免疫反應中的應用。其中所說的抗原肽包括由12-25個氨基酸組成的至少一個T細胞抗原決定基。另外，Sameul等人(Sameul，J.et al，Int.J.Cancer，75295-302，1998)以脂質(zhì)體包裹MUC1合成肽并以磷脂作為佐劑免疫小鼠，結(jié)果誘導產(chǎn)生了T1型細胞免疫反應，并且大部分被免疫動物產(chǎn)生了MUC1特異性T細胞、INF和IgG。Reddish等人(Reddish，M.et al，Int.J.Cancer，76817-823，1998)以包括16個氨基酸的MUC1合成肽(BP16)與KLH的交聯(lián)蛋白作為免疫原，并以Detox作為佐劑免疫轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人，結(jié)果大多數(shù)被試者產(chǎn)生了MUC1限制性CTL反應。Karanikas等人(Karanikas V，et al.，J.Clin.Invest.1002786-92，1997)用含有一個重復序列的合成肽與破傷風類毒素的結(jié)合物免疫乳癌病人，結(jié)果只誘發(fā)了微弱的免疫反應。Kim等人(Kim，SK et al.，Vaccine 19530-537，2001)使用12種不同的佐劑或復合佐劑配合合成的MUC1與KLH的結(jié)合蛋白免疫小鼠，結(jié)果顯示復合佐劑比單一佐劑能更好地誘導抗MUC1抗體反應，表明選擇適當?shù)淖魟τ谔岣叨嚯囊呙缰庖咴跃哂兄匾饔谩?br> 本發(fā)明的一個目的是提供基于MUC1串聯(lián)重復序列的免疫原性肽，特征在于所說的MUC1序列包括1-5個串聯(lián)重復，其中每個串聯(lián)重復至少含有一個D-型氨基酸，并且序列的兩末端均為脯氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的免疫原性肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的基于MUC1串聯(lián)重復序列的免疫原性肽具有提高了的MUC1特異的免疫原性。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的基于MUC1串聯(lián)重復序列的免疫原性肽是以肽合成方法制備的。
本發(fā)明的另一個目的是提供MUC1特異性疫苗組合物，所說的疫苗組合物基本上是由如上限定的免疫原性肽以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的佐劑組成的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的疫原性肽可以是與選自血清白蛋白、卵白蛋白和匙藍蛋白的載體蛋白質(zhì)化學偶聯(lián)的。
本發(fā)明的再一個目的涉及如上限定的疫苗組合物在誘導MUC1特異性抗腫瘤免疫反應中的應用。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的MUC1特異性抗腫瘤免疫反應是MUC1特異性細胞毒性淋巴細胞反應。
本發(fā)明總地涉及用于刺激機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應的肽疫苗，特別是涉及基于粘蛋白1之核心序列的手性肽抗原，含有所說的肽抗原的疫苗組合物，其制備方法及其作為免疫原在刺激機體產(chǎn)生免疫反應中的應用。
眾所周知，細胞免疫在腫瘤免疫排斥中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。T淋巴細胞可識別與靶細胞表面MHC1類或2類分子結(jié)合的長度約8-12個氨基酸的抗原肽。而作為殺傷靶細胞之主要效應細胞的細胞毒性淋巴細胞(CTL)則識別與MHC1類分子結(jié)合的內(nèi)源性肽。已有證據(jù)表明，合成的肽抗原不需經(jīng)過抗原呈遞細胞(APC)的加工處理即可與MHC類分子結(jié)合，并在激活免疫反應中發(fā)揮內(nèi)源性抗原肽的同樣效力。
鑒于粘蛋白1(MUC1)在多種組織和器官上皮表面的廣泛存在，以及其在相應腫瘤組織中的異常表達，故有可能以其作為一種潛在的腫瘤生物學標志物，并使用基于MUC1序列特別是包括MUC1之抗原決定基和不同數(shù)目串聯(lián)重復序列的肽作為免疫原，進行相應腫瘤的特異性主動免疫治療。然而，對于不含糖鏈的MUC1分子，特別是包括相對較少數(shù)目(例如一個)串聯(lián)重復的基于MUC1的免疫原來說，無疑其免疫原性是很低的。為了克服這一關(guān)鍵性問題，本發(fā)明試圖從以下幾個方面入手提高分子的抗酶降解能力和光學穩(wěn)定性，以提高分子的穩(wěn)定性和免疫原性(1)在保留并且不改變MUC1抗原決定基(APDTR)的前提下，合理調(diào)整MUC1分子核心區(qū)的氨基酸排列順序；(2)以一個或多個D型氨基酸代替野生序列中固有的L型氨基酸，以改善分子的抗酶解能力和受體結(jié)合活性；(3)在所說的肽的兩末端加入或替換具有光學穩(wěn)定性的脯氨酸；以及(4)將合成的基于MUC1的免疫原性肽偶聯(lián)到選自血清白蛋白、卵白蛋白和匙藍蛋白的載體蛋白質(zhì)大分子多肽鏈上。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供基于MUC1串聯(lián)重復序列的免疫原性肽，特征在于所說的MUC1序列包括1-5個串聯(lián)重復，其中每個串聯(lián)重復至少含有一個D-型氨基酸，并且序列的兩末端均為脯氨酸。
一般說來，在適當范圍內(nèi)，串聯(lián)重復的數(shù)目越多所得多肽的免疫原性越強，但為了觀察因加入D-型氨基酸所導致的局部手性特征對合成肽之免疫原性的影響，并且為了制備上的方便，本發(fā)明特別優(yōu)選的是只含有一個重復單元的合成肽。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，所說的MUC1核心串聯(lián)重復單元具有如下所示的氨基酸序列ProAlaHisGlyValThrD-SerAlaProAspThrArgProAlaProGlyD-SerThrAlaPro(SEG ID NO1)可以按照本領(lǐng)域已知的固相肽合成技術(shù)合成本發(fā)明的抗原肽(例如參見Steward，J.M.and Young J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2ndEd.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.(1984))。在固相肽合成方法中，首先將C末端氨基酸連接到一個適當?shù)墓滔噍d體或樹脂上。用于合成C末端羧基肽的的優(yōu)選的固相載體是4-羥甲基苯氧甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)。用于C末端酰胺的優(yōu)選固相載體是4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧乙酰胺乙基樹脂(Apllied Biosystem Co.)?？山柚鶱，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)或2-(1-氫-1-苯并三唑基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)使C末端氨基酸偶聯(lián)到樹脂上(50-100℃，在二氯甲烷或DMF溶劑中反應1至24小時)。當固相載體是4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺乙基樹脂時，應在與上述C末端氨基酸偶聯(lián)之前用哌啶等仲胺將Fmoc基團裂解掉。可以使用鄰苯三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸(HBTU，1當量)在DFM中與去保護的4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧乙酰胺乙基樹脂偶聯(lián)。
當固相合成結(jié)束時，可以用裂解試劑(例如苯甲硫醚、水、乙二硫醇及三氟乙酸)處理樹脂結(jié)合的肽，以從樹脂上去掉合成的肽并使之去保護。如果肽的C末端是烷基酰胺，可以用烷基胺進行氨解以裂解出樹脂?；蛘?，可以用乙醇進行轉(zhuǎn)酯處理以去除多肽，然后再進行氨解或直接進行轉(zhuǎn)酰胺基處理。可以使用上述的幾種裂解劑除去側(cè)鏈保護基團。
可以使用離子交換層析、親水吸附層析、硅膠吸附層析、分配層析、高效液相層析(HPLC)，特別是反相HPLC等一系列層析步驟純化完全去保護的合成肽。
可使用配有120A分析儀的Applied biosystems 477A型蛋白質(zhì)序列儀，以自動Edman化學法分析純化的肽的氨基酸序列?？墒褂眉す饨馕碗妵娚滟|(zhì)譜法測定各肽序列的分子質(zhì)量。
因此，為了本發(fā)明的目的，可以首先使用自動或半自動多肽合成裝置(例如美國ACT公司生產(chǎn)的ACT90型半自動多肽合成儀)，基本上按照已知的的固相肽合成法合成本發(fā)明的免疫原性肽。簡單地說，可首先在合成儀反應瓶充分漲溶所需的固相樹脂，然后以二異丙基碳二亞胺(DIC)、一水合羥基苯并三唑(HoBt)和二異丙基乙胺(DIPEA)作為偶聯(lián)劑，在DMF溶劑中按固定程序重復固相肽連接步驟，直至完成整個肽鏈的合成。
肽鏈合成后，脫去保護基團并從固相樹脂上切下所需的肽。沉淀并風干后，以反向高壓液相層析法(RP-HPLC)純化所需的合成肽并使用質(zhì)譜法測定其分子量(參見實施例1)。
由于本發(fā)明的合成肽在體內(nèi)和體外實驗中均表現(xiàn)有明顯改善了的特異免疫原活性(詳見下文)，故有可能以其作為抗原材料，配合適當?shù)拿庖咦魟?，制備具有臨床應用價值的疫苗組合物。
因此，本發(fā)明的另一個目的是提供MUC1特異性疫苗組合物，所說的疫苗組合物基本上是由如上限定的免疫原性肽以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的佐劑組成的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中作為本發(fā)明疫苗組合物之基本活性成分的所說的免疫原性肽可以是與選自血清白蛋白、卵白蛋白和匙藍蛋白的載體蛋白質(zhì)化學偶聯(lián)的。為此，例如可以使用戊二醛法(沈關(guān)心，周汝麟主編，現(xiàn)代免疫學實驗技術(shù)，第1版，第8-9頁，湖北科學技術(shù)出版社)實現(xiàn)合成肽與載體蛋白質(zhì)如小鼠血清白蛋白的結(jié)合。
本發(fā)明的疫苗組合物可含有一種或多種醫(yī)藥上可接受的佐劑。這些佐劑包括但不限于卡介苗(BCG)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素2(IL-2)和胸腺肽(TP)。
近年的研究發(fā)現(xiàn)，就免疫系統(tǒng)而言，GM-CSF可作用于抗原呈遞細胞--樹突狀細胞，進而發(fā)揮促進免疫反應、調(diào)節(jié)免疫功能的作用。另外，大量研究表明，胸腺肽是提高免疫功能的有效制劑，并且可能通過調(diào)節(jié)T細胞功能來調(diào)節(jié)機體的免疫活性。因此，本發(fā)明特別選用細胞-巨噬細胞集落刺激因子和胸腺肽作為制備MUC1特異性肽疫苗的復合佐劑。
為了研究基于本發(fā)明修飾的合成肽疫苗組合物的生物學活性，我們使用接種了乳腺癌細胞GZ.A5.3H.4(為轉(zhuǎn)染了人MUC1全長度cDNA的細胞系)的純系小鼠作為實驗對象，分別觀察本發(fā)明的疫苗組合物對荷瘤動物的治療效果和免疫保護效果，并進一步觀察了合成肽疫苗對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響，和誘導特異性CTL殺傷活性的能力。實驗中，以本發(fā)明的合成肽疫苗(以下簡稱為D-MUC1)加GM-CSF或TP為實驗組，以同樣加有GM-CSF或TP的基于MUC1核心區(qū)重復單元但不含有D-型氨基酸的合成肽疫苗(以下簡稱為L-MUC1)為陽性對照，并以生理鹽水為空白對照。為了排除GM-CSF或TP的非特異性抗腫瘤免疫活性對觀察結(jié)果的影響，實驗中還另外增設兩個陽性對照組，即GM-CSF組和TP組。
在治療實驗中，各組小鼠淋巴細胞經(jīng)合成肽(10微克/ml)體外連續(xù)刺激4天后，D-MUC1+TP組動物的淋巴細胞增殖活性顯著高于對照組，但L-MUC1組則與對照組基本相當。另一方面，D-MUC1+GM-CSF、D-MUC1+TP、GM-CSF和TP組小鼠淋巴細胞經(jīng)合成肽(5-10微克/ml)體外誘導8天后，各組均產(chǎn)生了MUC1特異性CTL反應，并顯示有對表達MUC1蛋白質(zhì)之GZ.A5.3H.4細胞的特異性殺傷活性。在免疫保護實驗中，各組小鼠淋巴細胞經(jīng)合成肽(5微克/ml)體外連續(xù)刺激4天后，D-MUC1+TP組和D-MUC1+GM-CSF組動物的淋巴細胞增殖活性顯著高于對照組，但L-MUC1組則與對照組基本相當。另一方面，L-MUC1、D-MUC1+GM-CSF、D-MUC1+TP、GM-CSF和TP組小鼠淋巴細胞經(jīng)合成肽(5-10微克/ml)體外誘導8天后，各組動物均產(chǎn)生了MUC1特異性CTL反應，并顯示有對表達MUC1蛋白質(zhì)之GZ.A5.3H.4細胞的特異性殺傷活性，但其中L-MUC1的反應活性則稍低。
另外，我們還分析了本發(fā)明的合成肽誘導體液免疫的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)兩次疫苗接種后，只產(chǎn)生微弱的抗MUC1抗體反應(數(shù)據(jù)未示出)。
在此基礎(chǔ)上，我們使用接種了高水平表達MUC1之GZ.A5.3H.4腫瘤細胞的小鼠模型，進一步觀察了本發(fā)明修飾的多肽疫苗對動物移植瘤的治療和預防效果。在對預先接種腫瘤細胞的荷瘤動物進行的治療實驗中，L-MUC1組小鼠的腫瘤生長速度和處死前的腫瘤重量均與對照組接近，而D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP組小鼠的這些參數(shù)則明顯低于對照組。光學顯微鏡下可見D-MUC1+GM-CSF組腫瘤組織有大范圍病理性壞死。D-MUC1+TP、GM-CSF和TP組小鼠腫瘤組織中也存在有相似的壞死病灶，但壞死程度和范圍均小于D-MUC1+GM-CSF組。組織學檢查進一步發(fā)現(xiàn)，在D-MUC1+GM-CSF佐劑的參與下，D-MUC1在小鼠體內(nèi)誘導的CTL反應導致靶細胞以凋亡和壞死的方式死亡。在對預先接種本發(fā)明的合成肽疫苗的動物進行的免疫保護實驗中，于動物接種上述腫瘤細胞后三周，斷頸處死動物并測定腫瘤重量和體重。結(jié)果可見，L-MUC1組小鼠的腫瘤生長速度和處死前的腫瘤重量均與對照組接近，而D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP組小鼠的這些參數(shù)則明顯低于對照組。光學顯微鏡下可見D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP組腫瘤組織有大范圍病理性壞死。GM-CSF、TP和L-MUC1組動物雖也存在有相似的壞死病灶，但壞死程度和范圍均小于D-MUC1+GM-CSF組。
作為一種腫瘤相關(guān)抗原，MUC1是細胞的固有成分。但在腫瘤細胞中，因其糖基化不完全而導致結(jié)構(gòu)變化，并因此其免疫原性較弱。這也是大多數(shù)上皮組織腫瘤(如乳腺癌)病人MUC1特異性CTL反應低下的原因。因此，本發(fā)明人設計并合成了基于MUC1核心區(qū)串聯(lián)重復單元的，以部分或全部D-型氨基酸取代其天然L-型氨基酸的修飾的抗原肽，并在此基礎(chǔ)上成功地制備了以所說的肽與惰性載體蛋白質(zhì)的結(jié)合物為基本活性成分的疫苗組合物。我們的體內(nèi)和體外實驗表明，本發(fā)明的合成肽疫苗可在某些細胞因子如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和胸腺肽(TP)的輔助下，有效地誘導荷瘤動物的特異性抗腫瘤細胞免疫反應(CTL反應)。雖然有關(guān)機理目前尚不明確，但推測可能是由于(1)D-MUC1分子中的一個或多個氨基酸被相應的D-型氨基酸所取代，氨基酸的這種反向倒轉(zhuǎn)使分子具有了不同于其野生序列的局部手性特征，從而改善了分子的免疫原性，提高了免疫系統(tǒng)對它的識別能力；(2)分子中D-型氨基酸的摻入改變了酶切位點處氨基酸的光學構(gòu)象和分子的剛性，從而提高了肽分子抵抗蛋白酶降解的能力；(3)與惰性載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)和佐劑(細胞因子)的加入也在一定程度上提高了本發(fā)明疫苗組合物誘導或刺激機體抗腫瘤免疫反應的能力。
下列實施例旨在進一步舉例說明本發(fā)明的基于MUC1核心串聯(lián)重復之合成肽及其疫苗的生產(chǎn)方法和優(yōu)點。應明確指出的是，在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的個別非必要技術(shù)特征所作的任何改動和改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實施例1本發(fā)明的基于MUC1核心串聯(lián)重復區(qū)的抗原肽及相關(guān)疫苗的制備基本上按照已知的方法，使用Advenced ChemTech 90型肽合成儀合成具有下示氨基酸序列的肽N-ProAlaHisGlyValThrD-SerAlaProAspThrArgProAlaProGlyD-SerThrAlaPro-C(SEG ID NO1)。為此，首先稱取固相樹脂(H-Pro-CLTR，0.9mmol)，并用二氯甲烷(DCM)充分溶漲。然后使用DIC、HOBt和DIPEA偶聯(lián)劑，在DMF溶劑中重復下列合成循環(huán)步驟，依次加入上述肽片段中所示的氨基酸1、首先用含20％哌啶的DCM洗滌(5分鐘)反應器中的Fmoc-氨基酸；2、使用溶于DMF中的20％哌啶再次處理25分鐘，以從氨基酸功能集團上除去Fmoc保護基團；3、用DMF洗2次，每次2分鐘；4、使用甲醇(MeOH)洗1次，共2分鐘；5、再次用DMF洗2次，每次2分鐘；6、在DIC、HOBt和DIPEA偶聯(lián)劑的存在下，加入相當于樹脂氨基3倍量的被保護的氨基酸，室溫下反應1小時；7、用DMF洗2次，每次2分鐘；8、使用甲醇(MeOH)洗1次，共2分鐘；9、再次用DMF洗2次，每次2分鐘。
合成完成后，用四氫呋喃(THF)洗樹脂(5分鐘)以除去DMF，然后在氬氣和氮氣環(huán)境下風干樹脂，從而得到樹脂結(jié)合的肽。
將樹脂結(jié)合的肽與預制備(-5至-10℃保存)的裂解試劑(三氟乙酸水∶苯酚∶以二硫醚∶茴香硫醚＝82.5∶5∶5∶2.5∶5)的混合物于大約0℃下攪拌約15分鐘，再于室溫下繼續(xù)攪拌約60分鐘。然后濾出樹脂并用純凈的三氟乙酸淋洗。將濾出并洗過的樹脂按每份0.5ml加到含有約8ml二乙醚的離心管內(nèi)，離心所得到的懸浮液后，除去上清?？啥啻沃貜驮撨^程直到所有的肽均被沉淀出來。用乙醚洗沉淀的濾液，然后風干并冷凍干燥之。
裂解完成后，使用Symmetry Prep C18柱以HPLC方法純化如上得到的粗肽(用5-100％乙腈梯度經(jīng)60分鐘洗脫)，然后冷凍干燥如此純化的肽。將所得到的肽用0.1％三氯乙酸溶解后，用點噴霧質(zhì)譜儀測定分子量。
然后以戊二醛法完成合成肽與載體蛋白的連接。例如可稱取小鼠血清白蛋白10mg，用硼酸鹽緩沖液溶解后加入合成肽15mg。然后震蕩下加入0.35％戊二醛1.0ml，并在室溫下反應2小時。加入甘油(1mol/L)約0.25ml封閉未反應的戊二醛并保持30分鐘，然后用硼酸鹽緩沖液(pH8.5)透析過夜，從而得到所需的結(jié)合物?？墒褂眉す饨馕婋x飛行時間質(zhì)譜儀測定所得結(jié)合物的分子量，并進而確定合成肽與載體蛋白的分子比?？筛鶕?jù)1mg/ml白蛋白的280nm吸光率為0.7，計算合成肽抗原溶液的蛋白質(zhì)濃度。
為了最終制得本發(fā)明的疫苗組合物，可預先或使用前臨時在所說的結(jié)合物中加入適當濃度的免疫佐劑。
實施例2本發(fā)明的疫苗組合物對小鼠淋巴細胞增殖能力和特異性CTL殺傷活性的影響本實施例使用接種了乳腺癌細胞GZ.A5.3H.4(為轉(zhuǎn)染了人MUC1全長度cDNA的細胞系)的純系小鼠作為實驗對象，分別觀察本發(fā)明的疫苗組合物對小鼠淋巴細胞增殖能力和特異性CTL殺傷活性的影響。
簡單地說，在治療實驗中，60只6-8周令雌性Balb/c小鼠經(jīng)皮下接種GZ.A5.3H.4乳腺癌細胞(Biomira公司惠贈)(5×105/0.1ml)后7天，隨機分為6組，每組10只。在免疫保護實驗中，于第二次免疫后一周皮下接種GZ.A5.3H.4乳腺癌細胞(Biomira公司惠贈)(1×106/0.1ml)，隨機分為6組，每組10只。L-MUC1疫苗組動物背部皮下接種L-MUC1肽15微克/只，每周一次，共兩次；D-MUC1疫苗+GM-CSF組動物背部皮下接種D-MUC1肽15微克/只，每周一次，共兩次，同時腹腔注射GM-CSF 300ng/天；GM-CSF組腹腔注射GM-CSF 300ng/天；D-MUC1疫苗+TP組動物背部皮下接種D-MUC1肽15微克/只，每周一次，共兩次，同時腹腔注射TP 0.4毫克/天；TP組腹腔注射TP 0.4毫克/天。
(1)免疫細胞功能檢測(3H-TdR摻入法)第二次免疫接種后一周，每組隨機選出四只動物，處死取脾臟并制備脾細胞懸液(2.5×106/ml)。按每孔2.5×105/孔(0.1ml)的濃度將細胞加入96孔培養(yǎng)板中。實驗孔添加本發(fā)明的合成肽(終濃度5微克/ml和10微克/ml)后，37℃保溫4天。然后各孔加入H-TdR(10微居里，50微升)，37℃繼續(xù)保溫14小時。收集各孔培養(yǎng)物，洗滌并烘干后測定并計算各孔的平均cpm值和刺激指數(shù)SI。結(jié)果如下列表1和表2所示。
表1合成肽疫苗對實驗小鼠淋巴細胞增殖活性的影響(治療實驗) n＝4對照組L-MUC1D-MUC1+GM-CSFGM-CSF D-MUC1+TP TPMUC1 1.398±0.25 1.476±0.33 1.311±0.18 1.193±0.36 1.563±0.211.284±0.32(5μg/ml)MUC1 0.958±0.15 1.042±0.26 1.132±0.15 0.872±0.26 1.217±0.19**0.974±0.22(10μg/ml)**與對照組比較P＜0.05。
表2合成肽疫苗對實驗小鼠淋巴細胞增殖活性的影響(免疫保護實驗)n＝4對照組 L-MUC1D-MUC1+GM-CSF GM-CSF D-MUC1+TPTPMUC11.976±0.33 1.182±0.22 1.430±0.28**0.935±0.37 2.582±0.25*1.284±0.32(5μg/ml)MUC10.853±0.36 0.747±0.16 1.108±0.29 0.910±0.14 2.339±0.34*1.234±0.18**(10μg/ml)*與對照組比較P＞0.01，**與對照組比較P＜0.05。
從表1和2所示的結(jié)果可以看出，在治療實驗中，小鼠淋巴細胞體外經(jīng)10微克/ml合成肽連續(xù)刺激4天后，D-MUC1+TP組的淋巴細胞增殖活性明顯高于對照組，L-MUC1組的淋巴細胞增殖活性與對照組大致相當。同樣，在免疫保護實驗中，小鼠淋巴細胞體外經(jīng)5微克/ml合成肽連續(xù)刺激4天后，D-MUC1+TP組的淋巴細胞增殖活性明顯高于對照組，L-MUC1組的淋巴細胞增殖活性與對照組大致相當，但D-MUC1+TP和D-MUC1+GM-CSF組淋巴細胞增殖活性明顯升高。經(jīng)10微克/ml合成肽連續(xù)刺激4天后，L-MUC1組的淋巴細胞增殖活性與對照組大致相當，但D-MUC1+TP和TP組則明顯高于對照組。
(2)特異性CTL檢測(3H-TdR摻入法)第二次免疫后一周，處死動物分離脾臟并制備脾細胞懸液(20×107/ml)，取1ml懸液在培養(yǎng)板中加合成肽(5微克/ml)37℃保溫8天，即得到效應細胞。然后取處于對數(shù)生長期的GZ.A5.3H.4乳腺癌細胞懸液1ml(1×106/ml)，加入3H-TdR(50微居里)37℃水浴4小時，洗滌并取50微升烘干后計算每個細胞的反射標記率。取放射標記的靶細胞懸液50微升(4萬個細胞)加入96控培養(yǎng)板中并按不同的效/靶比例加入上述效應細胞100微升，然后37℃保溫14小時。對照孔只加靶細胞。用胰蛋白酶消化30分鐘后，收集細胞并烘干，然后測定放射計數(shù)(cpm)并計算效應細胞對靶細胞的殺傷活性。結(jié)果如下列表3和表4所示。
表3合成肽疫苗對實驗小鼠特異性CTL殺傷活性的影響(治療實驗) n＝4效∶靶對照組 L-MUC1 D-MUC1+GM-CSF GM-CSF D-MUC1+TP TP100∶1 22.4±4.9 23.0±6.3 48.0±6.7*35.6±6.7*40.5±5.7*28.6±6.4**50∶114.6±4.4 20.3±7.1 39.9±8.0*30.0±3.5*35.4±3.9*22.5±5.0**10∶17.0±3.19.9±3.128.4±8.5*27.7±5.1*22.0±4.3*11.8±5.2***與對照組比較P＞0.01，**與對照組比較P＜0.05。
表4合成肽疫苗對實驗小鼠特異性CTL殺傷活性的影響(免疫保護實驗)n＝4效∶靶對照組 L-MUC1 D-MUC1+GM-CSF GM-CSFD-MUC1+TP TP100∶1 35.5±4.542.2±5.4**61.0±7.4 37.0±6.3 55.0±6.3*38.5±5.350∶131.6±3.437.5±5.7**53.9±5.2 35.0±3.1**43.4±5.9*35.9±4.5**10∶123.0±2.829.4±4.9**38.0±6.9 31.7±4.1*32.9±4.2*27.0±2.9***與對照組比較P＞0.01，**與對照組比較P＜0.05。
從表3和4所示的結(jié)果可以看出，在治療實驗中，小鼠淋巴細胞體外經(jīng)10微克/ml合成肽連續(xù)刺激4天后，D-MUC1+GM-CSF、GM-CSF、D-MUC1+TP和TP組動物的淋巴細胞體外經(jīng)本發(fā)明的合成肽誘導8天后，均產(chǎn)生了MUC1特異性CTL反應，并顯示有對GZ.A5.3H.4腫瘤細胞的MUC1特異性殺傷活性。同樣，在免疫保護實驗中，L-MUC1、D-MUC1+GM-CSF、GM-CSF、D-MUC1+TP和TP組動物的淋巴細胞體外經(jīng)本發(fā)明的合成肽誘導8天后，均產(chǎn)生了MUC1特異性CTL反應，并顯示有對GZ.A5.3H.4腫瘤細胞的MUC1特異性殺傷活性。但D-MUC1+TP和D-MUC1+GM-CSF組的殺傷活性明顯高于L-MUC1組。
實施例3本發(fā)明的疫苗組合物對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響本實施例使用接種了GZ.A5.3H.4乳腺癌細胞(為轉(zhuǎn)染了人MUC1全長度cDNA的細胞系)的純系小鼠作為實驗對象，觀察本發(fā)明的疫苗組合物對荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長的的影響。
基本上按照實施例2的方法制備腫瘤動物模型并分組。在治療實驗中，60只6-8周令雌性Balb/c小鼠經(jīng)皮下接種GZ.A5.3H.4乳腺癌細胞(Biomira公司惠贈)(50萬/0.1ml)后7天，如上隨機分為6組(每組10只)，于第二次免疫后處死動物并測量腫瘤體積和重量。在免疫保護實驗中，于第二次免疫后一周皮下接種GZ.A5.3H.4乳腺癌細胞(Biomira公司惠贈)(50萬/0.1ml)，如上隨機分為6組(每組10只)，于接種腫瘤細胞后21天處死動物并測量腫瘤體積和重量。結(jié)果如表5和表6所示。另外，實驗中還切除腫瘤組織進行了病理組織學檢查(結(jié)果未示出)。
表5合成肽疫苗對對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響(治療實驗)n＝4對照組 L-MUC1D-MUC1+GM-CSFGM-CSF D-MUC1+TP TP腫瘤重量 34.2±13.2 34.8±11.3 18.8±5.0*27.0±4.5 26.8±7.1 31.2±10.0(mg)*與對照組比較P＞0.01。
表6合成肽疫苗對對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響(免疫保護實驗)n＝4對照組L-MUC1 D-MUC1+GM-CSFGM-CSF D-MUC1+TP TP腫瘤重量 52.7±13.4 54.8±21.0 31.8±11.4*49.0±18.5 30.8±11.7*50.4±14.5(mg)*與對照組比較P＞0.01。
由這些結(jié)果可以看出在對預先接種腫瘤細胞的荷瘤動物進行的治療實驗中，L-MUC1組小鼠的腫瘤生長速度和處死前的腫瘤重量均與對照組接近，而D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP組小鼠的這些參數(shù)則明顯低于對照組。光學顯微鏡下可見D-MUC1+GM-CSF組腫瘤組織有大范圍病理性壞死。D-MUC1+TP、GM-CSF和TP組小鼠腫瘤組織中也存在有相似的壞死病灶，但壞死程度和范圍均小于D-MUC1+GM-CSF組。組織學檢查進一步發(fā)現(xiàn)，在D-MUC1+GM-CSF佐劑的參與下，D-MUC1在小鼠體內(nèi)誘導的CTL反應導致靶細胞以凋亡和壞死的方式死亡。在對預先接種本發(fā)明的合成肽疫苗的動物進行的免疫保護實驗中，于動物接種上述腫瘤細胞后三周，斷頸處死動物并測定腫瘤重量和體重。結(jié)果可見，L-MUC1組小鼠的腫瘤生長速度和處死前的腫瘤重量均與對照組接近，而D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP組小鼠的這些參數(shù)則明顯低于對照組。光學顯微鏡下可見D-MUC1+GM-CSF和D-MUC1+TP組腫瘤組織有大范圍病理性壞死。GM-CSF、TP和L-MUC1組動物雖也存在有相似的壞死病灶，但壞死程度和范圍均小于D-MUC1+GM-CSF組。
權(quán)利要求
1.基于MUC1串聯(lián)重復序列的免疫原性肽，特征在于所說的MUC1序列包括15個串聯(lián)重復，其中每個串聯(lián)重復至少含有一個D-型氨基酸，并且序列的兩末端均為脯氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性肽，其中所說的免疫原性肽具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性肽，其中所說的基于MUC1串聯(lián)重復序列的免疫原性肽具有提高了的MUC1特異的免疫原性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性肽，其中所說的基于MUC1串聯(lián)重復序列的免疫原性肽是以肽合成方法制備的。
5.MUC1特異性疫苗組合物，所說的疫苗組合物基本上是由如權(quán)利要求1中限定的免疫原性肽以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的佐劑組成的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物，其中所說的免疫原性肽可以是與選自血清白蛋白、卵白蛋白和匙藍蛋白的載體蛋白質(zhì)化學偶聯(lián)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的疫苗組合物在誘導MUC1特異性抗腫瘤免疫反應中的應用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的應用，其中所說的MUC1特異性抗腫瘤免疫反應是MUC1特異性細胞毒性淋巴細胞反應。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于刺激機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應的肽疫苗，特別是涉及基于粘蛋白1之核心序列的手性肽抗原，含有所說的肽抗原的疫苗組合物，其制備方法及其作為免疫原在刺激機體產(chǎn)生免疫反應中的應用。
文檔編號A61K39/00GK1480463SQ0212908
公開日2004年3月10日 申請日期2002年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月3日
發(fā)明者顏煒群, 王毅, 李玉林 申請人:吉林圣元科技有限責任公司