專(zhuān)利名稱(chēng)：他汀類(lèi)抑制破骨細(xì)胞形成的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及他汀(statins)類(lèi)抑制破骨細(xì)胞形成的用途，更具體而言，本發(fā)明涉及阿伐他汀(atorvastatin)抑制破骨細(xì)胞形成的用途和藥物組合物，盛有含他汀的組合物的藥盒，和通過(guò)抑制破骨細(xì)胞形成治療或預(yù)防疾病的方法，所述疾病例如骨質(zhì)疏松、佩吉特氏病(Paget’s disease)、骨質(zhì)溶解、惡性腫瘤的高鈣血癥、成骨不全、骨關(guān)節(jié)炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治療以及長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的副作用。
背景技術(shù)：
維持骨密度是一動(dòng)態(tài)的過(guò)程，其中破骨細(xì)胞吸收骨而成骨細(xì)胞再造骨骼，Parfitt Am，Riggs BL，Melton LJ，Osteoporosisetiology，diagnosis andmanagement，New YorkRaven Press，1988；13501。在如骨質(zhì)疏松和佩吉特氏病病癥中，骨吸收和骨形成之間的失衡導(dǎo)致骨損失。受失衡影響的其它病癥和疾病包括骨質(zhì)溶解、惡性腫瘤的高鈣血癥、成骨不全、骨關(guān)節(jié)炎、牙槽骨缺失或免疫抑制治療或長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素的副作用。骨損失部分是破骨發(fā)生(osteoclastogenesis)增強(qiáng)的結(jié)果，所述破骨發(fā)生是一系列事件，包括破骨細(xì)胞分化、遷移、融合和存活。破骨細(xì)胞，一種多核巨細(xì)胞，它是由巨噬細(xì)胞系造血細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的，是成骨細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的破骨細(xì)胞生成細(xì)胞因子增加的結(jié)果，Suda T，Takahashi N，Martin TJ，Modulation ofosteoclast differentiation，Endocr.Rev.，1992；13；66-80；Chambers TJ，Revell PA，F(xiàn)uller K，Athanasou NA，Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts，J.Cell Sci.，1984；66384-399；Takahashi N，Udagawa N，Suda T，A new member ofTNF ligand family，ODF/OPGL/TRANCE/RANKL，regulates osteoclastdifferentiation and function，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1999；256449-455；和Suda T，Takahashi N，Udagawa N，Jimi E，Gillespie MT，Martin TJ，Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of theTNF receptor and ligand families.Endocr.Rev.，1999；20345-357。各種破骨細(xì)胞生成細(xì)胞因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和NF-kB配體的受體活化劑(RANKL)，被認(rèn)為對(duì)于破骨發(fā)展是必要的，Jimi E等人，Osteoclast functionis activated by osteoblastic cells through a mechanism involving cell-to-cellcontact，Endocrinology，1996；1372187-2190；和Lacey D等人，Osteoprotegerin ligand murine osteoclast survival in vitro and in vivo，Am.J.Pathol.2000；157435-448。
已有數(shù)種不同治療劑用于治療與骨質(zhì)疏松有關(guān)的骨損失；然而，很少知道它們的作用機(jī)制。最近的研究表明，膽固醇生物合成通路的紊亂對(duì)于破骨細(xì)胞具有直接作用。譬如，據(jù)報(bào)道，含氮二膦酸鹽通過(guò)阻止蛋白異戊烯化而抑制破骨細(xì)胞的形成和促進(jìn)其凋亡，所述蛋白異戊烯化是膽固醇生物合成通路上的一個(gè)限速步驟，Cummings S，Bauer DC，Do Statins prevent bothcardiovascular disease and fracture？，J.Am.Med.Assoc.，2000；2833255-3257；Wang PS，Solomon DH，Mogun H，Avorn J，HMG-CoA reductase inhibitors andthe risk of hip fractures in elderly patients，J.Am.Med.Assoc.，2000；2833211-3216；Meier CR，Schlienger RG，Kraenzlin ME，Schlegel B，Hershel J，HMG-CoA reductase inhibitors and the risk of fractures，J.Am，Med.Assoc.，2000；2833205-3210；Russell RG，Rogers MJ，F(xiàn)rith JC等人，The pharmacology ofbispholsphanates and new insights into their mechanisms of action，J.BoneMiner Res.，1999；1453-65；Reszka AA，Halasy-Nagy JM，Masarachia PJ，Rodan GA，Bisphosphanates act directly on the osteoclast to induce caspasecleavage of mstl kinase during apoptosisa link between inhibition of themevalonate pathway and regulation of apoptosis-promoting kinase.J.Biol.Chem.，1999；27434967-34973。用他汀類(lèi)抑制HMG-CoA還原酶-膽固醇生物合成中的早期步驟，預(yù)期對(duì)破骨細(xì)胞具有類(lèi)似作用。相反，Mundy G等人，Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins，Science，1999；2861946-49，已證明體內(nèi)施用他汀類(lèi)提高骨形成蛋白-2(BMP-2)水平，后者反過(guò)來(lái)導(dǎo)致骨形成增加。類(lèi)似地，據(jù)報(bào)道，無(wú)論是在正常大鼠還是在切除卵巢的(OVX)大鼠，與已確定的生長(zhǎng)因子如BMP-2或基底成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-FGF)相比，斯伐他汀和洛伐他汀均刺激整個(gè)骨區(qū)域(totalbone area)更大程度的劑量依賴(lài)性增加(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6022887)。
因此，盡管已經(jīng)證明二膦酸鹽是抗吸收劑，但是得到的數(shù)據(jù)似乎提示他汀類(lèi)起著合成代謝劑的作用。有極少一點(diǎn)數(shù)據(jù)，如果有的話，提示他汀類(lèi)的抗吸收作用。Mundy G等人，出處同上，暗示斯伐他汀具有抗吸收性能的可能性，但是僅僅證明了在嚙齒動(dòng)物破骨細(xì)胞數(shù)量上的少量的減少(25％)。國(guó)際公布的專(zhuān)利申請(qǐng)WO99/45923公開(kāi)了洛伐他汀于10μM濃度時(shí)顯著抑制成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共培養(yǎng)物中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性。
但是，上述公開(kāi)物中無(wú)一證明阿伐他汀，或者就此而言他汀在破骨細(xì)胞生成及相關(guān)疾病調(diào)節(jié)中的治療作用。
和上面提到的研究所不同的是，我們采用了從機(jī)制上講適宜檢測(cè)化合物對(duì)破骨細(xì)胞生成直接作用、不依賴(lài)于成骨/間質(zhì)細(xì)胞通路的方案。更具體而言，我們發(fā)現(xiàn)阿伐他汀能夠用于抑制體內(nèi)和體外的破骨細(xì)胞形成。
美國(guó)專(zhuān)利5273995(此專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考)公開(kāi)的阿伐他汀鈣，目前正以商品名Lipitor出售，其化學(xué)名稱(chēng)為[R-(R*，R*)]-2-(4-氟苯基)-β，δ-二羥基-5-(1-甲基乙基)-3-苯基-4-[(苯胺)羰基]-1H-吡咯-1-庚酸鈣鹽(2∶1)三水合物(trihydrate)，具有下式結(jié)構(gòu) 阿伐他汀鈣是HMG-CoA還原酶的選擇競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。照此，阿伐他汀鈣是強(qiáng)力降脂化合物，因而作為降血脂和/或降膽固醇劑是非常有用的。
美國(guó)專(zhuān)利4681893(該專(zhuān)利引入本文作為參考)公開(kāi)了包括反式(±)-5-(4-氟苯基)-2-(1-甲基乙基)-N，4-二苯基-1-[(2-四氫-4-羥基-6-酮基-2H-吡喃-2-基)乙基]-1H-吡咯-3-羧酰胺(carboxamide)的特定反式-6-[2-(3-或4-酰胺-取代的-吡咯-1-基)烷基]-4-羥基-吡喃-2-酮。
美國(guó)專(zhuān)利5273995(該專(zhuān)利引入本文作為參考)公開(kāi)了反式-5-(4-氟苯基)-2-(1-甲基乙基)-N，4-二苯基-1-[(2-四氫-4-羥基-6-酮基-2H-吡喃-2-基)乙基]-1H-吡咯-3-羧酰胺(carboxamide)的R型開(kāi)環(huán)酸，即[R-(R*，R*)]-2-(4-氟苯基)-β，δ-二羥基-5-(1-甲基乙基)-3-苯基-4-[(苯胺)-羰基]-1H-吡咯-1-庚酸，這就是阿伐他汀。
美國(guó)專(zhuān)利5003080、5097045、5103024、5124482、5149837、5111251、5216174、5245047、5248793、5280126、5397792、5342952、5298627、5446054、5470981、5489690、5489691、5510488、5998633和6087511公開(kāi)了制備非晶形阿伐他汀的各種方法和關(guān)鍵中間體，所有這些專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，非晶形阿伐他汀不適宜過(guò)濾和干燥，而是必須避熱、避光、避氧和防潮。
美國(guó)專(zhuān)利5969156和6121461公開(kāi)了晶形阿伐他汀鈣，這兩篇專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考。
國(guó)際公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)WO01/36348旨在公開(kāi)多晶型阿伐他汀鈣。
美國(guó)專(zhuān)利5686104和6126971公開(kāi)了阿伐他汀鈣的穩(wěn)定的口服制劑。
令人驚奇和意想不到的是，我們發(fā)現(xiàn)阿伐他汀在相對(duì)低濃度(0.01nM～1μM)時(shí)顯著降低小鼠原骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物(IC50＝0.43nM)和RAW細(xì)胞(IC50＝0.17μM)中TRAP-陽(yáng)性多核細(xì)胞細(xì)胞的數(shù)量。而且，使用切除卵巢的大鼠骨損失模型進(jìn)行的體內(nèi)研究表明，每日給大鼠口服阿伐他汀(2.5-10mg/kg體重)服藥5周，顯著降低破骨細(xì)胞形成的數(shù)量，所述破骨細(xì)胞形成是用組織形態(tài)學(xué)分析測(cè)定的。因此，我們發(fā)現(xiàn)阿伐他汀在生理濃度即具有對(duì)體內(nèi)和體外破骨細(xì)胞的直接作用。
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明是抑制破骨細(xì)胞形成的方法，包括向需要治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的他汀。
第二方面，本發(fā)明是含有治療有效量他汀和載體的藥物組合物。
第三方面，本發(fā)明是通過(guò)抑制破骨細(xì)胞形成而治療或預(yù)防疾病狀態(tài)的方法，方法包括向需要治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的他汀，所述疾病狀態(tài)例如骨質(zhì)疏松、佩吉特氏病(Paget’s disease)、骨質(zhì)溶解、惡性腫瘤的高鈣血癥、成骨不全、骨關(guān)節(jié)炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治療的副作用，以及長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的副作用。
第四方面，本發(fā)明是適宜商業(yè)銷(xiāo)售的治療包裝盒或藥盒，包括容器和藥物組合物。
附圖簡(jiǎn)述參照

圖1至4，通過(guò)下面的非限定性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，現(xiàn)對(duì)各附圖作如下簡(jiǎn)述。
圖1，阿伐他汀和阿伐他汀的S，S-對(duì)映異構(gòu)體對(duì)RANKL-誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的作用。
骨髓細(xì)胞與100ng/mL M-CSF一起培養(yǎng)3天。在RANKL和M-CSF存在下，細(xì)胞與阿伐他汀、其S，S-對(duì)映異構(gòu)體或保骨素(osteoprotegerin)(OPG)再培養(yǎng)5天。然后，固定細(xì)胞并進(jìn)行TRAP染色。計(jì)數(shù)超過(guò)3個(gè)核的細(xì)胞，數(shù)據(jù)用抑制RANKL單獨(dú)處理的培養(yǎng)物中TRAP-陽(yáng)性細(xì)胞的％表示。數(shù)據(jù)顯示為均數(shù)±SD(n＝4孔/處理)。在5種不同試驗(yàn)中得到類(lèi)似的結(jié)果。
圖2，阿伐他汀對(duì)破骨細(xì)胞生成的時(shí)效圖。
用RANKL以及阿伐他汀(0.01nM，10nM和1μM)、其S，S-對(duì)映異構(gòu)體或者OPG刺激已經(jīng)與M-CSF一起培養(yǎng)3天的骨髓細(xì)胞。在一些試驗(yàn)中，在RANKL刺激2天后(分離后5天)加入阿伐他汀。在分離后第8天，固定細(xì)胞并進(jìn)行TRAP染色。計(jì)數(shù)TRAP-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并記錄。數(shù)據(jù)用均數(shù)±SD(n＝4孔/處理)表示。3種不同試驗(yàn)得到類(lèi)似結(jié)果。
圖3，阿伐他汀處理減少切除卵巢大鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量。
按照標(biāo)準(zhǔn)方案切除大鼠卵巢，給大鼠口服不同劑量的阿伐他汀(2.5、5和10mg/kg體重)，服藥5周。用組織形態(tài)學(xué)測(cè)定法分析脛骨破骨細(xì)胞數(shù)量。炔雌醇(EE)(0.4mg/kg)，一種已知的骨保護(hù)劑，用作陽(yáng)性對(duì)照。
圖4，阿伐他汀和其S，S-對(duì)映異構(gòu)體對(duì)RAW細(xì)胞中RANKL-誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的作用。
用RANKL(50ng/mL)±阿伐他汀和阿伐他汀的S，S-對(duì)映異構(gòu)體刺激RAW細(xì)胞(2000/孔)5天，在第5天末進(jìn)行TRAP染色，數(shù)據(jù)用與對(duì)照相比抑制TRAP-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的％來(lái)表示。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及抑制破骨細(xì)胞形成的方法，包括向需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的他汀。本發(fā)明治療藥物施用至取得所需治療效果為止。
本發(fā)明中有用的治療劑是他汀。
本文中有用的他汀的實(shí)例包括但不限于，洛伐他汀(lovastatin)(MEVACOR；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4231938，該專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考)；斯伐他汀(simvastatin)(ZOCOR；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4444784，該專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考)；普伐他汀(pravastatin)(PRAVACHOL；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4346227，該專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考)；氟伐他汀(fluvastatin)(LESCOL；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5354772，該專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考)；阿伐他汀(LIPITOR；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5273995，該專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考)；西立伐他汀(cerivastatin)(也稱(chēng)為rivastatin；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5177080，該專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考)；美伐他汀(mevastatin)(康帕丁，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利3983140，該專(zhuān)利文獻(xiàn)在此引入作為參考)；羅伐他汀(rosuvastatin)(Crestor，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5260440，；國(guó)際公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)WO00/42024和Watanabe M等人，Biorg.Med.Chem.，1997；5437-447，這些文獻(xiàn)在此引入作為參考)；以及伊伐他汀(itavastatin)(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5753675，該文獻(xiàn)在此引入作為參考)。優(yōu)選地，他汀選自洛伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、羅伐他汀、伊伐他汀，和它們的可藥用鹽、酯和內(nèi)酯，以及它們的混合物。最優(yōu)選地，他汀是阿伐他汀鈣。
術(shù)語(yǔ)“阿伐他汀的S，S-對(duì)映異構(gòu)體”，是指(3S，5S)-7-[2-(4-氟苯基)-5-異丙基-3-苯基-4-苯氨基甲?；?吡咯-1-基]-3，5-二羥基-庚酸鈣鹽(2∶1)，它是阿伐他汀的非活性對(duì)映異構(gòu)體。
本文涉及他汀所用術(shù)語(yǔ)“酯”，是其標(biāo)準(zhǔn)含義，指羧酸與醇的縮聚產(chǎn)物。所述化合物的酯衍生物可用作藥物前體，后者在吸收進(jìn)入溫血?jiǎng)游锏难骱罂梢粤呀忉尫懦鏊幬锊⑹沟盟幬锞哂懈玫闹委熜ЯΑ?br> 本文所用術(shù)語(yǔ)“內(nèi)酯”，是其標(biāo)準(zhǔn)含義，指羧酸和醇產(chǎn)生的環(huán)狀縮聚產(chǎn)物，即環(huán)酯。
本文所用術(shù)語(yǔ)“治療有效量”，是指按照所需治療方案臨床醫(yī)師、內(nèi)科醫(yī)師、獸醫(yī)、科研工作者或其它適宜從業(yè)者所想要達(dá)到的引發(fā)所需生物或醫(yī)學(xué)效果或響應(yīng)的他汀的量。優(yōu)選的治療有效量使抑制破骨細(xì)胞的量。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”也旨在涵蓋預(yù)防有效量，即適宜預(yù)防疾病狀態(tài)或病癥的量，如果預(yù)防或防止的效果是所需要的話。
本文所用術(shù)語(yǔ)“直至取得所需治療效果”，是指按照選用的給藥方案施用他汀，直至臨床醫(yī)師或者研究工作者觀察到所追求的對(duì)被治療或預(yù)防疾病或病癥的臨床或醫(yī)學(xué)效果時(shí)。對(duì)于本發(fā)明的治療方法而言，連續(xù)施用他汀直至在骨質(zhì)或結(jié)構(gòu)觀察到所需的變化為止。此種情況下，達(dá)到骨質(zhì)增加或異常骨結(jié)構(gòu)被正常骨結(jié)構(gòu)所取代，則是所需目標(biāo)。對(duì)于本發(fā)明的預(yù)防方法而言，盡所需長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)施用他汀以防止所不希望的病癥或疾病狀態(tài)。此種情況下，常常以保持骨質(zhì)密度為目標(biāo)。治療和預(yù)防給藥期間的非限定性實(shí)例，可由約2周至維持到哺乳動(dòng)物終生。對(duì)于人，給藥期間可以為約2周至人的終生，優(yōu)選約2周至約20年，更優(yōu)選約1個(gè)月至約20年，更優(yōu)選約6個(gè)月至約10年，最優(yōu)選約1年至約10年。
術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”包括人。
阿伐他汀對(duì)體內(nèi)破骨細(xì)胞形成的影響分離后，在含有100ng/mL重組鼠M-CSF的條件下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞3天。然后，在存在不同劑量阿伐他汀(0.01nM，1nM和1μM)、阿伐他汀的S，S-對(duì)映異構(gòu)體或保骨素(OPG)條件下，用鼠RANKL(100ng/mL)刺激細(xì)胞并再培養(yǎng)5天，染色檢測(cè)TRAP活性(見(jiàn)圖1)。由RANKL形成的TRAP-陽(yáng)性多核細(xì)胞數(shù)量被同時(shí)加向得自骨髓的破骨細(xì)胞的50ng/mL OPG完全抑制。
阿伐他汀對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的破骨細(xì)胞生成的影響將RAW細(xì)胞按照2000細(xì)胞/孔的密度在48孔培養(yǎng)板上鋪板，并在含有抗生素的α-MEM培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。用RANKL(50ng/mL)±阿伐他汀或阿伐他汀的S，S-對(duì)映異構(gòu)體(10、1和0.01μM)處理細(xì)胞5天，進(jìn)行TRAP酶染色。在顯微鏡下，計(jì)數(shù)有3個(gè)或更多細(xì)胞核的染成紫色的細(xì)胞，用相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞而言破骨細(xì)胞生成抑制％表示。因此，在圖4中，柱1代表幾乎100％抑制，不含任何TRAP細(xì)胞形成的對(duì)照細(xì)胞；柱2、3和4表明，即使用0.01微摩爾的阿伐他汀處理，對(duì)RANKL-誘導(dǎo)的多核細(xì)胞形成的抑制幾乎達(dá)到80％，而S，S-對(duì)映異構(gòu)體(柱4、6和7)顯示顯著微小的抑制％。
阿伐他汀抑制RANKL-誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的時(shí)效圖破骨細(xì)胞生成涉及一系列事件，其包括分化、增殖、活化和融合從而形成能夠吸收骨的多核細(xì)胞。為檢驗(yàn)阿伐他汀在哪個(gè)階段抑制破骨細(xì)胞生成，將阿伐他汀在不同時(shí)間加入到存在有M-CSF和RANKL的小鼠骨髓細(xì)胞中。圖2表明，RANKL刺激2天后(分離后5天)加入阿伐他汀能夠阻斷TRAP-陽(yáng)性細(xì)胞形成的數(shù)量。另一方面，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入阿伐他汀的S，S-對(duì)映異構(gòu)體則未觀察到差異。有趣的是，當(dāng)在分離后第5天加入時(shí)，阿伐他汀的作用較第3天加入時(shí)更為突出。這可能是由于在第3天加入的阿伐他汀較第5天加入的阿伐他汀或許在某種程度上被滅活的緣故，在第5天加入時(shí)，該時(shí)段正在發(fā)生融合和活化過(guò)程。這些結(jié)果提示，阿伐他汀通過(guò)直接作用于破骨細(xì)胞而能夠調(diào)節(jié)對(duì)于多核細(xì)胞形成來(lái)說(shuō)至關(guān)重要的最后融合/活化步驟。
阿伐他汀對(duì)切除卵巢大鼠破骨細(xì)胞數(shù)量的影響切除大鼠卵巢-誘導(dǎo)的骨損失是已建立的骨質(zhì)疏松模型，其中雌激素不足而導(dǎo)致破骨細(xì)胞生成增加，可能是由于增加了細(xì)胞因子產(chǎn)生的結(jié)果。為檢測(cè)他汀是否能夠減少體內(nèi)的骨吸收，故而，給切除卵巢大鼠口服不同劑量的阿伐他汀(2.5、5或10mg/mg體重)，服藥5周。試驗(yàn)?zāi)幩绖?dòng)物，對(duì)取自動(dòng)物的脛骨進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)分析。數(shù)據(jù)揭示，去卵巢大鼠動(dòng)物中存在的破骨細(xì)胞數(shù)量(圖3)顯著多于模擬的對(duì)照動(dòng)物。給去卵巢大鼠施用5或10mg/kg阿伐他汀，顯著減少了破骨細(xì)胞數(shù)量。在降低破骨細(xì)胞形成方面，5或10mg/kg阿伐他汀的施用劑量較本試驗(yàn)中使用的陽(yáng)性對(duì)照藥物-炔雌醇更為有效。因此，這些數(shù)據(jù)清楚地證明他汀具有對(duì)破骨細(xì)胞形成的直接抑制作用。
可以各種口服和非胃腸劑型制備本發(fā)明化合物并給藥。因此，本發(fā)明化合物可以注射給藥，即靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、十二指腸內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。本發(fā)明化合物也可吸入給藥，譬如經(jīng)鼻內(nèi)吸入。另外，本發(fā)明化合物還可以經(jīng)皮給藥。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，下述劑型含有作為活性成分的本發(fā)明化合物或其相應(yīng)的可藥用鹽。
為配制本發(fā)明化合物的藥物組合物，可藥用載體可以是固體，也可以是液體。固體制劑包括粉劑、片劑、丸劑、膠囊、扁囊劑、栓劑和可分散顆粒劑。固體載體可以是一種或多種同時(shí)作為稀釋劑、矯味劑、助溶劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、粘合劑、防腐劑、片劑崩解劑或包封材料的物質(zhì)。
粉劑時(shí)，載體是微細(xì)的固體，它可與微細(xì)的活性成分混合。
片劑時(shí)，活性成分與具有必需粘合性能、適宜于按比例摻入的載體混合并壓制成所需形狀和大小。
粉劑和片劑優(yōu)選含有2％或10％至約70％的活性化合物。適宜載體是碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點(diǎn)蠟、椰子油等。術(shù)語(yǔ)“制備”，旨在包括活性化合物與作為載體的包封材料一起制成膠囊，其中活性成分(與或不與其它載體一起)被載體包圍著，活性成分與載體就是以這種方式聯(lián)系共存。類(lèi)似地，扁膠囊和錠劑也如此制備。片劑、粉劑、膠囊、丸劑、扁膠囊和錠劑可用作適宜口服給藥的固體劑型。
為了制備栓劑，首先將低熔點(diǎn)蠟如脂肪酸甘油酯的混合物或者椰子油融化，然后通過(guò)攪拌方式把活性成分均質(zhì)地分散到其中。接著，把融化的均質(zhì)混合物傾入常用大小的模子中，使之冷卻，由此而固化。
液體制劑包括溶液、懸浮液、保留灌腸劑和乳劑，例如水或聚乙二醇水溶液。對(duì)于非胃腸注射，液體制劑可用聚乙二醇水溶液配制而成。
適宜于口服的水溶液可如下制備在水中溶解活性成分，加入適宜的著色劑、調(diào)味香料和穩(wěn)定劑與所需的增稠劑。
適宜口服的含水懸浮液可如下制備將微細(xì)活性成分與粘性物質(zhì)一起分散到水中，所述粘性物質(zhì)如天然或合成膠、樹(shù)脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和其它眾所周知的試劑。
也在考慮之中的固體制劑包括在使用前不久將其轉(zhuǎn)變?yōu)榭诜o藥的液體劑型的那些固體制劑。這些液體形式包括溶液，懸浮液，和乳液。這些制劑除含有活性成分外，還含有著色劑、調(diào)味香料、穩(wěn)定劑、緩沖劑、人工和天然甜味劑、分散劑、增稠劑、助溶劑等。
藥物制劑優(yōu)選呈單位劑量形式。以這種形式，制劑再分為含有適合量活性成分的單位劑量。該單位劑量形式可以是包裝的制劑，包裝盒盛有可分隔劑量的制劑，如包裝的片劑、膠囊和裝在小瓶或安瓿中的粉劑。單位劑量形式也可以本身就是膠囊、片劑、扁膠囊或錠劑，或者它是適宜數(shù)量的這些包裝形式中的任何形式。
單位劑量制劑中活性成分的量，可以根據(jù)特定用途和活性成分的效力而在0.5mg到100mg范圍內(nèi)不等或予以調(diào)整，優(yōu)選為2.5mg～80mg。如果需要，組合物也可含有其它可配伍的的治療劑。
在作為抑制破骨細(xì)胞形成的治療劑應(yīng)用和作為治療或預(yù)防選自下組的疾病狀態(tài)的藥物應(yīng)用時(shí)，更具體而言，阿伐他汀在本發(fā)明藥物方法中的每日初始給藥量為約2.5mg～約80mg，優(yōu)選每日給藥劑量范圍為約2.5mg～約20mg，所述疾病狀態(tài)為骨質(zhì)疏松、佩吉特氏病(Paget’s disease)、骨質(zhì)溶解、惡性腫瘤的高鈣血癥、成骨不全、骨關(guān)節(jié)炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治療的副作用，以及長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的副作用。然而，劑量將依患者的需要情況、受治療病癥的嚴(yán)重程度以及所使用的化合物不同而異。對(duì)特定情況時(shí)適宜劑量的確定，是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。通常，開(kāi)始時(shí)用小于化合物最適劑量的小劑量進(jìn)行治療，此后，小幅度增加劑量直至取得最佳療效。為了方便，如果需要的話，將每日總劑量在一日內(nèi)按份分次施用。
另外，本發(fā)明涉及通過(guò)施用盛在治療包裝盒或藥盒中的劑量形式藥物而治療個(gè)體的上述疾病和病癥。藥盒包括劑型和容器。通常，藥盒包括指導(dǎo)劑型施用的說(shuō)明書(shū)。容器可呈任何常用形狀或本領(lǐng)域已知的形式，譬如紙盒、玻璃或塑料瓶、或者按照治療程序表貼在背面的獨(dú)立劑量的發(fā)泡包裝。
下面的非限定實(shí)施例描述本發(fā)明者實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選的方法。
實(shí)施例1骨髓細(xì)胞培養(yǎng)如前所述，從6至8周齡的C57B1/6小鼠的骨髓細(xì)胞中得到破骨細(xì)胞，Kobayashi K等人，Tumor Necrosis Factorαstimulates osterclast differentiationby a mnechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction，J.Exp.Med.，2000；191275-285。簡(jiǎn)要講，經(jīng)無(wú)菌操作取下股骨后，從骨頭上剝離掉粘附的軟組織。使用注射器和針頭，用α極限必需培養(yǎng)基(alpha minimumessential medium)(α-MEM)引流骨髓。在48孔培養(yǎng)板上，在含有10％胎牛血清(FBS)、100IU盤(pán)尼西林、100μg/mL鏈霉素和100ng/mL重組鼠M-CSF的α-MEM中，培養(yǎng)骨髓細(xì)胞(0.15×106細(xì)胞/孔)3天。由此得到的破骨細(xì)胞再與RANKL±阿伐他汀、阿伐他汀的S，S-對(duì)映異構(gòu)體或者保骨素(OPG)一起培養(yǎng)5天。OPG是RANKL的溶解誘騙受體(decoy receptor)，已被證明在數(shù)種體內(nèi)和體外模型中能有效阻斷RANKL-誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。在一些試驗(yàn)中，化合物在分離后第5天加入。在第5天末，使用購(gòu)自Sigma化學(xué)品公司的白細(xì)胞酸性磷酸酶試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色以檢測(cè)TRAP活性，Goldberg AF和Barka T，Acid phosphatase activity in human blood cells，Nature，1962；189297。
實(shí)施例2RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)物在含有10％FBS、100IU盤(pán)尼西林、100μg/mL鏈霉素的α-MEM中培養(yǎng)RAW細(xì)胞。以2000細(xì)胞/孔的密度在48孔培養(yǎng)板上鋪板。過(guò)夜孵育后，用RANKL(50ng/mL)±阿伐他汀、阿伐他汀的S，S-對(duì)映異構(gòu)體或者保骨素(OPG)刺激5天，于5天末染色檢測(cè)TRAP。
實(shí)施例3抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色用1×PBS初步洗滌后，用含有丙酮、檸檬酸和37％甲醛的丙酮基固定溶液細(xì)固定細(xì)胞30秒鐘。用預(yù)熱到37℃的蒸餾水洗滌2遍后，于37℃在含有萘酚AS-B1和Fast Garnet GBC溶液的醋酸緩沖液中溫育細(xì)胞45分鐘。顯微鏡下查看，TRAP-陽(yáng)性細(xì)胞通常呈棕色。計(jì)數(shù)每個(gè)孔中有3個(gè)或更多核的TRP-陽(yáng)性細(xì)胞的總數(shù)量。TRAP活性是成熟破骨細(xì)胞的顯型標(biāo)志。
實(shí)施例4切除卵巢和組織形態(tài)學(xué)分析按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序，切除大鼠的卵巢。簡(jiǎn)言之，麻醉大鼠后，用無(wú)菌溶液擦洗干凈。在動(dòng)物背部拉一小切口，在脂肪組織下仔細(xì)找到卵巢，經(jīng)過(guò)適當(dāng)鉗夾止血，用解剖刀刀刃切下卵巢。而且，使用電烙術(shù)用子宮角封閉輸卵管。然后，用傷口回形針關(guān)閉皮膚切口。手術(shù)康復(fù)之后，動(dòng)物被隨機(jī)分為6組(模擬手術(shù)組，OVX組，OVX+阿伐他汀2.5、5、10mg/kg體重組和OVX+炔雌酚組)，每組8只動(dòng)物，每日施用不同濃度的阿伐他汀和載體對(duì)照品，給藥5周。
使用近心端脛骨的脫鈣切片對(duì)松質(zhì)骨進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析，使用未脫鈣的切片對(duì)骨密質(zhì)進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。簡(jiǎn)要講，用10％乙二胺四乙酸(EDTA)給脛骨脫鈣，隨后在遞增濃度的乙醇中再脫水，并包埋于甲基丙烯酸乙二醇酯(GMA)樹(shù)脂中。切出5～10μm的切片，用TARP染色，計(jì)數(shù)被甲基綠染色的細(xì)胞用于細(xì)胞參數(shù)測(cè)定。使用帶有連在適宜光學(xué)顯微鏡上的可視電視系統(tǒng)的OsterMeasure成像分析系統(tǒng)，進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)分析。
權(quán)利要求
1.抑制破骨細(xì)胞形成的方法，包括向需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的他汀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中他汀選自洛伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、羅伐他汀和伊伐他汀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中他汀是阿伐他汀鈣。
4.含有治療有效量他汀和載體的藥物組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其中他汀選自洛伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、羅伐他汀和伊伐他汀。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其中他汀是阿伐他汀鈣。
7.通過(guò)抑制破骨細(xì)胞形成而治療或預(yù)防疾病狀態(tài)的方法，包括向需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的他汀。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中疾病狀態(tài)選自骨質(zhì)疏松、佩吉特氏病、骨質(zhì)溶解、惡性腫瘤的高鈣血癥、成骨不全、骨關(guān)節(jié)炎、牙槽骨缺失、和免疫抑制治療的副作用，以及長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的副作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中疾病狀態(tài)是骨質(zhì)疏松。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中他汀選自洛伐他汀、斯伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、羅伐他汀和伊伐他汀。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中他汀是阿伐他汀鈣。
12.在哺乳動(dòng)物中達(dá)到治療效果的藥盒，包括裝在單位劑量形式中的治療有效量的他汀和載體以及盛裝所述劑量形式的容器。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥盒，其中他汀是阿伐他汀。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的藥盒，其中治療效果是對(duì)選自下列的疾病或病癥的治療效果骨質(zhì)疏松、佩吉特氏病、骨質(zhì)溶解、惡性腫瘤的高鈣血癥、成骨不全、骨關(guān)節(jié)炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治療的副作用，以及長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的副作用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥盒，其中治療效果是對(duì)骨質(zhì)疏松的治療效果。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制破骨細(xì)胞形成的方法，包括向需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的他汀，以及含有他汀的藥物組合物和藥盒，或者通過(guò)抑制破骨細(xì)胞形成而治療或預(yù)防疾病狀態(tài)的方法，包括向需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的他汀，所述疾病選自骨質(zhì)疏松、佩吉特氏病、骨質(zhì)溶解、惡性腫瘤的高鈣血癥、成骨不全、骨關(guān)節(jié)炎、牙槽骨缺失和免疫抑制治療的副作用，以及長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的副作用。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1403081SQ0213214
公開(kāi)日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2002年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月10日
發(fā)明者維杰伊庫(kù)馬·M·巴拉吉, 雷迪卡·M·德瓦拉雷加, 布蘭登·R·彼得斯, 理查德·R·倫基維茨 申請(qǐng)人:沃納-蘭伯特公司