專利名稱：表達(dá)fmdv結(jié)構(gòu)蛋白的重組雞痘活載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的重組雞痘活載體疫苗。
背景技術(shù)：
口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引起的動(dòng)物烈性傳染病之一，主要危害對(duì)象是牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物。發(fā)病率可達(dá)100％，并能形成大范圍的流行，危害嚴(yán)重，所以國際獸醫(yī)局(OIE)把口蹄疫列在A類家畜傳染病的首位?？谔阋叩牟⌒笏劳雎室话悴怀^5％，但幼畜死亡率可達(dá)50％。本病導(dǎo)致患病動(dòng)物的生產(chǎn)力下降，發(fā)病地區(qū)的豬、牛、羊肉和奶產(chǎn)品被限制上市，再加上控制疫情蔓延所用的開支，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。此外，各國對(duì)發(fā)病國家進(jìn)出口貿(mào)易的限制，嚴(yán)重影響其外匯收入。
FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，共有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia I等7個(gè)血清型，不同血清型之間不能交叉保護(hù)。
口蹄疫病毒的基因組為單股RNA，由大約8500個(gè)核苷酸組成，其分子量約為2.6×106，可分為5端非編碼區(qū)、P1區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)以及3端非編碼區(qū)。其中P1區(qū)編碼主要的結(jié)構(gòu)蛋白，P2區(qū)和P3區(qū)編碼與病毒復(fù)制、翻譯，以及完整病毒粒子裝配有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白。
結(jié)構(gòu)蛋白P1區(qū)核苷酸序列全長為2154nt，由1A、1B、1C和1D 4個(gè)基因編碼序列組成，長度依次為167、648、660和639nt，分別編碼85、218、220和213個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)多肽。1B、1C和1D位于衣殼表面，為外衣殼蛋白。其中1D蛋白編碼多肽VP1，其大部分暴露在病毒表面，是決定病毒抗原性的主要成分。但其他三種結(jié)構(gòu)多肽也都參與免疫原性的構(gòu)成。不同血清型病毒的抗原位點(diǎn)有所不同，O型病毒有5個(gè)位點(diǎn)抗原位點(diǎn)1由1D GH環(huán)(1133-1157)和200-213個(gè)氨基酸的線性表位組成。此位點(diǎn)是FMDV最主要的抗原位點(diǎn)，也是FMDV抗原位點(diǎn)的關(guān)鍵所在?？乖稽c(diǎn)2位于病毒表面的1B的βB-αβ上，由4個(gè)表位組成?？乖稽c(diǎn)3位于病毒粒子表面五重軸周圍1D的βB-C環(huán)上。抗原位點(diǎn)4位于五重軸周圍1C的βB球節(jié)上。抗原位點(diǎn)5位于1D G-H環(huán)內(nèi)，此位點(diǎn)較為保守。此外，C型和A型FMDV均有4個(gè)抗原位點(diǎn)。FMDV主要抗原位點(diǎn)存在于衣殼蛋白VP1第134-158殘基中，能與高滴度中和抗體產(chǎn)生強(qiáng)陽性反應(yīng)的A型病毒多肽在第145-147殘基無RGD三聯(lián)體。O型高滴度抗血清在ELISA中能與第141-150多肽(含有RGD基序)和第135-144(位于RGD上游)反應(yīng)，表明RGD三聯(lián)體不是一刺激產(chǎn)生中和抗體的必須成分。FMDV VP1的G-H環(huán)具有識(shí)別和與中和抗體相互作用的雙重功能，某些氨基酸殘基在這兩個(gè)功能中發(fā)揮著重要作用。
P3區(qū)基因編碼序列的長度為2721nt，由3A、3×3B、3C和3D組成，長度依次為459、213、639和1410nt(O1K)。3A編碼序列中存在著GUAA保守基序，被認(rèn)為可能與病毒復(fù)制有關(guān)。3B又稱為VPg，可通過Tyr-OH以脂鍵共價(jià)連接到正負(fù)鏈RNA 5’端，可能作為包裝信號(hào)存在。3D是一種病毒RNA依賴性聚合酶，用以催化、合成FMDV的RNA。3C蛋白酶由213個(gè)氨基酸組成，是聚合蛋白成熟過程中最為重要的蛋白酶之一。FMDV的3C能在P1-P2和P2-P3連接處裂解聚合蛋白。在感染細(xì)胞提取物和體外富含F(xiàn)MDV翻譯的產(chǎn)物中幾乎都無法檢測(cè)到3C。它能催化裂解2C/3A位點(diǎn)和除1A/1B位點(diǎn)外的所有位點(diǎn)的二級(jí)裂解。在感染細(xì)胞中，P1被3C蛋白酶催化加工成VP0-VP1和VP3后，這三種蛋白互相作用，形成5S原體，成為病毒結(jié)構(gòu)的基本組件。
目前針對(duì)口蹄疫的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗。但傳統(tǒng)上的滅活疫苗在制備過程中不僅會(huì)造成病毒本身的免疫原性的降低，還可能出現(xiàn)滅活不完全造成散毒現(xiàn)象；而弱毒疫苗由于可能出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，從而限制了其的使用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建重組載體，表達(dá)FMDV的主要保護(hù)性抗原制備而成的基因工程疫苗是新型疫苗研究的主要方向之一。
雞痘病毒(Fowlpox Virus，F(xiàn)PV)表達(dá)載體系統(tǒng)是類似于金絲雀痘病毒載體的又一種動(dòng)物病毒載體。FPV作為載體具有與金絲雀痘病毒載體相同的優(yōu)點(diǎn)，此外，相比于金絲雀痘病毒載體，其基因組結(jié)構(gòu)更為龐大，能容納較大的外源基因而不喪失其感染性；被表達(dá)的外源蛋白，在感染細(xì)胞中，能忠實(shí)地進(jìn)行修飾，如糖基化、羧基化等；外源基因的表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)時(shí)間較長的細(xì)胞免疫和體液免疫；嚴(yán)格的胞漿內(nèi)復(fù)制，避免了病毒基因重組入宿主細(xì)胞染色體的可能性，消除了重組病毒應(yīng)用后對(duì)人畜的潛在威脅。FPV的宿主特異性使重組FPV(Recombinant FPV，rFPV)接種哺乳動(dòng)物后僅產(chǎn)生流產(chǎn)性感染，但仍然可在較廣范圍的動(dòng)物中正確表達(dá)外源基因，在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生構(gòu)像正確的抗原，從而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，且安全、有效，尤其是對(duì)免疫缺陷和免疫低下的動(dòng)物是更為理想的載體。所以，F(xiàn)PV不僅可以用于研制禽類的基因工程活疫苗，而且可以作為非復(fù)制型病毒載體，研制哺乳動(dòng)物基因工程活疫苗，用于禽類以外的動(dòng)物乃至人類的免疫。因此，F(xiàn)PV載體的研究，尤其是FPV作為非復(fù)制型載體的研究日益受到人們的重視。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供表達(dá)口蹄疫病毒NY00株病毒結(jié)構(gòu)蛋白前體P1區(qū)基因、P1區(qū)基因與3C蛋白酶基因共表達(dá)的重組雞痘病毒。這兩種重組雞痘病毒均可刺激小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可作為預(yù)防我國FMDV感染的活載體疫苗。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一株表達(dá)O型口蹄疫病毒中國流行株O_NY00株結(jié)構(gòu)蛋白前體P1的重組雞痘病毒vPUTA2-P1，和一株共表達(dá)O_NY00株結(jié)構(gòu)蛋白前體P1與蛋白酶3C基因的重組雞痘病毒vPUTAL-3C-P1。其中vPUTAL-3C-P1表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白前體P1可在蛋白酶3C作用下裂解產(chǎn)生成熟結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP3和VP1，并裝配成病毒樣粒子，重組病毒可作為預(yù)防口蹄疫的活載體疫苗。
表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的重組雞痘活載體疫苗的構(gòu)建方法是將O_NY00株結(jié)構(gòu)蛋白前體P1基因插入到雞痘病毒表達(dá)載體PUTA2復(fù)合啟動(dòng)子ATI-P7.5×20下游，同時(shí)將蛋白酶3C插入到串聯(lián)啟動(dòng)子P7.5×16下游，分別構(gòu)建了含有P1、P1/3C的重組雞痘病毒表達(dá)質(zhì)粒；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒與雞痘病毒株共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞內(nèi)，使其進(jìn)行同源重組，并用5-溴-2-脫氧尿嘧啶(Budr)進(jìn)行加壓篩選；重組病毒分別經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫蛋白印記(Western blot)和免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，篩選獲得陽性重組雞痘病毒；將篩選的陽性重組雞痘病毒分別免疫BALBc小鼠并進(jìn)行了免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。


圖1重組質(zhì)粒pUTAL3C-P1的構(gòu)建流程圖；圖2重組質(zhì)粒pUTA2-P1的構(gòu)建流程圖；圖3口蹄疫NY00株結(jié)構(gòu)蛋白前體P1基因核苷酸和氨基酸序列；圖4口蹄疫NY00株病毒蛋白酶3C核苷酸和氨基酸基因序列。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為1、本發(fā)明得到的重組雞痘病毒vPUTA2-P1可表達(dá)完整的口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白前體P1基因；重組雞痘病毒vPUTAL-3C-P1可同時(shí)表達(dá)P1和蛋白酶3C，且表達(dá)的蛋白前體P1裂解產(chǎn)生VP0、VP3和VP1，可裝配成病毒樣粒子。兩重組雞痘病毒表達(dá)的蛋白均可與口蹄疫抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。
2、本發(fā)明得到的兩株重組雞痘病毒可刺激小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫。
3、本發(fā)明得到的兩株重組雞痘病毒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是安全的，無任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)。
4、本發(fā)明得到的兩株重組雞痘病毒具有很好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)多次傳代后外源基因不丟失，且可在非禽屬動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白。
5、本發(fā)明所使用的目的基因?yàn)橹袊餍兄闛_NY00株基因，從而構(gòu)建的重組雞痘病毒可作為我國預(yù)防O型口蹄疫的活載體疫苗。
具體實(shí)施例方式1.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)以無菌接種環(huán)刮取凍存于-70℃冰箱的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16h左右。挑取單一菌落，接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振搖培養(yǎng)到OD600＝0.4~0.6，在無菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩個(gè)無菌并以冰預(yù)冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無菌)，冰浴10min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；4℃、2000r/min離心10min，棄上清，以10ml用冰預(yù)冷的75mmol/L CaCl2、10mmol/L(pH6.5)溶液重懸沉淀，冰浴10min，4℃，2000r/min離心10min，棄上清，以2ml用冰預(yù)冷的，含15％(v/v)甘油的75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris·Cl(pH6.5)溶液重懸每管沉淀，用無菌吸頭將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無菌微量離心管中，每管200μl；標(biāo)明菌株、體積和日期，置-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br> 2.轉(zhuǎn)化將適量質(zhì)粒DNA(體積質(zhì)粒＜1μl，連接產(chǎn)物＜10μl，DNA＜50ng)加入200μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min；加入200μl 37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37℃150r/min振搖培養(yǎng)50min；取培養(yǎng)液涂布于含Amp(50μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)14~16h后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。
3.質(zhì)粒的提取3.1質(zhì)粒的小量制備(堿裂解法)挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，接種到2ml含50μg/ml Amp的LB培養(yǎng)液(下同)中，37℃250r/min振搖培養(yǎng)12~16h；將1.5ml轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄上清。以200μl冰預(yù)冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0)重懸沉淀，加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，顛倒數(shù)次混勻，加入200μl用冰預(yù)冷的溶液III(3mol KAc，5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4℃12000r/min離心10min，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次；加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，置-20℃30min，4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌抽干。以20μl含終濃度20μg/ml RNA酶(無DNA酶)的TE(10mmol/L Tris·HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0，下同)溶解沉淀，并于37℃水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-20℃保存。
3.2質(zhì)粒的大量制備與純化將含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌接種于100ml LB培養(yǎng)液中，37℃250r/min振搖培養(yǎng)16~18h；冰浴10min，4℃ 4000r/min離心10min，棄上清，沉淀用20ml預(yù)冷的特殊TE(STE，10mmol/L Tris·Cl，pH8.0；50mmol/L EDTA，pH8.0)洗滌一次，4000r/min離心10min，棄上清；用4ml預(yù)冷的溶液I重懸沉淀，加8ml新配的溶液II充分混勻，冰浴10min后，加6ml預(yù)冷的溶液III中止反應(yīng)，冰浴10min，4℃7000r/min離心15min，取上清加0.6~0.7倍體積的異丙醇，37℃作用30min；4℃，7000r/min離心15min，棄上清，以適量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加等體積的氯化鋰(5mol/L)充分混勻，8000r/min離心10min；取上清，加2倍體積100％冷乙醇，-20℃30min，4℃12000r/min離心10min；棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干。以適量TE(pH8.0)溶解沉淀，加無DNA酶的RNA酶(10mg/ml)至終濃度20μg/ml，37℃水浴30min；加等體積13％聚乙二醇溶液(PEG8000，2.5mol/L NaCl)，4℃靜置過夜；4℃12000r/min離心10min，棄上清；加400μlTE(pH8.0)溶解沉淀，用等體積酚、酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)、氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次，加0.1倍體積3MNaAC(pH5.2)，2倍體積100％冷乙醇，混勻后-20℃30min以上，4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干，溶于適量TE(pH8.0)中，-20℃保存。
3.3質(zhì)粒DNA的定量以TE(pH8.0)為空白對(duì)照，用TZK-800Z型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定波長260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。OD260＝1相當(dāng)于含質(zhì)粒大約50μg/ml，雙鏈DNA純品的OD260/OD280值為1.8，如樣品OD260/OD280值明顯低于1.8，則可能有蛋白質(zhì)或酚污染，需進(jìn)一步純化。
4.瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/LEDTA)配0.8-1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱至瓊脂糖完全溶解后，加溴化乙啶(EB)(10mg/ml)至終濃度0.5μg/ml；混勻倒入封固好的膠模中，插入相應(yīng)的梳子，梳子距底板1.0mm左右，待凝膠完全凝固，小心移去梳子，將凝膠放入裝有0.5×TBE電泳緩沖液的電泳槽中，取適量DNA樣品在封口膜上與適量體積加樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)、0.25％二甲苯青FF、40％蔗糖)混勻，用微量加樣器將樣品加到梳孔中，以5v/cm的電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至適當(dāng)位置，在長波紫外燈下觀察結(jié)果和拍照。
5.DNA操作5.1限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)單酶切反應(yīng)將1.0μg質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18μl，加入2-3單位限制性內(nèi)切酶及1μl相應(yīng)的10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置最適反應(yīng)溫度水浴2~3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。對(duì)大量質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)，相應(yīng)擴(kuò)大限制性內(nèi)切酶用量和反應(yīng)體積，取少量反應(yīng)液電泳檢查，完全酶切后，-20℃保存，以備進(jìn)一步鑒定或回收片段之用。
雙酶切反應(yīng)選擇反應(yīng)活性等于或接近100％的同一緩沖系統(tǒng)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，若溫度或緩沖系統(tǒng)不同，則按先低溫后高溫，先低鹽后高鹽的順序進(jìn)行；或第一酶切完成后，酚/仿抽提，乙醇沉淀后，再進(jìn)行第二酶切反應(yīng)。
5.2 DNA片段的3’凹端補(bǔ)平在10μl反應(yīng)體系中，加入1μl 1mmol/L dNTP和1單位大腸桿菌聚合酶I(klenow)，室溫反應(yīng)15~30min后，75℃水浴滅活10min。
5.3線性質(zhì)粒DNA末端去磷酸化在50μl反應(yīng)體積中，分別加入完全消化的質(zhì)粒DNA約2μg，5μl 10×CIP緩沖液和2Weiss單位CIP，補(bǔ)水至20μl，混勻后置37℃水浴30min，補(bǔ)加1Weiss單位CIP，1μl CIP緩沖液，8μl水，55℃水浴45min后，加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至終濃度5mmol/L，中止反應(yīng)；75℃水浴滅活10min。反應(yīng)液降至室溫后，用等量酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，以10μl TE(pH8.0)溶解后，置-20℃保存。
5.4 DNA片段的回收將酶切完全的含目的DNA片段的溶液與上樣緩沖液混合，加入適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠板中電泳至目的DNA片段完全分離，根據(jù)DNA片段大小選擇下述方法回收DNA片段。
凍融法將含目的DNA片段的凝膠條置于微量離心管中，用玻棒搗碎，補(bǔ)加去離子水至50μl，加等量飽和酚振蕩混勻，置液氮罐氣相中10min，4℃12000r/min離心10min，回收上清。
低熔點(diǎn)瓊脂糖法(Low melting point agarose，LMPA) 將目的DNA條帶前沿切一溝，加入融化的LMPA，等其凝固后，繼續(xù)電泳至目的DNA完全進(jìn)入LMPA(用手提式長波紫外燈觀察)，切下目的DNA條帶，加適量TE，與含目的DNA的LMPA于65℃共溫育使之融化。溶液冷卻至室溫后，加等量酚混合均勻，12000r/min離心10min，回收上清。
DEAE-81膜回收法膜的活化(1)10mmol/L EDTA(pH8.0)浸泡膜5min；(2)0.5mol/LNaOH浸泡膜5min；(3)滅菌雙蒸水洗滌6次，于滅菌水中，4℃保存。
DNA的回收當(dāng)目的DNA泳至適當(dāng)位置，將其前后瓊脂糖上各切一口，插入適當(dāng)大小、處理過的DEAE-81膜，繼續(xù)電泳，用長波紫外燈觀察到目的DNA全部吸附于膜上，拆膜。用低鹽緩沖液(LSBF，50mmol/L Tris·Cl，pH8.0；0.15mol/L NaCl；10mmol/L EDTA，pH8.0)漂洗膜二次，并移膜至一Eppendorf管中，加入高鹽緩沖液(HSBF，50mmol/L Tris·Cl，pH8.0；1mol/L NaCl；10mmol/L EDTA，pH8.0)充分混勻后，65℃溫育30min；移上清液于另一Eppendorf管中，再往膜上加適量HSBF，65℃溫育15min，檢查膜上無DNA存留后，棄膜。合并二次HSBF，用酚、氯仿抽提，乙醇沉淀目的DNA，回收物溶于適量TE(pH7.6)，-20℃保存。
5.5外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)粘端連接取0.5μg回收的載體DNA，加3~5倍摩爾量的外源DNA片段，2μl 5×連接緩沖液加水定容至10ul，最后加入1 Weiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16℃連接1~4h，取7μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。
平端連接取0.1μg平末端去磷后的載體DNA，加5~8倍量的平端目的DNA片段，3ul 5×連接緩沖液，加水定容至15μl混勻后，加入1 Weiss單位T4DNA連接酶，混勻離心，14℃連接20~24h。取8μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。
5.6重組子的酶切篩選和鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，37℃培養(yǎng)過夜。取單菌落接種于2ml AmpLB培養(yǎng)液中，小量制備質(zhì)粒DNA。選擇1~2種合適的限制性內(nèi)切酶單獨(dú)或組合消化，瓊脂糖凝膠電泳分析。挑選酶切結(jié)果與預(yù)計(jì)相同者進(jìn)一步用2種以上的內(nèi)切酶消化，所有酶切結(jié)果均與預(yù)計(jì)完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。
6.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建6.1攜帶目的基因FMDV P1重組雞痘病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Spe I酶切pGEMT-P1質(zhì)粒后，回收FMDV的P1基因片段，應(yīng)用Klenow大片段補(bǔ)平成為鈍性末端，同時(shí)用Sma I單酶切pUTA-2質(zhì)粒，再用CIAP進(jìn)行DNA片段末端去磷酸化處理后，回收線性化載體片段。將二者進(jìn)行鈍性末端連接，構(gòu)建含有P1基因的重組雞痘病毒載體質(zhì)粒。
6.2攜帶目的基因FMDV P1和3C重組雞痘病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Hind III和Sal I雙酶切pUTA-LacZ質(zhì)粒后回收載體片段，再將pKS-3C質(zhì)粒用Hind III和Sal I進(jìn)行雙酶切后回收載體片段。將二者進(jìn)行粘性末端連接獲得pUTAL-3C中間質(zhì)粒。用Sma I單酶切pUTAL-3C中間質(zhì)粒、末端去磷酸化后回收載體片段；用Spe I酶切pGEM-T-P1質(zhì)粒、粘性末端用Klenow大片段補(bǔ)平。將二者進(jìn)行連接，獲得攜帶有FMDV P1基因和蛋白酶3C基因的重組雞痘病毒載體質(zhì)粒pUTAL-3C-P1。
7.同源重組及重組病毒的篩選、純化7.1 FPV毒價(jià)測(cè)定用于同源重組的FPV經(jīng)細(xì)胞傳代復(fù)壯，計(jì)算空斑形成單位(PFU)，并用HE染色，鑒定病毒。將FPV按102~106稀釋倍數(shù)接種于傳代生長的6×30mm培養(yǎng)板(雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)單層，補(bǔ)加含1％甲基纖維素和1％小牛血清(FCS)的MEM作為維持液，37℃，5％CO2培養(yǎng)120h后，棄培養(yǎng)液，PBS(pH7.2)洗2次，室溫下1％甲醛固定15min，自來水洗滌，0.1％結(jié)晶紫染色5min，自來水洗滌，統(tǒng)計(jì)病毒空斑數(shù)計(jì)算出每毫升病毒液中所含的空斑形成單位(Plaque forming units，PFU)。
PFU＝(病毒空斑數(shù)×稀釋倍數(shù))/染毒體積(ml)7.2體內(nèi)同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用脂質(zhì)體法于6×30mm培養(yǎng)板中接種傳代的CEF 1×105~3×105個(gè)/ml，當(dāng)細(xì)胞長至80％融合時(shí)，感染0.1MOI(Multiplicity of infection)的FPV，37℃，5％CO2吸附2h后，與在室溫下作用15~30min的轉(zhuǎn)染試劑DOTAP和重組質(zhì)粒的混合物共轉(zhuǎn)染。即在500μl基本維持液(MEM)中，加入15μl DOTAP脂質(zhì)體(Liposomal)，輕輕混勻，另取500μl MEM加入重組質(zhì)粒DNA 10μg混勻。然后將后者滴加于前一液體中輕輕混勻，溫室下作用15~30min。轉(zhuǎn)染后12~18h，更換新鮮配制的含2％FCS的MEM，繼續(xù)培養(yǎng)48~72h，收獲病毒。測(cè)重組病毒的毒價(jià)。
7.3重組病毒的篩選和純化在6×30mm培養(yǎng)板制備CEF單層，在接毒前24小時(shí)用含40μg/mlBudr的MEM營養(yǎng)液培養(yǎng)，然后按10MOI接種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后收獲的病毒，5％CO2吸附2h后，再用含40μg/ml BUdR的MEM營養(yǎng)液培養(yǎng)120h，收獲細(xì)胞。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，然后將收獲細(xì)胞反復(fù)凍融三次，在無BUdR的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，分別挑出單個(gè)病毒蝕斑，純化3次后，分別進(jìn)行擴(kuò)毒。用無BudR的MEM營養(yǎng)液培養(yǎng)，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后挑出單個(gè)病毒蝕斑，并分別擴(kuò)增重組雞痘病毒。
8.重組病毒的PCR鑒定取20μl細(xì)胞培養(yǎng)物(凍融3次)加入到25μl蛋白酶K溶液(0.25％SDS，5mM EDTA，10mM Tris-HCl pH8.0)中，56℃反應(yīng)2h，置95℃作用10min滅活蛋白酶K。加入1×PCR緩沖液使總體積為450μl，PCR時(shí)取5～25μl即可。PCR反應(yīng)條件為97℃預(yù)變性5min后，按94℃變性60s，50℃退火60s，72℃延伸1min共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。
9.重組病毒表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)9.1間接免疫熒光鑒定重組病毒取適量初步篩選并純化的重組病毒，接種于載玻片上CEF單層細(xì)胞，同時(shí)設(shè)FPV和細(xì)胞對(duì)照。37℃，5％CO2感作2h，加入含1％FCS及0.5g甲基纖維素的MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，取出飛片，PBS(pH7.2)洗一次，100％丙酮固定10~15min，PBS沖洗。在用3％牛血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)溶液封閉2h后，與豬O型FMDV陽性血清(1∶300)反應(yīng)2h，PBS洗滌3次，然后與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG反應(yīng)2h，PBS洗滌3~5次，載玻片上加一滴甘油緩沖液(50％甘油PBS)，將載有細(xì)胞的飛片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察和拍照。
9.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將擴(kuò)增后的純化重組病毒，以10MOI分別接種于10ml培養(yǎng)瓶1×106個(gè)/ml CEF細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)FPV對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照，至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，棄培養(yǎng)液，用1ml 37℃預(yù)熱的TEN(40mol/L Tris·ClpH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脫細(xì)胞，收集于Eppendorf管中，3000r/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗一次，加60μl裂解緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.4，1mmol/L MgCl2，0.5％NP40，20μg/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000r/min離心5min，-20凍存。
取30μl細(xì)胞裂解液與等量2×樣品緩沖液(100mmol/L Tris·Cl，pH6.8，4％SDS，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油，使用前加入2.5％β-巰基乙醇)混勻，于10％凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
9.3免疫印跡(Western blot)經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5％脫脂乳或3％牛血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)37℃封閉2h，洗滌緩沖液(10mmol/L Tris·ClpH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗滌3次，每次5~10min，豚鼠FMDV O型陽性血清用封閉緩沖液稀釋(1∶300)覆蓋膜上，室溫感作2h，洗滌3~5次，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG(1∶1000)室溫感作2h，洗滌3~5次后，每次5~10min，用10ml堿性磷酸酶緩沖液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl2，100mmol/L Tris·Cl pH9.5)加入66μl NBT(0.5g NBT，70％二甲基甲酰胺)，混勻后再加33μlBCIP(0.5gBCIP，100％二甲基甲酰胺)，顯色10~20min，用蒸餾水中止反應(yīng)。
10.重組病毒表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果篩選獲得的重組雞痘病毒vPUTA2-P1和vPUTAL-3C-P1接種雞胚成纖維細(xì)胞后，在感染細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜等處，均可觀察到特異的黃綠色熒光，說明表達(dá)產(chǎn)物是特異的；經(jīng)Western blot分析重組毒vPUTA2-P1接種的細(xì)胞培養(yǎng)物分析，出現(xiàn)了可與抗口蹄疫病毒單抗結(jié)合的大小為79kD的特異帶，證明了P1蛋白在雞胚成纖維細(xì)胞中得到了表達(dá)；重組毒vPUTAL-3C-P1接種的細(xì)胞培養(yǎng)物分析，出現(xiàn)了可與抗口蹄疫病毒多抗相結(jié)合的不同大小的特異性條帶。
11.重組病毒的免疫原性研究11.1重組病毒免疫小鼠重組病毒接種CEF單層細(xì)胞，培養(yǎng)40h，收取感染細(xì)胞。4℃3000r/min離10min，細(xì)胞沉淀(培養(yǎng)液上清待用)懸浮于10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液，于冰上超聲波破碎4×15秒，將此懸液4℃3000r/min離心10min，取上清測(cè)定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴度使其達(dá)到107PFU。
BALB/c雌性小鼠84只，體重18～20g，隨機(jī)分7組，采取足墊皮下注射方式，分別注射重組雞痘病毒vPUTA2-P1、vPUTAL-3C-P1和不含任何外源基因的FPV野生毒各0.5ml。上述各組均免疫三次，間隔20天，最后一次免疫后的第7天摘眼球取血，頸椎脫臼處死，凝血分離血清供ELISA檢測(cè)抗HIV抗原的IgG抗體。無菌取其脾臟分別檢測(cè)細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性和用流式細(xì)胞儀分析T淋巴細(xì)胞亞類的數(shù)量。
11.2脾臟免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)
11.2.1脾臟單淋巴細(xì)胞懸液制備頸椎脫臼處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI 1640培養(yǎng)基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龍網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，1500r/min，離心5min，棄上清。用Hanks液離心洗細(xì)胞兩次，重懸于含10％NBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，調(diào)至2×107個(gè)/ml備用。
11.2.2脾T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測(cè)取脾細(xì)胞懸液0.1ml，加5ml PBS，1500r/min，離心10min，洗細(xì)胞兩次，在0.5ml PBS細(xì)胞懸浮液中分別加熒光標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4+和CD8+單克隆抗體(此抗體用PBS按1∶10稀釋)室溫避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min離心10min，將管底細(xì)胞用200μl PBS懸浮，待上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。FACS檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
11.2.3脾細(xì)胞特異性CTL細(xì)胞毒活性檢測(cè)采用脂質(zhì)體法將純化的真核表達(dá)質(zhì)粒pdisplay-GE，在Lipofectin Reagent包裹后轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)呈60％~80％單層的P815細(xì)胞，在G418加壓下，轉(zhuǎn)染細(xì)胞長成單層。單層細(xì)胞傳代后，處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，加入740KBq/20μl的3H-TdR，混勻后于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)4~6h，每1/2h振蕩一次。標(biāo)記后用Hanks液充分洗去未標(biāo)記上的游離的3H-TdR，用NBS-1640培養(yǎng)液調(diào)成2×105個(gè)/ml，作為靶細(xì)胞備用。將脾細(xì)胞懸液調(diào)成5×106個(gè)/ml，作為效應(yīng)細(xì)胞備用。96孔板加入效應(yīng)細(xì)胞100μl和靶細(xì)胞50μl(三復(fù)孔)，設(shè)自發(fā)釋放孔(單純靶細(xì)胞孔)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)18h，終止培養(yǎng)前半小時(shí)加入含胰酶和DNA酶的Hanks液50μl，用多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于49型玻璃纖維濾膜上，液閃法測(cè)定3H-TdR參入量，結(jié)果以cpm值表示。
CTL殺傷活性(3H-TdR釋放率，％)＝(1-實(shí)驗(yàn)孔cpm/對(duì)照孔cpm)×100％11.3 ELISA試劑盒測(cè)定免疫小鼠血清中抗FMDV抗體ELISA試劑盒中的包被抗原為滅活的全病毒，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體。在酶聯(lián)免疫儀450nm測(cè)量各孔OD值。
12.電鏡下觀察P1形成的病毒樣粒子以10MOI的重組病毒vPUTAL-3C-P1感染CEF細(xì)胞40小時(shí)后，從培養(yǎng)瓶中刮下感染細(xì)胞，3000r/min離心15min，沉淀細(xì)胞用2.5％戊二醛固定2小時(shí)，1％鋨酸固定1小時(shí)，按常規(guī)方法脫水、包埋、切片和染色，置JEM-100EX II透射電鏡下觀察并攝影。
檢測(cè)結(jié)果獲得的兩株重組雞痘病毒vPUTA2-P1和vPUTAL-3C-P1提取基因組后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得預(yù)期大小的目的片段。間接免疫熒光試驗(yàn)和Western blot檢測(cè)均為陽性結(jié)果，說明構(gòu)建的重組雞痘病毒可分別表達(dá)口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白前體P1，其中vPUTAL-3C-P1表達(dá)的P1可以進(jìn)一步裂解并裝配成病毒樣粒子。兩株重組雞痘病毒均可在非禽屬動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，且重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。將重組雞痘病毒大量擴(kuò)增后進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn)，可在免疫小鼠血清中檢測(cè)到抗FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的抗體，表明重組病毒刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生了特異性體液免疫。免疫小鼠脾T細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測(cè)及CTL殺傷試驗(yàn)結(jié)果均顯示小鼠產(chǎn)生了特異性細(xì)胞免疫。
研究結(jié)果表明，兩株重組雞痘病毒是一種安全、有效的基因工程活載體疫苗，具有開發(fā)成為用于預(yù)防口蹄疫的疫苗的良好前景。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的重組雞痘活載體疫苗，其特征在于表達(dá)O型口蹄疫病毒中國流行株O_NY00株結(jié)構(gòu)蛋白前體P1的重組雞痘病毒vPUTA2-P1，和一株共表達(dá)O_NY00株結(jié)構(gòu)蛋白前體P1與蛋白酶3C基因的重組雞痘病毒vPUTAL-3C-P1。其中vPUTAL-3C-P1表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白前體P1可在蛋白酶3C作用下裂解產(chǎn)生成熟結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP3和VP1，并裝配成病毒樣粒子，重組病毒可作為預(yù)防口蹄疫的活載體疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的重組雞痘活載體疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于將O_NY00株結(jié)構(gòu)蛋白前體P1基因插入到雞痘病毒表達(dá)載體PUTA2復(fù)合啟動(dòng)子ATI-P7.5×20下游，同時(shí)將蛋白酶3C插入到串聯(lián)啟動(dòng)子P7.5×16下游，分別構(gòu)建了含有P1、P1/3C的重組雞痘病毒表達(dá)質(zhì)粒；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒與雞痘病毒株共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞內(nèi)，使其進(jìn)行同源重組，并用5-溴-2-脫氧尿嘧啶(Budr)進(jìn)行加壓篩選；重組病毒分別經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫蛋白印記(Western blot)和免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，篩選獲得陽性重組雞痘病毒；將篩選的陽性重組雞痘病毒分別免疫BALBc小鼠并進(jìn)行了免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。
全文摘要
一種表達(dá)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的重組雞痘活載體疫苗，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供表達(dá)口蹄疫病毒NY00株病毒結(jié)構(gòu)蛋白前體P1區(qū)基因、P1區(qū)基因與3C蛋白酶基因共表達(dá)的重組雞痘病毒。這兩種重組雞痘病毒均可刺激小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可作為預(yù)防我國FMDV感染的活載體疫苗。本發(fā)明得到的兩株重組雞痘病毒可刺激小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫。兩株重組雞痘病毒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是安全的，無任何病理現(xiàn)象出現(xiàn)，并且具有很好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)多次傳代后外源基因不丟失，且可在非禽屬動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白。本發(fā)明所使用的目的基因?yàn)橹袊餍兄?_NY00株基因，從而構(gòu)建的重組雞痘病毒可作為我國預(yù)防O型口蹄疫的活載體疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/135GK1490051SQ0213323
公開日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2002年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月18日
發(fā)明者金寧一, 張洪勇, 劉棋, 鄭敏, 金擴(kuò)世, 郭建剛, 尹革芬, 江文正, 夏志平 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所, 中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究