專利名稱：心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥中的基因制品，特別是能植入人體不斷地釋放人類心房肽，治療高血壓、心力衰竭、腎功能不全的微囊制品。
背景技術(shù)：
高血壓是一種影響人類健康的主要疾病，目前發(fā)病率呈上升趨勢，高血壓有許多并發(fā)癥腦血管疾病、心臟疾病、腎臟疾病等。因此尋找一種有效的治療藥物或技術(shù)成為當(dāng)務(wù)之急。目前高血壓主要應(yīng)用藥物治療，但這些藥物治療存在許多問題必須定時(shí)長期服藥，給患者帶來許多不便；同時(shí)由于有很強(qiáng)的副作用，使藥物的應(yīng)用時(shí)間和劑量受到很大的限制。
心房肽(ANP)是一種心臟激素，主要由心房對局部張力產(chǎn)生應(yīng)答而分泌的。ANP有許多生理功能a)降低血壓；b)增加鹽與水的排泄；c)促進(jìn)血漿中滲出的水分到組織間隙；d)抑制幾種激素如血管緊張素原II(ANG II)、內(nèi)皮素(ET)、腎素、血管加壓素的釋放和作用。ANP對血管、腎臟、腎上腺及其它器官產(chǎn)生快速而持續(xù)的作用，既降低了系統(tǒng)血壓又減少了血容量。由于ANP具有這些獨(dú)特的功能，使得其在治療高血壓、腎衰、及擴(kuò)張性心臟病方面受到高度重視。
目前已經(jīng)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)的將ANP作為治療性藥物的途徑(Heikki Ruskoaho，Atrialnatriuretic peptidesynthesis，release，and metabolism[J].PharmacologicalReviews.1992；44479-602.)，有如(1)抑制ANP的降解目前還沒有確定的實(shí)驗(yàn)表明能通過利用ANP類似物抑制ANP的降解應(yīng)用于人類的可行性。(2)ANP靜脈輸入由于心房肽較短的血漿半衰期及在胃腸內(nèi)易受消化酶影響，使心房肽不易通過口服用藥。實(shí)驗(yàn)表明，長期的輸入ANP可使心房肽血漿濃度高于生理水平并且產(chǎn)生持久的血壓降低。但是，由于ANP的半衰期短，作為一種藥物，必須持續(xù)輸入，這就失去了作為治療高血壓藥物的實(shí)用價(jià)值。并且ANP易被消化酶降解，使得ANP只能局限于靜脈給藥。通過皮下注射的方式給藥尚未觀察到利尿和利鈉的效果。(3)ANP受體類似物盡管這些類似物可以制得，但特異性的、穩(wěn)定的、不易被降解的分子形式還是很難獲得；另外要使合成的這種類似物易于從腸道吸收而不被破壞也有困難。(4)ANP基因治療高血壓目前進(jìn)行的基因治療方法是將人類ANP基因整合到RSV-LTR(Rous Sarcoma Virus 3`-Long Terminal Repeat，勞氏肉瘤病毒3’-長末端重復(fù)序列)上。Chao等人已經(jīng)利用心房肽基因的過度表達(dá)來控制高血壓病鼠的血壓(Lin KF，Chao J，Chao L.Atrialnatriuretic peptide gene del ivery attenuates hypertension cardiac hypertropy andrenal injury in salt sensive rats[J].Hum Gene Ther.1998；91429-1438.)。他們的研究主要是通過質(zhì)粒DNA或借助病毒載體直接輸入動物體內(nèi)。ANP基因治療高血壓目前還在嘗試階段，還沒有明確的方法和手段，并且對基因載體的安全性要求較高。實(shí)際應(yīng)用仍有許多困難，一個(gè)最重要的困難是靶組織的導(dǎo)入基因的較低轉(zhuǎn)染率，另一個(gè)困難是如何提高轉(zhuǎn)基因免疫耐受性、安全性及基因表達(dá)。嚴(yán)重的副作用或致死性可能伴隨著病毒介導(dǎo)的基因治療。基因治療的案例中，很少有成功的，一個(gè)主要的障礙是安全問題(Seppo Yla-Herttuala，John F Martin.Cardiovascular gene therapy[J].Lancet.2000；355213-22.)。體細(xì)胞基因治療高血壓和充血性心力衰竭的可行性在動物模型上已得到證實(shí)。直接植入轉(zhuǎn)染細(xì)胞可能是一種有效的體細(xì)胞治療方案，但也存在著許多缺點(diǎn)不能控制細(xì)胞的游走性，不能控制治療的持續(xù)性。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種治療高血壓、心力衰竭、腎功能不全等疾病，且治療安全、治療持續(xù)時(shí)間長的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊。
本發(fā)明采用將心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞包被在聚己內(nèi)酯或聚氨酯微囊中來實(shí)現(xiàn)其目的。
本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊是在聚己內(nèi)酯或聚氨酯微囊中包被人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞，上述聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊的囊體上的孔徑為5-10nm(納米)，上述人類心房肽基因編碼序列如下atg agc tcc ttc tcc acc acc acc ctg agc ttc ctc ctt tta ctg gca 48Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala-25 -20 -15 -10ttc cag ctc cta ggt cag acc aga gct aat ccc atg tac aat gcc gtg 96Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val-5 -1 1 5tcc aac gca gac ctg atg gat ttc aag aat ttg ctg gac cat ttg gaa 144Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu10 15 20gaa aag atg cct tta gaa gat gag gtc gtg ccc cca caa gtg ctc agt 192Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser25 30 35gag ccg aat gaa gaa gcg gcg gct gct ctc agc ccc ctc cct gag gtg 240Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val40 45 50 55cct ccc tgg acc ggg gaa gtc agc cca gcg cag aga gat gga ggt gcc 288Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala60 65 70ctc ggg cgg ggc ccc tgg gac tcc tct gat cga tct gcc ctc cta aaa 336Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys75 80 85agc aag ctg agg gcg ctg ctc act gcc cct cgg agc ctc cgg aga tcc 384Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser90 95 100agg tgc ttc ggg ggc agg atg gac agg att gga gcc cag agc gga ctg 432Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu105 110 115ggc tgt aac agc ttc cgg tac tga 456Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr120 125上述的永生化細(xì)胞可以是CHO細(xì)胞(倉鼠卵巢細(xì)胞)。
上述的永生化細(xì)胞也可以是COS細(xì)胞(恒河猴腎細(xì)胞)。
上述的永生化細(xì)胞還可以是EVC304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞，3T3TK成纖維細(xì)胞，人胚肺細(xì)胞等。
上述的聚己內(nèi)酯微囊是分子量為72000-90000道爾頓的聚己內(nèi)酯85％混合pluronicF68 15％采用通常技術(shù)制成的微囊。
上述的聚氨酯微囊為多嵌段聚醚型聚氨酯微囊。
本發(fā)明將人類心房肽基因編碼序列ANP cDNA(ANP的mRNA的互補(bǔ)脫氧核糖核酸)轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞包被在聚己內(nèi)酯(PCL)或聚氨酯(PU)微囊內(nèi)，然后將聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯的微囊植入動物體內(nèi)。使用共聚焦激光掃描顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，特異性放射免疫法檢測證明ANP cDNA轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞能夠存活在聚己內(nèi)酯或聚氨酯的微囊內(nèi)至少六個(gè)月并且能夠持續(xù)地向培養(yǎng)基中分泌ANP。ANP cDNA轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞包被在聚己內(nèi)酯或聚氨酯的微囊內(nèi)8天后，轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞繁殖和死亡達(dá)到均衡，同時(shí)也說明ANP cDNA轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞適合聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊內(nèi)環(huán)境。
本發(fā)明中的聚己內(nèi)酯微囊的降解產(chǎn)物(H2O，CO2)易于消除，聚己內(nèi)酯由于其具有親水性、體外穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、緩慢降解性(3個(gè)月到3年)、無毒性，被大量應(yīng)用于臨床。在所有的生物降解聚酯材料中，聚己內(nèi)酯的藥物通透性最好。聚己內(nèi)酯的微囊由于其具有生物相容性而被應(yīng)用于細(xì)胞的載體，且具有的親水性適于細(xì)胞附著(DominicWalsh，Tsutomu Furuzono，Junzo T anak.Preparation of porous composite implantmaterials by in situ polymerization of porous apatite containing caprolactoneor methyl methacrylate[J].Biomaterials.2001；221205-1212.)。本發(fā)明中的聚氨酯微囊為非生物降解醫(yī)用高分子材料，植入體內(nèi)可長期存在。現(xiàn)已廣泛的用于人工血管，藥物釋放體系。聚氨酯由于具有生物相容性、血液相容性、耐生物老化和物理機(jī)械性能，而適于作植入體內(nèi)的細(xì)胞載體。本發(fā)明的多嵌段聚醚型聚氨酯(SPEU)微囊還具有血液相容性和良好生物力學(xué)性能。
由于血壓存在晝夜節(jié)律的變化，因此，治療時(shí)應(yīng)考慮以適應(yīng)人體的血壓晝夜節(jié)律變化的同步性。為此，可以采用melatonin浸泡本心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，使微囊中的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的行為同步化，改變其時(shí)間生物學(xué)特征。
本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊的制作步驟如下1、微囊的制備采用通常方法制備聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊。微囊的形狀和大小按治療要求確定。
2、人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞的制備人類心房肽基因編碼序列即人ANP cDNA(CANP)編碼全部序列(核苷酸1到456)從人心房的mRNA通過RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增得到。然后，采用已有方法進(jìn)行永生化細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染。
3、用注射器將轉(zhuǎn)染細(xì)胞注入聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊中，封閉開口，放入培養(yǎng)基中生長。
4、用melatonin浸泡本心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊適當(dāng)時(shí)間，使其中的心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞的行為同步化，改變其時(shí)間生物學(xué)特征。以適應(yīng)人體的血壓晝夜節(jié)律變化的同步性。
從而制成本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊。
經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)、放免法檢測ANP、共聚焦激光掃描顯微鏡檢測和動物實(shí)驗(yàn)，證明本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊能夠分泌生物活性ANP，應(yīng)用于治療高血壓等疾病。
使用本發(fā)明時(shí)，將本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊植入機(jī)體，使其不斷的釋放心房肽，治療疾病。
本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有如下的明顯優(yōu)點(diǎn)和顯著效果。
一、本發(fā)明將人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞，用聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊包被，使人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染的永生化細(xì)胞在微囊中表達(dá)產(chǎn)生心房肽，植入體內(nèi)后能有效的治療疾病。用本發(fā)明治療疾病，能克服已有的ANP基因治療疾病的困難，避免基因治療所帶來的免疫耐受和安全問題，同時(shí)彌補(bǔ)單純藥物治療的應(yīng)用時(shí)間和劑量的限制。
二、本發(fā)明中的聚己內(nèi)酯微囊和聚氨酯微囊的囊體上的孔徑為5-10nm，可通過分子量≤150000道爾頓的多肽或蛋白質(zhì)，使人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞在微囊中表達(dá)產(chǎn)生的心房肽能通過微囊上的微孔釋放到微囊外，而人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞由于直徑大而不能通過微囊上的微孔釋放出來，并且免疫球蛋白也不能由微囊外進(jìn)入微囊內(nèi)。人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞在微囊中可長期生存，在微囊中表達(dá)產(chǎn)生心房肽。聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊在植入體內(nèi)后，在使用期內(nèi)不會降解，并且可從體內(nèi)去除。
本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊適用于植入人體，能長時(shí)間不斷地釋放心房肽，治療高血壓、心力衰竭、腎功能不全等疾病。
下面，再用實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明的一種心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，在聚己內(nèi)酯或聚氨酯微囊中包被人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞。
本實(shí)施例的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊的制作步驟如下1、微囊的制備1)聚己內(nèi)酯微囊的制備優(yōu)選分子量72000-90000道爾頓的聚己內(nèi)酯(PCL)85％混合pluronic F68 15％，其中pluronic F68(普朗尼克F68)是一種表面活性劑，本發(fā)明作為成孔劑使用。采用通常的工藝制成長3厘米左右、直徑1厘米左右的中空形的微囊，囊體上的孔徑為5-10nm。為充填細(xì)胞的需要，在囊體的適當(dāng)部位制有1個(gè)或2個(gè)小的開口。微囊的形狀、長度、直徑均根據(jù)治療需要確定，沒有嚴(yán)格的限制。在包被前，經(jīng)Co-60(鈷-60)γ射線滅菌60min后備用。
2)聚氨酯微囊的制備優(yōu)選具有血液相容性和力學(xué)性能的多嵌段聚醚型聚氨酯(SPEU)為原料，水溶性物質(zhì)聚乙二醇(分子量4000-6000)為成孔劑，采用通常的工藝制成。聚氨酯微囊的囊體上的孔徑、形狀、長度、直徑、滅菌處理均與聚己內(nèi)酯微囊相同。
2、人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞的制備1)RSV-cANP質(zhì)粒DNA的構(gòu)建ANP cDNA(ANP的mRNA的互補(bǔ)脫氧核糖核酸)(456bp)的表達(dá)受控于勞氏肉瘤病毒長未端重復(fù)序列(RSV-LTR)，并且有一simian(類人猿)病毒40(SV40)Poly A(多聚腺苷酸)信號。人ANP cDNA(CANP)編碼全部序列(核苷酸1到456)從人心房的mRNA通過RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增得到。引物為人ANP cDNA(456bp)的1-20(5’-ATGAGCTCCTTCTCCACCAC-3’)，反義引物為末端的456-437(5，-TCAGTACCGGAAGCTGTTAC-3 ’)，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PCRII vector(PCR II載體，購自invitrogen公司)。為了質(zhì)粒RSV-cANP構(gòu)建，人ANP cDNA(CANP)用XhoI，HindIII限制性內(nèi)切酶消化從PCRII vector釋放出來，克隆入質(zhì)粒PREP8的XhoI，HindIII位點(diǎn)，表達(dá)載體PREP8包括ori P和EBNA-1基因，控制其靈長類和犬科細(xì)胞的染色體外復(fù)制。(參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版第一章、第五～七章、第十四章、第十六章，科學(xué)出版社；《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二版第三章、第四章、第七章、第十三章、第十六章、第十七章，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社)。
2)細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染本實(shí)施例采用的永生化細(xì)胞選用CHO細(xì)胞，將商品化的CHO細(xì)胞珠，在培養(yǎng)基(CHO-S-SFM培養(yǎng)基購自GIBCO/BRL公司，按說明配制)中，37℃，5％CO2條件下生長，細(xì)胞每周傳代2次。轉(zhuǎn)染前，CHO細(xì)胞在100mm培養(yǎng)板上生長到密度70-80％。轉(zhuǎn)染時(shí)，將3ug質(zhì)粒RSV-cANP，30ul-Liposome(脂質(zhì)體)和300ul培養(yǎng)基順次加到聚苯乙稀管內(nèi)，在室溫下放置25min。然后將其直接加入到去除培養(yǎng)液的培養(yǎng)板上，在37℃，5％CO2條件下放置4hr后，倒掉上述液體，加入培養(yǎng)基在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48hr。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用G418篩選6-10days(培養(yǎng)基中G418濃度600ug/ml)。從培養(yǎng)板中選出10個(gè)克隆分別放入10個(gè)培養(yǎng)基中生長。(參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版第一章、第五～七章、第十四章、第十六章，科學(xué)出版社；《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二版第三章、第四章、第七章、第十三章、第十六章、第十七章，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社；《體外培養(yǎng)的原理和技術(shù)》第一版，科學(xué)出版社)3)通過免疫細(xì)胞化學(xué)和放免法檢測ANP確定RSV-cANP質(zhì)粒DNA通過Liposome轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞成功。
(1)免疫細(xì)胞化學(xué)將轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和對照組細(xì)胞分別在培養(yǎng)板上生長至單層后用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗3次，然后用丙酮在37℃浸泡固定4分鐘；洗滌后與羊抗人ANP Ab(1∶20)，37℃反應(yīng)2hr；PBS洗3次，再與兔抗羊IgG/Fab結(jié)合HRP(辣根過氧化物酶)(1∶200)反應(yīng)15min；PBS洗3次，與DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色劑反應(yīng)顯色。通過此免疫細(xì)胞化學(xué)方法來證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的成功。其結(jié)果為陽性，在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞質(zhì)中有棕色的顆粒形成，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染的成功。(hANP RIA kit，兔抗山羊IgG/Fab’HRP標(biāo)記，F(xiàn)ITC-兔抗山羊IgG，DAB購自北京中山生物技術(shù)公司。)(2)放免法檢測ANP從轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中分泌到培養(yǎng)基(n＝10)內(nèi)的ANP濃度用特異性放射免疫法檢測。通過此放免法檢測ANP，證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的成功。
3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的微囊包被將轉(zhuǎn)染細(xì)胞計(jì)數(shù)采用通常方法制成密度為3×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，用注射器將200μl的細(xì)胞懸液注入上述制備好的聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯的微囊中，微囊的開口用溫?zé)岬氖中g(shù)鉗封閉，然后將包被后的微囊放入2ml培養(yǎng)基中，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)生長。
4、在ANP從微囊中釋放的峰值位相點(diǎn)，將微囊放入melatonin(1mg/ml)處理10分鐘，然后，放入培養(yǎng)基在37℃，5％CO2下培養(yǎng)生長。改變其時(shí)間生物學(xué)特征，使心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞的行為與血壓晝夜節(jié)律變化同步。
經(jīng)上述步操制成本發(fā)明的一種心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊。
本實(shí)施例采用的永生化細(xì)胞優(yōu)選CHO細(xì)胞，但本發(fā)明不限于CHO細(xì)胞。同樣適用于其他永生化細(xì)胞，對于其他永生化細(xì)胞只須根據(jù)已有知識，選擇相應(yīng)合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。從而制成多種本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊。
然后，將本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊作如下步驟的質(zhì)量檢測
1、本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊是否釋放免疫活性ANP的檢測方法培養(yǎng)基每24hr收集并檢測1次，用通常的特異性放射免疫法檢測。
結(jié)果特異性放射免疫法檢測為陽性。見表1，在細(xì)胞被聚己內(nèi)酯微囊包被2天后，培養(yǎng)基(n＝10)內(nèi)的ANP濃度用特異性放射免疫法檢測結(jié)果ANP濃度為46.5pg/ml，包被9天后，培養(yǎng)基(n＝10)內(nèi)的ANP濃度為241.8pg/ml。
表1


結(jié)論表明本心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊的確釋放了ANP。
2、本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊釋放活性ANP的時(shí)間生物學(xué)特征檢測方法為了獲得melatonin對ANP從心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊中釋放的時(shí)間生物學(xué)特征的影響，在ANP從心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊中釋放的峰值位相點(diǎn)，將心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊放入melatonin(1mg/ml)處理10分鐘，然后，放入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基每4hr收集1次，收集24hr，用特異性放射免疫法檢測。ANP釋放的時(shí)間生物學(xué)特征分析方法如下首先，將數(shù)據(jù)排列在表格中，橫坐標(biāo)代表取樣時(shí)間，縱坐標(biāo)代表各取樣時(shí)間對應(yīng)的特異性放射免疫法檢測的濃度。其次，用簡單余弦法分析上述數(shù)據(jù)確定ANP釋放的時(shí)間生物學(xué)特征。
結(jié)果見表2，表3。
表2 放射免疫法檢測的每4hr內(nèi)從心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊中釋放ANP濃度，2組為經(jīng)melatonin處理組。1組為來經(jīng)處理組。

表3 用簡單余弦法分析上述數(shù)據(jù)確定ANP釋放的時(shí)間生物學(xué)特征參數(shù)顯示了心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊內(nèi)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞分泌的ANP水平呈晝夜節(jié)律性變化的mesor(midline estimating statistic of rhythm中值)，acrophase(頂相)，amplitude(振幅，P(概率值)。

結(jié)論本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊釋放活性ANP有時(shí)間生物學(xué)特征，而用melatonin處理可以改變微囊釋放活性ANP的時(shí)間生物學(xué)特征，使其更適應(yīng)治療需要。
3、本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊中轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長檢測方法為了檢驗(yàn)心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊是否適于轉(zhuǎn)染細(xì)胞附著生長，將心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊切開用PBS洗3次，然后用丙酮在37℃浸泡固定4分鐘；洗滌后與羊抗人ANPAb(1∶20)，37℃反應(yīng)2hr；PBS洗3次，再與兔抗羊FITC-兔抗山羊IgG反應(yīng)15min；PBS洗3次，用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞和生長情況。
結(jié)果轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞在被聚己內(nèi)酯微囊包被6個(gè)月后，共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)檢查發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞分布在聚己內(nèi)酯微囊的內(nèi)表面。
結(jié)論本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊適于轉(zhuǎn)染細(xì)胞附著生長，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在微囊中長期存在。
4、動物實(shí)驗(yàn)方法將本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊植入高血壓病的大鼠(n＝10)腹腔，每鼠植入兩個(gè)心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，然后將手術(shù)切口縫合。用血壓計(jì)檢測血壓。對照組采用將包被有未經(jīng)心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞的聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊植入高血壓大鼠(n＝10)腹腔。每隔4小時(shí)檢測血壓，呼吸，心率，體溫，尿量。實(shí)驗(yàn)持續(xù)五個(gè)月，每隔一個(gè)月將兩只鼠腹內(nèi)的聚己內(nèi)酯或聚氨酯的微囊取出，在培養(yǎng)基內(nèi)重新培養(yǎng)，檢測微囊的完整性，釋放ANP的水平。然后，將管切開，用共聚焦激光掃描顯微鏡檢測。
結(jié)果如表4，高血壓大鼠(n＝10)(植入心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊第15天)血壓，呼吸，心率，體溫，尿量(x±s)

●P＜0.05#與對照組無顯著性差異表5高血壓病大鼠植入心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊的完整性，釋放ANP的水平，心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長情況。

結(jié)論心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊植入高血壓病的大鼠腹腔，可顯著降低其血壓，增加大鼠尿量，但不影響其正常生理行為。心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊在體內(nèi)可長期保持完整、ANP釋放的水平保持平穩(wěn)、心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長良好。
結(jié)語以上實(shí)驗(yàn)說明心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊可長期在高血壓患者體內(nèi)發(fā)揮作用，不影響患者正常生理。本發(fā)明適用于治療高血壓、心力衰竭、腎功能不全等疾病。實(shí)踐應(yīng)用中可根據(jù)患者情況及臨床實(shí)際，選擇心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊的植入部位及個(gè)數(shù)，以達(dá)到最佳臨床效果。
心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊<110>四川大學(xué) 王正榮<120>心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊<160>2<210>1<211>456<212>DNA<213>人種(Homo sapiens.)<220><221>CDS<222>(1)...(456)<400>1atg agc tcc ttc tcc acc acc acc ctg agc ttc ctc ctt tta ctg gca 48Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala-25 -20 -15 -10ttc cag ctc cta ggt cag acc aga gct aat ccc atg tac aat gcc gtg 96Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val-5 -1 1 5tcc aac gca gac ctg atg gat ttc aag aat ttg ctg gac cat ttg gaa 144Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu10 15 20gaa aag atg cct tta gaa gat gag gtc gtg ccc cca caa gtg ctc agt 192Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser25 30 35gag ccg aat gaa gaa gcg gcg gct gct ctc agc ccc ctc cct gag gtg 240Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val40 45 50 55cct ccc tgg acc ggg gaa gtc agc cca gcg cag aga gat gga ggt gcc 288Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala60 65 70ctc ggg cgg ggc ccc tgg gac tcc tct gat cga tct gcc ctc cta aaa 336Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys75 80 85agc aag ctg agg gcg ctg ctc act gcc cct cgg agc ctc cgg aga tcc 384Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser90 95 100agg tgc ttc ggg ggc agg atg gac agg att gga gcc cag agc gga ctg 432Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu105 110 115ggc tgt aac agc ttc cgg tac tga 456Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr120 125<210>2<211>151<212>PRT<213>人種(Homo sapiens.)<400>2Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala-25 -20 -15 -10Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val-5 -1 1 5Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu10 15 20Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser25 30 35Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val40 45 50 55Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala60 65 70Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys75 80 85Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser90 95 100Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu105 110 115Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr120 12權(quán)利要求
1.一種心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，其特征在于在中空的聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊中包被人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞，上述聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊的囊體上的孔徑為5-10nm，上述人類心房肽基因編碼序列如下atg agc tcc ttc tcc acc acc acc ctg agc ttc ctc ctt tta ctg gca 48Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala-25 -20 -15 -10ttc cag ctc cta ggt cag acc aga gct aat ccc atg tac aat gcc gtg 96Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val-5 -1 1 5tcc aac gca gac ctg atg gat ttc aag aat ttg ctg gac cat ttg gaa 144Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu10 15 20gaa aag atg cct tta gaa gat gag gtc gtg ccc cca caa gtg ctc agt 192Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser25 30 35gag ccg aat gaa gaa gcg gcg gct gct ctc agc ccc ctc cct gag gtg 240Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val40 45 50 55cct ccc tgg acc ggg gaa gtc agc cca gcg cag aga gat gga ggt gcc 288Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala60 65 70ctc ggg cgg ggc ccc tgg gac tcc tct gat cga tct gcc ctc cta aaa 336Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys75 80 85agc aag ctg agg gcg ctg ctc act gcc cct cgg agc ctc cgg aga tcc 384Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser90 95 100agg tgc ttc ggg ggc agg atg gac agg att gga gcc cag agc gga ctg 432Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu105 110 115ggc tgt aac agc ttc cgg tac tga 456Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr120 125
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，其特征在于所說的永生化細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，其特征在于所說的永生化細(xì)胞是COS細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，其特征在于所說的永生化細(xì)胞是EVC304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、3T3TK成纖維細(xì)胞和人胚肺細(xì)胞中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，其特征在于所說的聚己內(nèi)酯微囊是分子量為72000-90000道爾頓的聚己內(nèi)酯85％混合pluronic F6815％制成的微囊。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，其特征在于所說的聚氨酯微囊為多嵌段聚醚型聚氨酯微囊。
全文摘要
本發(fā)明的心房肽基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞微囊，涉及醫(yī)藥中的基因制品。旨在解決心房肽基因治療疾病帶來的免疫耐受、安全、使用時(shí)間和劑量限制等問題。本發(fā)明的微囊在中空的聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊中包被人類心房肽基因編碼序列轉(zhuǎn)染永生化細(xì)胞，上述聚己內(nèi)酯微囊或聚氨酯微囊的囊體上的孔徑為5－10nm，人類心房肽基因編碼序列是人ANPcDNA(CANP)編碼全部序列，即核苷酸1到456。永生化細(xì)胞是CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、EVC304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、3T3TK成纖維細(xì)胞和人胚肺細(xì)胞中的一種。本發(fā)明的微囊適用于植入人體，能長時(shí)間不斷地釋放人類心房肽，治療高血壓、心力衰竭、腎功能不全等疾病。
文檔編號A61P13/00GK1472325SQ0213355
公開日2004年2月4日 申請日期2002年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月31日
發(fā)明者王正榮, 陳立國, 屈藝, 王躍锜 申請人:四川大學(xué), 王正榮