專利名稱：兼抗凝溶栓雙重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是膜聯(lián)蛋白A5(AnnexinA5)的一種突變體mAnxA5和尿激酶B鏈(UKB)的融合蛋白mA5UKB，該融合蛋白具有血栓靶向性的溶栓作用，兼具有抗凝作用。
背景技術(shù)：
血栓癥，如急性心肌梗塞(AMI)、靜脈血栓栓塞等是一類嚴重危及人類健康及生命的心血管疾病。在西方國家，因血栓引起的死亡已占人口總死亡率的首位。在我國，隨著經(jīng)濟發(fā)展和人口趨向老齡化，血栓癥患者日益增多，對抗血栓藥物的需求也越來越大。目前臨床上常用的溶栓藥物主要為纖溶酶原激活劑，如鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、單鏈尿激酶(scu-PA)、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)等，這些藥物雖然都具有較強的溶栓效果，但均存在如下問題(1)出血由于這些藥物不僅激活纖維蛋白凝塊中的纖溶酶原，同時也激活血漿中的纖溶酶原，使血漿中纖溶酶活性增高，血漿纖溶酶能水解凝血因子VII等，導(dǎo)致凝血因子減少而引起出血。(2)體內(nèi)半衰期短，故治療用量大。(3)再梗死纖溶酶系統(tǒng)被激活后可同時活化血小板，使纖維蛋白原和Von Willebrand因子聚集于血小板GpIIb/IIIa受體，從而促使血栓形成，在溶栓后短時間內(nèi)容易再次形成血栓，使治療失敗。因此，如何能夠使溶栓藥物靶向性的激活血栓中的纖溶酶原、開發(fā)新型的效力更強、溶栓專一性更好、并能有效預(yù)防再栓塞的溶栓制劑是目前抗血栓藥物研究的熱點。

發(fā)明內(nèi)容
眾所周知，血液凝固過程是一個級聯(lián)反應(yīng)首先是血小板活化，使得質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的膜磷脂如磷脂酰絲氨酸(PS)暴露在血小板外側(cè)；接下來凝血因子IX、X等在膜磷脂的表面不斷被激活；最后使凝血酶原激活為凝血酶。因此，血小板的膜磷脂在凝血過程中具有至關(guān)重要的作用，是溶栓和抗凝藥物的一種有效的作用靶點?；谶@一事實，本發(fā)明設(shè)計了一種具有靶向性溶栓和抗凝作用的融合蛋白。本融合蛋白由兩種蛋白融合而成，一為AnnexinA5的突變體mAnxA5，另一為尿激酶的B鏈UKB。
一、AnnexinA5突變體mAnxA5AnnexinA5是膜聯(lián)蛋白家族(Annexin family)中含量最豐富的一種鈣結(jié)合蛋白，在鈣離子存在的情況下，可以高親和性地同血小板活化后所暴露出的的膜磷脂結(jié)合。研究證實，每個活化血小板的表面約有20萬個AnnexinA5的結(jié)合位點，大約是抗血小板糖蛋白IIb/IIIa單克隆抗體結(jié)合位點的10倍(Shattil SJ.et al.，1985，J Biol Chem，26011107)。動物實驗也表明，同位素標記的AnnexinA5靜脈注射后主要聚集于主動脈血栓部位(TaitJF，et al.1994，Thromb Res.，75491)。因此，AnnexinA5可以作為一種“生物導(dǎo)彈”研制動脈血栓的靶向溶栓藥物。但有一個問題不容忽視AnnexinA5的分子量為34kDa，所以和溶栓藥物融合后分子量往往太大(一般為90kDa左右)，這樣不僅不利于融合蛋白的表達，也導(dǎo)致了其半衰期的縮短，因而溶栓效率降低。針對這種情況，本發(fā)明根據(jù)AnnexinA5具有四個同源結(jié)構(gòu)域的特點對AnnexinA5進行了基因改造，得到了一個僅包含第一、第二結(jié)構(gòu)域的序列缺失突變體mAnxA5，其分子量僅為原來的一半，但保留了AnnexinA5的血栓靶向功能和抗凝血功能。
除了序列缺失突變外，mAnxA5還含有一個點突變，亦即將第二結(jié)構(gòu)域中的纈氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(V-G-D)序列改造成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D)序列，以增強mAnxA5的抗凝血作用。其理論依據(jù)為在凝血過程中，血小板通過其膜整合素受體GP IIb/IIIa與纖維蛋白和Von Willebrand factor(vWF)等粘附分子中的“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D)”序列結(jié)合，可介導(dǎo)血小板的粘附和聚集。實驗證明含有R-G-D序列的天然和人工短肽能夠顯著抑制血小板的聚集反應(yīng)，具有抗凝血的功能(Collen D et al.，Thromb Haemost，1994，7195)。因此，mAnxA5不僅具有血栓靶向性，還有很強的抗凝血活性，且分子量僅為AnnexinA5的一半，所以非常適合于作為溶栓藥物的載體。
二、尿激酶B鏈(UKB)Scu-PA是目前臨床上常用的一種溶栓藥物，具有較強的溶栓活性和一定的纖維蛋白特異性。尿激酶B鏈(UKB)是單鏈尿激酶纖溶酶原激活劑(Scu-PA)的衍生物，由Scu-PA的第159～411位氨基酸殘基組成。Kenji等(Kenji et al.，Biochemistry，1996，35924)的研究表明，UKB具有和Scu-PA相似的溶栓活性。由于其分子量僅為30kDa，因而是目前構(gòu)建嵌合體溶栓劑常用的分子。
本發(fā)明利用mAnxA5的血栓靶向性和抗凝活性，利用尿激酶B鏈(UKB)的溶栓功能，制備成一種兼有抗凝、溶栓雙重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB。由于該蛋白還具有血栓靶向的特性，所以溶栓效率優(yōu)于一般的溶栓劑。
本發(fā)明融合蛋白mA5UKB是通過基因工程的方法制備的，具體制備過程為一、構(gòu)建融合基因mA5UKB1、基因突變體mAnxA5的構(gòu)建mAnxA5基因是以AnnexinA5基因(GenBank No.M18366)為基礎(chǔ)，通過定點突變和PCR等方法得到。整個構(gòu)建過程分兩步第一步進行點突變，將AnnexinA5基因第二結(jié)構(gòu)域中“V-G-D”序列突變?yōu)椤癛-G-D”序列將纈氨酸(V)突變?yōu)榫彼?R)采用重疊區(qū)基因擴增法，共需合成四條引物，分別為 其中P1與AnnexinA5基因的5’端相一致，并引入Nco I酶切位點CCATGG。
P2含有精氨酸密碼子的互補核苷酸序列ACG。
以含有AnnexinA5基因的質(zhì)粒pUC119-AnxA5為模板，P1，P2為引物擴增，得到的序列稱為P1P2。
P3含有精氨酸密碼子序列CGT。
P4同AnnexinA5的3’末端互補。以含有AnnexinA5基因的質(zhì)粒pUC119-AnxA5為模板，P3，P4為引物擴增，得到的序列稱為P3P4。
引物P2，P3具有一段互補的序列(引物中有陰影的部分)，所以P1P2和P3P4的序列中也存在這一互補序列。將P1P2和P3P4變性后退火，可以在這段互補區(qū)形成雙鏈。提供PCR反應(yīng)條件，P1P2和P3P4可以互為引物進行擴增，擴增后的產(chǎn)物為P1P4。通過這種方法，將AnnexinA5第二結(jié)構(gòu)域中“V-G-D”序列突變?yōu)椤癛-G-D”序列。
第二步PCR擴增P1P4序列中的第一、二結(jié)構(gòu)域，得到突變體基因mAnxA5以P1P4為模板，以P1，P5為引物進行PCR擴增，得到的產(chǎn)物即為本發(fā)明的突變體基因mAnxA5基因，其核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別見表1和表2。
P15’GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG 3’P55’ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAGA 3’P1與第一步所用的P1相同，P5與編碼AnnexinA5第154-157位氨基酸殘基的核苷酸序列互補。
2、尿激酶B鏈(UKB)基因的獲得人工合成人尿激酶原基因(GenBank No.M15476)中編碼第159-411氨基酸序列的核苷酸序列，該基因序列即稱為UKB基因，其核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別見表3和表4。
3、融合基因mA5UKB基因的構(gòu)建PCR擴增UKB的基因序列，所用的引物為P65’GGATCCGGTGGCGGTCCATCACCGCCTAGGCC 3’P75’GCGTCGACTTAGAGGGCCAGGCCATTCTC 3’PCR擴增mAnxA5的序列，所用的引物為P15’GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG 3’P55’ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAG 3’因為引物P6和P5有一段序列互補，所以利用上述方法得到的mAnxA5和UKB在變性后退火，可形成互補的雙鏈。提供PCR條件，可以得到mAnxA5和UKB的融合基因mA5UKB，并在其兩端分別引入NcoI和SalI酶切位點。為使兩個基因連接后所編碼的融合蛋白能夠各自保持正確的空間結(jié)構(gòu)，本發(fā)明以甘氨酸和絲氨酸為主的G-S-G-G-S-G-S作為連接肽(斜線部分)，最終得到的融合基因命名為mA5UKB基因，其核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別見表5和表6。
二、構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28a-mA5UKB和工程菌BL21(mA5UKB)將融合基因mA5UKB利用NcoI和Sal I雙酶切，插入經(jīng)相應(yīng)雙酶切的原核表達質(zhì)粒pET28a，所得到的重組質(zhì)粒為pET28a-mA5UKB。將質(zhì)粒pET28a-mA5UKB轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌BL21(DE3)，通過卡那抗性篩選陽性重組子。含有質(zhì)粒pET28a-mA5UKB的大腸桿菌BL21(DE3)即為工程菌BL21(mA5UKB)。
三、融合蛋白mA5UKB的制備
1、培養(yǎng)菌體，誘導(dǎo)融合蛋白表達挑取少量工程菌BL21(mA5UKB)于LB培養(yǎng)基(含卡那100μg/ml)中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，然后按照1％的接種量轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基(含卡那100μg/ml)中，37℃振蕩培養(yǎng)3小時至A600＝0.5-0.6，加IPTG至終濃度為0.5mmol/L，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時。
2、制備包含體離心收集菌體，按照每克濕菌加3ml裂解緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1mmol/L)的比例加入裂解緩沖液，懸浮沉淀。冰浴超聲以破碎菌體，離心收集沉淀。
加入洗滌液(0.5％Triton X-100，10mmol/L EDTA，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)懸浮離心洗滌3次，可得初步純化的包含體。
3、溶解包含體包含體溶解在變性液中(8M尿素，0.5M NH4Cl，50mmol/L Tris-HCl，pH8.5，100mmol/Lβ-巰基乙醇)，室溫保溫4小時，然后12,000g離心10分鐘，取上清液，得到粗蛋白溶液。
4、分子篩純化上述獲得的上清液在變性狀態(tài)下通過Sephacryl S-200分子篩，平衡和洗脫液為(5M尿素，0.5M NH4Cl，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mmol/L EDTA，10mmol/Lβ-巰基乙醇)，收集洗脫峰樣品液，得到初步純化的蛋白。加入β-巰基乙醇至終濃度為100mmol/L。
5、稀釋復(fù)性上述樣品液對5M尿素，0.5M NH4Cl，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mmol/LEDTA，10mmol/Lβ-巰基乙醇透析過夜。
滴入100倍體積的復(fù)性液(2.5M尿素，0.5M NH4Cl，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0)中，4℃靜置24小時。
6、離子交換進一步純化復(fù)性后的樣品液用弱陰離子交換柱DEAE-Sephoarose進行離子交換層析。收集含有融合蛋白mA5UKB的洗脫峰，利用中空超濾纖維超濾濃縮，將濃縮液加入80％硫酸銨溶液進行沉淀，置于-20℃凍存。
四、融合蛋白mA5UKB的生物活性測定本發(fā)明所提供的融合蛋白mA5UKB主要具有三種生物活性一是同尿激酶原類似的溶栓活性，該活性可以利用血纖維蛋白平板法證實，利用本發(fā)明所提供的工藝純化蛋白，比活可以達到4萬IU/mg蛋白。二是抗凝血活性?？鼓龑嶒灡砻?，融合蛋白mA5UKB和AnnexinA5類似，能夠顯著延長白陶土激活的部分凝血酶原時間(KPTT)，說明該蛋白具有較強的抗凝血活性。三是對活化血小板具有較高的親和力。膜結(jié)合特異性研究表明，mA5UKB與AnnexinA5的下降趨勢基本一致，因此說明mA5UKB對活化血小板的親和力和AnnexinA5相當。
以上實驗證實，mAnxA5同尿激酶原B鏈融合表達后，表達產(chǎn)物能保留各自的生物學(xué)活性，從而得到一種具有抗凝和溶栓雙重功能且具有血栓靶向的新型溶栓蛋白。依據(jù)同樣的思路，可以將mAnxA5作為一種血栓靶向的載體，同其他一些溶栓劑如組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、鏈激酶等構(gòu)建血栓靶向性溶栓藥物。
綜上所述，同現(xiàn)有的溶栓藥物相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、mAnxA5對活化的血小板具有較高的親和力，因而可以靶向作用于血栓部位，提高了溶栓效率，減小了用量；2、降低了對血液中纖溶酶原的激活，減小了系統(tǒng)性出血等不良反應(yīng)；3、本發(fā)明利用的溶栓劑是尿激酶B鏈，缺失了凝血酶敏感的位點，從而能夠延長融合蛋白mA5UKB的半衰期；4、mAnxA5本身具有很強的抗凝血活性，大大減小了血栓溶解后再栓塞的幾率。因此，本發(fā)明mA5UKB可用于制備血栓靶向性的溶栓藥物。
本發(fā)明采用目前表達效率最高的T7噬菌體原核表達系統(tǒng)，因而表達量遠遠高于其他表達系統(tǒng)中尿激酶的表達量，有利于規(guī)模化生產(chǎn)。


圖1 重組質(zhì)粒pET28a-mA5UKB的結(jié)構(gòu)示意圖譜圖2 mA5UKB的抗凝活性柱形3 mA5UKB對活化血小板親和力的曲線圖1mA5UKB；2AnnexinA5圖4 mA5UKB溶栓測定結(jié)果示意圖1陽性對照(尿激酶20IU)；2陰性對照(1×PBS)30.3μg蛋白mA5UKB；40.4μg mA5UKB
具體實施例方式試劑與材料本發(fā)明所用的質(zhì)粒pUC119購自invitrogen公司；原核表達質(zhì)粒pET28a和宿主菌BL21(DE3)購自Novagen公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA聚合酶均購自TaKaRa公司，dNTP購自上海博彩生物工程公司。引物的合成和核苷酸序列測序均由上?；倒就瓿伞＜兓玫膶游鲋捌涮盍蟂ephacryl S-400、DEAE購自Pharmacia公司?？鼓蚣っ竼慰寺】贵w購自華美生物工程公司。
實施例1 構(gòu)建mAnxA5突變體基因人AnnexinA5的基因序列從人胎盤組織中利用RT-PCR方法得到，為方便進一步的擴增、酶切等操作，將該基因插入質(zhì)粒pUC119，得到重組質(zhì)粒pUC119-AnxA5。(參見《分子克隆》相關(guān)章節(jié)，科學(xué)出版社，1992出版)。
1、將AnnexinA5基因中第142-144位的“V-G-D”序列突變?yōu)椤癛-G-D”序列在100μl的PCR反應(yīng)體系中，加引物P1，P2各2μl(15pmol/μl)，pUC119-AnxA5模板DNA1μl(50ng/μl)，15mM MgCl210μl，高保真pfu DNA聚合酶3個單位，10mMdNTP為5μl，10×PCR緩沖液10μl，補雙蒸水至100μl。PCR條件為第一循環(huán)94℃變性4分鐘，第二循環(huán)為94℃變性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸1分鐘。共進行30個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10分鐘，反應(yīng)后產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物，命名為P1P2。
在100μl的PCR反應(yīng)體系中，加引物P3，P4各2μl(15pmol/μl)，pUC119-AnxA5模板DNA1μl(50ng/μl)，15mM MgCl210μl，高保真pfu DNA聚合酶3個單位，10mMdNTP為5μl，10×PCR緩沖液10μl，補雙蒸水至100μl。PCR條件為第一循環(huán)94℃變性4分鐘，第二循環(huán)為94℃變性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸1分鐘。共進行30個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10分鐘，反應(yīng)后產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物，命名為P3P4。
因為引物P2和P3具有互補的一段核苷酸序列，因而退火后可以使P1P2的單鏈和P3P4的單鏈在互補區(qū)形成局部雙鏈。在100μl反應(yīng)體系中，各取5μl(500ng)回收的P1P2、P3P4產(chǎn)物混合，94℃變性5分鐘，50℃退火1分鐘。然后加入引物P1，P4各2μl(15pmol/μl)，15mM MgCl210μl，高保真pfu DNA聚合酶4個單位，10mM dNTP為5μl，10×PCR緩沖液10μl，補雙蒸水至100μl。PCR條件為第一循環(huán)94℃變性4分鐘，第二循環(huán)為94℃變性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸2分鐘。共進行30個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10分鐘，反應(yīng)后產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物，命名為P1P4。經(jīng)測序證實得到的PCR產(chǎn)物AnnexinA5第二結(jié)構(gòu)域中“V-G-D”序列密碼子突變?yōu)椤癛-G-D”序列，該基因片段成為P1P4。
2、PCR擴增得到基因突變體mAnxA5
在100μl的PCR反應(yīng)體系中，引物P1，P5各2μl(15pmol/μl)，P1P4模板DNA1μl(50ng/μl)，15mM MgCl210μl，高保真pfu DNA聚合酶3個單位，10mM dNTP為5μl，10×PCR緩沖液10μl，補雙蒸水至100μl。PCR條件為第一循環(huán)94℃變性4分鐘，第二循環(huán)為94℃變性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸1分鐘。共進行30個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10分鐘，反應(yīng)后產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序證實獲得的產(chǎn)物為mAnxA5基因突變體。
實施例2構(gòu)建融合基因mA5UKB1、PCR擴增尿激酶B鏈基因人工合成的尿激酶B鏈基因插入質(zhì)粒pUC119得到重組質(zhì)粒pUC119-UKB。100μlPCR反應(yīng)體系中，加15pmol/μl的P6，P7引物各2μl，模板質(zhì)粒DNApUC119-UKB 1μl(50ng)，10mM dNTP 5μl，10×PCR緩沖液10μl，15mM MgCl210μl。PCR條件為第一循環(huán)94℃變性4分鐘，第二循環(huán)為94℃變性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸1分鐘。共進行30個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10分鐘，反應(yīng)后產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序證實為尿激酶B鏈基因(UKB基因)。
2、構(gòu)建融合基因mA5UKB基因因為引物P5和P6具有互補的部分序列，所以退火后mAnxA5基因的單鏈可以和尿激酶B鏈基因的單鏈退火，然后互為模板向兩邊延伸，最終得到mAnxA5基因和尿激酶B鏈基因的融合基因mA5UKB基因。將PCR擴增的基因突變體mAnxA5基因和UKB基因各10μl(500ng)混合，94℃變性5分鐘，50℃退火1分鐘。100μl PCR反應(yīng)體系中，加10pmol/μl的P1，P7引物各2μl，10mM dNTP 5μl，10×PCR緩沖液10μl，15mM MgCl210μl。PCR條件為第一循環(huán)94℃變性4分鐘，第二循環(huán)為94℃變性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸2分鐘。共進行30個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10分鐘，反應(yīng)后產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序證實得到的PCR產(chǎn)物即為尿激酶B鏈基因UKB和mAnxA5的融合基因mA5UKB，并且在5’和3’端分別引入了Nco I和Sal I的酶切位點。
實施例3構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28a-mA5UKB和工程菌BL21(mA5UKB)本發(fā)明采用IPTG誘導(dǎo)型大腸桿菌表達載體pET-28a。該質(zhì)粒全長5396bp(堿基對)，含有噬菌體T7啟動子、Luc阻抑物基因LucI，質(zhì)粒復(fù)制起點(ori)和卡那抗性基因(kanr)。將實施例2獲得的融合基因mA5UKB用Nco I、Sal I雙酶切，膠回收酶切片段。與同樣用Nco I、Sal I雙酶切的載體pET28a混合(分子數(shù)5∶1)，于20ul連接體系中，加T4連接酶，14℃連接過夜，得重組質(zhì)粒pET28a-mA5UKB(圖1)。
制備感受態(tài)細胞BL21(DE3)挑取大腸桿菌BL21(DE3)單菌落，于3ml LB培養(yǎng)基(含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化鈉，pH7.0)中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。然后按照3％的接種量接種于50ml LB培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至OD600＝0.4。4℃以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘；去上清后，菌體用1～2ml冰預(yù)冷的100mM的氯化鈣溶液重懸，即得大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細胞。
轉(zhuǎn)化將上述連接混合液20ul與200ul感受態(tài)細胞混勻，冰浴30分鐘。42℃熱休克90秒，然后再于冰浴中10分鐘。取0.2ml轉(zhuǎn)化混合液涂布于含有卡那霉素100ug/ml的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12-15小時，挑取單菌落于3ml卡那抗性的LB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜。抽提質(zhì)粒，用Nco I、Sal I雙酶切能夠切出一條1260bp的條帶。該轉(zhuǎn)化子即為含有重組質(zhì)粒pET28a-mA5UKB的工程菌BL21(mA5UKB)。
實施例4融合蛋白mA5UKB的誘導(dǎo)表達挑取大腸桿菌BL21(mA5UKB)的單菌落，于3ml含卡那霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按照1％的接種量接種于500ml LB培養(yǎng)基(含卡那100μg/ml)，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2-3小時。至OD600＝0.6時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1mM。繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時。含質(zhì)粒pET28a的BL21(DE3)以同樣條件培養(yǎng)、誘導(dǎo)，菌體經(jīng)超聲處理后，取樣品上清和沉淀作SDS-PAGE及其Western Blot分析。結(jié)果表明，工程菌誘導(dǎo)后在56kDa處有一明顯的表達條帶，主要存在于超聲沉淀中，而含有pET28a質(zhì)粒的對照菌體無此條帶。說明表達蛋白為融合蛋白mA5UKB，表達量占菌體總蛋白的25％左右，主要以包含體的形式表達。
實施例5融合蛋白mA5UKB的分離純化1、超聲破菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液7700g離心10分鐘，收集菌體。
按照每克濕重菌體加3ml緩沖液的比例，用緩沖溶液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，pH8.0)懸浮菌沉淀。再加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，0℃冰浴15分鐘；超聲破菌，超聲功率100W，30秒/次，顯微鏡檢查菌體破碎情況。當菌體基本破碎后停止超聲。
2、包含體制備超聲液經(jīng)10000g離心15分鐘，棄去上清。包含體沉淀用9倍體積的洗滌液(50mM Tris-HCl，10mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Triton X-100，pH8.0)離心洗滌兩次，棄上清。
按照每克濕重包含體9ml緩沖液的比例，用12ml裂解液(8M尿素，0.5MNH4Cl，500mM Tris-HCl，pH8.5)懸浮沉淀，室溫振蕩4小時。然后7700g離心將不溶的部分除去。利用這種方法可以制備含量約70％的粗蛋白。
3、融合蛋白mA5UKB經(jīng)分子篩純化粗蛋白在變性狀態(tài)下進一步經(jīng)Sephacryl S-400凝膠層析柱純化。平衡和洗脫液均為5M尿素，0.5 NH4Cl，50mM Tris-HCl，pH8.0，0.5mM EDTA，10mM DTT。根據(jù)SDS-PAGE分析，收集峰值的蛋白樣品液，-20℃保存。
4、蛋白稀釋復(fù)性上述樣品透析12小時，透析液為10倍體積的5M尿素，0.5 NH4Cl，50mMTris-HCl，pH8.5。尿激酶原含有12對二硫鍵，因此在透析過程中應(yīng)注意去除透析液中氧氣。先將透析液超聲除氣10分鐘，然后通入N25分鐘，最后用parafilm膜將透析的三角燒瓶密封。
透析后的樣品逐滴加入100倍體積的緩沖液，含2M尿素，0.5 NH4Cl，50mMTris-HCl，0.5mM EDTA，1.25mM還原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，pH8.5。4℃輕輕攪動24小時，然后再加入0.5mM氧化型谷胱甘肽，繼續(xù)攪動24小時。最后，樣品在12倍體積的緩沖溶液10mM Tris-HCl，pH8.0中透析12小時。透析后的樣品利用超濾膜濃縮。
5、離子交換進一步純化上述樣品再用二乙胺基乙基瓊脂糖(DEAE Sepharose)弱陰離子交換柱進行離子交換層析。層析柱用50mM Tris·HCl，pH8.0平衡。洗脫鹽濃度從0～1mol/L NaCl進行等濃度梯度洗脫，流速為1ml/分鐘。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定重組蛋白洗脫的峰值，發(fā)現(xiàn)重組蛋白在鹽濃度為0.4mol/L時被洗脫下來。收集峰值洗脫液，經(jīng)10％SDS-PAGE電泳分離，考馬氏亮藍染色顯示為51kDa的單一蛋白條帶，凝膠掃描發(fā)現(xiàn)該蛋白的純度達95％。
實施例6融合蛋白mA5UKB的生物活性鑒定大腸桿菌表達的融合蛋白mA5UKB具有三種顯著的生物活性(一)溶栓活性。采用纖溶活性測定的標準方法(中國生物制品規(guī)程2000版，中國生物制品標準化委員會編，化學(xué)工業(yè)出版社，423頁)125mg瓊脂糖，加入23ml生理氯化鈉溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14ul(100IU/ml)，纖溶酶原280ul(0.5mg/ml)，要邊加邊搖勻，然后加2.2ml人纖維蛋白原(6mg/ml)，不停(應(yīng)在兩天之內(nèi)使用)。標準品用生理鹽水溶液稀釋成以下5個稀釋度(IU/ml)1000，250，62.5，15.6，3.9待檢樣品根據(jù)標示量稀釋至大約100IU/ml或1ug/ml的濃度，待用。
在形成的纖維蛋白平皿內(nèi)打孔(直徑2mm)，每孔點樣10ul，每個待檢樣品和標準品各點兩個孔，37℃濕盒(在飯盒內(nèi)加少量水以保持一定的濕度)水平放置24小時。
縱橫兩次量取溶圈直徑，以各個稀釋度的活性的對數(shù)(X)為橫坐標，以溶圈直徑的平均數(shù)(4次量取得數(shù)值)的對數(shù)為縱坐標(Y)，按生物統(tǒng)計學(xué)方法分析結(jié)果，并求得y＝a+bx中的a和b及線性回歸系數(shù)r值，根據(jù)待檢樣品的溶圈直徑可求得待檢樣品的活性。實驗證實大腸桿菌表達的融合蛋白mA5UKB具有同尿激酶相似的溶栓活性，比活約為4萬IU/mg(圖2)。
(二)抗凝活性?？鼓囼灢捎貌糠旨せ畹哪蠲冈囼?KPTT)法，取100ul的活化部分凝血活酶試劑，加入100ul的待測樣品，37℃溫育3分鐘；加入100ul的參比血漿，37℃溫育3分鐘；加入100ul CaCl2溶液，測定反應(yīng)物凝固時間。試驗表明，融合蛋白mA5UKB能夠顯著延長KPTT時間，抗凝血活性優(yōu)于AnnexinA5(圖3)。
(三)mA5UKB能特異性結(jié)合活化的血小板，所以對以活化血小板為主的主動脈血栓具有血栓靶向性。膜特異性的分析采用血小板結(jié)合試驗進行，方法如下制備分離125I標記的蛋白125I-AnnexinA5，按照文獻(Patrick J等，Thrombin stimulates theintracellular relocation of annexin V in human platelets，Biochimica etBiophysica Acta，1222135)的方法制備凝血酶活化的血小板5×107/ml，在下列反應(yīng)體系10mmol/L Na-HEPES(pH7.4)，150mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl2，2.7mmol/LKCl，2mmol/L MgCl2，1mmol/L NaH2PO4，5mmol/L glucose，5mg/ml BSA中加入不同濃度的AnnexinA5及mA5UKB，離心收集血小板及上清，分別測定其放射活性，計算結(jié)合百的AnnexinA5及mA5UKB，離心收集血小板及上清，分別測定其放射活性，計算結(jié)合百分比。膜結(jié)合特異性研究表明，mA5UKB融合蛋白對活化血小板的親和力與AnnexinA5相當(圖4)。
上述結(jié)果表明，mA5UKB融合蛋白不僅具有對以活化血小板為主要成分的主動脈血栓的靶向溶栓作用，而且兼具有抗凝功能，可用其制備新型溶栓藥物。
表1 mAnxA5基因的核苷酸序列表ATGGCACAGGTTCTCAGAGGCACTGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCTGAT 60GCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGCATCCTGACT 120CTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTG 180TTTGGCAGGGATCTTCTGGATGACCTGAAATCAGAACTAACTGGAAAATTTGAAAAATTA 240ATTGTGGCTCTGATGAAACCCTCTCGGCTTTATGATGCTTATGAACTGAAACATGCCTTG 300AAGGGAGCTGGAACAAATGAAAAAGTACTGACAGAAATTATTGCTTCAAGGACACCTGAA 360GAACTGAGAGCCATCAAACAAGTTTATGAAGAAGAATATGGCTCAAGCCTGGAAGATGAC 420GTGGTGGGGGACACTTCAGGGTACTACCAGCGGATGTTGGTGGTTCTCCTTCAG表2 mAnxA5的氨基酸序列表5 10 15 20METAlaGlnValLeuArgGlyThrValThrAspPheProGlyPheAspGluArgAlaAsp2530 35 40AlaGluThrLeuArgLysAlaMETLysGlyLeuGlyThrAspGluGluSerIleLeuThr4550 55 60LeuLeuThrSerArgSerAsnAlaGlnArgGlnGluIleSerAlaAlaPheLysThrLeu6570 75 80
8590 95 100IleValAlaLeuMETLysProSerArgLeuTyrAspAlaTyrGluLeuLysHisAlaLeu105110115120LysGlyAlaGlyThrAsnGluLysValLeuThrGluIleIleAlaSerArgThrProGlu125130135140GluLeuArgAlaIleLysGlnValTyrGluGluGluTyrGlySerSerLeuGluAspAsp145150155160ValValGlyAspThrSerGlyTyrTyrGlnArgMETLeuValValLeuLeuGln表3 UKB基因的核苷酸序列表GGCGGATCCGGTGGCGGTAAGATTATTGGGGGAGAATTTACCACCATCGAGAACCAGCCC 60TGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGC 120AGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAG 180AAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAG 240ATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCT 300CACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCA 360TCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACA 420AGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAAAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAG 480CTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTAC 540GGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTATGTGCTGCTGACCCCCAATGGAAAACAGATTCC 600TGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACT 660GGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGA 720GTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTC 780TAA表4 UKB的氨基酸序列表5 10 15 20GlyGlySerGlyGlyGlyLysIleIleGlyGlyGluPheThrThrIleGluAsnGlnPro25 30 35 40TrpPheAlaAlaIleTyrArgArgHisArgGlyGlySerValThrTyrValCysGlyGly45 50 55 60SerLeuIleSerProCysTrpValIleSerAlaThrHisCysPheIleAspTyrProLys65 70 75 80LysGluAspTyrIleValTyrLeuGlyArgSerArgLeuAsnSerAsnThrGlnGlyGlu85 90 95 100MetLysPheGluValGluAsnLeuIleLeuHisLysAspTyrSerAlaAspThrLeuAla105110115120HisHisAsnAspIleAlaLeuLeuLysIleArgSerLysGluGlyArgCysAlaGlnPro125130135140SerArgThrIleGlnThrIleCysLeuProSerMetTyrAsnAspProGlnPheGlyThr145150155160SerCysGluIleThrGlyPheGlyLysGluAsnSerThrAspTyrLeuTyrProGluGln165170175180LeuLysMETThrValValLysLeuIleSerHisArgGluCysGlnGlnProHisTyrTyr185190195200GlySerGluValThrThrLysMetLeuCysAlaAlaAspProGlnTrpLysThrAspSer
205210 215220CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysSerLeuGlnGlyArgMETThrLeuThr225230 235240GlyIleValSerTrpGlyArgGlyCysAlaLeuLysAspLysProGlyValTyrThrArg245250 255260ValSerHisPheLeuProTrpIleArgSerHisThrLysGluGluAsnGlyLeuAlaLeu*表5 mA5UKB基因的核苷酸序列表ATGGCACAGGTTCTCAGAGGCACTGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCTGAT 60GCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGCATCCTGACT 120CTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTG 180TTTGGCAGGGATCTTCTGGATGACCTGAAATCAGAACTAACTGGAAAATTTGAAAAATTA 240ATTGTGGCTCTGATGAAACCCTCTCGGCTTTATGATGCTTATGAACTGAAACATGCCTTG 300AAGGGAGCTGGAACAAATGAAAAAGTACTGACAGAAATTATTGCTTCAAGGACACCTGAA 360GAACTGAGAGCCATCAAACAAGTTTATGAAGAAGAATATGGCTCAAGCCTGGAAGATGAC 420GTGGTGGGGGACACTTCAGGGTACTACCAGCGGATGTTGGTGGTTCTCCTTCAGGGTAGT 480GGCGGATCCGGTGGCGGTAAGATTATTGGGGGAGAATTTACCACCATCGAGAACCAGCCC 540TGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGC 600AGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAG 660AAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAG 720ATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCT 780CACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCA 840TCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACA 900AGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAAAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAG 960CTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTAC 1020GGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTATGTGCTGCTGACCCCCAATGGAAAACAGATTCC 1080TGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACT 1140GGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGA 1200GTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTC 1260TAA表6 mA5UKB的氨基酸序列表5 10 15 20METAlaGlnValLeuArgGlyThrValThrAspPheProGlyPheAspGluArgAlaAsp25 30 35 40AlaGluThrLeuArgLysAlaMETLysGlyLeuGlyThrAspGluGluSerIleLeuThr45 50 55 60LeuLeuThrSerArgSerAsnAlaGlnArgGlnGluIleSerAlaAlaPheLysThrLeu65 70 75 80PheGlyArgAspLeuLeuAspAspLeuLysSerGluLeuThrGlyLysPheGluLysLeu85 90 95 100IleValAlaLeuMETLysProSerArgLeuTyrAspAlaTyrGluLeuLysHisAlaLeu105110115120LysGlyAlaGlyThrAsnGluLysValLeuThrGluIleIleAlaSerArgThrProGlu125130135140GluLeuArgAlaIleLysGlnValTyrGluGluGluTyrGlySerSerLeuGluAspAsp
145150155160ValValGlyAspThrSerGlyTyrTyrGlnArgMETLeuValValLeuLeuGlnGlySer165170175180GlyGlySerGlyGlyGlyLysIleIleGlyGlyGluPheThrThrIleGluAsnGlnPro185190195200TrpPheAlaAlaIleTyrArgArgHisArgGlyGlySerValThrTyrValCysGlyGly205210215220SerLeuIleSerProCysTrpValIleSerAlaThrHisCysPheIleAspTyrProLys225230235240LysGluAspTyrIleValTyrLeuGlyArgSerArgLeuAsnSerAsnThrGlnGlyGlu245250255260MetLysPheGluValGluAsnLeuIleLeuHisLysAspTyrSerAlaAspThrLeuAla265270275280HisHisAsnAspIleAlaLeuLeuLysIleArgSerLysGluGlyArgCysAlaGlnPro285290295300SerArgThrIleGlnThrIleCysLeuProSerMetTyrAsnAspProGlnPheGlyThr305310315320SerCysGluIleThrGlyPheGlyLysGluAsnSerThrAspTyrLeuTyrProGluGln325330335340LeuLysMETThrValValLysLeuIleSerHisArgGluCysGlnGlnProHisTyrTyr345350355360GlySerGluValThrThrLysMetLeuCysAlaAlaAspProGlnTrpLysThrAspSer
365370375380CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysSerLeuGlnGlyArgMETThrLeuThr385390395400GlyIleValSerTrpGlyArgGlyCysAlaLeuLysAspLysProGlyValTyrThrArg405410415420ValSerHisPheLeuProTrpIleArgSerHisThrLysGluGluAsnGlyLeuAlaLeu*注劃線部分代表兩基因融合時中間的甘氨酸和絲氨酸接頭。
權(quán)利要求
1.一種兼抗凝溶栓雙重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB，其特征在于氨基酸序列如下5 10 15 20METAlaGlnValLeuArgGlyThrValThrAspPheProGlyPheAspGluArgAlaAsp25 30 35 40AlaGluThrLeuArgLysAlaMETLysGlyLeuGlyThrAspGluGluSerIleLeuThr45 50 55 60LeuLeuThrSerArgSerAsnAlaGlnArgGlnGluIleSerAlaAlaPheLysThrLeu65 70 75 80PheGlyArgAspLeuLeuAspAspLeuLysSerGluLeuThrGlyLysPheGluLysLeu85 90 95 100IleValAlaLeuMETLysProSerArgLeuTyrAspAlaTyrGluLeuLysHisAlaLeu105110115120LysGlyAlaGlyThrAsnGluLysValLeuThrGluIleIleAlaSerArgThrProGlu125130135140GluLeuArgAlaIleLysGlnValTyrGluGluGluTyrGlySerSerLeuGluAspAsp145150155160ValValGlyAspThrSerGlyTyrTyrGlnArgMETLeuValValLeuLeuGlnGlySer165170175180GlyGlySerGlyGlyGlyLysIleIleGlyGlyGluPheThrThrIleGluAsnGlnPro185190195200TrpPheAlaAlaIleTyrArgArgHisArgGlyGIySerValThrTyrValCysGlyGly205210215220SerLeuIleSerProCysTrpValIleSerAlaThrHisCysPheIleAspTyrProLys225230235240LysGluAspTyrIleValTyrLeuGlyArgSerArgLeuAsnSerAsnThrGlnGlyGlu245250255260MetLysPheGluValGluAsnLeuIleLeuHisLysAspTyrSerAlaAspThrLeuAla265270275280HisHisAsnAspIleAlaLeuLeuLysIleArgSerLysGluGlyArgCysAlaGlnPro285290295300SerArgThrIleGlnThrIleCysLeuProSerMetTyrAsnAspProGlnPheGlyThr305310315320SerCysGluIleThrGlyPheGlyLysGluAsnSerThrAspTyrLeuTyrProGluGln325330335340LeuLysMETThrValValLysLeuIleSerHisArgGluCysGlnGlnProHisTyrTyr345350355360GlySerGluValThrThrLysMetLeuCysAlaAlaAspProGlnTrpLysThrAspSer365370375380CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysSerLeuGlnGlyArgMETThrLeuThr385390395400GlyIleValSerTrpGlyArgGlyCysAlaLeuLysAspLysProGlyValTyrThrArg405410415420ValSerHisPheLeuProTrpIleArgSerHisThrLysGluGluAsnGlyLeuAlaLeu
2.權(quán)利要求1所述兼抗凝溶栓雙重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB用于制備溶栓藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種兼具抗凝、溶栓雙重功能的血栓靶向性融合蛋白mA5UKB。該蛋白由膜聯(lián)蛋白5(AnnexinA5)的突變體mAnxA5和尿激酶B鏈(UKB)融合而成。AnnexinA5有四個同源結(jié)構(gòu)域，而mAnxA5僅包含第一、第二個結(jié)構(gòu)域，其分子量僅為前者的一半，但保留了AnnexinA5的血栓靶向功能和抗凝血功能，且第二結(jié)構(gòu)域中的纈氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(V－G－D)序列突變成精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(R－G－D)序列，使mAnxA5具有更強的抗凝血功能。將mAnxA5與具有溶栓作用的UKB融合，所得到的融合蛋白mA5UKB能夠靶向性地作用于血栓部位，提高了溶栓效率，并減小了出血等不良反應(yīng)。本發(fā)明融合蛋白兼具抗凝溶栓作用，可將其制備成為溶栓藥物。
文檔編號A61K38/16GK1401662SQ02136158
公開日2003年3月12日 申請日期2002年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月23日
發(fā)明者孫樹漢, 顏宏利, 陳蕊雯 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)