專利名稱：一種具有抗腫瘤活性的錨參提取物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物有效成分提取物及制備方法，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的錨參提取物及制備方法。
我國多種本草記載海洋錨參可用于癰瘡毒腫，具有消腫止痛、斂瘡生肌等功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明海洋刺錨參中含有豐富的多種蛋白水解酶，具有多種生物活性。
本發(fā)明公開的具有抗腫瘤活性的錨參提取物是以海洋錨參為原料，采用抽提、鹽析、離子交換層析、分子篩層析等步驟純化分離得到的分子量在38000左右的蛋白質(zhì)。用SDS-PAGE電泳測定其純度及相對分子量，在38000左右有一明顯條帶(見

圖1)。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是公開上述錨參提取物的制備方法。
本發(fā)明公開的錨參提取物是采用下述技術(shù)方案獲得的新鮮海洋錨參用3-5倍體積的含EDTA的磷酸緩沖溶液抽提，高速離心后，上清液用硫酸銨分級沉淀，得到硫酸銨飽和濃度介于40％～65％之間的組分，進(jìn)行離子交換層析，用pH8.0的Tris緩沖液(含NaCl梯度)洗脫，收集0.6-0.86mol/L的NaCl梯度組分，濃縮后進(jìn)行分子篩層析，得到三個(gè)洗脫峰，收集活性峰，濃縮凍干即得。
本發(fā)明所述的磷酸緩沖液可選用10mmol/L PB或其它磷酸緩沖液，其中含有1-5mmol/L的EDTA。
本發(fā)明所述的離子交換層析的介質(zhì)可選用DEAE-Sepharose CL6B、DEAE-SephadexA 50等陰離子交換劑。
本發(fā)明所述的分子篩層析介質(zhì)可選用Sephadex G-75、SephadexG-100、Sephadex G-150、Sephacryl S-300等。
本發(fā)明所述的活性峰可用電泳、細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)鑒定。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題是公開上述錨參提取物在制備抑制腫瘤生長藥物中的應(yīng)用。
用MTT方法測定本發(fā)明錨參提取物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示海洋錨參抗腫瘤活性成分能夠非常顯著抑制7901胃癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞、QGY7721人肝癌細(xì)胞的生長，而對929成纖維細(xì)胞在較低濃度時(shí)無明顯抑制作用。用荷瘤小鼠抑瘤試驗(yàn)測定錨參提取物對小鼠腫瘤生長的作用，結(jié)果顯示海洋錨參抗腫瘤活性成分對S-180小鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制效應(yīng)，抑瘤率可達(dá)71.7％，而對小鼠體重和脾臟無明顯影響。對Lewis肺，C-26結(jié)腸癌的抑瘤率分別為66.4％和70.9％。上述結(jié)果提示海洋錨參抗腫瘤活性成分對腫瘤生長具有較好的抑制作用。
下面結(jié)合詳細(xì)的藥效試驗(yàn)，對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。1原料與方法1.1原料與試劑Tris，SDS，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，Sigma公司；胰蛋白酶1∶250，Difco進(jìn)口分裝；RPMI-1640培養(yǎng)基，Scientific產(chǎn)品；小牛血清，胎牛血清，上海華美生物工程公司；其余為一般常用試劑。C57BL/6小鼠，BALB/c小鼠，昆明種小鼠，上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司；Lewis肺癌，HAC肝癌、S-180肉瘤瘤株，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；Hela細(xì)胞，HLF人肺成纖維細(xì)胞，中科院細(xì)胞所細(xì)胞庫。錨參原料購自浙江溫州地區(qū)。1.2海洋錨參抗腫瘤活性成分的制備新鮮海洋錨參用10mmol/L的磷酸緩沖溶液(含3mmol/L的EDTA，pH7.2)抽提24h，8000rpm高速離心30min，上清液用硫酸銨分級沉淀，得到硫酸銨飽和濃度介于40％～65％之間的組分，進(jìn)行DEAE-Sepharose CL-6B離子交換層析，用20mmol/L，pH8.0的Tris-Cl緩沖液，0～1.5mol/L的NaCl梯度洗脫，收集0.6～0.86mol/L的NaCl梯度組分，濃縮后進(jìn)行Sephacryl S-300分子篩層析，得到三個(gè)洗脫峰，收集第二峰，濃縮凍干得到海洋錨參抗腫瘤活性成分。1.3海洋錨參抗腫瘤活性成分的SDS-PAGE分析采用Sambrook報(bào)道的方法。5％的濃縮膠，10％的分離膠，0.8mm膠厚的SDS-PAGE電泳。1mg海洋錨參抗腫瘤活性成分溶解于1ml的H2O中，離心取上清100μl加100μl 2×上樣緩沖液，水浴煮沸3min，冰浴后離心，取上清100μl上樣。100V電泳1h后，樣品進(jìn)入分離膠，增加電壓至200V，電泳4h?？捡R斯亮藍(lán)染液染色過夜，10％的冰醋酸10％甲醇溶液脫色4h，掃描記錄結(jié)果。1.4海洋錨參抗腫瘤活性成分對腫瘤細(xì)胞生長抑制的測定采用MTT測定法[4]。分別以7901胃癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞、QGY7721人肝癌細(xì)胞和929成纖維細(xì)胞為研究對象。1×104個(gè)細(xì)胞懸浮于200μl含有10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加到96孔板中，培養(yǎng)12h后，加入10μl不同濃度的海洋錨參抗腫瘤活性成分作用24h，加入100μl 0.5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5h，傾去培養(yǎng)基，加入100μl DMSO，振蕩10min，用Bio-Rad酶標(biāo)儀在570nm處測定OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3-8個(gè)平行樣品。對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析各處理組差異。1.5海洋錨參抗腫瘤活性成分對荷瘤小鼠腫瘤生長抑制的測定根據(jù)付生法報(bào)道的方法加以改進(jìn)。采用三種動物模型，C57BL/6小鼠接種Lewis肺癌，昆明種小鼠接種S-180肉瘤，BALB/c小鼠接種HAC肝癌。無菌操作取生長良好的小鼠瘤組織，用滅菌生理鹽水以1∶4勻漿制備成癌細(xì)胞懸液。臺盼藍(lán)染色檢查活細(xì)胞數(shù)，應(yīng)大于95％。于每只小鼠前腋皮下接種0.2ml，隨機(jī)分成3組，每組動物數(shù)10個(gè)，設(shè)生理鹽水對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(40mg/kg，ip×7)；海洋錨參抗腫瘤活性成分設(shè)5mg/kg劑量組，給藥體積為0.5ml/只，于接種瘤株后次日起灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥七天，接種后10日脫頸椎處死動物，稱體重后，解剖取出每只小鼠瘤塊，稱瘤塊重量，比較各劑量組瘤重之大小，根據(jù)下列公式判定結(jié)果 2結(jié)果2.1海洋錨參抗腫瘤活性成分的SDS-PAGE電泳采用SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖1所示，海洋錨參抗腫瘤活性成份在分子量38000左右有一明顯條帶。2.2海洋錨參抗腫瘤活性成分對腫瘤細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)我們采用MTT方法測定了海洋錨參對7901胃癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞、QGY7721人肝癌細(xì)胞和929成纖維細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)，結(jié)果如表1～4所示。海洋錨參對腫瘤細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用。
表1 海洋錨參對7901胃癌細(xì)胞生長抑制作用A570nm組 別 4.0μg/ml 1.0μg/ml0.5μg/mlControl 0.511±0.032 0.511±0.032 0.511±0.032海洋錨參制劑1 0.113±0.071**0.161±0.022** 0.269±0.023**海洋錨參制劑2 0.112±0.043**0.211±0.038** 0.260±0.368**海洋錨參制劑3 0.107±0.041**0.115±0.011** 0.253±0.030**與對照組比較，*＜0.05，**＜0.01表2 海洋錨參對Hela細(xì)胞生長抑制作用A570nm組別 4.0μg/ml 1.0μg/ml0.5μg/mlControl0.987±0.092 0.987±0.092 0.987±0.092海洋錨參制劑1 0.102±0.032**0.341±0.028** 0.558±0.052**海洋錨參制劑2 0.22 1±0.023** 0.267±0.039** 0.489±0.078**海洋錨參制劑3 0.124±0.025**0.301±0.070** 0.467±0.038**與對照組比較，*＜0.05，**＜0.01表3 海洋錨參對QGY7721肝癌細(xì)胞生長抑制作用A570nm組別 4.0μg/ml1.0μg/ml 0.5μg/mlControl1.126±0.088 1.126±0.088 1.126±0.088海洋錨參制劑1 0.334±0.056** 0.623±0.043**0.998±0.092*海洋錨參制劑2 0.368±0.043** 0.689±0.069**0.876±0.057*海洋錨參制劑3 0.423±0.051** 0.721±0.073**0.792±0.054*與對照組比較，*＜0.05，**＜0.01表4 海洋錨參對929成纖維細(xì)胞生長抑制作用A570nm組別 4.0μg/ml1.0μg/ml 0.5μg/mlControl0.654±0.049 0.654±0.0490.654±0.049海洋錨參制劑1 0.393±0.080*0.584±0.0380.545±0.077海洋錨參制劑2 0.426±0.005*0.525±0.0530.847±0.056海洋錨參制劑3 0.418±0.007*0.582±0.0960.517±0.043與對照組比較，*＜0.05，**＜0.012.3海洋錨參抗腫瘤活性成分對小鼠腫瘤生長的抑制效應(yīng)采用小鼠皮下移植腫瘤生長抑制試驗(yàn)，ICR小鼠接種S-180肉瘤、C57BL/6小鼠接種Lewis肺癌、BALB/c小鼠接種C-26結(jié)腸癌，給藥10天后測定腫瘤生長抑制率。結(jié)果如表5～7所示，海洋錨參抗腫瘤活性成分對S-180小鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制效應(yīng)，抑瘤率可達(dá)71.7％，而對小鼠體重和脾臟無明顯影響(如表8)。對Lewis肺，C-26結(jié)腸癌的抑瘤率分別為66.4％和70.9％。
表5 海洋錨參對ICR小鼠S180肉瘤的抑制作用組別 動物數(shù)瘤重(g)抑瘤率(％)P值Control 10 2.69±0.62 ——— ———海洋錨參制劑8 0.76±0.21 71.7 ＜0.001(5mg/kg)表6 海洋錨參對C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑制作用組別 動物數(shù)瘤重(g) 抑瘤率(％)P值Control 103.24±0.79 ——— ———海洋錨參制劑8 0.99±0.51 66.4 ＜0.001(5mg/kg)表7 海洋錨參對BALB/c小鼠C-26結(jié)腸癌的抑制作用組別 動物數(shù)瘤重(g) 抑瘤率(％) P值Control 101.86±0.52 ——— ———海洋錨參制劑8 0.54±0.25 70.9 ＜0.001(5mg/kg)表8 海洋錨參對S180荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響脾指數(shù) 胸腺指數(shù)組別 動物數(shù) 體重(g)(mg/g)(mg/g)Control 1030.92±2.22 9.77±1.353.26±0.82海洋錨參9 29.88±1.43 11.01±1.60 3.39±0.55(5mg/kg)3、結(jié)論研究結(jié)果表明，錨參提取物抗腫瘤效果非常明顯，能夠非常顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長和繁殖，非常顯著抑制體內(nèi)腫瘤的生長，且無明顯的毒副作用。其抗癌機(jī)理新穎獨(dú)特，對胃癌具有特別顯著的抑制效應(yīng)，對其他腫瘤(肝癌、肺癌、子宮頸癌、乳腺癌等)也具有明顯的抑瘤效果。
錨參提取物可作為抗腫瘤藥物的活性成分，與藥用輔料制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的藥物制劑。
海洋藥物的研究始于上世紀(jì)50年代末。美國最早開展海洋生物活性物質(zhì)的研究。隨后，日本、歐共體及其它各國學(xué)者相繼開展了海洋生物抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗心腦血管病等活性成分的研究。到目前為止，大約有6000多種海洋天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，其中有重要生物活性并已申請專利的新化合物有200多種。尤其重要的是從海洋生物中發(fā)現(xiàn)了一系列高效低毒的抗腫瘤化合物，有的已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。如Bryostatin A(II期)，Dehydrodidemin B(III期)，ET-729，ET-743，Dolastatin 10等。
海洋錨參為一種海洋棘皮動物，生長于沿海泥沙質(zhì)灘涂中，我國蘊(yùn)藏量極大?，F(xiàn)已解決了其人工養(yǎng)殖的技術(shù)性問題，有需要可進(jìn)行大規(guī)模人工養(yǎng)殖。海洋錨參的抗腫瘤活性成分的相關(guān)研究，國內(nèi)外未見報(bào)道，對其進(jìn)一步分離純化，可獲得高純的活性單體，且其提取得率較高(1‰)，具有極高的開發(fā)價(jià)值，有望成為新型的、療效顯著的抗腫瘤藥物
權(quán)利要求
1.一種錨參提取物，其特征在于該提取物是以海洋錨參為原料，采用抽提、鹽析、離子交換層析、分子篩層析等步驟純化分離得到的分子量在38000左右的蛋白質(zhì)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的錨參提取物的制備方法，其特征在于該提取物通過下述步驟制得新鮮海洋錨參用3-5倍體積的含EDTA的磷酸緩沖溶液抽提，高速離心后，上清液用硫酸銨分級沉淀，得到硫酸銨飽和濃度介于40％～65％之間的組分，進(jìn)行離子交換層析，用pH8.0含NaCl梯度的Tris緩沖液洗脫，收集0.6-0.86mol/L的NaCl梯度組分，濃縮后進(jìn)行分子篩層析，得到三個(gè)洗脫峰，收集活性峰，濃縮凍干即得。
3.一種如權(quán)利要求2所述的錨參提取物的制備方法，其特征在于其中所述的磷酸緩沖液可選用10mmol/L PB或其它磷酸緩沖液，其中含有1-5mmol/L的EDTA。
4.一種如權(quán)利要求2所述的錨參提取物的制備方法，其特征在于其中所述的離子交換層析的介質(zhì)可選用DEAE-Sepharose CL-6B、DEAE-Sephadex A 50等陰離子交換劑。
5.一種如權(quán)利要求2所述的錨參提取物的制備方法，其特征在于其中所述的分子篩層析介質(zhì)可選用Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150、Sephacryl S-300等。
6.一種如權(quán)利要求2所述的錨參提取物的制備方法，其特征在于其中所述的活性峰可用電泳、細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)鑒定。
7.一種如權(quán)利要求1所述的錨參提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
8.一種如權(quán)利要求7所述的錨參提取物在制備抑制腫瘤生長藥物中的應(yīng)用，其特征在于錨參提取物可作為抗腫瘤藥物的活性成分，與藥用輔料制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的錨參提取物及制備方法。本發(fā)明公開的錨參提取物是以海洋錨參為原料，采用抽提、鹽析、離子交換層析、分子篩層析等步驟純化分離得到的分子量在38000左右的蛋白質(zhì)。該提取物能夠非常顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長和繁殖，非常顯著抑制體內(nèi)腫瘤的生長，且無明顯的毒副作用，可作為抗腫瘤藥物的活性成分，與藥用輔料制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的藥物制劑。
文檔編號A61K38/17GK1472224SQ0213625
公開日2004年2月4日 申請日期2002年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月29日
發(fā)明者沈先榮, 賈福星, 蔣寶文, 陳美華, 李樹林 申請人:上海澳博海洋生物技術(shù)開發(fā)有限公司, 中國人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所