專(zhuān)利名稱(chēng)：跨膜型金黃色葡萄球菌腸毒素a融合蛋白的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程類(lèi)，主要涉及跨膜型金黃色葡萄球菌腸毒素A融合蛋白的制備及其在腫瘤治療方面的應(yīng)用。
超抗原強(qiáng)烈激活T細(xì)胞的特性啟發(fā)人們將其用于腫瘤的治療。目前對(duì)細(xì)菌SAg的抗腫瘤作用研究較多的主要是金黃色葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB和TSST1等)。但是，將超抗原直接用于腫瘤治療尚存在許多限制，因?yàn)榇蠖鄶?shù)腫瘤細(xì)胞并不表達(dá)MHCII類(lèi)抗原；同時(shí)，表達(dá)MHCII類(lèi)抗原的正常細(xì)胞如APC也可能成為超抗原的靶細(xì)胞而受到攻擊。
為了充分發(fā)揮超抗原的特異性抗腫瘤作用，Dohlsten[5]等通過(guò)基因工程的方法，制備了人結(jié)腸癌單克隆抗體C215的Fab段與SEA的融合蛋白，此融合蛋白在體外將反應(yīng)性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)導(dǎo)向表達(dá)C215抗原的腫瘤細(xì)胞，并降低與MHCII類(lèi)分子的結(jié)合親和力。用C215Fab-SEA融合蛋白治療B16-C215黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移，結(jié)果能消除95％的轉(zhuǎn)移灶。Rosendahl等[6]用C215Fab-SEA融合蛋白治療荷C215轉(zhuǎn)染的同基因B16黑色素瘤小鼠的肺轉(zhuǎn)移，也證明了能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤作用。Sakurai[7]等構(gòu)建了SEA雙功能抗體的融合蛋白SEA-scFv，結(jié)果表明該融合蛋白在腫瘤的免疫治療中發(fā)揮了非常重要的作用。
在近年來(lái)的研究中，盡管單克隆抗體(McAb)靶向的超抗原在一系列實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的治療中顯示出是一個(gè)極具有潛力的腫瘤生物治療制劑，由于其本身尚存在一些不足之處，以致于限制了它的實(shí)際應(yīng)用，這些缺點(diǎn)包括(1)McAb靶向超抗原的抗腫瘤譜很窄，一種McAb只能靶向表達(dá)特異性抗原的腫瘤組織，這種制劑缺乏廣譜性；(2)融合蛋白活化的T細(xì)胞是SEA反應(yīng)性的，并非腫瘤特異性T細(xì)胞。
如何增強(qiáng)融合蛋白的抗腫瘤療效，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。除了McAb靶向超抗原的抗腫瘤作用之外，另有學(xué)者用化學(xué)偶聯(lián)的方法使超抗原結(jié)合在腫瘤細(xì)胞表面。Shimizu等[8]使用Sulfo-GMBS交聯(lián)劑能夠使SEB結(jié)合在Meth A腫瘤細(xì)胞表面，表面賦有SEB的Meth A腫瘤細(xì)胞在體外能有效地刺激Vβ8+T細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，用表面賦有SEB的腫瘤細(xì)胞滅活后免疫小鼠，對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。但是，化學(xué)偶聯(lián)的穩(wěn)定性欠佳，嚴(yán)重影響了其應(yīng)用價(jià)值。Shrayer等[9]將SEA基因轉(zhuǎn)染B16腫瘤細(xì)胞作為腫瘤疫苗，雖然作者報(bào)道取得了較好的療效，但是SEA本身是分泌型的，直接用SEA轉(zhuǎn)染的腫瘤疫苗用于治療，將無(wú)法避免分泌型SEA所帶來(lái)的全身性毒副作用。在這些背景研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明克服了現(xiàn)階段對(duì)超抗原用于腫瘤治療方面的不足。
本發(fā)明構(gòu)建的TM-SEA融合蛋白具有跨膜功能，可以將超抗原SEA錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，并具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，SEQ ID NO1，顯示本發(fā)明TM-SEA融合蛋白的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備TM-SEA融合蛋白的方法包括將分泌型的SEA蛋白與c-erb-B2基因中的一段編碼TM區(qū)的序列融合，構(gòu)建TM-SEA的融合蛋白。其中，TM序列來(lái)自表達(dá)c-erb-B2原癌基因的卵巢癌HO-8910細(xì)胞系；SEA基因來(lái)源于金黃色葡萄球菌(ATCC 13565)。首先從HO-8910卵巢癌細(xì)胞系中提取其總RNA，使用一對(duì)針對(duì)TM區(qū)序列特異的引物，采用RT-PCR的方法擴(kuò)增出編碼TM的一段序列；然后從金黃色葡萄球菌(ATCC 13565)中提取DNA，PCR擴(kuò)增出SEA基因；用剪接重疊延伸法(splicing overlap extension，SOE)將TM與SEA連接，獲得TM-SEA融合基因。然后將TM-SEA融合基因定向克隆到pGEM-T載體中，經(jīng)過(guò)DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆。經(jīng)核苷酸序列分析證實(shí)獲得了正確的TM-SEA融合基因。亞克隆構(gòu)建TM-SEA的表達(dá)載體pET-28a-TM-SEA，再次測(cè)序證實(shí)了表達(dá)載體pET-28a中目的基因TM-SEA是正確的。將包含目的基因的重組表達(dá)載體pET-28a-TM-SEA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用于融合蛋白表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，卡那霉素和氯霉素抗性LB平板篩選陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)5h，收獲工程菌，用融合蛋白純化試劑盒純化獲得TM-SEA融合蛋白；并通過(guò)一系列的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TM-SEA融合蛋白的跨膜功能以及刺激T細(xì)胞增殖的功能。
本發(fā)明構(gòu)建的TM-SEA融合蛋白可制備腫瘤疫苗，可有效激發(fā)機(jī)體的特異性和非特異性抗腫瘤免疫，具有對(duì)荷黑色素瘤小鼠的免疫治療作用，以及具有對(duì)親本腫瘤細(xì)胞攻擊的免疫保護(hù)作用?？捎糜谀[瘤復(fù)發(fā)和微轉(zhuǎn)移的治療，及廣泛地應(yīng)用于多種腫瘤的治療。
本發(fā)明的特點(diǎn)是(1)TM-SEA融合蛋白具有跨膜功能，可以將超抗原SEA錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，并具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性；同時(shí)保持了SEA的生活學(xué)活性，具有刺激人外周血淋巴細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞增殖的功能。(2)體內(nèi)研究表明TM-SEA融合蛋白制備的腫瘤疫苗可有效激發(fā)機(jī)體的特異性和非特異性抗腫瘤免疫，能顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)其生存期，其脾細(xì)胞的NK和CTL活性顯著增強(qiáng)。(3)TM-SEA融合蛋白制備的腫瘤疫苗可誘導(dǎo)特異性抗腫瘤反應(yīng)，對(duì)同種腫瘤細(xì)胞攻擊可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用動(dòng)物成瘤時(shí)間延遲，腫瘤生長(zhǎng)緩慢，生存期顯著延長(zhǎng)，部分動(dòng)物無(wú)瘤生存，其脾細(xì)胞的CTL活性增強(qiáng)。該腫瘤疫苗有可能作為一種有效的方法用于腫瘤復(fù)發(fā)和微轉(zhuǎn)移的治療。
圖2 TM基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。
圖3 擴(kuò)增SEA基因和編碼TM序列的PCR產(chǎn)物，TM-SEA融合基因在克隆及亞克隆后重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物的電泳。
圖4 本發(fā)明克隆的TM-SEA融合基因的序列測(cè)序結(jié)果。
圖5 跨膜型超抗原TM-SEA融合蛋白的表達(dá)與IPTG誘導(dǎo)時(shí)效的WesternBlot分析。
圖6 超抗原SEA蛋白的表達(dá)與IPTG誘導(dǎo)時(shí)效的Western Blot分析。
圖7 純化后TM-SEA融合蛋白的Western Blot分析。
圖8 免疫組化方法檢測(cè)與TM-SEA融合蛋白共育的腫瘤細(xì)胞膜表面錨定的SEA；其中8A是TM-SEA融合蛋白錨定在腫瘤細(xì)胞膜上的陽(yáng)性染色結(jié)果，8B是相關(guān)對(duì)照。
圖9 TM-SEA融合蛋白與B16細(xì)胞共育后，SEA錨定在B16細(xì)胞膜上的免疫熒光圖象。


圖10a B16細(xì)胞與TM-SEA融合蛋白孵育4h的對(duì)照樣本。
圖10b B16細(xì)胞與TM-SEA融合蛋白孵育4h的實(shí)驗(yàn)樣本1。
圖10c B16細(xì)胞與TM-SEA融合蛋白孵育結(jié)束后放置4h的實(shí)驗(yàn)樣本2。
圖11 不同濃度的TM-SEA融合蛋白對(duì)人PBLs的增殖誘導(dǎo)活性。
圖12 不同濃度的TM-SEA融合蛋白對(duì)小鼠脾細(xì)胞的增殖誘導(dǎo)活性。
圖13 Colo-205腫瘤細(xì)胞膜上結(jié)合的TM-SEA融合蛋白對(duì)人PBLs的活化作用。
圖14 B16腫瘤細(xì)胞膜上結(jié)合的TM-SEA融合蛋白對(duì)小鼠脾細(xì)胞的活化作用。
圖15 荷瘤小鼠在接受不同制劑治療后的腫瘤生長(zhǎng)曲線。
圖16 荷瘤小鼠B16-TM-SEA vaccine治療后NK活性檢測(cè)(LDH釋放法)。
圖17 不同制劑治療組小鼠的CTL活性(LDH釋放法)。
圖18 荷瘤小鼠在接受不同制劑治療后的生存期。
圖19 免疫組小鼠在接受腫瘤細(xì)胞攻擊后的腫瘤生長(zhǎng)曲線。
圖20 不同制劑免疫鼠的CTL活性(LDH釋放法)。
圖21 不同制劑免疫小鼠在腫瘤細(xì)胞攻擊后的生存期。
本實(shí)驗(yàn)中所有相關(guān)數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)，其它計(jì)量資料采用方差分析(F檢驗(yàn))和兩兩比較q檢驗(yàn)。實(shí)施例一 TM-SEA融合基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建(一)超抗原SEA基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建1.擴(kuò)增SEA基因產(chǎn)物的電泳分析擴(kuò)增的SEA基因大小為795bp，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)附圖1。2.重組pGEM-T-SEA質(zhì)粒DNA的酶切鑒定重組pGEM-T-SEA質(zhì)粒DNA用Nhe I和Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物用1.7％的瓊脂糖凝膠電泳，目的基因大小為784bp，結(jié)果見(jiàn)附圖1。3.擴(kuò)增SEA基因的序列分析除擴(kuò)增片段兩端的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列及保護(hù)堿基序列外，測(cè)序結(jié)果與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致[10]，見(jiàn)附圖4。4.重組pET-28b-SEA質(zhì)粒DNA的酶切鑒定將亞克隆后的重組pET-28b-SEA質(zhì)粒用Nhe I和Hind III內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)附圖1。目的基因大小為784bp。
附圖1中，泳道1，100bp DNA分子量標(biāo)志物；泳道2，擴(kuò)增SEA基因的PCR產(chǎn)物；泳道3，pGEM-T載體；泳道4，pGEM-T-SEA質(zhì)粒Nhe I/Hind III雙酶切產(chǎn)物；泳道5，pET-28b載體；泳道6，pET-28b-SEA質(zhì)粒Nhe I/Hind III雙酶切產(chǎn)物；泳道7，λDNA/Hind III DNA分子量標(biāo)志物。
(二)跨膜型超抗原TM-SEA基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建1.擴(kuò)增SEA基因產(chǎn)物的電泳分析以金黃色葡萄球菌(ATCC 13565)的DNA為模板，用引物P1和P2，PCR擴(kuò)增出用于和TM片段連接的SEA基因片段，大小為796bp，見(jiàn)附圖3。
2.擴(kuò)增編碼TM序列片段產(chǎn)物的電泳分析以HO-8910細(xì)胞系RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，用引物P3和P4擴(kuò)增出編碼TM序列的片段，大小為155bp，電泳結(jié)果見(jiàn)附圖2。
3.擴(kuò)增TM-SEA融合基因PCR產(chǎn)物的電泳鑒定以擴(kuò)增SEA和編碼TM序列的PCR產(chǎn)物為模板，用引物P1和P4擴(kuò)增出跨膜型超抗原TM-SEA融合基因，其大小為922bp，電泳結(jié)果見(jiàn)附圖3。同時(shí)，對(duì)融合基因TM-SEA進(jìn)行克隆和亞克隆后，TM-SEA重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物也一并電泳，結(jié)果見(jiàn)附圖3。
附圖3中，M1，100bp DNA標(biāo)志物；泳道1，TM擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2，SEA擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3，TM-SEA擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4，pGEM-T載體；泳道5，pGEM-T-TM-SEA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；泳道6，pET-28a載體；泳道7，pET-28a-TM-SEA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；M2，λDNA/Hind III標(biāo)志物。
4.重組pGEM-T-TM-SEA質(zhì)粒DNA的酶切鑒定克隆質(zhì)粒pGEM-T-TM-SEA，經(jīng)Nhe I和Hind III雙酶切后，目的基因大小為913bp，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)附圖3。
5.亞克隆pET-28a-TM-SEA質(zhì)粒DNA的酶切鑒定表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-TM-SEA，經(jīng)Nhe I和Hind III雙酶切后，其酶切產(chǎn)物用1.7％的瓊脂糖凝膠電泳，目的基因大小為913bp(見(jiàn)附圖3)。
6.TM-SEA融合基因的序列分析6.1 SEA的標(biāo)準(zhǔn)序列[10]1 atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca61 cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct121 gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct181 aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc241 ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt301 gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt361 gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat421 aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat481 acagtacctt tggaaacggt taaaacgaat aagaaaaatg taactgttca ggagttggat541 cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat601 gggaaggttc agaggggatt aatcgtgttt catacttcta cagaaccttc ggttaattac661 gatttatttg gtgctcaagg acagtattca aatacactat taagaatata tagagataat721 aaaacgatta actctgaaaa catgcatatt gatatatatt tatatacaag ttaa6.2 本研究克隆的TM區(qū)基因片段與Genbank中的序列比較(1)Genbank中接收號(hào)為M11730的TM序列[11]2041 acccactcct gtgtggacct ggatgacaag ggctgccccg ccgagcagag agccagccct2101 ctgacgtcca tcgtctctgc ggtggttggc attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc2161 tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag aagatccgga agtacacgat gcggagactg(2)本研究克隆的編碼TM區(qū)的片段經(jīng)測(cè)序證實(shí)的序列如下gccgagcagagagccagccctctgacgtccatcgtctctgcggtggttggcattctgctggtcgtggtcttgggggtggtctttgggatcctcatcaagcgacggcagcagaagatccggaagtacacgat結(jié)果與Genbank中接收號(hào)為M11730的TM區(qū)編碼序列完全一致。
6.3本研究克隆的TM-SEA融合基因的序列通過(guò)ABI PRISM 377全自動(dòng)核酸測(cè)序儀(PE，USA)測(cè)序，本研究克隆的TM-SEA融合基因的序列與Genbank[10，11]中的標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致(見(jiàn)測(cè)序圖附圖4)。
實(shí)施例二跨膜型超抗原SEA融合蛋白的表達(dá)與純化(一)PTG誘導(dǎo)TM-SEA融合蛋白表達(dá)的時(shí)效Western Blot分析制備誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后1h、3h、5h和7h的蛋白樣本，其Western Blot分析結(jié)果見(jiàn)圖5。將圖片掃描后，經(jīng)密度分析確定，誘導(dǎo)后5h時(shí)，目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量最高。從圖5中可以看出空載體轉(zhuǎn)化的工程菌在誘導(dǎo)后無(wú)目的蛋白表達(dá)，目的蛋白的產(chǎn)量在IPTG誘導(dǎo)后1h，3h，5h逐漸增加；而沒(méi)有誘導(dǎo)的工程菌呈現(xiàn)微量的蛋白表達(dá)。圖5中，泳道1，陽(yáng)性對(duì)照ppSEA；泳道2，空載體轉(zhuǎn)化的工程菌；泳道3，誘導(dǎo)前樣本對(duì)照；泳道4，誘導(dǎo)后1h的樣本；泳道5，誘導(dǎo)后3h的樣本；泳道6，誘導(dǎo)后5h的樣本；泳道7，誘導(dǎo)后7h的樣本。
(二)PTG誘導(dǎo)超抗原SEA蛋白表達(dá)的Western Blot分析同樣地，取誘導(dǎo)后1h、3h、5h的蛋白樣本。Western Blot分析的結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6中可以看出目的蛋白的產(chǎn)量在IPTG誘導(dǎo)后1h，3h，5h逐漸增加；將圖片掃描后，經(jīng)密度分析確定在誘導(dǎo)后3h，目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量最高。圖6中，泳道1，陽(yáng)性對(duì)照(ppSEA)；泳道2，誘導(dǎo)后1h；泳道3，誘導(dǎo)后3h；泳道4，誘導(dǎo)后5h。
(三)目的蛋白的純化IPTG誘導(dǎo)5h后的工程菌，按照純化試劑盒的說(shuō)明書(shū)，對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化，純化后的目的蛋白的純度在95％以上，可直接用于體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究。純化蛋白樣本的Western Blot分析(參見(jiàn)圖7)。圖7中，泳道1，陽(yáng)性對(duì)照ppSEA；泳道2，工程菌裂解后的上清；泳道3，純化過(guò)程中未結(jié)合的蛋白；泳道4，純化后的TM-SEA融合蛋白。
實(shí)施例三跨膜型超抗原SEA融合蛋白的功能研究(一)TM-SEA融合蛋白的體外功能研究(In vitro)1.TM-SEA融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞膜的錨定作用(1)免疫組化法(Immunohistochemistry)純化的TM-SEA融合蛋白與腫瘤細(xì)胞共同孵育4h后，用免疫組化方法可以檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞膜上SEA蛋白的染色(見(jiàn)圖8A)；在對(duì)照組樣本(圖8B)中，用純化的SEA蛋白同樣與腫瘤細(xì)胞Colo-205共同孵育4h后，免疫組化結(jié)果未見(jiàn)細(xì)胞膜上有棕黃色蛋白抗原顆粒存在。圖8中，A是TM-SEA融合蛋白錨定在腫瘤細(xì)胞膜上的陽(yáng)性染色結(jié)果，B是相關(guān)對(duì)照。
(2)免疫熒光法(Immune Fluorescence)
0.3μM的TM-SEA融合蛋白與B16細(xì)胞共同孵育4h。分別加入一抗和二抗作用后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞膜表面存在顯示細(xì)胞輪廓的熒光(見(jiàn)圖9)。錨定陽(yáng)性細(xì)胞的百分率達(dá)92％以上。同時(shí)，檢測(cè)了此融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞膜錨定的穩(wěn)定性，結(jié)果表明錨定(共同孵育)結(jié)束后4h，陽(yáng)性細(xì)胞的百分率為83％，并未顯著減少。
(3)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometric Analysis)流式細(xì)胞儀對(duì)TM-SEA融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞膜的錨定作用的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10a、10b、10c。對(duì)照樣本(圖10a)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為2.16；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(本底)的百分率為1.6％(圖10b)的平均熒光強(qiáng)度為13.1；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分率為94.9％；實(shí)驗(yàn)樣本2(圖10c)的平均熒光強(qiáng)度為12.0；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為87％。錨定后4h樣本的熒光強(qiáng)度(12.0)較正常制備的陽(yáng)性樣本的熒光強(qiáng)度(13.1)略低，表明TM-SEA融合蛋白與B16腫瘤細(xì)胞孵育4h后，能夠錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，而且這種錨定具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。
(二)TM-SEA融合蛋白對(duì)人PBLs及C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的活化作用1.TM-SEA融合蛋白對(duì)人PBLs的增殖誘導(dǎo)活性PHA-P(10μg/ml)在作用48h時(shí)，活化人PBLs的PI值為1.13；TM-SEA蛋白在3×10-5nM濃度時(shí)，已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)人PBLs的增殖誘導(dǎo)能力(PI為1.19)；在3×10-5nM～3×10-1nM濃度范圍內(nèi)，TM-SEA蛋白刺激細(xì)胞增殖的作用呈劑量依賴(lài)性；其中，3×10-1nM濃度的TM-SEA蛋白，在作用48h時(shí)的細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)(PI為1.74)，而且顯著高于最佳劑量的陽(yáng)性對(duì)照PHA-P(P＜0.05)。純化的SEA蛋白對(duì)人PBLs的刺激作用的結(jié)果表明，TM-SEA融合蛋白具有與SEA蛋白類(lèi)似的刺激作用。然而，當(dāng)兩種蛋白的終濃度達(dá)到3nM以上時(shí)，刺激PBLs增殖的作用開(kāi)始降低。結(jié)果見(jiàn)圖11。同時(shí)，也比較了作用24h、72h的刺激增殖作用的結(jié)果(未顯示)，但以作用48h時(shí)的效果最佳。
2.TM-SEA融合蛋白對(duì)C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的增殖誘導(dǎo)活性Con A(20U/ml)在作用48h時(shí)，活化C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的PI值為1.95；TM-SEA融合蛋白在4.5×10-4nM濃度時(shí)，已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)脾細(xì)胞的增殖誘導(dǎo)能力(PI為1.52)；在4.5×10-4nM-4.5nM濃度范圍內(nèi)，TM-SEA融合蛋白刺激小鼠脾細(xì)胞增殖的作用呈劑量依賴(lài)性正相關(guān)；其中，4.5nM濃度的TM-SEA融合蛋白，在作用48h時(shí)的細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)(PI為3.28)，而且顯著高于最佳劑量的陽(yáng)性對(duì)照Con A(P＜0.05)。純化的SEA蛋白對(duì)小鼠脾細(xì)胞刺激作用的結(jié)果表明SEA蛋白具有與TM-SEA融合蛋白類(lèi)似的刺激作用。當(dāng)融合蛋白的終濃度達(dá)到4.5nM以上時(shí)，刺激小鼠脾細(xì)胞增殖的作用開(kāi)始減弱。結(jié)果見(jiàn)圖12。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也比較了作用24h、72h的刺激小鼠脾細(xì)胞增殖作用的結(jié)果(未顯示)，但以作用48h的效果最為顯著。
3.錨定在腫瘤細(xì)胞膜上的TM-SEA融合蛋白對(duì)人PBLs及C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的活化作用3.1錨定在Colo-205細(xì)胞膜上的TM-SEA融合蛋白對(duì)人PBLs的活化作用與不用融合蛋白孵育的結(jié)果(Colo-205+PBLs)比較，Colo-205細(xì)胞膜上錨定的TM-SEA融合蛋白能顯著性地誘導(dǎo)人PBLs增殖(P＜0.01)，Colo-205腫瘤細(xì)胞膜上結(jié)合的TM-SEA融合蛋白對(duì)人PBLs的活化作用(見(jiàn)圖13)。
3.2錨定在B16細(xì)胞膜上的TM-SEA融合蛋白對(duì)C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的活化作用與對(duì)照組(無(wú)TM-SEA融合蛋白孵育的B16 cells+Splenocytes)比較，B16細(xì)胞膜上結(jié)合的TM-SEA能夠顯著性地刺激小鼠脾細(xì)胞的增殖(P＜0.01)。結(jié)果表明B16腫瘤細(xì)胞膜上結(jié)合的TM-SEA融合蛋白在體外能誘導(dǎo)人小鼠脾細(xì)胞增殖(見(jiàn)圖14)。
(三)TM-SEA融合蛋白的體內(nèi)功能研究(In vivo)1.腫瘤疫苗對(duì)荷瘤小鼠的治療作用1.1腫瘤疫苗對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用于C57BL/6小鼠的右后肢皮下注射1×105個(gè)野生型B16細(xì)胞。5～7天后，發(fā)現(xiàn)有可觸及的腫瘤。分別給予PBS、B16腫瘤疫苗、B16-SEA腫瘤疫苗、B16-TM-SEA腫瘤疫苗瘤體內(nèi)注射，三天一次，共4次。24天時(shí)，B16-TM-SEA腫瘤疫苗治療組小鼠的平均腫瘤直徑顯著性小于PBS組、B16和B16-SEA腫瘤疫苗組(見(jiàn)圖15，P＜0.01)；B16瘤苗組和B16-SEA瘤苗組小鼠的平均腫瘤大小較PBS組小，但其間差異無(wú)顯著性(見(jiàn)圖15)。
1.2荷瘤小鼠脾細(xì)胞中的NK活性采用LDH釋放法對(duì)各種不同治療組的(荷瘤)小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行NK活性檢測(cè)。靶細(xì)胞為YAC-1，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例分別為25∶1，50∶1和100∶1。圖16表明與對(duì)照組(PBS)相比，B16-TM-SEA腫瘤疫苗組小鼠的NK活性顯著性增高(P＜0.05)；而B(niǎo)16和B16-SEA腫瘤疫苗組小鼠的NK活性無(wú)顯著性改變(P＞0.05)。1.3荷瘤組小鼠脾細(xì)胞的CTL活性治療結(jié)束后5天，分別選取PBS組、B16腫瘤疫苗組、B16-SEA腫瘤疫苗組、B16-TM-SEA腫瘤疫苗組的小鼠各3只，常規(guī)制備其脾細(xì)胞，在重組小鼠IL-2存在的情況下，與B16細(xì)胞共同孵育7天，以誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生，LDH釋放法測(cè)定CTL的活性。
與PBS組、B16疫苗組及B16-SEA疫苗組比較，B16-TM-SEA疫苗組小鼠脾細(xì)胞的CTL活性顯著升高(見(jiàn)圖17，P＜0.05)；而且當(dāng)E∶T＝50∶1時(shí)，CTL活性升高最為顯著。而B(niǎo)16疫苗組和B16-SEA疫苗組小鼠脾細(xì)胞的CTL活性較PBS組略高，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
1.4荷瘤小鼠的生存期除了用于檢測(cè)NK和CTL活性的3只小鼠之外，對(duì)剩余的5只小鼠，觀察其生存期。結(jié)果表明B16-TM-SEA腫瘤疫苗治療組小鼠較B16、B16-SEA腫瘤疫苗治療組和PBS組小鼠的生存期顯著性延長(zhǎng)(見(jiàn)圖18，P＜0.01)。荷瘤35天后，B16-TM-SEA腫瘤疫苗組小鼠的生存率為80％；而其它組小鼠的生存率為0。
2.腫瘤疫苗對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的免疫保護(hù)作用2.1各免疫組小鼠對(duì)腫瘤細(xì)胞攻擊后的腫瘤生長(zhǎng)曲線用野生型B16細(xì)胞攻擊的B16-TM-SEA疫苗免疫組小鼠與B16疫苗免疫組、B16-SEA疫苗免疫組、PBS組小鼠，以及與EL4細(xì)胞攻擊的B16-TM-SEA腫瘤疫苗免疫組比較，其腫瘤顯著性縮小(結(jié)果見(jiàn)圖19，P＜0.01)。與PBS對(duì)照組和用EL4攻擊的B6-TM-SEA腫瘤疫苗免疫組小鼠相比，B16腫瘤疫苗免疫組和B16-SEA腫瘤疫苗免疫組的腫瘤存在不同程度的縮小(P＜0.05)。結(jié)果表明，使用B16-TM-SEA腫瘤疫苗免疫的C57BL/6小鼠，可以免受同種腫瘤細(xì)胞的攻擊，獲得較強(qiáng)的特異性免疫保護(hù)作用(結(jié)果見(jiàn)圖19)。
2.2免疫小鼠脾細(xì)胞的CTL活性免疫結(jié)束后5天，分別選取PBS組，B16腫瘤疫苗組，B16-SEA腫瘤疫苗組和B16-TM-SEA腫瘤疫苗組的小鼠各3只，常規(guī)制備其脾細(xì)胞，在重組小鼠IL-2存在的情況下，與B16細(xì)胞共同孵育7天，以誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生，LDH釋放法測(cè)定CTL的活性。
與其它三組比較，B16-TM-SEA腫瘤疫苗免疫組小鼠脾細(xì)胞的CTL活性顯著升高(見(jiàn)圖20，P＜0.01＝；而且當(dāng)E∶T＝50∶1時(shí)，CTL活性升高最為顯著。B16腫瘤疫苗組和B16-SEA腫瘤疫苗組小鼠脾細(xì)胞的CTL活性與PBS組比較，也有明顯升高(見(jiàn)圖20，P＜0.05)。
2.3免疫組小鼠的生存期每組剩余的5只小鼠，用于觀察其生存期。結(jié)果表明用B16-TM-SEA腫瘤疫苗免疫的小鼠，當(dāng)用野生型B16細(xì)胞攻擊時(shí)，此組小鼠的生存期較PBS組和用EL4腫瘤細(xì)胞攻擊組的小鼠的生存期顯著性地延長(zhǎng)(見(jiàn)圖21，P＜0.01)有40％的小鼠無(wú)瘤生存。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
SEQ ID NO1，本發(fā)明TM-SEA融合蛋白的核苷酸序列atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca 60cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct 120gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct 180aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc 240ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt 300gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt 360gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat 420aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat 480acagtacctt tggaaacggt taaaacgaat aagaaaaatg taactgttca ggagttggat 540cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat 600gggaaggttc agaggggatt aatcgtgttt catacttcta cagaaccttc ggttaattac 660gatttatttg gtgctcaagg acagtattca aatacactat taagaatata tagagataat 720aaaacgatta actctgaaaa catgcatatt gatatatatt tatatacaag tgccgagcag 780agagccagcc ctctgacgtc catcatctct gcggtggttg gcattctgct ggtcgtggtc 840ttgggggtgg tctttgggat cctcatcaag cgacggcagc agaagatccg gaagtacacg 900atgtaa1～72信號(hào)肽1～771 SEA的序列772～906 TM的序列本發(fā)明所參考的文獻(xiàn)1 White J，Herman A，Pullen AM，et al.The V beta-specific superantigen staphylococcalenterotoxin Bstimulation of mature T cells and clonal deletion in neonatal mice.Cell，1989；56(1)27-352 Janeway，CA.Autoimmune diseaseimmunotherapy by peptides？Nature，1989；341(6242)482-4833 Dohlsten M，Sundstedt A，Bjorklund M，et al.Superantigen-induced cytokines suppressgrowth of human colon-carcinoma cells.Int-J-Cancer，1993；54(3)482-4884 Dhein J，Walczak H，Baumler C，et al.Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/(Fas/CD95).Nature，1995 373(6513)438-4415 Dohlsten M，Abrahmsen L，Bjork P，et al.Monoclonal antibody-superantigen fusion proteintumor specific agents for T-cell-based tumor therapy.Proc Natl Acad Sci USA，1994；91(19)8945-89496 Rosendahl A，Hansson J，Sundstedt A，et al.Immune response during tumor therapy withantibody-superantigen fusion proteins.Int-J-Cancer，1996；68(1)109-1137 Sakurai N，Kudo T，Suzuki M，et al.SEA-scFv as a bifunctional antibodyconstruction of abacterial expression system and its functional analysis.Biochem-Biophys-Res-Commun.1999；256(1)223-308 Shimizu M，Yamamoto A，Nakano H，et al.Augmentation of antitumor immunity withbacterial superantigen，staphylococcal enterotoxin B-bound tumor cells.Cancer-Res，1996；56(16)3731-37369 Shrayer DP，Kouttab N，Hearing VJ，et al.Immunization of mice with melanoma cellstransfected to secrete the superantigen，staphylococcal enterotoxin A.Cancer-Immunol-Immunother.1998；46(1)7-1310 Betley MJ，Mekalanos J.Nucleotide sequences of the type A staphylococcal enterotoxin gene.J Bacteriology，1988，170(1)34-4111 Coussens L，Yang-Feng TL，Liao YC，et al.Tyrosine kinase receptor with extensive homologyto EGF receptor shares chomosomal location with neu oncogene.Science，1985，230(4730)1132-1139
權(quán)利要求
1.跨膜型金黃色葡萄球菌腸毒素A融合蛋白的制備及其應(yīng)用，其特征是構(gòu)建了跨膜型金黃色葡萄球菌腸毒素A(Transmembrane-SEA，TM-SEA)的原核表達(dá)系統(tǒng)(pET-28a-TM-SEA)，制備TM-SEA融合蛋白，為了拓展SEA的抗腫瘤范圍，使SEA能夠更加廣泛地應(yīng)用于多種腫瘤的治療，SEQ ID NO1，顯示本發(fā)明TM-SEA融合蛋白的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的制備本發(fā)明TM-SEA融合蛋白的方法，其特征是本發(fā)明中TM序列來(lái)自表達(dá)c-erb-B2原癌基因的卵巢癌HO-8910細(xì)胞系，SEA基因來(lái)源于金黃色葡萄球菌(ATCC 13565)，剪接重疊延伸法(splicing overlapextension，SOE)將TM片段與SEA基因連接后，分別進(jìn)行克隆和亞克隆，經(jīng)酶切鑒定及核苷酸測(cè)序證實(shí)，獲得重組的表達(dá)載體pET-28a-TM-SEA，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生TM-SEA融合蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的TM-SEA融合蛋白，其特征是用此融合蛋白可制備成腫瘤疫苗，可有效激發(fā)機(jī)體的特異性和非特異性抗腫瘤免疫，用于荷黑色素瘤小鼠的免疫治療，及對(duì)親本腫瘤細(xì)胞攻擊的免疫保護(hù)作用等。
4.如權(quán)利要求1所述的TM-SEA融合蛋白，其特征是用此融合蛋白制備的腫瘤疫苗，可用于腫瘤復(fù)發(fā)和微轉(zhuǎn)移的治療，及廣泛地應(yīng)用于多種腫瘤的治療。
全文摘要
本發(fā)明構(gòu)建了跨膜型金黃色葡萄球菌腸毒素A(Transmembrane Staphylococcal Enterotoxin A，TM－SEA)的原核表達(dá)系統(tǒng)(pET－28a－TM－SEA)，制備了TM－SEA融合蛋白及其腫瘤疫苗。TM－SEA融合蛋白具有跨膜功能，可以將超抗原SEA錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，并具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性；同時(shí)保持了SEA的生活學(xué)活性，具有刺激人外周血淋巴細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞增殖的功能。由其制備的腫瘤疫苗可有效激發(fā)機(jī)體的特異性和非特異性抗腫瘤免疫，能顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)其生存期；可誘導(dǎo)特異性抗腫瘤反應(yīng)，對(duì)同種腫瘤細(xì)胞攻擊可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，該腫瘤疫苗有可能作為一種有效的方法用于腫瘤復(fù)發(fā)和微轉(zhuǎn)移的治療。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1403484SQ0213741
公開(kāi)日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者余海, 馬文學(xué) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)