專利名稱：具有鎮(zhèn)靜催眠作用的酸棗仁總黃酮的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥有效部位的提取分離方法，具體地說是從中藥酸棗仁中提取分離具有鎮(zhèn)靜催眠作用總黃酮的方法。
背景技術：
酸棗仁是鼠李科棗屬植物(Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.Chou)的干燥種子，能養(yǎng)肝寧心，斂汗生津，為傳統(tǒng)鎮(zhèn)靜催眠良藥。近年來的化學研究證明酸棗仁藥材中含有脂肪油、皂甙、糖、多肽和黃酮類物質。雖有文獻分別報道酸棗仁所含的脂肪油、皂甙和黃酮類物質均有鎮(zhèn)靜、催眠作用，但亦有研究對皂甙的鎮(zhèn)靜、催眠效果表示質疑。而酸棗仁中黃酮類物質則因其水溶性較大，分離較困難，更難以進行工業(yè)化的生產(chǎn)。
現(xiàn)有技術中，從酸棗仁中提取分離總黃酮類物質的方法均為萃取法。如藥材先用石油醚或乙醚索式提取法脫脂后，用甲醇或70％乙醇加熱回流提取，再用乙酸乙脂或正丁醇萃取得總黃酮，參見王健，生、炒酸棗仁中鎮(zhèn)靜催眠成分初探，中成藥，1989，11(1)，19-21；曾路等，酸棗仁化學成分研究；藥學學報1987，22(2)114-120。再如藥材脫脂后用乙醇加熱回流提取，將此醇提取物用水溶解，用正丁醇萃取，正丁醇液用5％氫氧化鉀處理，堿水液經(jīng)鹽酸中和后用正丁醇提取得到酚性成分，將酚性成分用甲醇反復重結晶，得總黃酮部位，參見郭勝民等，酸棗仁中阿魏酸的提取、分離和鑒定，西北藥學雜志，1995，10(1)，22-23；郭勝民等，酸棗仁總黃酮的中樞抑制作用，中藥材，1998，21(11)，578-579?，F(xiàn)有技術中采用萃取法從酸棗仁中提取分離總黃酮類物質，不但重現(xiàn)性不好，而且提取物中雜質較多，黃酮含量不高。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是改進從酸棗仁中提取分離具有鎮(zhèn)靜催眠作用總黃酮的方法，使其不但重現(xiàn)性好，而且雜質減少，總黃酮含量高，從而保證了療效的穩(wěn)定，并有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
為解決該技術問題，本發(fā)明研究了下述技術解決方案。
一種酸棗仁總黃酮的制備方法，其特征在于取酸棗仁，加熱，粉碎，脫脂后，加入40-95％乙醇回流提取，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，用含水乙醇梯度洗脫，收集35～55％乙醇洗脫部分，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
上述酸棗仁總黃酮的制備方法，其特征在于酸棗仁加熱至微黃，粉碎成40目粉，石油醚脫脂后，用45-70％乙醇回流提取，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，用含水乙醇梯度洗脫，收集40～50％乙醇洗脫部分，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
所述酸棗仁總黃酮的制備方法，其特征在于酸棗仁用炒、烘焙或微波方法加熱至微黃，粉碎成40目粉，石油醚脫脂后，用藥材重量6-10倍體積的50-60％乙醇，于80～95℃條件下回流提取，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，用含水乙醇梯度洗脫，收集40～50％乙醇洗脫部分，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
酸棗仁總黃酮的較好的制備方法是用藥材重量7-9倍體積的50-55％乙醇，于85～90℃條件下回流提取2次，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，用含水乙醇梯度洗脫，收集40～50％乙醇洗脫部分，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
所述酸棗仁總黃酮的更為合適的制備方法為用藥材重量8倍體積的50％乙醇，于85℃條件下回流提取2次，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，依次用25％、45％、70％、95％的乙醇梯度洗脫，收集45％乙醇洗脫液，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
前述酸棗仁總黃酮可與藥學上適用載體混合，制備具有鎮(zhèn)靜催眠作用的藥物。
本發(fā)明工藝所用的藥材炮制方法是經(jīng)實驗比較而得出，提取溶劑種類和濃度、提取方法、藥材粉碎目數(shù)等經(jīng)過正交設計研究而成，保證了所得到的酸棗仁總黃酮得率高；大孔樹脂的洗脫分段，經(jīng)過嚴格的小濃度梯度實驗，保證了所得到的分段部位中主要黃酮(spinosin，6-feruolspinosin等)的含量達到50～60％，藥材中總黃酮的轉移率為60～85％。
其研究步驟和詳細數(shù)據(jù)如下1.藥材選用鼠李科棗屬植物Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥種子，藥材的性狀特征、粉末特征、理化性質應符合中國藥典2000版一部“酸棗仁”項下的內容。2.優(yōu)化提取工藝的技術條件2.1藥材炮制藥材經(jīng)炒制后，提取物中黃酮類成分含量較高。2.2提取溶劑根據(jù)本課題組長期研究酸棗仁的經(jīng)驗，酸棗仁所含黃酮多為黃酮苷類極性較大的化合物，甲醇或乙醇是優(yōu)良的提取溶劑，但甲醇毒性較大，所以本發(fā)明用乙醇溶液作為總黃酮的提取溶劑，而且采用含水量較高的乙醇提取。2.3提取方式對提取效率的影響分別取粉碎成40目的藥材粉末約20g，精密稱定，以8倍量50％乙醇按下列方法提取冷浸8倍量溶劑冷浸12小時，提取2次。滲漉16倍量溶劑滲漉。熱回流8倍量溶劑85℃熱回流，提取2次。
分別合并各種提取液，按紫外分光光度法分別測定提取物中總黃酮量，結果如表1。
表1提取方式對提取效率的影響樣品 總黃酮得提取方式 總黃酮得量(mg) 浸膏量(g)重(g) 率(％)50.00 201.6 5.650.01冷浸 202.5 202.7±1.5 5.35.5±0.10.4150.15 204.1 5.550.00 220.2 6.350.10滲漉 225.4 222.3±3.2 6.2 6.2±0.4 0.4450.03 219.7 6.250.09 308.6 7.850.08 熱回流 306.9 306.2±2.6 7.8 7.6±0.2 0.6150.00 303.2 7.4以上結果可見，熱提的提取效率最高，滲漉次之，冷浸較差，而且三者差異顯著。2.4提取工藝的優(yōu)化為了確定乙醇濃度、用量、溫度以及提取次數(shù)對提取效率的影響，我們進行了正交設計試驗研究，以總黃酮的含量為指標，對提取工藝進行了優(yōu)化。用熱回流法提取，提取液濃縮后，按紫外分光光度法測定提取物中總黃酮含量。
提取工藝正交實驗涉及溶劑濃度、溫度、溶劑用量、提取次數(shù)等，分別測定總黃酮量、浸膏量和總黃酮得率。
綜合考慮到總黃酮提取總量、含量及得率，同時結合到工業(yè)化生產(chǎn)的成本、后處理的難易，以及工藝的穩(wěn)定與重現(xiàn)性等因素，本發(fā)明選用按藥材重量計6-10倍體積的40-95％乙醇，于80～95℃條件下進行回流提取。較好的提取分離條件是用藥材重量7-9倍體積的45-70％乙醇，回流提取。較佳條件還有用藥材重量7-9倍體積的50-60％乙醇，于80～90℃條件下回流提取2次。更佳條件為用藥材重量8倍體積的50％乙醇，于85℃條件下回流提取2次。2.5酸棗仁總黃酮的分離、純化、濃縮與干燥工藝2.5.1分離與純化工藝本課題組研究表明，酸棗仁提取物經(jīng)D-101大孔樹脂分段，依次用水，25％，45％，70％，95％乙醇洗脫，收集45％乙醇洗脫部分，減壓濃縮后干燥，即得總黃酮部分。2.5.2濃縮與干燥工藝將45％乙醇洗脫部分過濾，減壓回收溶劑，真空干燥，即得總黃酮部位，其中總黃酮的含量可達到50～60％，藥材的轉移率可達到60～85％。3.酸棗仁鎮(zhèn)靜催眠作用研究按常規(guī)，以對戊巴比妥鈉閾上、閾下劑量誘導的小鼠睡眠的影響為指標，研究了酸棗仁的總黃酮部位對正常小鼠的鎮(zhèn)靜催眠藥效。3.1試驗材料3.1.1受試藥物酸棗仁，采自河北邢臺市；及從酸棗仁藥材中提取的脂肪油，總黃酮和總皂苷部位。
戊巴比妥鈉Serva進口，上?；瘜W試劑分裝廠分裝，批號84-06-12。3.1.2受試動物昆明種小白鼠，體重18～22g，雄性，由中國藥科大學實驗動物中心提供。3.2方法與結果3.2.1對戊巴比妥鈉閾下劑量潛伏期試驗劑量的影響試驗試驗方法取昆明種小鼠60只，體重18-22g，雄性，隨機分成6組，每組10只。一組為正常對照組，ig生理鹽水，另外五組為給藥組，分別給藥樣品1酸棗仁水溶液提取物，用量按5g生藥/kg計；樣品2酸棗仁70％醇溶液提取物，用量相當于5g生藥/kg；樣品3酸棗仁脂肪油吐溫80溶液，用量相當于10g生藥/kg；樣品4本發(fā)明方法制得的酸棗仁總黃酮，用量相當于10g生藥/kg；樣品5酸棗仁總皂甙，用量相當于10g生藥/kg。
以上各樣品的給藥體積為0.1ml/10g，給藥1h后，ip注射0.27％戊巴比妥鈉27mg/kg，給藥體積為0.1ml/10g。ip后，記錄翻正反射消失需要的時間。結果采用student’s t-test進行統(tǒng)計分析表示組間差異，參見表2。
表2、戊巴比妥鈉閾下劑量潛伏期試驗

**P＜0.05vs.Control結果表明酸棗仁的總黃酮部位有顯著的可協(xié)同閾下劑量戊巴比妥鈉誘導睡眠的作用。3.2.2對戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠時間的影響試驗試驗方法取昆明種小鼠60只，體重18-22g，雄性，隨機分成6組，每組10只。一組為正常對照組，ig生理鹽水，另外五組為給藥組，分別給藥樣品1酸棗仁水溶液提取物，用量相當于5g生藥/kg；樣品2酸棗仁70％醇溶液提取物，用量相當于5g生藥/kg；樣品3酸棗仁脂肪油吐溫80溶液，用量相當于10g生藥/kg；樣品4酸棗仁總黃酮，用量相當于10g生藥/kg；樣品5酸棗仁總皂甙，用量相當于10g生藥/kg。
上述各樣品給藥體積為0.1ml/10g，給藥1h后，ip注射0.35％戊巴比妥鈉35mg/kg，給藥體積為0.1ml/10g。ip后，記錄翻正反射消失至翻正反射恢復所需時間，即睡眠時間。結果采用“學生t-試驗法”進行統(tǒng)計分析表示組間差異，參見表3。
表3、戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠期試驗

***P＜0.01，**P＜0.05vs.Control結果表明樣品1(酸棗仁水溶液提取物)，樣品2(酸棗仁70％醇溶液提取物)、樣品3(酸棗仁脂肪油吐溫80溶液)、樣品4(酸棗仁總黃酮)都有增長戊巴比妥鈉閾上劑量誘導的睡眠期作用。
綜合上述兩個實驗的結果表明本發(fā)明制備的酸棗仁總黃酮有顯著的鎮(zhèn)靜催眠作用。
具體實施例方式
實施例1取酸棗仁藥材20kg，微炒至黃色，有撲鼻香味，粉碎成40目粉，石油醚80℃索式法提取12小時進行脫脂后，采用藥材重量6倍體積的45％乙醇75℃熱回流提取三次，每次1小時。提取液合并，減壓回收溶劑，所得濃縮液用D101大孔樹脂分段，洗脫劑為梯度增加的乙醇溶液。收集35-55％乙醇段洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏經(jīng)真空干燥，即得酸棗仁總黃酮粗品0.17kg，其總黃酮含量為50％，轉移率為66％。
實施例2取酸棗仁藥材20kg，微炒至黃色，粉碎成40目粉，石油醚80℃索式法提取12小時進行脫脂后采用藥材重量8倍體積的70％乙醇85℃熱回流提取二次，每次1小時。提取液合并，減壓回收溶劑，所得濃縮液用D101大孔樹脂分段，洗脫劑為梯度增加的乙醇溶液。收集45-50％乙醇段洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏經(jīng)真空干燥，即得酸棗仁總黃酮粗品0.16kg，其總黃酮含量為55％，轉移率為70％。
實施例3取酸棗仁藥材20kg，微炒至黃色，粉碎成40目粉，石油醚80℃索式法提取12小時進行脫脂后，采用藥材重量10倍體積的95％乙醇95℃熱回流提取二次，每次1小時。提取液合并，減壓回收溶劑，所得濃縮液用大孔樹脂分段，洗脫劑為梯度增加的乙醇溶液。收集45-55％乙醇段洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏經(jīng)真空干燥，即得酸棗仁總黃酮粗品0.15kg，其總黃酮含量為51％，轉移率為60％。
實施例4
取酸棗仁藥材20kg，微炒至黃色，有撲鼻香味，粉碎藥材至40目，石油醚80℃索式法提取12小時進行脫脂后，以熱回流方式，用50％乙醇，8倍量溶劑，85℃，提取2次。合并提取液，減壓濃縮至濃縮液體積與藥材的重量比為0.8-1.0。濃縮液用多層紗布過濾，上樣于D-101大孔樹脂頂端，用水，25％，45％，70％，95％乙醇梯度洗脫，收集45％乙醇段洗脫液，減壓回收溶劑，真空干燥得0.18kg酸棗仁總黃酮粗品，其總黃酮含量為59％，轉移率為84％。
權利要求
1.一種酸棗仁總黃酮的制備方法，其特征在于取酸棗仁，加熱，粉碎，脫脂后，加入40-95％乙醇回流提取，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，用含水乙醇梯度洗脫，收集35～55％乙醇洗脫部分，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
2.根據(jù)權利要求1所述酸棗仁總黃酮的制備方法，其特征在于酸棗仁加熱至微黃，粉碎成40目粉，石油醚脫脂后，用45-70％乙醇回流提取，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，用含水乙醇梯度洗脫，收集40～50％乙醇洗脫部分，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
3.根據(jù)權利要求2所述酸棗仁總黃酮的制備方法，其特征在于酸棗仁用炒、烘焙或微波方法加熱至微黃，粉碎成40目粉，石油醚脫脂后，用藥材重量6-10倍體積的50-60％乙醇，于80～95℃條件下回流提取，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，用含水乙醇梯度洗脫，收集40～50％乙醇洗脫部分，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
4.根據(jù)權利要求3所述酸棗仁總黃酮的制備方法，其特征在于用藥材重量7-9倍體積的50-55％乙醇，于85～90℃條件下回流提取2次，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，用含水乙醇梯度洗脫，收集40～50％乙醇洗脫部分，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
5.根據(jù)權利要求4所述酸棗仁總黃酮的制備方法，其特征在于用藥材重量8倍體積的50％乙醇，于85℃條件下回流提取2次，提取液濃縮后上D-101大孔樹脂柱，依次用25％、45％、70％、95％的乙醇梯度洗脫，收集45％乙醇洗脫液，回收溶劑，殘留物即為總黃酮。
6.根據(jù)權利要求1～5之一所述方法得到的酸棗仁總黃酮，可與藥學上適用載體混合，制備具有鎮(zhèn)靜催眠作用的藥物。
全文摘要
一種酸棗仁總黃酮的制備方法，取酸棗仁，加熱，粉碎，脫脂后，加入40－95％乙醇回流提取，提取液濃縮后上大孔樹脂柱，用含水乙醇梯度洗脫，收集35～55％乙醇洗脫部分，回收溶劑后，得總黃酮，其可與藥學輔料混合，制備具有鎮(zhèn)靜催眠作用的藥物；該方法不但重現(xiàn)性好，而且雜質減少，總黃酮含量高，從而保證了療效的穩(wěn)定，并有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P25/00GK1401643SQ02138270
公開日2003年3月12日 申請日期2002年9月13日 優(yōu)先權日2002年9月13日
發(fā)明者李萍, 王少敏, 李會軍, 竇昌貴 申請人:中國藥科大學