專利名稱：微生物、微生物抗病毒產(chǎn)品及其應(yīng)用的制作方法
發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的微生物，由其獲得的抗病毒產(chǎn)品，培養(yǎng)方法及其在抗病毒中的應(yīng)用。
芽孢桿菌類細(xì)菌有11個(gè)屬100多種，是一類具有眾多生物用途的微生物群落，目前在對(duì)芽孢桿菌的研究主要集中在用芽孢桿菌生產(chǎn)酶制劑、冶煉金屬，以及用芽孢桿菌作殺蟲劑、作食品保鮮劑和用于外源基因的表達(dá)系統(tǒng)。某些類別的芽孢桿菌抗細(xì)菌性疾病的研究已有報(bào)道。
發(fā)明技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的微生物，該微生物及其提取物具有抗病毒作用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)該微生物的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供新的微生物及其提取物在抗病毒中的應(yīng)用。
一種新的微生物，該微生物或其提取物對(duì)人體及動(dòng)物無害，具有廣譜抗病毒作用。該微生物為地衣芽孢桿菌類，經(jīng)菌種鑒定是地衣芽孢桿菌變種(Bacilluslickeniformis)。該微生物從畜禽糞便中分離，通過紫外線誘變，再通過亞硝基胍處理篩選得到，并優(yōu)選生長穩(wěn)定，抗病毒力強(qiáng)的菌種命名為CX990C2。
地衣芽孢桿菌CX990C2是一個(gè)經(jīng)長期篩選獲得新菌株，生長培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基組成以1000毫升體積計(jì)，含牛肉膏3～7克，蛋白胨5克～15克，葡萄糖5～15克，NaCl 3～7克。培養(yǎng)基PH值6.6-7.0，培養(yǎng)溫度為28℃～35℃。在固體培養(yǎng)基中可加入15～20克瓊脂。優(yōu)選的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基組成為以1000毫升體積計(jì)，含牛肉膏5克，蛋白胨1克，葡萄糖10克，NaCl 5克，培養(yǎng)基pH值為6.8，培養(yǎng)溫度為32℃，固體培養(yǎng)基可加入20克瓊脂。
本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌CX990C2具有下列形態(tài)學(xué)及生理生化特征1)個(gè)體形態(tài)特征正常菌體長2.2～3.4um，寬0.6～1.0um；形狀為橢圓形；革蘭氏反應(yīng)陽性；菌體生長排列以單個(gè)為主；芽孢位置為中生；孢囊不膨大。
2)群體形態(tài)特征在瓊脂平板上菌落呈現(xiàn)下列特征形狀不規(guī)則；菌落較??；邊緣葉裂狀；表面質(zhì)地粗糙有褶皺；光學(xué)特征為不透明；顏色為暗臘色；隆起程度是稍隆起；生長速度較慢。
3)液體培養(yǎng)特征有菌膜；菌液呈現(xiàn)較混濁；但無沉淀。
4)生理生化特征
本發(fā)明培養(yǎng)的菌種可采用傳統(tǒng)的方法濃縮收集，如離心法、冷凍干燥法；本發(fā)明培養(yǎng)的菌種提取物也是采用傳統(tǒng)的提取方法，如離心去沉淀，上清液濃縮、過濾而得提取物。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了新的微生物單獨(dú)制成的飼料添加劑在預(yù)防與治療禽流感病毒性疾病，豬流感病毒性疾病，動(dòng)物口蹄疫疾病，豬附紅細(xì)胞體病，豬疾病性腹瀉病，草魚出血性病毒性疾病以及偽狂犬病毒性疾病中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中提供了新的微生物也可同其它有益的微生物如光合菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌中的一種或多種混合使用，在預(yù)防與治療禽流感病毒性疾病，豬流感病毒性疾病，動(dòng)物口蹄疫疾病，豬附紅細(xì)胞體病，豬病毒性腹瀉，草魚出血性病毒性疾病以及偽狂犬病毒性疾病中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了新的微生物的提取物單獨(dú)制成的飼料添加劑在預(yù)防與治療禽流感病毒性疾病，豬流感病毒性疾病，動(dòng)物口蹄疫疾病，豬附紅細(xì)胞體病，豬病毒性腹瀉，草魚出血性病毒性疾病以及偽狂犬病毒性疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的新的微生物提取物也可同其它有益的微生物如光合菌、乳酸菌等菌種發(fā)酵提取物混合使用，在預(yù)防與治療禽流感病毒性疾病，豬流感病毒性疾病，動(dòng)物口蹄疫疾病，豬附紅細(xì)胞體病，豬病毒性腹瀉，草魚出血性病毒性疾病以及偽狂犬病毒性疾病中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一方面，提供了新的微生物單獨(dú)或與口服液中可接收的載體等制成的口服液在預(yù)防與治療乙型肝炎病毒性疾病，皰疹病毒性疾病，腺病毒性疾病的藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的新的微生物也可同其它有益微生物如乳酸菌，酪酸梭菌，雙歧桿菌等以及口服液中可接收的載體等制成的口服液在預(yù)防與治療乙型肝炎病毒性疾病，皰疹病毒性疾病，腺病毒性疾病的藥品中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了新的微生物提取物或與口服液中可接收的載體制成的口服液在預(yù)防乙型肝炎病毒性疾病、皰疹病毒性疾病、腺病毒性疾病，流感病毒性疾病的藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供新的微生物提取物也可同其它有益微生物如乳酸菌、酪酸梭菌，雙歧桿菌等中的一種或多種提取物以及口服液中可接收的載體等制成的口服液在預(yù)防乙型肝炎病毒疾病、皰疹病毒性疾病、腺病毒性疾病，流感病毒疾病的藥品中的應(yīng)用。
從地衣芽孢桿菌CX990C2中獲取的提取物單獨(dú)使用可有效地抑制偽狂犬病毒PRV對(duì)豬腎細(xì)胞PK15；禽流感病毒AIV對(duì)原代雞成纖維細(xì)胞；魚呼腸孤病毒FRV對(duì)草魚腎細(xì)胞GIK；人皰疹病毒I型HSV-1對(duì)人宮頸瘤細(xì)胞Hela，腺病毒ADV-III對(duì)原代腎細(xì)胞293的感染，其有效抑制病毒滴度平均在8個(gè)TCID50左右。從地衣芽孢桿菌CX990C2中獲取的提取物與從其它有益微生物如乳酸菌酵母菌中的提取物混合后，其有效抑制病毒滴度平均在8～10個(gè)TCID50左右。用芽孢桿菌單獨(dú)或混合制備的飼料添加劑飼養(yǎng)動(dòng)物，與不同添加劑如化學(xué)添加劑，抗生素添加劑的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比，抗病毒感染高出80％以上。
下面結(jié)合具體實(shí)施例。進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如殷震，劉累華主編，科學(xué)出版社，1997，動(dòng)物病毒學(xué)；熊宗貴主編，高等教育出版社，1999，生物技術(shù)制藥；以及沈萍主編，高等教育出版社，1999，微生物學(xué)等書中所述的條件，或接照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1、抗病毒芽孢桿菌的篩選和獲得從1984年開始，從土壤、中草藥、污水、畜禽糞便等樣品中，分離出100多株芽孢桿菌，通過紫外線誘導(dǎo)，亞硝基胍處理，以抗病毒為目的反復(fù)多次篩選，最后選出6株芽孢桿菌，再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，優(yōu)選生長穩(wěn)定，抗病毒力強(qiáng)的一株新的芽孢桿菌進(jìn)行菌種鑒定根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明獲得的芽孢桿菌具有現(xiàn)有的芽孢桿菌不同的特性，是地衣芽孢桿菌變種(Bacillus lickeniformis)，命名為CX990C2。實(shí)施例2 抗病毒芽孢桿菌的培養(yǎng)方法培養(yǎng)基成份，以1000毫升計(jì)，牛肉膏5克，蛋白胨10克，葡萄糖10克，氯化鈉5克，調(diào)PH為6.8。固體培養(yǎng)基加瓊脂20克，滅菌制成平板，劃線接種芽孢桿菌。置30℃，培養(yǎng)24小時(shí)，可見典型芽孢桿菌菌落。實(shí)施例3 抗病毒芽孢桿菌的培養(yǎng)方法培養(yǎng)其成份，以1000毫升計(jì)，牛肉膏5克，蛋白胨10克，葡萄糖10克，NaCl 5克，調(diào)PH為7.0。滅菌，接種芽孢桿菌0.5毫升，置28℃，培養(yǎng)36小時(shí)，用分光光度計(jì)測(cè)細(xì)菌OD600＝0.8實(shí)施例4 地衣芽孢桿菌及其提取物的獲得將實(shí)施例3中培養(yǎng)的芽孢桿菌3000rmp離心30分鐘，收集沉淀即芽孢桿菌的活菌種。取上清用0.22μm膜濾器除菌即得其提取物。實(shí)施例5 地衣芽孢桿菌提取物抗偽狂犬病毒在96孔培養(yǎng)板中接種豬腎細(xì)胞PK-15，每孔細(xì)胞100μl，細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，培養(yǎng)24小時(shí)，至細(xì)胞40％形成單層。一組接種不同稀釋度的偽狂犬病毒PRV；另一組對(duì)應(yīng)接種不同稀釋度的偽狂犬病毒和實(shí)施例4中獲得的芽孢桿菌提取物。吸附24小時(shí)，用5％正常維持培養(yǎng)基更換，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。一周內(nèi)，芽孢桿菌提取物可有效抑制8個(gè)TCID50偽狂犬病毒。實(shí)施例6 地衣芽孢桿菌與乳酸菌、雙歧桿菌提取物抗禽流感病毒取13日齡雞胚，無菌條件下制備雞胚成纖維細(xì)胞，在96孔培養(yǎng)板中接種雞胚成纖維細(xì)胞，每孔100μl，細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，培養(yǎng)24小時(shí)至80％形成單層，一組接種不同稀釋度的禽流感病毒AIV，另一組對(duì)應(yīng)接種不同稀釋度的禽流感病毒AIV與二株菌的混合提取物，吸附24小時(shí)，用5％正常維持培養(yǎng)基更換。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，在3天內(nèi)，混合提取物能有效抑制10個(gè)TCID50禽流感病毒。實(shí)施例7 抗病毒芽孢桿菌作飼料添加劑抗病毒實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例4收集活菌產(chǎn)物用作飼料添加劑飼養(yǎng)10日齡雛雞，同時(shí)設(shè)常規(guī)飼料對(duì)照組。一周后，用禽流感病毒噴霧雞舍，對(duì)雛雞攻毒，攻毒3天內(nèi)，對(duì)照組雛雞大量死亡。結(jié)果如下 實(shí)施例8地衣芽孢桿菌變種和光合細(xì)菌，酵母菌、放線菌作飼料添加劑抗魚呼腸孤病毒將地衣芽孢桿菌變種和光合細(xì)菌，酵母菌、放線菌作飼料添加劑飼養(yǎng)草魚，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組。飼養(yǎng)20天。每池放入人工注射患呼腸孤病毒的草魚30尾作病毒源，飼養(yǎng)水溫控制在32±2℃。十天內(nèi)，對(duì)所有死魚進(jìn)行解剖，確認(rèn)死因，結(jié)果如下 實(shí)施例9 地衣芽孢桿菌變種提取物地抗乙肝病毒效果。
本發(fā)明的地衣芽孢桿菌變種提取物經(jīng)32例志愿者服用，臨床觀察。志愿者的選擇采取自愿的原則，并選擇病史、病情、年齡性別及原治療方法相當(dāng)?shù)囊腋尾《净颊?2例為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的病例按WHO 1980年制定的乙肝病毒診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的成年乙肝病毒患者，年齡在27-70歲之間，病程半年以上。試驗(yàn)組，在原治療基礎(chǔ)上，停用其它藥，服用本發(fā)明的提取物；對(duì)照組，常規(guī)治療方案，觀察其三個(gè)月，一個(gè)月一個(gè)療程，共三個(gè)療程。服用方法，25毫升/次，日服2次。結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1 一種微生物，其特征在于它是地衣芽孢桿菌變種(Bacillus lickeniformis)，具有抗病毒功能。
2 一種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述微生物的方法，其特征是培養(yǎng)基組成以1000毫升體積計(jì)，含牛肉膏3～7克，蛋白胨5克～15克，NaCl 3～7克，葡萄糖5～15克。培養(yǎng)基PH值6.6-7.0，培養(yǎng)溫度為28℃～35℃。
3 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是培養(yǎng)基組成為以1000毫升體積計(jì)，含牛肉膏5克，蛋白胨10克，NaCl 5克，葡萄糖10克，培養(yǎng)基pH值為6.8，培養(yǎng)溫度為32℃。
4 一種權(quán)利要求1所述微生物單獨(dú)或同其它有益微生物制成的飼料添加劑在預(yù)防與治療禽流感病毒性疾病，豬流感病毒性疾病，動(dòng)物口蹄疫疾病，豬附紅細(xì)胞體病，豬病毒性腹瀉，草魚出血性病毒性疾病以及偽狂犬病毒性疾病中的應(yīng)用。
5 一種權(quán)利要求1所述微生物的提取物單獨(dú)或同其它有益微生物的提取物制成的飼料添加劑在預(yù)防與治療禽流感病毒性疾病，豬流感病毒性疾病，動(dòng)物口蹄疫疾病，豬附紅細(xì)胞體病，豬病毒性腹瀉，草魚出血性病毒性疾病以及偽狂犬病毒性疾病中的應(yīng)用。
6 一種權(quán)利要求1所述微生物單獨(dú)或同其它有益微生物制成的口服液在預(yù)防與治療乙型肝炎病毒性疾病，皰疹病毒性疾病，腺病毒性疾病的藥品中的應(yīng)用。
7 一種權(quán)利要求1所述微生物的提取物單獨(dú)或同其它有益微生物的提取物制成的口服液在預(yù)防與治療乙型肝炎病毒性疾病，皰疹病毒性疾病，腺病毒性疾病的藥品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的微生物，該微生物是地衣芽孢桿菌類，具有抗病毒活力；本發(fā)明還公開了一種培養(yǎng)該微生物的方法，以及由該微生物的活菌單獨(dú)或同其它有益微生物制成的口服液或飼料添加劑在抗病毒性疾病中應(yīng)用，和該微生物的提取物單獨(dú)或同其它有益微生物提取物制成的口服液或飼料添加劑在抗病毒性疾病中應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1470631SQ02138818
公開日2004年1月28日 申請(qǐng)日期2002年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月23日
發(fā)明者蘇雄, 蘇 雄 申請(qǐng)人:湖北暢響生物工程股份有限公司