專利名稱：魚類精巢發(fā)育因子的基因序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類胚胎發(fā)育神經(jīng)胚期起始表達(dá)的基因序列，更具體涉及一種從銀鯽胚胎發(fā)育尾芽期SMART cDNA文庫中篩選出的一個精巢高度富含的新基因精巢發(fā)育因子1(Tdf1)(testis development factor 1)的核苷酸序列、氨基酸序列及其時空表達(dá)圖譜，本發(fā)明還涉及該基因的用途。
背景技術(shù)：
兩性差異是脊椎動物個體間最大的差異，它不但表現(xiàn)在雌雄個體間不同的生殖器官上，而且還表現(xiàn)在諸如體色、大小等與生長速度和經(jīng)濟性狀相關(guān)的多方面。在長期的生產(chǎn)實踐中，人們早已發(fā)現(xiàn)，不同性別的動物往往在生長速度和商品價值上有著明顯的差異，如雌性鯽魚、鯉魚、鱖魚、牙鲆等的生長速度比雄性個體約快30％；鱘魚和鯔魚的魚籽價值要比魚本身高出百倍，東北林蛙(哈士蟆)的卵巢腺每公斤價值4000元，比作為食用的蛙高出數(shù)百倍。因此，自20世紀(jì)80年代以來，動物的性別決定機制以及性別決定基因的鑒定一直是生命科學(xué)和生物技術(shù)的研究熱點，并在動物遺傳育種生物技術(shù)中發(fā)展起以人工培育單性動物群體為目標(biāo)的性別控制育種技術(shù)。性激素誘導(dǎo)和染色體組操作可以產(chǎn)生全雌性后代，但操作相對費時。近年來，隨著基因組計劃的啟動和功能基因組時代的到來，一些遺傳育種學(xué)家開始將注意力轉(zhuǎn)向了性別決定基因，并試圖用這些基因來達(dá)到動物性控目的。
銀鯽(Carassius auratus gibelio)屬鯉科(Cyprinidae)鯽屬(Carassius)鯽(C.auratus)的一個亞種，廣泛分布于北歐到西伯利亞及亞洲一帶，是重要的經(jīng)濟魚類。銀鯽具有雌核發(fā)育單性生殖的能力，有趣的是，它與其它單性物種明顯不同，在其天然種群和人工自交繁育群體中存在約5％-20％的雄性個體。銀鯽卵子用其它魚類的精子授精時，其后代全為雌性，而當(dāng)用銀鯽的精子授精時，產(chǎn)生的后代中出現(xiàn)一定比例的雄性個體，既表明銀鯽的卵子具有特殊的應(yīng)答精子的機制，也說明在其精子發(fā)生、受精以及胚胎發(fā)育過程中存在微妙的獨特調(diào)控方式。雖然已經(jīng)在小鼠等動物中鑒定出了Dmrt和SOX等基因家族，并認(rèn)為它們與動物性別決定相關(guān)，但是生物的性別控制和分化涉及許多基因參與，是一個極為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還有許多未知基因參與了動物性別決定與分化，因此，鑒定和分離調(diào)控性別決定與分化的基因無疑能為動物性控育種提供堅實的技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種魚類精巢發(fā)育因子的基因序列、氨基酸序列和時空表達(dá)圖譜，篩選方法簡便。
本發(fā)明還涉及一種魚類精巢高度豐富的基因序列在魚類的生殖調(diào)控中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種魚類精巢高度豐富的基因序列在魚類的雄性性腺分化中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種魚類精巢高度豐富的基因序列在魚類性別決定繁殖和人工性別調(diào)控中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種魚類精巢高度豐富的基因序列在飼料制備人工餌料中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施本發(fā)明所述的基因Tdf1是從銀鯽尾芽期胚胎的SMART cDNA質(zhì)粒文庫中篩選到的一個新基因。其cDNA序列和編碼蛋白的氨基酸序列如下。該基因cDNA全長761bp，自54bp至476bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼141個氨基酸，5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元，沒有特殊的結(jié)構(gòu)域或跨膜區(qū)，3’非編碼區(qū)長285bp，有多聚腺苷酸加尾信號(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中進行同源搜索，發(fā)現(xiàn)與其它基因無任何同源性，為一新基因。Tdf1基因的cDNA序列如下ACGCGGGGACTCCAGTCCTTTAATTCTCTCTACAGGAATCTCACTAGCACAAGATGAAGCTGACATTTGCTCTCATTCTTGCACTCCAAGTGTCAGTGTGTGTCTGGGCACAGGAATGGCCCCAGCCTGACAAGGAGTTAGTAGAGAAATATGAGGGGCTGAAGGCAGTTTTCTTTAAGAGGATCGTCAATGCTTGGGAAAAGACCAAAGCTGCCCTTCAGCCAACACTCGAGGGCTCACCAACAGGAGATCAAGCCAAACAAATTCTTGAAGAACTGAGCAAAAGGCCAAGAGTGGAGAGTGCCATCAAAATCATCGGCGGTTTGGCCAGTGATATGGAGCCTATGGTGGACAAAGCTCGCATGGCTCTTCTTGGTGCTTATGGCCACTATCTGCGGCCCCACATCGGAGAATACCTGGACAGGGCAATCACCAACATCAAGCCCGTGCTGGATACTGTCCTGCCTCATGAGGGTTAGAGTCTGCAGCTCATCAACCACTGATTCCTTCAACCCAGCAAACTTCAATAATAGATCTGGATGCTGTGTGTCCAGCACGTCGGTGCAGATTTTGCATGTATATACTGTATCTGTGTATTTGATACCATTCTGTTCAGTGCAGGAAAAATAAAAAACACCCAGCCCAGCATTAATAGAGAATGAATTATGTGATTTTGTGTGCCTCATAAAGAAACAACATGACCCATTCTAAATAAAAACATCTGGAAAATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Tdf1基因編碼蛋白的氨基酸序列如下MKLTFALILALQVSVCVWAQEWPQPDKELVEKYEGLKAVFFKRIVNAWEKTKAALQPTLEGSPTGDQAKQILEELSKRPRVESAIKIIGGLASDMEPMVDKARMALLGAYGHYLRPHIGEYLDRAITNIKPVLDTVLPHEG運用RT-PCR技術(shù)考察了Tdf1在銀鯽腦、卵巢、腎臟、精巢、心臟、肝臟和脾臟的mRNA水平，考察了其在銀鯽未受精的成熟卵細(xì)胞、受精后40分鐘、多細(xì)胞期、桑椹期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心跳開始期、出苗前期和出苗期的表達(dá)圖譜，結(jié)果表明該基因在成熟卵細(xì)胞以及胚胎發(fā)育早期無mRNA轉(zhuǎn)錄本，神經(jīng)胚期可以明顯檢測到mRNA存在，肌肉效應(yīng)期后擴增帶的亮度基本無變化，直至出苗(附圖1)。成魚組織中的結(jié)果顯示，該基因在精巢中的mRNA豐度很高，在脾中可以檢測到微量mRNA的存在，而在其它組織中未檢測到mRNA產(chǎn)物(附圖2)。這表明該基因在銀鯽的雄性性腺誘導(dǎo)分化和生殖調(diào)控中具有重要功能。
鑒于Tdf1基因是全新基因，目前人類對此基因的認(rèn)識和了解僅限于本發(fā)明人所作的科學(xué)工作研究。由于該基因基本只在精巢中表達(dá)，而且，銀鯽卵子用非銀鯽的異源精子授精時產(chǎn)生的后代均為雌性個體，而以銀鯽精子授精時產(chǎn)生的后代有5-20％的雄性個體，因此它有可能在銀鯽的生殖授精和雄性性腺誘導(dǎo)分化中有著重要功能。通過制備該基因的原核表達(dá)蛋白和真核酵母表達(dá)蛋白，用于研究該基因在銀鯽的生殖調(diào)控、雄性性腺分化中的作用。通過制備該基因的真核酵母表達(dá)蛋白，可作為飼料添加劑制備人工餌料，可能改變銀鯽和其它魚類的繁殖力和人工控制性別。
本發(fā)明的優(yōu)點通過制備該基因的蛋白，用于研究該基因在銀鯽的生殖調(diào)控、雄性性腺分化中的作用，通過制備酵母表達(dá)的蛋白，可制備人工餌料，改變銀鯽和其它魚類的繁殖力和人工控制性別。


圖1為RT-PCR檢測基因Tdf1在銀鯽組織中的表達(dá)。
1-未受精卵；2 受精40分鐘；3-多細(xì)胞期；4-桑椹胚；5-囊胚；6-原腸胚；7-神經(jīng)胚；8-尾芽期；9-肌肉效應(yīng)期；10-心跳開始期；11-出苗前期；12-出苗期。MDL 2 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。表明該基因在神經(jīng)胚期以前不轉(zhuǎn)錄，而在神經(jīng)胚期開始的所有胚胎發(fā)育階段均可檢測到mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物圖2為RT-PCR檢測基因Tdf1在銀鯽組織中的表達(dá)。
1-腦；2-卵巢；3-腎臟；4-精巢；5-肝臟；6-心臟；7-脾；8-基因組對照。MDL 2 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖中表明該基因在精巢中mRNA豐度極高，其它組織中除了脾臟有極少量的mRNA外均無轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，提示該基因為精巢特異性表達(dá)基因，可能與銀鯽精巢誘導(dǎo)發(fā)育以及性別調(diào)控和生殖調(diào)控有關(guān)。
具體實施例方式
1.超速離心法提取尾芽期胚胎的總RNA用三氟乙酸銫鹽(CsTFA)密度梯度超速離心提取總RNA，步驟詳見RNAExtraction Kit(Pharmaica)操作手冊。銀鯽胚胎于20℃條件下在盛有暴氣水的培養(yǎng)名中孵化，稱取1.4g尾芽期胚胎，加入8mL提取緩沖液，勻漿。5,000×g離心取上清，上清用7號針頭反復(fù)抽吸10次以上。在16×89mm離心管中先加7.5mL的CsTFA溶液，再輕輕地加入3.5mL上清。用SW41水平轉(zhuǎn)頭15℃下以125,000×g(32,000rpm)超速離心16h。棄去所有溶液后用250μL TE溶解附著于管底的總RNA。同樣時期的兩管中的Total RNA合并于一個1.5ml離心管中，取兩份0.5μl分別用分光光度計電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。
2.尾芽期mRNA的純化mRNA用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)探針和鏈親和素包裹的磁珠純化，步驟詳見PolyATract mRNA Isolation System(Promega)操作手冊。將上步提取的總RNA分別定容至500μL，65℃水浴10min。加入3μL生物素標(biāo)記的寡聚(dT)探針和13μL的20×SSC，混勻后于室溫下放置10min。加入0.3mL 0.5×SSC到裝鏈親和素包裹的磁珠的管中，輕輕重懸磁珠后用磁架將磁珠吸到管壁上，吸去SSC洗滌液。這樣反復(fù)洗滌3次。將寡聚(dT)探針和RNA溶液與洗好的磁珠混合，室溫下放置10min，保持磁珠的懸浮狀態(tài)。棄去溶液，用0.3mL 0.1×SSC洗滌磁珠3次，棄去SSC洗滌液。加入0.1mL H2O，輕輕重懸磁珠后吸取上清。再用0.15mL H2O洗滌磁珠，吸取上清。合并兩次上清，上清中含有polyA+mRNA。用0.1倍體積的NaAc和1倍體積的異丙醇沉淀mRNA，沉淀溶于8μL H2O中，于-70℃保存。取兩份0.5μl分別用分光光度計電泳檢測mRNA濃度和質(zhì)量。
3.SMART cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建SMART cDNA的合成步驟詳見SMART cDNA synthesis Kit(Clontech)操作手冊，合成所用的三個引物是(1)CDS引物(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT(30)N-1N-3′；(2)Smart II寡核苷酸(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3′；(3)PCR引物(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3′。
取銀鯽尾芽期mRNA1μg，按文庫構(gòu)建方法合成第一鏈cDNA加入CDS引物和Smart II寡核苷酸各1μl，72℃保溫2min后，冰上速冷2min；然后在終體積為10μL的反應(yīng)體系中，加入5×第一鏈反應(yīng)緩沖液(250mmol/L Tris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl2)2μl、DTT(20mmol/L)1μl、dNTP(10mmol/L)1μl和PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，42℃保溫1h合成第一鏈cDNA。取2μl第一鏈cDNA加入dNTP 2μl、PCR引物4μl、和2μl 50×Advantage 2 cDNA Polymerase Mix，于100μl反應(yīng)體系中進行如下PCR循環(huán)95℃預(yù)變性1min后，以95℃5s、65℃5s、68℃ 6min反應(yīng)13個循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL電泳檢測。
合成的SMART cDNA連接入pEGM-T載體中(Promega)，并轉(zhuǎn)化入top-10感受態(tài)細(xì)胞中。鋪平板(內(nèi)含μg/mL Amp以及-溴--氯--吲哚-β-D-半乳糖苷和異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，37℃培養(yǎng)過夜。
4.質(zhì)粒文庫的隨機篩選及測序該基因cDNA全長761bp，自54bp至476bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼141個氨基酸，5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元，沒有特殊的結(jié)構(gòu)域或跨膜區(qū)，3’非編碼區(qū)長285bp，有多聚腺苷酸加尾信號AAUAAA和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中進行同源搜索，發(fā)現(xiàn)與其它基因無任何同源性，為一新基因。
5.組織和胚胎總RNA的提取和RT-PCR反應(yīng)銀鯽腦、卵巢、腎臟、精巢、心臟、肝臟和脾臟等組織以及未受精的成熟卵細(xì)胞、受精后40分鐘、多細(xì)胞期、桑椹期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心跳開始期、出苗前期和出苗期等胚胎發(fā)育不同時期的總RNA用SVTotal RNA Isolation System(Promega)提取，用于RT-PCR檢測，步驟詳見SVTotal RNA Isolation System(Promega)操作手冊。依試劑盒的說明分別稱取適量的新鮮組織或胚胎，加入1mL的抽提緩沖溶液。充分勻漿后，各取175μl勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5離心管中，加入350μlSV RNA稀釋Buffer，混勻后70℃封阻3分鐘，14000×g離心10min。轉(zhuǎn)移上清，加入200μl 95％乙醇，吹打混勻后轉(zhuǎn)移至離心柱，14000×g離心1min，加入600μl SV RNA洗滌液，14000×g離心1min。加入50μl Dnase I 20-25℃消化15min后加200μl SV Dnase終止溶液，14000×g離心1min。加入600μl SV RNA洗滌液，14000×g離心1min后，再次加入250μl SVRNA洗滌液，高速離心2min。用250μl無RNA酶水洗脫總RNA兩次。取0.5-5μl電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。其余總RNA于-70℃凍結(jié)實，真空凍干機超低溫凍干濃縮，溶解于20-30μl水中，取0.5μl電泳檢測mRNA濃度和質(zhì)量。用鯽魚的α-tubulin基因(上游引物5’-GTGCACTGGTCTTCAGGGGTT-3’；下游引物5’-GGGAAGTGGATGCGTGGGTAT-3’)作為對照，確證各個組織和各個胚胎發(fā)育時期逆轉(zhuǎn)錄的效率都符合要求而且cDNA的量都相差不多。該基因RT-PCR的引物為上游引物5′-ACTAGCACAAGATGAAGCTG-3′，下游引物5′-CATGAGGCAGGACAGTATCC-3′；PCR反應(yīng)條件為94℃(30秒)-60℃(30秒)-72℃(40秒)，30個循環(huán)。
6.Tdf1基因融合蛋白的制備以基因開放閱讀框的核苷酸序列與pGEX載體設(shè)計構(gòu)成表達(dá)質(zhì)粒，挑單克隆培養(yǎng)至對數(shù)期，加入終濃度為1mmoL的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4-8h。表達(dá)的蛋白N端融合了長20個氨基酸的組氨酸t(yī)ag，可用金屬離子親和層析純化。
7.Tdf1基因編碼蛋白特異性多克隆抗體將3mL純化蛋白(約200-500μg)與3mL弗氏完全佐劑充分混勻乳化，在家兔的背部皮下多點注射，每點注射約0.2mL。第一次注射3周后加強免疫4次，各次劑量為第一次注射的四分之一，每次間隔10天，后4次以弗氏不完全佐劑乳化樣品。在第5次注射后10天自心臟抽取血液。將兔血于37℃放置1h后再在4℃放置過夜，×4000g離心10min，吸取上層的多抗血清，分裝后于-80℃凍存8.Tdf1基因在酵母中的表達(dá)以基因開放閱讀框的核苷酸序列與pGAPZA和pGAPZαB表達(dá)載體制備成表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入克隆菌株DHα中，將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BspH I消化，濃縮線性化的DNA片段后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，在Zeocin抗性平板上篩選重組子，3mlYPD(100μg/ml)Zeocin)培養(yǎng)，48h分別取菌體和上清于12.5％的聚丙烯按凝膠電泳。篩選出有特異蛋白表達(dá)的克隆。
權(quán)利要求
1.一種魚類精巢發(fā)育因子的基因序列，其特征在于基因Tdf1基因cDNA序列及其編碼蛋白的氨基酸序列，該基因cDNA全長761bp，自54bp至476bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼141個氨基酸，5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元，3’非編碼區(qū)長285bp，有多聚腺苷酸加尾信號AAUAAA和多聚腺苷酸尾巴。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的一種魚類精巢發(fā)育因子的基因序列，其特征在于Tdf1基因cDNA序列ACGCGGGGACTCCAGTCCTTTAATTCTCTCTACAGGAATCTCACTAGCACAAGATGAAGCTGACATTTGCTCTCATTCTTGCACTCCAAGTGTCAGTGTGTGTCTGGGCACAGGAATGGCCCCAGCCTGACAAGGAGTTAGTAGAGAAATATGAGGGGCTGAAGGCAGTTTTCTTTAAGAGGATCGTCAATGCTTGGGAAAAGACCAAAGCTGCCCTTCAGCCAACACTCGAGGGCTCACCAACAGGAGATCAAGCCAAACAAATTCTTGAAGAACTGAGCAAAAGGCCAAGAGTGGAGAGTGCCATCAAAATCATCGGCGGTTTGGCCAGTGATATGGAGCCTATGGTGGACAAAGCTCGCATGGCTCTTCTTGGTGCTTATGGCCACTATCTGCGGCCCCACATCGGAGAATACCTGGACAGGGCAATCACCAACATCAAGCCCGTGCTGGATACTGTCCTGCCTCATGAGGGTTAGAGTCTGCAGCTCATCAACCACTGATTCCTTCAACCCAGCAAACTTCAATAATAGATCTGGATGCTGTGTGTCCAGCACGTCGGTGCAGATTTTGCATGTATATACTGTATCTGTGTATTTGATACCATTCTGTTCAGTGCAGGAAAAATAAAAAACACCCAGCCCAGCATTAATAGAGAATGAATTATGTGATTTTGTGTGCCTCATAAAGAAACAACATGACCCATTCTAAATAAAAACATCTGGAAAATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
3.根據(jù)權(quán)利要求所述的一種魚類精巢發(fā)育因子的基因序列，其特征在于Tdf1基因編碼蛋白的氨基酸序列MKLTFALILALQVSVCVWAQEWPQPDKELVEKYEGLKAVFFKRIVNAWEKTKAALQPTLEGSPTGDQAKQILEELSKRPRVESAIKIIGGLASDMEPMVDKARMALLGAYGHYLRPHIGEYLDRAITNIKPVLDTVLPHEG
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類精巢高度豐富的基因序列在魚類的生殖調(diào)控中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類精巢高度豐富的基因序列在魚類的雄性性腺分化中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類精巢高度豐富的基因序列在魚類性別決定繁殖和人工性別調(diào)控中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚類精巢高度豐富的基因序列在飼料制備人工餌料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魚類精巢發(fā)育因子的基因序列及其用途，該基因cDNA全長761bp，自54bp至476bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼141個氨基酸，5’非編碼區(qū)長53bp，起始于一個包含在脊椎動物起始密碼子ANNATG基元，3’非編碼區(qū)長285bp，有多聚腺苷酸加尾信號(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。該基因在魚類雄性性別誘導(dǎo)分化決定、雄性性腺發(fā)育和生殖調(diào)控中的應(yīng)用。
文檔編號A61P43/00GK1401656SQ0213903
公開日2003年3月12日 申請日期2002年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月12日
發(fā)明者石耀華, 劉軍, 桂建芳 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所