專利名稱：新的乙型肝炎疫苗制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的疫苗制劑，特別是乙型肝炎疫苗制劑，該制劑采用的配方，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)?？捎糜诔扇恕⑵渌愋鸵倚透窝滓呙缑庖呤≌?、腎透析病人、器官移植病人的免疫，以及慢性乙型肝炎病人的免疫治療。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)為嗜肝DNA病毒，具有雙層殼結(jié)構(gòu)，外殼含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、前S1蛋白(PreS1)和前S2蛋白(PreS2)，內(nèi)核的表面為乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)，內(nèi)核內(nèi)含雙鏈環(huán)狀DNA和DNA多聚酶(DNA-P)。
自1985年中國(guó)開(kāi)展乙型肝炎疫苗接種工作以后，在免疫兒童中乙型肝炎病毒攜帶率已由10％左右降低為1％左右。北京、上海等地由于新生兒乙型肝炎疫苗接種率高，學(xué)齡前兒童的乙型肝炎病毒攜帶率已降低至0.5％以下。實(shí)踐證明，如同其它疫苗可預(yù)防疾病一樣，接種乙型肝炎疫苗及聯(lián)合使用乙型肝炎免疫球蛋白是預(yù)防和控制乙型肝炎最有效的武器。接種乙型肝炎疫苗不僅可以預(yù)防乙型肝炎，而且可以預(yù)防與乙型肝炎病毒有關(guān)的肝癌，同時(shí)還可以預(yù)防丁型肝炎。
目前中國(guó)使用的乙型肝炎疫苗每劑量含5μg、10μg酵母表達(dá)的HBsAg或10μg、20μgCHO細(xì)胞表達(dá)的HBsAg，每劑量含0.5～1.0mg鋁佐劑。美國(guó)MSD公司生產(chǎn)的用于器官移植、腎透析及免疫力低下者的疫苗劑量為40μg/劑。
現(xiàn)用的乙型肝炎疫苗均為含氫氧化鋁佐劑的疫苗，能較好的誘導(dǎo)體液免疫，但難于誘發(fā)高水平的體液免疫。本發(fā)明將脫毒單磷脂A(MPL)加入到含HBsAg、人抗乙型肝炎表面抗原抗體(HBIG)及鋁佐劑的疫苗中，可有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平體液免疫。
復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院研制的治療性乙型肝炎疫苗含乙型肝炎表面抗原及HBIG(乙型肝炎表面抗原超量)，在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及有限的臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出具有良好的提升人體體液免疫的作用，在動(dòng)物試驗(yàn)中還表現(xiàn)出了刺激細(xì)胞免疫的作用。本發(fā)明與其不同之處是抗原與抗體的量均等，即抗原的加入量不多于抗體，另外還加入了免疫增強(qiáng)劑MPL，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果明顯優(yōu)于現(xiàn)用的乙肝疫苗?？纱筝椂鹊奶岣呷梭w抗乙型肝炎病毒的體液免疫及細(xì)胞免疫，可用于慢性乙型肝炎病人的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的乙型肝炎疫苗制劑，該制劑的特征在于，在配方中加入了無(wú)毒(脫毒)單磷脂A(以下簡(jiǎn)稱為MPL)，以及抗原與抗體的量均等，即抗原的加入量不多于抗體，本發(fā)明的乙型肝炎疫苗是基于打破免疫系統(tǒng)細(xì)胞對(duì)HBV病毒免疫耐受或?qū)BsAg低反應(yīng)者而設(shè)計(jì)的，疫苗所含的人抗體Fc段與抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面的Fc受體結(jié)合，主動(dòng)呈遞乙肝病毒表面抗原，在MPL存在的情況下，有效地激活T細(xì)胞，可以產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫，在試驗(yàn)鼠中誘生高水平的抗-HBs。采用此種新型免疫增強(qiáng)劑及特定類型的抗原提呈既可對(duì)免疫抑制藥物使用者進(jìn)行有效的免疫，又可對(duì)慢性HBV感染者進(jìn)行免疫治療，有望將目前較難治療的無(wú)癥狀HBV表面抗原(HBsAg)攜帶者轉(zhuǎn)陰并出現(xiàn)抗-HBs。已有的研究證明疫苗中加入MPL可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性體液免疫及細(xì)胞免疫，含MPL的以乙型肝炎病毒表面抗原等為主要成分的乙肝疫苗將會(huì)給慢性乙型肝炎的治療帶來(lái)光明的前景。
本發(fā)明中使用的乙型肝炎表面抗原為基因工程重組抗原，而不是來(lái)源于乙型肝炎病人血漿的乙型肝炎表面抗原。由酵母菌或CHO細(xì)胞表達(dá)的基因工程表面抗原由226個(gè)氨基酸組成。重組酵母菌或CHO細(xì)胞表達(dá)的HBsAg均可形成22nm顆粒，已用于人群免疫十余年，均表現(xiàn)出良好的預(yù)防乙型肝炎病毒感染的效果。本發(fā)明乙型肝炎疫苗配方中所使用的無(wú)毒(脫毒)MPL購(gòu)自美國(guó)Avanti Polar Lipids，Inc，許多報(bào)道表明MPL可有效的提高體液免疫及細(xì)胞免疫，已廣泛用于新型蛋白類疫苗的配方中。
本發(fā)明乙型肝炎疫苗制劑含有乙型肝炎病毒表面抗原、MPL、HBIG、鋁佐劑，其中的乙型肝炎表面抗原可以為重組酵母制造或重組CHO表達(dá)的乙型肝炎表面抗原或其片段或含pre S1/Pre S2成分的抗原。
本發(fā)明的疫苗制劑，其中，HBIG可以是人抗-HBs、人源化抗-HBs單克隆抗體或人源性抗-HBs單克隆抗體。
本發(fā)明的疫苗制劑，還可含有其它已知的可提高機(jī)體免疫的人體或微生物蛋白質(zhì)及多糖或小分子化合物。
本發(fā)明優(yōu)選的疫苗制劑每劑中各主成分的含量范圍如下MPL 10～100μg、HBsAg 5～120μg、HBIG 5～100IU、鋁離子0.25～1.20mg。
本發(fā)明還包括本發(fā)明的疫苗制劑在制備用于成人、腎透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群免疫的藥物中的應(yīng)用。以及在制備慢性乙型肝炎病人的免疫治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的疫苗制劑可以采用以下方法制備用水溶解脫毒MPL，用磷酸鹽緩沖液溶解基因工程乙型肝炎表面抗原，將一定量的HBsAg與不同量的HBIG反應(yīng)，然后用EIA試劑盒測(cè)定反應(yīng)體系中殘存的HBsAg及HBIG的量，確定使反應(yīng)體系中95％以上的抗原和抗體均參與反應(yīng)的抗體量。向定量的HBsAg溶液中加入鋁佐劑，室溫條件下放置，按預(yù)先確定的比例加入HBIG(也可在加鋁佐劑前加入)，室溫條件下反應(yīng)，再加入適當(dāng)濃度的MPL溶液。根據(jù)HBsAg的加入量，以磷酸鹽緩沖液調(diào)整混懸液的總體積，再加入1％的硫柳汞(也可不加)即得。
動(dòng)物試驗(yàn)表明本發(fā)明的新型乙型肝炎疫苗是安全的，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物無(wú)可見(jiàn)的毒性。可有效的刺激動(dòng)物產(chǎn)生高滴度的特異性抗體。
按上述配制方法備的乙型肝炎疫苗與其它配方配制的乙型肝炎疫苗或?qū)φ找呙缭谛∈笾械拿庖邔W(xué)試驗(yàn)簡(jiǎn)述如下材料基因工程(酵母)乙型肝炎表面抗原(20μg/ml)、抗-HBs Mab(3.0mg/ml)、鼠抗體(Mab，3.0mg/ml)、氫氧化鋁佐劑(1.0mg/ml)，磷酸鋁佐劑(1.0mg/ml)，MPL(2.0mg/ml)，生理鹽水。
設(shè)備Labsystem MK3酶標(biāo)儀、冰箱、37℃培育箱、洗板機(jī)、分析天平、可調(diào)定量移液器、玻璃吸管。
試驗(yàn)方法先將5mg MPL溶入2.5ml生理鹽水中，超聲波處理1分鐘，備用。各試驗(yàn)組佐劑及各種成分的加量見(jiàn)表1
表1、不同佐劑乙型肝炎疫苗的配制組別HBsAg Al(OH)3AlPO4MPL Anti-HBs Mab Mab HBIG 生理鹽水 合(20μg/ml) (1.0mg/ml) (1.0mg/ml) (2mg/ml)(3mg/ml)(3mg/ml) (270IU/ml) 計(jì)mlml ml μl μl μl μl ml mlH1 4.0 4.0 / / / / / /8.0H2 4.0 4.0 / / 14.0/ / /8.0H3 4.0 4.0 / 40.014.0/ / /8.0H4 4.0 4.0 / 40.0/ 14.0 / /8.0H5 4.0 4.0 / 40.0/ / 100/8.1H6 4.0*4.0 / / 7.0 / / /8.0P6 4.0 / 4.0 / / / / /8.0P7 4.0 / 4.0 / 7.0 / / /8.0P8 4.0 / 4.0 40.014.0/ / /8.0P9 4.0 / 4.0 40.0/ 14.0 / /8.0P10 4.0 / 4.0 40.0/ / 100/8.1N0.0 / / 40.0/ / / 8.0 8.0*先將2.0ml含HBsAg的溶液與anti-HBs Mab反應(yīng)，24小時(shí)后再加入2.0ml含HBsAg的溶液2.0ml。
取SPF級(jí)雌性BALB/C小鼠120只，分成12組，每組10只小鼠，分別標(biāo)明組別。各組小鼠分別腹腔注射相應(yīng)組別的疫苗0.10ml。28天后，以同種類、同劑量的疫苗再次免疫。7天之后心臟采血，分離血清后，用雙抗原夾心法EIA乙型肝炎表面抗體檢測(cè)試劑(北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司)測(cè)定血清中抗-HBs的含量。檢測(cè)時(shí)以中國(guó)藥品生物制品檢定所(世界衛(wèi)生組織)發(fā)放的HBIG標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照，計(jì)算血清中抗體的相對(duì)含量(IU/ml)。結(jié)果見(jiàn)表2表2、不同配方的乙型肝炎疫苗在小鼠中誘生抗體的比較

*各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清anti-HBs定量檢測(cè)結(jié)果均為陰性，未計(jì)算均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。
從上表可以看出，加入anti-HBs Mab及MPL組的疫苗誘生Anti-HBs的效價(jià)明顯高于其它組；磷酸鋁佐劑組的免疫效果優(yōu)于氫氧化鋁組，加入非乙肝表面抗原鼠抗體或非同種的抗體(HBIG，人乙肝免疫球蛋白)不能明顯增加抗體滴度。
由此可以推斷，在制備人用乙型肝炎疫苗時(shí)，如以HBIG代替鼠anti-HBs Mab，以實(shí)例之一、二、三、四、五中的方法制備疫苗免疫人，亦能得到類似的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
用注射用水溶解脫毒MPL至終濃度為1.0mg/ml，超聲波助溶(控制溫度2-20℃)。
用磷酸鹽緩沖液調(diào)整基因工程乙型肝炎表面抗原(HBsAg)至終濃度為100μg/ml。將1μg HBsAg與不同量的HBIG反應(yīng)，然后用EIA試劑盒測(cè)定反應(yīng)體系中殘存的HBsAg及HBIG的量，結(jié)果表明使反應(yīng)體系中95％以上的抗原和抗體均參與反應(yīng)的抗體量為1.08 IU。即1μg的HBsAg可以中和1.08IU的HBIG。
取HBsAg(含量為100μg/ml)溶液10ml，加入10ml鋁佐劑(鋁離子含量為1mg/ml)，室溫條件下放置24小時(shí)，期間每隔1小時(shí)搖動(dòng)1次(或持續(xù)低速度攪拌)；按預(yù)先確定的比例加入4.0ml高效價(jià)HBIG(270IU/ml)，充分混勻后，室溫條件下反應(yīng)24小時(shí)，期間每小時(shí)振搖一次，靜置至溶液分層，小心吸出上層水溶液；再加入等體積的磷酸鹽緩沖液混勻，靜置至溶液再次分層，吸出上層溶液；再加入等體積的磷酸鹽緩沖液，靜置至溶液再次分層，吸出上層溶液(共洗滌3次，以去除未被吸附的蛋白)；加入磷酸鹽緩沖液調(diào)整混懸液的體積為19ml，加入MPL溶液(1mg/ml)0.8ml，再加入1％的硫柳汞(也可不加)0.2ml。放置于2～10℃，或無(wú)菌條件下分裝成1.0ml/支，2～8℃保存。
用注射用水溶解脫毒MPL至終濃度為1.0mg/ml，超聲波助溶。
用磷酸鹽緩沖液調(diào)整基因工程乙型肝炎表面抗原(HBsAg)至終濃度為100μg/ml。向10ml HBsAg溶液中加入4.0ml HBIG(見(jiàn)實(shí)施例一)，室溫條件下反應(yīng)24小時(shí)(或37℃反應(yīng)2小時(shí)后置2～8℃反應(yīng)22小時(shí))，期間每小時(shí)振搖一次；加入10ml鋁佐劑(1mg/ml按Al3+計(jì)算)，室溫條件下放置24小時(shí)，期間每隔1小時(shí)搖動(dòng)1～2次；靜置至溶液分層，小心吸出上層溶液；再加入等體積的磷酸鹽緩沖液混勻，靜置至溶液再次分層，吸出上層溶液；重復(fù)洗滌兩次；加入適當(dāng)體積的磷酸鹽緩沖液，使混懸液的總體積為19.0ml，之后加入0.8ml MPL溶液，充分混勻后，再加入1％的硫柳汞0.2ml(也可不加)，放置于2～10℃?；驘o(wú)菌條件下分裝成1.0ml/支，2～8℃保存。
用注射用水溶解脫毒MPL至終濃度為1.0mg/ml，超聲波助溶。
用磷酸鹽緩沖液調(diào)整基因工程乙型肝炎表面抗原(HBsAg)至終濃度為200μg/ml。取HBsAg溶液10ml，然后加入8.5ml HBIG(過(guò)量6％，見(jiàn)實(shí)施例一)，室溫條件下反應(yīng)24小時(shí)，期間每小時(shí)振搖一次。加入18％PEG 6000溶液3.7ml，離心后棄上清，沉淀用3％的PEG 6000洗滌、離心2次，再用6ml磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，溶解后裝入透析袋內(nèi)(截留分子量為30KD)，在磷酸鹽緩沖液中透析24小時(shí)，期間換液3次，或用截留分子量300KD的超濾器超濾，除去PEG6000。調(diào)整透析后的HBsAg-HBIG復(fù)合物的體積至7.8ml，加入10ml鋁佐劑(鋁離子含量為1mg/ml)，加入2.0ml MPL溶液，室溫條件下放置24小時(shí)，期間每隔1小時(shí)搖動(dòng)1次。加入適當(dāng)體積的磷酸鹽緩沖液調(diào)整混懸液的總體積，加入1％的硫柳汞(也可不加)溶液0.2ml。無(wú)菌條件下分裝，0.5～1.0ml/支，2～8℃保存。
用注射用水溶解脫毒MPL至終濃度為1.0mg/ml，超聲波助溶。
用磷酸鹽緩沖液調(diào)整基因工程乙型肝炎表面抗原(HBsAg)至終濃度為200μg/ml。取HBsAg溶液10ml，然后加入8.5ml HBIG(稍過(guò)量，見(jiàn)實(shí)施例一)，室溫條件下反應(yīng)24小時(shí)，期間每小時(shí)振搖一次。用截留分子量為300D或500KD的超濾膜超濾，除去多余的HBIG及雜蛋白，調(diào)整體積至7.8ml。向HBsAg-HBIG復(fù)合物溶液中加入鋁佐劑10ml(按Al3+計(jì)算，1mg/ml)，室溫條件下放置24小時(shí)，期間每隔1小時(shí)搖動(dòng)1次，然后置2～10℃存放。之后加入2.0ml MPL溶液。再加入1％的硫柳汞(也可不加)0.2ml。無(wú)菌條件下分裝，0.5～1.0ml/支，2～8℃保存。
用注射用水溶解脫毒MPL至終濃度為1.0mg/ml，超聲波助溶。
用磷酸鹽緩沖液調(diào)整基因工程乙型肝炎表面抗原(HBsAg)至終濃度為200μg/ml。取HBsAg溶液10ml，然后加入8.0ml HBIG(見(jiàn)實(shí)施例一)，室溫條件下反應(yīng)24小時(shí)，期間每小時(shí)振搖一次。向形成的HBsAg-HBIG復(fù)合物溶液中加入鋁佐劑10ml(按Al3+計(jì)算，1.5mg/ml)，室溫條件下放置24小時(shí)，期間每隔1小時(shí)搖動(dòng)1次，然后置2～10℃存放。之后加入2.0ml MPL溶液。再加入1％的硫柳汞(也可不加)0.2ml。無(wú)菌條件下分裝，0.5～1.0ml/支，2～8℃保存。實(shí)施例六乙型肝炎疫苗制備方法之六脫毒單磷脂A購(gòu)自美國(guó)Avanti Po1ar Lipids，Inc公司，乙型肝炎病毒表面抗原(疫苗)購(gòu)自北京生物制品研究所，鼠抗-HBs-MAb購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。氫氧化鋁、磷酸鋁佐劑為本公司自制產(chǎn)品。
用注射用水溶解脫毒MPL至終濃度為2.0mg/ml，超聲波助溶。
用磷酸鹽緩沖液調(diào)整基因工程乙型肝炎表面抗原(HBsAg)至終濃度為20μg/ml，將1μg的HBsAg與不同量的鼠抗-HBs-MAb(3mg/ml)反應(yīng)，然后用EIA試劑盒測(cè)定反應(yīng)體系中殘存的HBsAg及鼠抗-HBs-MAb的量，結(jié)果表明使反應(yīng)體系中95％以上的抗原和抗體均參與了反應(yīng)抗體量為1μg。即在本實(shí)驗(yàn)中，1μg的HBsAg可以中和1μg的鼠抗-HBs-Mab。
向10ml HBsAg溶液中加入67μl鼠抗-HBs-MAb，37℃放置2小時(shí)，期間每隔30分鐘搖動(dòng)1次；然后加入10ml鋁佐劑(按Al3+計(jì)算，0.5mg/ml)，充分混合，放置于2～10℃。之后加入0.1ml MPL溶液，再加入1％的硫柳汞(也可不加)0.1ml。無(wú)菌條件下分裝，2～8℃保存。此種以鼠單抗為材料制備的乙型肝炎疫苗僅限用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
此實(shí)施例可用作以人源抗-HBs單克隆抗體、人源化抗-HBs單克隆抗體替代HBIG制備本發(fā)明所述乙型肝炎疫苗的參考。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎疫苗制劑，其特征在于，該制劑中含有乙型肝炎病毒表面抗原，鋁佐劑，無(wú)毒單磷脂A(MPL)，人抗乙型肝炎表面抗原抗體(HBIG)。
2.權(quán)利要求1的疫苗制劑，其特征在于，每劑疫苗中MPL的含量為5-100μg，HBIG的含量為5-100IU，HBsAg的含量為5-120μg，鋁佐劑(以鋁離子的量計(jì)算)0.25-1.2mg。
3.權(quán)利要求1的疫苗制劑，其中，乙型肝炎表面抗原為重組酵母制造或重組CHO細(xì)胞制造的乙型肝炎表面抗原或其片段或含pre S1/Pre S2成分的抗原。
4.權(quán)利要求1的疫苗制劑，其中，HBIG可以是人抗-HBs、人源化抗-HBs單克隆抗體或人源性抗-HBs單克隆抗體。
5.權(quán)利要求1的疫苗制劑的制備方法，其特征在于，制備此疫苗的工藝中所用HBsAg的量與HBIG等量，所制備的疫苗中游離抗原、抗體的含量少于總量的5％。。
6.權(quán)利要求1疫苗制劑的制備方法，其特征還在于制備抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程中抗體的加入量可超過(guò)抗原的加入量。
7.權(quán)利要求5、6的疫苗制備方法中，應(yīng)用鋁吸附、沉淀、或超濾等技術(shù)除去了無(wú)關(guān)抗體。
8.權(quán)利要求1的疫苗制劑，還可含有其它已知的可提高機(jī)體免疫的人體或微生物蛋白質(zhì)及多糖或小分子化合物。
9.權(quán)利要求1的疫苗制劑在制備用于成人、腎透析病人、器官移植病人及乙型肝炎高危人群免疫的藥物以及制備慢性乙型肝炎病人的免疫治療藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1的疫苗制劑和其他的慢性乙型肝炎病人治療用的化學(xué)合成藥物聯(lián)合應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎疫苗的新配方，該疫苗的主要成分為基因工程乙型肝炎病毒表面抗原、人抗乙型肝炎表面抗原抗體、鋁佐劑、無(wú)毒單磷脂A(MPL)等。以該配方制備的乙型肝炎疫苗的免疫原性優(yōu)于目前使用的鋁佐劑疫苗，該乙型肝炎疫苗可用于成人、腎移植病人、腎透析病人等的免疫，以預(yù)防乙型肝炎病毒的感染，該乙型肝炎疫苗亦可用于慢性乙型肝炎患者的免疫治療。
文檔編號(hào)A61P1/16GK1401389SQ0214624
公開(kāi)日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月17日
發(fā)明者孔健, 蔣先敏 申請(qǐng)人:北京綠竹生物技術(shù)有限責(zé)任公司