專利名稱：Hepcidin(海魄喜定)在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Hepcidin(海魄喜定)的用途，特別涉及其在制藥領(lǐng)域中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供Hepcidin(海魄喜定)的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用。
實(shí)際上本發(fā)明涉及Hepcidin(海魄喜定)作為制備治療鐵代謝紊亂疾病藥物的應(yīng)用。
即涉及Hepcidin(海魄喜定)作為制備緩解或治療鐵過載類疾病藥物的靜脈注射劑。
還涉及Hepcidin(海魄喜定)的單克隆抗體作為制備治療任何類型的缺鐵性貧血藥物的靜脈注射劑。
鐵是人體最豐富的必需微量元素之一，它廣泛參與重要的生命代謝過程。鐵代謝紊亂引起的疾患是人類最常見的疾病，影響著數(shù)以千萬計(jì)的人口。鐵缺乏可造成貧血、智障等多種疾病。而鐵過量則可促發(fā)產(chǎn)生大量自由基，引起神經(jīng)退行性變及許多與老年相關(guān)的疾病。因此，人體存在著嚴(yán)格的鐵代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，可以確保體內(nèi)鐵始終處于正常生理水平。這種機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)(iron homeostasis)的關(guān)鍵是依賴于小腸鐵吸收和機(jī)體鐵需要之間的平衡。當(dāng)機(jī)體缺(或需要)鐵時(shí)，小腸鐵吸收會相應(yīng)增加，而機(jī)體鐵含量太高時(shí)，小腸則會減少鐵吸收。很久以來，人們一直推測人類機(jī)體內(nèi)存在調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的類似激素樣物質(zhì)，這種物質(zhì)可溶于血液，因此能在肝臟、小腸，網(wǎng)織紅細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮RE系統(tǒng)之間傳遞有關(guān)鐵調(diào)節(jié)的信號。研究顯示，Hepcidin(海魄喜定)就是鐵代謝研究者們長期一直尋找的調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的重要激素。動物試驗(yàn)證明，Hepcidin(海魄喜定)缺乏會導(dǎo)致小鼠進(jìn)行性組織鐵積聚，而Hepcidin(海魄喜定)高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的鐵缺乏，呈現(xiàn)嚴(yán)重的小細(xì)胞性貧血且生存時(shí)間大為縮短。此外，飲食鐵含量增高或者肝鐵增加均可導(dǎo)致肝臟Hepcidin(海魄喜定)表達(dá)增加。證實(shí)Hepcidin在機(jī)體鐵代謝調(diào)節(jié)中具有重要作用。Hepcidin(海魄喜定)調(diào)節(jié)鐵代謝的機(jī)制模式是，當(dāng)任何原因引起循環(huán)鐵增加時(shí)，肝細(xì)胞經(jīng)TfR2(是一種區(qū)別于經(jīng)典TfR的載鐵蛋白受體)增加攝鐵，導(dǎo)致肝細(xì)胞增加合成和分泌Hepcidin(海魄喜定)進(jìn)入血液，Hepcidin(海魄喜定)經(jīng)血流運(yùn)輸?shù)绞改c隱窩細(xì)胞直接作用于正常鐵吸能力β2M/HFE/TfR1復(fù)合物，促成隱窩細(xì)胞攝鐵量增加，隱窩細(xì)胞內(nèi)鐵池增大進(jìn)而抑制腸吸收上皮細(xì)胞四種鐵吸收蛋白表達(dá)下降，鐵吸收量因此下降。當(dāng)循環(huán)鐵較低時(shí)，經(jīng)TfR2介導(dǎo)的肝細(xì)胞鐵攝取將會減少，肝臟合成分泌的Hepcidin(海魄喜定)將會減少。這將引起隱窩細(xì)胞鐵池變小，腸吸收上皮相關(guān)蛋白表達(dá)增加，腸鐵吸收量增加，使鐵水平回復(fù)到正常。同時(shí)肝臟分泌的Hepcidin也可經(jīng)血流到達(dá)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)RE系統(tǒng)，調(diào)節(jié)RE系統(tǒng)鐵代謝作相應(yīng)變化。這一模式顯示Hepcidin(海魄喜定)是肝臟、小腸和RE系統(tǒng)之間鐵代謝調(diào)節(jié)信號的傳遞者。而且，高濃度的Hepcidin(海魄喜定)可經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)竭_(dá)十二指腸隱窩細(xì)胞作用于β2M/HFE/TfR1復(fù)合物，導(dǎo)致小腸鐵吸收下降。這就是炎癥性貧血或慢性疾病并發(fā)性貧血的根本起因，這也是為什么這些貧血病人循環(huán)鐵和小腸鐵吸收都減少的原因。如果抑制這類病人的肝臟的Hepcidin(海魄喜定)合成或分泌，或者阻斷Hepcidin(海魄喜定)與β2M/HFE/TfR1復(fù)合物相互作用，均應(yīng)該可以增加小腸鐵吸收，達(dá)到有效治療這類貧血的目的。異常升高的Hepcidin也可能是其它類型臨床貧血的原因。很顯然，抗Hepcidin作用類物質(zhì)也可通過增加小腸鐵吸收的途徑改善鐵缺乏狀況及有效地治療任何類型缺鐵性貧血。另一方面，任何原因引起的肝臟Hepcidin(海魄喜定)合成或分泌障礙可能是臨床鐵過負(fù)荷類疾病的起因。因此給予外源性Hepcidin(海魄喜定)會緩解或有效地治療這一類疾病。這就是利用Hepcidin開發(fā)制備有效治療各類貧血或鐵積聚性疾病的藥物極好的依據(jù)。
動物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)用小白鼠共40只，分為四組，每組10只。第一組、第二組飼喂基礎(chǔ)飼料，含鐵60mg/kg飼料。第三組、第四組飼喂高鐵飼料，每千克基礎(chǔ)飼料添加2.5％的羰基鐵。第一組、第三組小白鼠每天尾靜脈注射生理鹽水0.1毫升作為對照，第二組和第四組每天注射小鼠的Hepcidin(海魄喜定)為0.1毫升(每毫升生理鹽水含10微克海魄喜定)，連續(xù)注射7天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭取血、取肝臟，分別測定血清鐵和肝臟鐵含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果注射海魄喜定7天后，飼喂基礎(chǔ)飼料小鼠血清鐵比對照組顯著降低，差異極顯著P＜0.01，n＝10。表明Hepcidin(海魄喜定)有降低小鼠對鐵的吸收的作用。飼喂高鐵飼料的小鼠，血清鐵較對照組明顯升高，P＜0.05，n＝10。表明高鐵飲食能夠增加小鼠的血清鐵的吸收。飼喂高鐵飼料的小鼠注射Hepcidin(海魄喜定)，血清鐵含量與單純飼喂高鐵飼料小鼠相比顯著降低，差異極顯著，P＜0.01，n＝10。Hepcidin(海魄喜定)有效地防止了高鐵的形成。而注射Hepcidin(海魄喜定)7天后，飼喂基礎(chǔ)飼料小鼠肝臟鐵比對照組降低，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＝0.067，n＝10。表明正常飲食情況下，尾靜脈注射Hepcidin(海魄喜定)7天，對于降低小鼠肝臟鐵的吸收沒有明顯的作用。飼喂高鐵飼料的小鼠，肝臟鐵較對照組明顯升高，P＜0.05，n＝10。表明高鐵飲食能夠增加小鼠的肝臟鐵的儲存。飼喂高鐵飼料的小鼠注射Hepcidin(海魄喜定)，肝臟鐵含量與單純飼喂高鐵飼料小鼠相比顯著降低，差異極顯著，P＜0.01，n＝10。對于高鐵情況下，Hepcidin(海魄喜定)降低肝臟鐵吸收的作用比正常飲食情況下為高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Hepcidin(海魄喜定)能夠抑制動物的鐵攝入，阻止動物形成高鐵狀態(tài)。其作用尤其在動物高鐵情況下更為明顯。研究表明Hepcidin(海魄喜定)基因敲除小鼠肝臟有明顯的鐵沉積，類似遺傳性血色素沉著病，而轉(zhuǎn)基因小鼠則因?yàn)镠epcidin(海魄喜定)過量表達(dá)造成小鼠出生時(shí)嚴(yán)重貧血，不久便死亡。由此證明人體內(nèi)鐵的過量增高可以用Hepcidin(海魄喜定)進(jìn)行治療。而人體內(nèi)鐵的缺乏則可用Hepcidin(海魄喜定)抗體來調(diào)節(jié)。
將從人尿中提純的Hepcidin(海魄喜定)制作為靜脈注射劑注入人體，可加強(qiáng)Hepcidin(海魄喜定)與β2M/HFE/TfR1復(fù)合物相互作用，減少腸鐵吸收相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低鐵的吸收，從而緩解或有效地治療鐵過載類疾病。
而將制備的Hepcidin(海魄喜定)單克隆抗體作為靜脈注射劑注入人體，使其結(jié)合血液中的Hepcidin(海魄喜定)從而阻斷Hepcidin(海魄喜定)與β2M/HFE/TfP1復(fù)合物相互作用，就能增加腸鐵吸收相關(guān)蛋白的表達(dá)，使鐵攝取增加，達(dá)到治療鐵缺乏的目的。
注射劑1、收集過濾健康人尿液除去其中的細(xì)胞及雜質(zhì)，2、用弱陽離子交換樹脂萃取得到陽離子多肽，3、用百分之五的醋酸洗脫，然后用反向液相色譜純化，所用C18柱子(Vydac)用百分之一的三氟醋酸平衡，4、所得到的多肽用乙腈進(jìn)行梯度(4％)洗脫，然后用20％的乙腈洗5分鐘，最后用0.5％的乙腈梯度洗脫30分鐘，5、用酸性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳分析高壓液相色譜得到的峰值多肽，用MALDI-TOF-MS方法進(jìn)行鑒定，6、將Hepcidin(海魄喜定)作為靜脈注射劑。
實(shí)施例2制作Hepcidin(海魄喜定)單克隆抗體作為治療鐵缺乏的藥物Hepcidin(海魄喜定)單克隆抗體靜脈注射劑。
1、構(gòu)建噬菌體抗體庫，2、篩選噬菌體抗體庫純化后的Hepcidin(海魄喜定)直接包被ELISA板(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))，經(jīng)過3-4輪ELISA法篩選，最后將特異性結(jié)合的具有特異性抗體的噬菌體洗脫下來，感染受體菌，培養(yǎng)后鋪皿，3、Fab的抗體的可溶性表達(dá)經(jīng)上述篩選后的陽性克隆，37度培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒。酶切除去基因III，重新構(gòu)建質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染XLI-Blu，培養(yǎng)、篩選陽性克隆，培養(yǎng)后離心收集細(xì)菌，反復(fù)凍融三次，4度離心，吸取上清，得到可溶性的Fab抗體，4、Fab抗體的純化與鑒定采用抗Fab抗體親和層析純化法純化，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純度，最后進(jìn)行抗體功能測定，5、將Hepcidin(海魄喜定)單克隆抗體作為靜脈注射劑。
權(quán)利要求
1.Hepcidin(海魄喜定)作為制備治療鐵代謝紊亂疾病藥物的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Hepcidin(海魄喜定)作為制備治療鐵代謝紊亂疾病藥物的應(yīng)用，其特征在于將(海魄喜定)作為制備緩解或治療鐵過載類疾病藥物的靜脈注射劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Hepcidin(海魄喜定)作為制備治療鐵代謝紊亂疾病藥物的應(yīng)用，其特征在于所述的Hepcidin(海魄喜定)為海魄喜定單克隆抗體，作為制備治療任何類型的缺鐵貧血藥物的靜脈注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種各為Hepcidin(海魄喜定)的富含胱氨酸的抗菌多肽在制藥領(lǐng)域的新用途。從人尿中提純的Hepcidin(海魄喜定)，經(jīng)血流運(yùn)輸?shù)绞改c隱窩細(xì)胞，直接作用于正常吸鐵能力β
文檔編號A61P31/04GK1403154SQ02146309
公開日2003年3月19日 申請日期2002年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月21日
發(fā)明者錢忠明, 常彥忠, 袁其朋 申請人:錢忠明, 常彥忠, 袁其朋