專利名稱：抗Pgp單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗Pgp(P-glycoprotein，P-糖蛋白)單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在制備用于耐藥腫瘤的診斷和治療的藥物中的應(yīng)用。具體地講，本發(fā)明的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因來自抗P-GLYCOPROTEIN(P-糖蛋白)單克隆抗體PHMA02。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是我國攻關(guān)的重點疾病之一。而腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的耐受是導(dǎo)致臨床化療失敗的主要原因。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，美國每年約有49萬例癌癥患者死亡，其中90％以上腫瘤患者的死亡在不同程度上與耐藥有關(guān)。腫瘤細(xì)胞對一系列結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制不同的藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象稱為多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。產(chǎn)生MDR最主要的分子基礎(chǔ)是細(xì)胞膜表面分子量為170KD的糖蛋白Pgp。Pgp依賴ATP酶提供的能量可將藥物“泵”出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，表現(xiàn)為細(xì)胞對藥物產(chǎn)生耐受。多種研究表明Pgp不僅與耐藥相關(guān)，而且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性相關(guān)，所以針對Pgp這一廣譜腫瘤抗原的研究具有廣泛的應(yīng)用前景。
抗Pgp單克隆抗體的研究已有十多年的歷史，早在80年代抗Pgp抗體MRK16，JSB-1已用于耐藥腫瘤的診斷。不同的抗Pgp抗體和Pgp結(jié)合的位點不同，有的結(jié)合于Pgp的胞外區(qū)(例如MRK16，UICЦ)，有的結(jié)合于胞內(nèi)區(qū)(例如C219)。
單抗PHMA02是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所于1999年研制成功的抗Pgp鼠源性單克隆抗體(中華血液學(xué)雜志1999.Vol 20.No.6)。制備的鼠源性單抗PHMA02特異性地結(jié)合于P-glycoprotein(P-糖蛋白)胞外區(qū)，與Pgp高表達(dá)的耐藥腫瘤細(xì)胞系K562/A02及MCF-7/ADR具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，而與親代細(xì)胞株K562、MCF-7無結(jié)合能力，說明單抗PHMA02具有與多藥耐藥細(xì)胞特異結(jié)合的能力。
鼠源單抗作為異種蛋白應(yīng)用于人體時產(chǎn)生的人抗小鼠抗體(human anti-mouseantibody，HAMA)反應(yīng)，是限制其應(yīng)用的重大缺陷。正是由于這一原因，80年代開始進(jìn)行對鼠源性單抗的人源化改造。而后又通過基因操作技術(shù)制備出基因工程抗制抗體，力求在保持親代抗體生物活性的同時，降低免疫原性。單鏈抗體(ScFv)是由接頭(linker)將輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因以兩種取向(VL-Linker-VH，VH-Linker-VL)連接起來，從而可以構(gòu)建具有特異性抗原結(jié)合功能的小分子片段。它具有分子量小，穿透能力強(qiáng)，異源性小，構(gòu)建周期短，表達(dá)后的效果好，易于大量生產(chǎn)等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種抗Pgp單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因及其表達(dá)產(chǎn)物，兩者重組后表達(dá)產(chǎn)生的抗PgpscFv片段，能降低鼠源性抗Pgp抗體的免疫原性。本發(fā)明的另一個目的在于抗PgpscFv片段在制備用于耐藥腫瘤的診斷和治療的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的抗Pgp單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因及其表達(dá)產(chǎn)物是所述的輕鏈可變區(qū)基因的全長為333bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO4所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示；所述的重鏈可變區(qū)基因的全長為375bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示；本發(fā)明利用噬菌體抗體展示技術(shù)克隆抗Pgp單克隆抗體PHMA02的輕重鏈可變區(qū)基因，再將其克隆到具有強(qiáng)啟動子的PET28a(+)上，構(gòu)建了表達(dá)載體PET28a(+)PGPscFv，表達(dá)產(chǎn)物為包涵體，經(jīng)復(fù)性后能特異性的與表達(dá)Pgp抗原的K562/A02細(xì)胞相結(jié)合但并不抑制Pgp外排泵的功能。
本發(fā)明制備的抗PgpscFv片段只有針對Pgp抗原的識別功能，并無抑制作用，能作為靶向診斷治療藥物的載體和雙功能抗體的一臂。
本發(fā)明的有益效果是在所有正常人類組織中均可檢測到P-gp及mdr-1基因的mRNA，不同器官中的Pgp及mdr-1基因mRNA的水平相差很大，在腎臟、肝、消化道、肺等器官Pgp及mdr-1基因mRNA的水平較高，而在睪丸、卵巢、子宮、皮膚等器官處于較低水平。這些研究提示Pgp與正常細(xì)胞的分泌功能密切相關(guān)。本發(fā)明制備的抗Pgpscfv PgpscFv片段只有針對Pgp抗原的識別功能，并無抑制作用，因此應(yīng)用于人體后不會干擾正常細(xì)胞的排泄分泌功能，無論是作為靶向診斷治療的載體還是作為雙功能抗體的一臂，均具有廣泛的應(yīng)用前景。


附圖1 表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳分析圖。
圖中1純化后的Pgpscfv片段，2 Marker。
附圖2 表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行WESTERNBLOT分析圖。圖中1粗提液，2流出液，3純化后樣品(未復(fù)性)，4純化后樣品(復(fù)性后)。
附圖3 免疫熒光競爭實驗的測定結(jié)果圖之一——PBS+K562/A02。
附圖4 免疫熒光競爭實驗的測定結(jié)果圖之二——無關(guān)蛋白(抗CD20Fab片段)+K562/A02。
附圖5 免疫熒光競爭實驗的測定結(jié)果圖之三——抗Pgpscfv+K562。
附圖6 免疫熒光競爭實驗的測定結(jié)果圖之四——PHMAO2+K562/A02。
附圖7 免疫熒光競爭實驗的測定結(jié)果圖之五——抗Pgpscfv免疫熒光競爭實驗。
附圖8 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)Rh123的蓄積測定結(jié)果圖之一——陰性對照。
附圖9 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)Rh123的蓄積測定結(jié)果圖之二——PHMA02。
附圖10 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)Rh123的蓄積測定結(jié)果圖之三——抗Pgpscfv。
附圖11 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)Rh123的蓄積測定結(jié)果圖之四——維拉帕米(VRP)。
附圖12 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)Rh123的蓄積測定結(jié)果圖之五——K562細(xì)胞。
具體實施例方式
以下列舉部分實施例僅對本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但不限制本發(fā)明。
實施例1、抗Pgp抗體輕重鏈可變區(qū)基因克隆。
采取異硫氰酸胍一步法(Chomczynski P，Sacchi N，Single-step method of RNAisolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal.Biochem.1987，162156)提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄的方法擴(kuò)增抗PGP單克隆抗體PHMA02輕重鏈可變區(qū)基因取2μg總RNA置于0.5ml Eppendorf管中，依次加入600ng隨機(jī)引物、4×dNTP各10nmol、Rnasin 20μl、于65℃水浴5-10分鐘，然后加入200U的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃水浴放置1小時，轉(zhuǎn)移至70℃水浴放置10分鐘。
輕鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(100μl)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl，10mM dNTP 2μl，10×PCR buffer 10μl，Taq DNA聚合酶2U，購于pharmacia公司的重組噬菌體抗體系統(tǒng)的輕鏈擴(kuò)增引物1、2各2μl，加水至終體積100μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘后，再進(jìn)行30循環(huán)的PCR擴(kuò)增(94℃變性1分鐘，55℃退火2分鐘，72℃延伸2分鐘)，最后于72℃延伸10分鐘。
重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(100μl)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl，10mM dNTP 2μl，10×PCR buffer 10μl，Taq DNA聚合酶2U，購于pharmacia公司的重組噬菌體抗體系統(tǒng)的重鏈擴(kuò)增引物1、2各2μl，加水至終體積100μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘后，再進(jìn)行30循環(huán)的PCR擴(kuò)增(94℃變性1分鐘，55℃退2分鐘，72℃延伸2分鐘)，最后于72℃延伸10分鐘。
用編碼接頭(GGGGS)3的寡核苷酸序列連接所獲得的輕重鏈可變區(qū)基因，經(jīng)酶切后組裝到一嗜菌體表達(dá)載體pCANTAB 5E(Pharmacia Biotech)相應(yīng)的酶切位點上，采用電穿孔的方法將組裝好的單鏈抗體(scFv)表達(dá)載體PCANTAB PGPscFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株TG1(本發(fā)明人所在實驗室保存)，建立一個重組噬菌體抗體庫。用ELISA法對抗體庫進(jìn)行了篩選，獲得幾株分泌抗Pgp單鏈抗體的克隆株。經(jīng)核酸測序，免疫球蛋白(IgG)一級結(jié)構(gòu)中特征氨基酸同源分析，證明我們克隆的基因是目的基因。
實施例2、單鏈抗體基因表達(dá)載體PET28a(+)PGPscFv的構(gòu)建用引物①②從PCANTAB PGPscFv質(zhì)粒中擴(kuò)增Pgp scFv基因(連同純化標(biāo)記E-tag一起擴(kuò)增)，并在5’端加上HindIII酶切位點，再以PET28a(+)質(zhì)粒(購于Novagen公司)為模板用引物③④擴(kuò)增到該載體從起始密碼子至酶切位點SphI之間的片段，上述兩片段經(jīng)OverlapPCR連接后，純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII+SphI處理后再與經(jīng)HindIII+SphI處理后的PET28c(+)載體連接(16℃，過夜)。
引物①5’GACCAGGTCAAACTGCAGCA 3’。
②5’GCGTACCTAAGCTTTGCGGCACGCGGTTCCAG 3’。
③5’CGCAAGGAATGGTGCATGCA 3’。
④5’TGCTGCAGTTTGACCTGGTCGCTGCTGCCCATGGTATATC 3’。
實施例3、抗PgpScFv抗體片斷的表達(dá)、純化及復(fù)性。3.1抗PgpScFv抗體片斷的表達(dá)用構(gòu)建的PET28c(+)-PGPscFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并在含有50ug/ml卡那霉素，LB平板(1％agar)上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取經(jīng)鑒定正確的單克隆活化后，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.7-0.9，加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷，購于SIGMA公司，終濃度為100umol/L)，37℃，250rpM誘導(dǎo)表達(dá)3小時，6200g，4℃離心15min收集菌體。收集的菌體沉淀中加入1/30培養(yǎng)體積的冰預(yù)冷50mmol/Ltris-HCL、100mmol/LnaCl、1mmol/LEDTA、PH7.0溶解。反復(fù)凍融三次后超聲破碎細(xì)胞(超聲30秒/冷卻1分鐘/200瓦/8次)，4℃，30000g離心30分。沉淀中加入1/30培養(yǎng)體積的3M尿素和50mmol/LTris-HCL PH7.0溶解后離心30000g 30’，4℃收集包涵體，用1/40培養(yǎng)體積的6M鹽酸胍和0.1Mtris-HCL PH7.0于4℃搖動過夜溶解包涵體。4℃ 30000g離心30’去處沉淀，上清用于純化。3.2抗PgpScFv抗體片段的純化及復(fù)性a、3倍柱床體積的Start buffer(6M鹽酸胍，0.1MTris-HCL，PH7.0)平衡柱后，上樣(樣品中加入終濃度5mmol/L咪唑)，20倍柱床體積的6M尿素，50mmol/Ltris-HCL，50mmol/L咪唑，PH7.0洗柱，用4倍柱床體積的含250mmol/l咪唑，6M尿素，50mmol/Ltris-HCL，PH7.0洗脫結(jié)合在鎳柱上的scfv。b、洗脫樣品在TEA緩沖液(0.4M精氨酸-HCl，0.1Mtris-HCL，2mmol/LEDTA，PH7.0)透析復(fù)性，4℃過夜。c、12％SDS-PAGE電泳及Wersternblot(蛋白質(zhì)雜交)分析表達(dá)產(chǎn)物分子量約為30KD，見附圖1、2。
實施例4、抗PgpScfv抗體活性測定。
1、免疫熒光競爭實驗，見圖3-7將k562/A02制成5×105細(xì)胞懸液，加樣于40孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2×106/孔，PHMA027.5μl(4.8μg/μl)/孔，陰性對照組加15μlPBS，4℃孵育1小時。PBS洗兩次，加純化后抗Pgpscfv50μg/孔，陽性對照組加PBS，4℃孵育1小時。PBS洗兩次，加兔抗鼠熒光抗體，4℃孵育40分鐘。PBS洗去未結(jié)合的熒光抗體，流式細(xì)胞儀測定。
單抗PHMA02與K562/A02的結(jié)合陽性率為96.44％，經(jīng)抗Pgpscfv競爭后，PHMA02與K562/A02的結(jié)合陽性率為51.08％。實驗證明抗Pgpscfv能夠與小鼠抗Pgp全抗競爭結(jié)合表達(dá)Pgp抗原的K562/A02細(xì)胞。
2、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)Rh123(羅丹明123，購于SIGMA公司)的蓄積，見圖8-12取對數(shù)生長期的K562和K562/A02細(xì)胞，用冷生理鹽水洗兩次，以無血清RPMI1640稀釋成細(xì)胞濃度為5×105/ml，加入10μM的熒光染料Rh123，再分別加入a)1×10-6-10-8MPHMA02，b)4×10-6-1×10-8抗Pgpscfv。以10μMVRP作為陽性對照，以不含Rh123的細(xì)胞懸液作為陰性對照。與細(xì)胞共同孵育60分鐘后冷生理鹽水洗去Rh123，繼續(xù)孵育2小時，冷生理鹽水洗2次，流式細(xì)胞儀(激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm)檢測細(xì)胞內(nèi)Rh123的濃度。檢測結(jié)果表明1×10-6-10-8M單抗PHMA02與K562/A02共同孵育后測定的相對熒光強(qiáng)度分別為3.37，3.07，3.41，4×10-6-1×10-8抗Pgpscfv與K562/A02共同孵育后測定的相對熒光強(qiáng)度分別為3.02，4.02，3.38。陽性對照耐藥逆轉(zhuǎn)劑維拉帕咪(VRP)與K562/A02共同孵育后測定的相對熒光強(qiáng)度為79.81。實驗證明單抗PHMA02及抗Pgpscfv均不能抑制Pgp泵的功能。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所<120>抗Pgp單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>125<212>PRT<213>小鼠(musculus)<400>1Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pho Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser20 25 30Ile Tyr Asp Met Ser Trp Phe Arg Leu Thr Pho Glu Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Thr Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Pho50 55 60Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys65 70 75Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr80 85 90Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Tyr Tyr Gly Lys Gly Asp95 100 105Pho Phe His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr110 115 120Val Thr Val Ser Ser125<210>2<211>375<212>DNA<213>小鼠(musculus)<221>V-region<222>(1)------(375)<400>2caggtcaaac tgcagcagtc tgggggaggc ttagtgaggc ctggagggtc cctgaaactc 60tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt atctatgaca tgtcttggtt cctcctgact120cctgagaaga ggctggagtg ggtcacatac attagtagtg gtggtggcac ctactatcca180
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權(quán)利要求
1.一種抗Pgp抗體的重鏈可變區(qū)基因，其具有SEQ ID NO2的序列。
2.由權(quán)利要求1的基因編碼的多肽，其具有SEQ ID NO1的序列。
3.一種抗Pgp抗體的輕鏈可變區(qū)基因，其具有SEQ ID NO4的序列。
4.由權(quán)利要求3的基因編碼的多肽，其具有SEQ ID NO3的序列。
5.一種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求1的抗Pgp抗體的重鏈可變區(qū)及權(quán)利要求3的抗Pgp抗體的輕鏈可變區(qū)基因。
6.如權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其為PET28a(+)PGP scFv。
7.如權(quán)利要求5或6的表達(dá)載體所表達(dá)的多肽。
8.權(quán)利要求7所述的多肽在制備用于耐藥腫瘤的診斷和治療的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗Pgp單克隆抗體PHMA02重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在制備用于耐藥腫瘤的診斷和治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明制備的抗Pgpscfv PgpscFv片段只有針對Pgp抗原的識別功能，并無抑制作用，因此應(yīng)用于人體后不會干擾正常細(xì)胞的排泄分泌功能，無論是作為靶向診斷治療的載體還是作為雙功能抗體的一臂，均具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K39/395GK1498894SQ0214674
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月6日
發(fā)明者楊純正, 熊冬生, 高瀛岱, 彭輝, 許元富, 邵曉楓, 齊靜, 范冬梅 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所